1 Congreso Internacional de Ciencias Básicas y Aplicadas 25 al 27 de febrero de 2015, Ciudad Valles, San Luis Potosí, México ISBN 000-000-00000-0-0 MEMORIAS CONGRESO INTERNACIONAL DE CIENCIAS BÁSICAS Y APLICADAS (COICIBA 2015) Caracterización bioquímica y evaluación de los niveles de células T reguladoras relacionadas con el desarrollo de inflamación en obesidad, en población de origen Tének del estado de San Luis Potosí. Jocelin Moctezuma-González a , Brenda Alvarado-Sánchez a , Jesús Ramón Castillo-Hernández c , Diana Zavala-Cuevas a , Ángel León-Buitimea b , Martha Imelda-Cervantes c . a Laboratorio de Investigación Biomédica, Carrera de Bioquímica, Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Huasteca, Universidad Autónoma de San Luis Potosí. b Escuela de Medicina, Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Huasteca, Universidad Autónoma de San Luis Potosí c Laboratorio de Biomédica, Escuela de Enfermería, Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Media, Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Resumen El perfil epidemiológico en México ha sufrido una drástica transición hacia enfermedades crónico- degenerativas (ECD) como obesidad y Diabetes Mellitus 2 (DM2). Esto debido a un cambio en la dieta y estilo de vida, favoreciendo un ambiente obesogénico que conduce a la obesidad. Misma que definida como inflamación en bajo grado del tejido adiposo (TA), es el elemento central en la progresión hacia ECD. Teniendo un papel etiológico la infiltración y acumulación de macrófagos hacia TA; y su posterior activación con carácter pro-inflamatorio, que es estimulada por algunos tipos de células T. Debido a lo anterior, se ha sugerido que la infiltración de células T y el desequilibrio de los subconjuntos, como un evento principal en la iniciación de la inflamación del TA. Aunado a ello existen diferencias étnico-raciales entre la susceptibilidad a obesidad, debidas a factores genéticos, patrones alimenticios y estilos de vida específicos. En este contexto los grupos étnicos presentan mayor susceptibilidad a desarrollar obesidad, debido a la reciente exposición a un estilo de vida urbanizado, caracterizado por alta ingesta calórica y disminución de la actividad física. En esta investigación se evaluaron parámetros bioquímicos e inmunológicos, específicamente se determinaron los niveles de células T reguladoras en individuos del grupo étnico Tének, con obesidad periférica o central y no obesos, originarios del estado de San Luis Potosí. Los resultados sugieren un sesgo hacia un fenotipo de células T pro-inflamatorias en el tejido adiposo específicamente abdominal y a nivel sistémico en virtud de poblaciones reducidas de células Treg. Abstract The epidemiological profile in Mexico has suffered a drastic transition to chronic degenerative diseases (CDD) as obesity and diabetes mellitus 2 (DM2). This is due to a change in diet and lifestyle, encouraging an obesogenic environment that leads to obesity. Which defined as low-grade inflammation in adipose tissue (AT) is the central element in the progression to CDD. Taking an etiologic role infiltration and accumulation of macrophages into TA; and subsequent activation with pro- inflammatory nature, that is stimulated by some types of T cells. Because of this, it has been suggested that infiltration of T cells and subsets imbalance as a major event in the initiation of the TA inflammation. Added to this there are ethnic and racial differences between susceptibility to obesity due to genetic factors, dietary patterns and specific lifestyles. In this context ethnic groups have increased susceptibility to obesity due to recent exposure to an urbanized life style, characterized by high caloric intake and decreased physical activity. In this research biochemical and immunological parameters were evaluated, specifically the levels of regulatory T cells were determined in individuals of ethnic tének, with central or peripheral obesity and non-obese, from the state of San Luis Potosi. The results suggest a bias towards a pro-inflammatory phenotype T cells specifically abdominal adipose tissue and systemic under reduced populations of Treg cells. Palabras clave: Obesidad, Diabetes tipo 2, grupo étnico, células Treguladoras. Keywords: Obesity, Diabetes type 2, ethnic group, Tregulatory cells. Correspondencia Fecha de recepción:
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1 Congreso Internacional de Ciencias Básicas y Aplicadas
25 al 27 de febrero de 2015, Ciudad Valles, San Luis Potosí, México ISBN 000-000-00000-0-0
MEMORIAS CONGRESO INTERNACIONAL DE
CIENCIAS BÁSICAS Y APLICADAS (COICIBA 2015)
Caracterización bioquímica y evaluación de los niveles de células T reguladoras relacionadas con el desarrollo de inflamación en obesidad, en población de origen Tének del estado de San
Luis Potosí. Jocelin Moctezuma-Gonzáleza, Brenda Alvarado-Sáncheza, Jesús Ramón Castillo-Hernándezc, Diana
Zavala-Cuevasa, Ángel León-Buitimeab, Martha Imelda-Cervantesc. a Laboratorio de Investigación Biomédica, Carrera de Bioquímica, Unidad Académica Multidisciplinaria
Zona Huasteca, Universidad Autónoma de San Luis Potosí. b Escuela de Medicina, Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Huasteca, Universidad Autónoma de
San Luis Potosí c Laboratorio de Biomédica, Escuela de Enfermería, Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Media,
Universidad Autónoma de San Luis Potosí.
Resumen El perfil epidemiológico en México ha sufrido una drástica transición hacia enfermedades crónico-degenerativas (ECD) como obesidad y Diabetes Mellitus 2 (DM2). Esto debido a un cambio en la dieta y estilo de vida, favoreciendo un ambiente obesogénico que conduce a la obesidad. Misma que definida como inflamación en bajo grado del tejido adiposo (TA), es el elemento central en la progresión hacia ECD. Teniendo un papel etiológico la infiltración y acumulación de macrófagos hacia TA; y su posterior activación con carácter pro-inflamatorio, que es estimulada por algunos tipos de células T. Debido a lo anterior, se ha sugerido que la infiltración de células T y el desequilibrio de los subconjuntos, como un evento principal en la iniciación de la inflamación del TA. Aunado a ello existen diferencias étnico-raciales entre la susceptibilidad a obesidad, debidas a factores genéticos, patrones alimenticios y estilos de vida específicos. En este contexto los grupos étnicos presentan mayor susceptibilidad a desarrollar obesidad, debido a la reciente exposición a un estilo de vida urbanizado, caracterizado por alta ingesta calórica y disminución de la actividad física. En esta investigación se evaluaron parámetros bioquímicos e inmunológicos, específicamente se determinaron los niveles de células T reguladoras en individuos del grupo étnico Tének, con obesidad periférica o central y no obesos, originarios del estado de San Luis Potosí. Los resultados sugieren un sesgo hacia un fenotipo de células T pro-inflamatorias en el tejido adiposo específicamente abdominal y a nivel sistémico en virtud de poblaciones reducidas de células Treg.
Abstract The epidemiological profile in Mexico has suffered a drastic transition to chronic degenerative diseases (CDD) as obesity and diabetes mellitus 2 (DM2). This is due to a change in diet and lifestyle, encouraging an obesogenic environment that leads to obesity. Which defined as low-grade inflammation in adipose tissue (AT) is the central element in the progression to CDD. Taking an etiologic role infiltration and accumulation of macrophages into TA; and subsequent activation with pro-inflammatory nature, that is stimulated by some types of T cells. Because of this, it has been suggested that infiltration of T cells and subsets imbalance as a major event in the initiation of the TA inflammation. Added to this there are ethnic and racial differences between susceptibility to obesity due to genetic factors, dietary patterns and specific lifestyles. In this context ethnic groups have increased susceptibility to obesity due to recent exposure to an urbanized life style, characterized by high caloric intake and decreased physical activity. In this research biochemical and immunological parameters were evaluated, specifically the levels of regulatory T cells were determined in individuals of ethnic tének, with central or peripheral obesity and non-obese, from the state of San Luis Potosi. The results suggest a bias towards a pro-inflammatory phenotype T cells specifically abdominal adipose tissue and systemic under reduced populations of Treg cells.
Palabras clave: Obesidad, Diabetes tipo 2, grupo étnico, células Treguladoras.
Keywords: Obesity, Diabetes type 2, ethnic group, Tregulatory cells.
Correspondencia Fecha de recepción:
2 Congreso Internacional de Ciencias Básicas y Aplicadas
25 al 27 de febrero de 2015, Ciudad Valles, San Luis Potosí, México ISBN 000-000-00000-0-0
MEMORIAS CONGRESO INTERNACIONAL DE
CIENCIAS BÁSICAS Y APLICADAS (COICIBA 2015)
M.C. Jocelin Moctezuma González Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Huasteca, Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Romualdo del Campo 501, Fraccionamiento Rafael Curiel, CP 79060. Cd. Valles, S.L.P. México.
Fecha de recepción de correcciones: Fecha de aceptación:
Introducción
La obesidad definida como inflamación en bajo
grado del tejido adiposo, asociada a RI es el
elemento central en la progresión hacia DM2.
El deterioro de la sensibilidad a la insulina (SI)
involucra múltiples órganos, incluyendo
primordialmente tejido adiposo (TA)
incrementado con un asociado incremento en la
liberación de ácidos grasos libres, adipocinas y
citocinas pro inflamatorias como: IL-6, TNF- α.
Que pueden llegar a interferir en la señalización
de insulina, finalizando en la generación de
resistencia a la insulina (RI) en TA con una
subsecuente RI sistémica (1). Teniendo un
papel etiológico la infiltración y acumulación
macrófagos en TA, predominantemente el
visceral, de individuos con peso corporal
incrementado (2). Aunado a la secreción de
citocinas y adipocinas, existe una infiltración de
células inmunes hacia el TA, principalmente
macrófagos y células T. Sin embargo es
necesaria la activación con carácter pro
inflamatorio de los macrófagos asociados al TA,
para el desarrollo de RI con obesidad. Dicha
activación es modificada por subgrupos de
células T; las células Th1 secretoras de IFN-y
dirigen las propiedades de los macrófagos
hacia un perfil pro inflamatorio (M1) mediante la
liberación de IL-1, IL-6 y TNF- α. Por el
contrario las células anti inflamatorias Th2
secretoras de IL-4 e IL-13, o TCD4+Foxp3+,
regulan las funciones de los macrófagos
mediante la diferenciación hacia macrófagos
secretores de IL-10 (M2) (3). Sin embargo en
TA con obesidad primordialmente central se
presenta un mecanismo donde las células Th1
incrementan y las células TCD4+Foxp3+
disminuyen progresivamente de acuerdo al
incremento en masa corporal; permitiendo un
ambiente pro inflamatorio (4). Aunado a ello,
existen diferencias étnico/raciales entre la
susceptibilidad a obesidad y DM2, debidas a
factores genéticos, patrones alimenticios y
estilos de vida específicos de poblaciones, que
afectan tanto la distribución como la
composición de la masa corporal entre etnias.
En este contexto los grupos étnicos presentan
mayor susceptibilidad a desarrollar obesidad.
Debido a la exposición a un estilo de vida
urbanizado, caracterizado por alta ingesta
calórica y disminución de la actividad física (5,
6). El objetivo de este estudio es evaluar
parámetros bioquímicos así como niveles de
células T reguladoras, implicados en la
aparición de la inflamación generada en
obesidad y su asociación con la RI que
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25 al 27 de febrero de 2015, Ciudad Valles, San Luis Potosí, México ISBN 000-000-00000-0-0
MEMORIAS CONGRESO INTERNACIONAL DE
CIENCIAS BÁSICAS Y APLICADAS (COICIBA 2015)
promueve la aparición de DM2, en el grupo
étnico Tének.
Metodología
Muestreo y población de estudio. Se
muestrearon a 207 individuos provenientes de
dos comunidades de origen Tének del estado
de San Luis Potosí; San Pedro de las Anonas,
Aquismón, y Sagrada Familia, Tanquian de
Escobedo. Mismos que aceptaron participar en
esta investigación mediante la firma de un
consentimiento informado. La población de
estudio fue formada sólo por individuos que
cumplieron con los criterios de inclusión
establecidos. Mismos que fueron incluidos en
uno de los tres grupos de estudio: 1. No
Obesos; 2. Obesos periféricos; 3. Obesos
centrales; después de ser sometidos a un
protocolo de caracterización clínica mediante la
determinación de medidas antropométricas.
Para después someterse a una toma de
muestra de sangre venosa periférica que
permitirá la evaluación de parámetros
bioquímicos e inmunológicos propios de la
presente investigación.
Determinación de medidas antropométricas.
Se calculó el Índice de Masa Corporal (IMC)
midiendo la talla, el peso, y utilizando la
fórmula: peso (Kg)/ talla (m)2; que clasifica con
obesidad a individuos con un IMC≥30.
Enseguida se tomó la medida del perímetro de
cintura (PC) utilizando una cinta métrica, en
posición paralela al piso, el punto de medida
fue entre la última costilla y la cresta iliaca,
durante el final de la espiración. Los valores
normales de PC fueron <90 cm para hombres y
<80 cm en mujeres. Así mismo se determinó el
Índice Cadera/Cintura (ICC), tomando en
cuenta el perímetro de cadera en el punto más
ancho de los glúteos; y utilizando la fórmula:
Perímetro de Cintura / Perímetro de Cadera.
Los valores que se tomaron como normales
para ICC fueron <1 para hombres y <0.8 en
mujeres.
Evaluación de parámetros bioquímicos. Se
tomó una muestra sanguínea mediante punción
venosa, en tubos con y sin anticoagulante
(EDTA), por la mañana después de 8 a 12
horas de ayuno. El suero y plasma se obtuvo
después de 10 minutos de centrifugación a
3500 rpm. Enseguida se realizó la
determinación bioquímica de: glucosa,
colesterol (COL), colesterol HDL (cHDL) y
triglicéridos (TG), utilizando el
espectrofotómetro MiniTecno (I.S.E. GRUP®
RM). Los niveles de insulina se determinaron
mediante la técnica de
inmunoquimioluminiscencia en el equipo
automatizado IMMULITE 1000 (SIEMENS®).
Se tomaron como normales los valores de
glucosa <100 mg/dL, como alterados: 100-126
mg/dL y como pre diagnóstico de DM: >126
mg/dL. Así mismo se establecieron como
normales los niveles de COL <200 mg/dL; TG
<150 mg/dL y cHDL>35 mg/dL.
Para calcular el riesgo a padecer ECV se utilizó
la siguiente fórmula:
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Índice TG-cHDL= TG/ cHDL, tomando el punto
de corte para definir riesgo de padecer ECV, un
índice de TG-cHDL>3 (9).
Los valores de insulina igual o mayores al P75,
se definieron como hiperinsulinismo.
Índice HOMA. La RI fue establecida mediante
el modelo homeostático para la medición de RI
(HOMA-RI) (7), utilizando la siguiente fórmula:
[Glucosa (mmol/L) x Insulina (µU/mL)/22.517].
La SI fue calculada mediante el índice QUICKI
(por sus siglas en inglés: quantitative insulin
sensitivity check index), utilizando la fórmula: 1/
[log Insulina (µU/mL) + log Glucosa (mg/dL)].
Tomándose un valor de 0.357 como punto de
corte; valores menores a éste punto indican
menor SI (8).
Clasificación de los grupos de estudio. La
población incluida en los tres grupos de estudio
fueron individuos con niveles normales de
glucosa (<100 mg/dL) y de acuerdo a las
siguientes características:
1. No obesos (NO): fue integrado por individuos
que presentaron valores de: IMC< 30; PC <90
cm para hombres y <80 cm en mujeres, ICC <1
para hombres y <0.8 para mujeres.
2. Obesos periféricos (OP): conformado por
individuos que presentaron un IMC≥30.
3. Obesos centrales (OC): los individuos se
incluyeron en dos subgrupos dependiendo de la
medición que se utilizó para establecer
obesidad central: PC ≥90 cm para hombres y ≥
80 cm en mujeres; o ICC≥1 para hombres y ≥
0.8 en mujeres.
Evaluación de los niveles de células T
reguladoras.
a) Separación de Células Mononucleares
(CMN).
Las CMN se aislaron utilizando el método de
centrifugación por gradiente de densidad. La
muestra sanguínea, se diluyó 1:1 en solución
buffer de fosfatos (PBS), enseguida esta
mezcla se añadió sobre 3 mL de Ficoll-
Hypaque (Sigma- Aldrich, St. Louis MO) y se
llevó a centrifugación a 2500 rpm durante 20
min. Las CMN fueron recuperadas, lavadas en
dos ocasiones con PBS y ajustadas a 1mL con
medio RPMI 1640 suplementado con 10 % de
suero bovino fetal. Finalmente la viabilidad de
las mismas se evaluó mediante la tinción con
Azul de tripano y se ajustó a una concentración
final de 1×106 células/mL.
b) Análisis por citometría de flujo.
Se realizaron marcajes dobles para cuantificar
la expresión de células Treg y Ts en CMN de
los individuos que integran cada uno de los tres
grupos de estudio.
• Tinción de células Treg (CD4+Foxp3+): 500
µL de suspensión celular a una concentración
de 1x106 células/mL, fue tratada con una
solución de trabajo fijación-permeabilización del
kit de tinción para Foxp3 (e-Bioscience®, San
Diego, CA), para permitir la entrada del
marcador intracelular Foxp3, enseguida se
lavaron las células y se adicionó el anticuerpo
monoclonal anti-Foxp3-PE (Phicoerythrin),
posteriormente se agregó el anticuerpo anti-
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CD4 conjugado a FITC (Fluorescein
isothiocyanate) (e-Bioscience®).
•Tinción de células Ts (CD8+CD28-): Se
centrifugaron 500 µL de suspensión celular
(1x106 células/mL), el precipitado se
resuspendió y se le añadieron anti-CD8
conjugado a FITC (e-Bioscience®) y anti-CD28
conjugado a PE (e-Bioscience®); se incubó en
la oscuridad.
Los controles de isotipo se trataron de forma
simultánea, adicionándole anticuerpos anti-IgG-
PE y anti-IgG-FITC (e-Bioscience®). Todos los
marcajes descritos se fijaron en 100 µL
formaldehido al 1%. El procedimiento de cada
uno de los marcajes descritos se realizó en
condiciones de esterilidad dentro de la
campana de flujo laminar (Class II Type A/B3,
ESCO®). Finalmente se analizaron las
muestras en el citómetro de flujo FACS Calibur
(Becton Dickinson San José, CA). Los gráficos
de citometría fueron generados mediante el
programa CellQuest (Becton Dickinson
Immunocytometry Systems, San Jose CA,
USA) y se analizaron en el programa WinMDi
versión 2.8 (Windows Multiple Document
Interface for Flow Cytometry, Becton Dickinson
Immunocytometry Systems, San Jose CA,
USA).
Análisis estadístico. El análisis de los datos
incluyo estadística descriptiva con
cuantificación de medias y desviación estándar
para las variables continuas, las prevalencias
fueron expresadas en porcentajes. Los análisis
de correlación fueron realzados en el programa
STATISTICA. Finalmente el análisis de
significancia estadística fue realizado en el
programa Graph Pad Prism versión 4,
utilizando pruebas de normalidad de
Kolmogorov-Smirnov y la prueba de
significancia T no pareada; tomando un valor
de p≤0.05 como significativo.
Resultados
Se muestrearon a 207 individuos provenientes
de dos comunidades de origen Tének del
estado de San Luis Potosí: San Pedro de las
Anonas, Aquismón; y Sagrada Familia,
Tanquian de Escobedo. Quedando incluidos
solo individuos que cumplieron con los criterios
de inclusión establecidos. De esta manera la
población de estudio fue conformada por 129
individuos en una edad promedio de 39 ±12
años; 29% fueron hombres y 71% mujeres. Los
cuales fueron caracterizados clínicamente e
incluidos en cada grupo de estudio: No obesos
(32 individuos); Obesidad periférica (70
individuos); y con Obesidad central (27
individuos).
En la figura 1 se muestra la comparación de las
prevalencias de cada tipo de obesidad por
sexo. La prevalencia de OP determinada por
IMC es menor para hombres (21.42%), con
respecto a la prevalencia en mujeres (33.57%).
En cuanto a la OC determinada tanto por PC o
ICC, afecta en mayor proporción a las mujeres.
En este sentido, la OC determinada por PC
incluye al 100% de los hombres, mientras que
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OC determinada por ICC, incluye cerca al
97.81% de las mujeres. Debido a lo anterior, en
esta investigación, se decidió utilizar ICC para
mujeres y PC para hombres para establecer el
grupo con obesidad central.
Al evaluar el perfil lipídico (COL, TG y cHDL) de
la población de estudio ajustados por tipo de
obesidad y sexo, encontramos que el promedio
de los valores de COL es mayor en hombres
(169,18 ±31,08 mg/dL), que el promedio
mostrado en mujeres (157,67 ±39,73 mg/dL),
p=0.1336.
Figura 1. Prevalencia y clasificación por tipo de
Obesidad y sexo. Obesidad central determinada por
PC o ICC y obesidad periférica determinada por IMC
(%).IMC: Índice de masa corporal; PC: Perímetro de
cintura; ICC: Índice de cintura/cadera.
Encontrándose desfavorecedor para los
hombres específicamente con OC, los cuales
mostraron valores incrementados respecto a
las mujeres con OC (COL hombres=189.19
±34.88 mg/dL, mujeres = 162 ±38.02 mg/dL;
TG hombres = 199.20 ±94.80 mg/dL, mujeres=
196.70 ±60.78 mg/dL; cHDL hombres= 24.86
±6.7 mg/dL, mujeres= 24.57 ±8.36 mg/dL).
En la figura 2A se muestra la prevalencia de
desórdenes en el perfil lipídico (COL>200
mg/dL, TG> 200 mg/dL y cHDL < 35 mg/dL);
ajustados por sexo y tipo de obesidad. En esta
población con obesidad, ya sea periférica o
central, la Hipercolesterolemia afecto al 7.41%
de la población con obesidad, la prevalencia de
Hipertrigliceridemia fue de 41.49% y el 91.49%
de ésta población mostró valores de colesterol
HDL disminuidos. Mostrando un patrón común
a nivel poblacional en dichas las alteraciones
lipídicas con niveles elevados de TG, en
conjunto con disminución en los niveles de
cHDL. Este tipo de dislipidemia es conocida
como dislipidemia aterogénica.
En la figura 2B, se muestra que la prevalencia
de dislipidemia aterogénica, se establece entre
el 90% al 100% de la población con obesidad,
mientras que la población no obesa presenta
una prevalencia del 53%. Además se ha
demostrado que la dislipidemia aterogénica
está relacionada con la presencia de RI.
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