Melanie Pierra PhD defense : Coupling dark fermentation and microbial electrolysis for hydrogen production : formation and conservation of electroctive biofilm.

Couplage de la fermentation et de l’électrolyse microbienne pour la production d’hydrogène :

Formation et maintenance du biofilm électro-actif

Mélanie PIERRA,

Directeur de Thèse : Nicolas BERNET Encadrant : Eric TRABLY

1

Hydrogène Fort pouvoir calorifique 122kJ/g

Limitation des gaz à effet de serre

Contexte Travaux de Thèse conclusionss & perspectives

2

Modes de production principaux :

96 % : énergies fossiles

4 % : électrolyse de l’eau

Voies de recherche pour la production d’hydrogène à privilégier: Voies biologiques

Electrolyse microbienne (Microbial electrolysis

cell - MEC)

Fermentation Photo-Fermentation Bio-photolyse de l’eau

Bactéries électroactives

Bactéries anaérobies

Cyanobactéries Microalgues

Hawkes et al, 2007

Hallembeck et Benemann, 2002

3

La fermentation

Hawkes et al, 2007

Guo et al, 2010

Lactate

Acétone,

Butanol,

Ethanol,

Propionate

…

Acétate CO2 + H2

Matière organique

(biomasse, déchets solides, effluents)

Acides aminés Sucres simples Acides gras

Acides gras volatils

(acétate, butyrate)

CO2 + CH4

Bactéries hydrolytiques

Bactéries fermentaires

Bactéries homoacétogènes

Archaea

méthanogènes Conditions opératoires

spécifiques

(pH, T°, [S])

Contexte Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives

Les étapes de la fermentation

Lactate

Acétone,

Butanol,

Ethanol,

Propionate

…

Acétate CO2 + H2

Matière organique

(biomasse, déchets solides, effluents)

Acides aminés Sucres simples Acides gras

Acides gras volatils

(acétate, butyrate)

CO2 + CH4

Bactéries hydrolytiques

Bactéries fermentaires

Bactéries homoacétogènes

Archaea

méthanogènes Conditions opératoires

spécifiques

(pH bas, T°, [S])

4

La fermentation

Hawkes et al, 2007

Guo et al, 2010

Rendements moyens limités :

2-3 mol H2/mole hexose


Fermentation

Voie acétate :

C6H12O6 + 4H2O → 2CH3COOH + 2CO2 + 4H2

Voie butyrate :

C6H12O6 + 2H2O → CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2

Cultures mixtes : C6H12O6 + 0,5 H2O→ 0,75 CH3CH2CH2COOH + 0,5 CH3COOH + 2CO2 + 2,5H2

2 CH3COOH

4 H2

4 CO2

4 H2O C6H12O6

Voies de production

6

Anaérobies strictes

Clostridium Y = 1,8 – 2

Anaérobies facultatives

Enterobacter Y = 0,2 – 1

Cultures mixtes anaérobies

Co-cultures Y = 2,5 Complexes Y = 2,0 – 3,0

Rendement (mole H2/molehexose)

Latrille et al, 2011

La fermentation Contexte Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives

Les bactéries productrices d’hydrogène


7

Hydrogène

Voies de recherche pour la production de l’hydrogène à privilégier: Voies biologiques

Electrolyse microbienne (Microbial electrolysis

cell - MEC)

Fermentation Photo-Fermentation Bio-photolyse de l’eau


Microorganismes anaérobies

Cyanobactéries Microalgues

Hawkes et al, 2007

Hallembeck et Benemann, 2002

Fort pouvoir calorifique 122kJ/g

Limitation des gaz à effet de serre

Modes de production principaux :

96 % : énergies fossiles

4 % : électrolyse de l’eau

Contexte

Rabaey et Vertraete, 2005 8

Les systèmes bioelectrochimiques

CH3COOH

2 CO2

8 e-

8 H+

8 e- 8 e-

2 H2O

8 H+

2 O2

2 H2O

Liu et al, 2005

Rozendal et al, 2006

Production

d’hydrogène

CH3COOH

2 CO2

8 e-

8 H+

8 e- 8 e-

Générateur

4 H2

2 H2O

8 H+

Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives

Microbial Fuel cell MFC

Microbial Electrolysis cell MEC

Anode (anaérobie) Cathode (aérobie) Anode (anaérobie) Cathode (anaérobie)

Electrolyse microbienne

Liu et al, 2010 9

La différence de potentiel à appliquer est inférieure en MEC par rapport à l’électrolyse de l’eau.

Les systèmes bioelectrochimiques Contexte Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives

MFC MEC

Electrolyse de l’eau

Catalyse microbienne

10

Les bactéries électro-actives

Desulfuromonas acetoxidans 0,16 A/m² [3]

Desulfobulbus propionicus 0,03 A/m² [4]

Shewanella oneidensis 0,12 A/m² [1]

Geobacter sulfurreducens 8,40 A/m² [2]

Klebsiella pneumoniae 1,20 A/m² [5]


pH = 7-9,

T = 30-37 °C

Acétate

CO2

Fe(III)

Fe(II)

e-

8 e-

Acétate

2 CO2

8 H+

4 H2O

8e-


[1] Carmona-Martinez et al., 2012

[2] Dumas et al., 2008

[3] Bond et al., 2002

[4] Holmes et al., 2004

[5] Zhang et al., 2008

Kim et al., 1999

Wang et al., 2010

12 Kiely et al., 2011; Freguia et al., 2010

Acétate : substrat modèle pour l’activité électroactive des biofilms

Les bactéries électro-actives Contexte Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives

Substrats

𝐶𝐸 = 𝑛𝑒−𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑓é𝑟é𝑠

𝑛𝑒−𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡

Rendement faradique :

Chae et al., 2009

13

H2 H2

Fermentation Electrolyse

Microbienne Substrat Acides organiques

(acétate, butyrate) Effluent

Contexte Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives Couplage Fermentation / MEC

37°C pH 5,5

Milieu salin (conductivité) pH 7

2 CH3COOH

4 H2

2 CO2

4 H2O C6H12O6

16 e- 16 e-

Générateur

2 CH3COOH

4 CO2

16 H+

4 H2O

16 H+

8 H2

16e-

14

Communauté microbienne de la fermentation

Communauté microbienne électroactive

en MEC

Paramètres opératoires

Contexte Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives Objectifs & Stratégie

pH Salinité Acides organiques Stratégie d’inoculation

Objectifs et stratégie

Structure (composition, diversité) Fonction (production d’hydrogène, électroactivité)

…des communautés microbiennes

Espèces exogènes

15

pH Salinité Acides organiques Stratégie d’Inoculation



en MEC


Contexte Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives Objectifs & Stratégie

Objectifs et stratégie

Structure (composition, diversité) Fonction (production d’hydrogène, électroactivité)

…des communautés microbiennes

Espèces exogènes

16

Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives Objectifs & Stratégie Contexte



en MEC


B1 Paramètres abiotiques (pH, AGV)

B2 Nature et adaptation de

l’inoculum

A Fermentation en milieu salin :

- pH 8 - pH 6

C Perturbations biotiques

Stratégie => inoculum commun anaérobie et salin Etude de l’adaptation de cet inoculum aux paramètres spécifiques de chaque procédé.

17




en MEC



- pH 8 - pH 6

Stratégie => inoculum commun anaérobie et salin Etude de l’adaptation de cet inoculum aux paramètres spécifiques de chaque procédé.

Faisabilité de la fermentation en milieu salin et à pH8 ?



l’inoculum C

Perturbations biotiques

18

Conclusions & Perspectives Fermentation en milieu salin Contexte Travaux de Thèse

2 CH3COOH

4 H2

2 CO2

4 H2O C6H12O6

Inoculum : sédiments de salins

VL = 200 mL

Substrat : glucose (5g/L)

Oligo-éléments

pH initial : 8

7 salinités de 9 à 75 gNaCl/L

Triplicats

Matériel et Méthodes

-0,2

-0,1

0,0

9 19 29 38 48 58 75

Vit

ess

e s

pé

cifi

qu

e d

e

con

som

mat

ion

d’H

2 (

j-1

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

9 19 29 38 48 58 75

H2

max

(m

ol H

2 /

mo

l Glu

cose

)

salinité (gNaCl/L)

19 Quéméneur et al, 2011; Quéméneur et al, 2011; Oren, 2001

• Diminution de H2max de 9 à 29 gNaClL-1

• Puis augmentation constante

=> 0,90 (±0,02) molH2 molGlc-1 at 75 gNaClL

-1

• Meilleurs taux de conversion en hydrogène

pour les plus fortes concentrations en NaCl

• Impact de NaCl sur les consommateurs d’H2

• Inhibition de la voie propionique de

consommation d’H2

Conclusions & Perspectives A / Fermentation en milieu salin Contexte Travaux de Thèse

Production d’hydrogène

• Consommation d’hydrogène plus inhibée que production

aux plus fortes salinités

• Production d’hydrogène à pH 8 & en milieu salin

Communautés microbiennes

20

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

9 19 29 38 48 58 75

Others

VIBRIONALES

Vibrio sp

Vibrionaceae

Vibrio ssp

Vibrio parahaemolyticus

Vibrio nereis

FUSOBACTERIALES

ENTEROBACTERIALES

CLOSTRIDIALES

BACTEROIDALES

ALTEROMONADALES

Concentration en NaCl (gNaCl/L)

58 gNaClL-1 and 75 gNaClL

-1 : une nouvelle Vibrionaceae

Conclusions & Perspectives Contexte Travaux de Thèse

• 9gNaClL-1 : Clostridium & Enterobacter.

• % Clostridium & Enterobacter diminuent avec l’augmentation de la salinité

• 58 & 75 gNaClL-1 : l’abondance relative des Vibrionales atteint plus de 79 & 92%

Guo et al, 2010 , , Trably et al, 2011; Quéméneur, 2011; Quéméneur, 2012

Pyroséquençage: Abondance relative

(%)

A / Fermentation en milieu salin

21

Espèces isolées à partir d’eaux usées Conditions non salines


γ-proteobacterie

bacilles Gram –

vivent dans eau

pH alcalin (7,5-9)

halophiles simples ou strictes

10-30 gNaCl/L

10°C-40°C

aérobiose de préférence

Oh et al, 2003

Vibrio A / Fermentation en milieu salin

22

Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives conclusionss intermédiaires Contexte


Production de bioH2 par fermentation en

milieu salin à pH8

Nouvelle Vibrionaceae



en MEC


Influence du pH et du substrat sur la structure et les fonctions du biofilm



l’inoculum C


Pierra et al, International Journal of Hydrogen Energy, 2013


- pH 8 - pH 6

Compound g/L

K2HPO4 0.5

NH4Cl 2.0

Yeas extract 0.2

MES 7.6

NaCl 35.0

Oligo elements solution 1.0 mL

Starkey media composition:

Working electrode:

Graphite plate

Counter electrode:

Platinium grid

Reference electrode:

SCE

Temperature controlled system at 37 C

Continuos stirring at 200 rpmAnaerobic sediments collected in Gruissan

Experimental conditions

Electrode de travail : Plaque de graphite

Electrode de référence : ECS

Contre électrode : grille de Platine

2,5 cm « Anode »

« Cathode »

Compound g/L

K2HPO4 0.5

NH4Cl 2.0

Yeas extract 0.2

MES 7.6

NaCl 35.0

Oligo elements solution 1.0 mL

Starkey media composition:

Working electrode:

Graphite plate

Counter electrode:

Platinium grid

Reference electrode:

SCE

Temperature controlled system at 37 C

Continuos stirring at 200 rpmAnaerobic sediments collected in Gruissan

Experimental conditions

23

Éle

ctr

ode d

e tra

vail

Éle

ctr

ode d

e r

éfé

rence

Contr

e é

lectr

ode

U

I

0,2V vs ECS

Système à 3 électrodes (Demi-cellule)

Température : 37°C U

I I= f(t)


I J

(A/m²)

Cultures mixtes

Matériel et Méthodes B1 / Paramètres abiotiques (pH, AGV)

Inoculum : sédiment de salin

35gNaCl/L

24


Desulfuromonas acetoxidans & Geoalkalibacter subterraneus :

espèces majoritaires

Desulfuromonas acetoxidans / Desulfuromonas spp

Geoalkalibacter subterraneus

Pyroséquençage des communautés des biofilms électroactifs : Enrichissement sur anode de souches dominantes

pH

5,5 ou 7

Acides organiques

Acétate (10mM) ou Acétate(5mM) + Butyrate (5mM)

2,2 A/m² 4,2 A/m² 6,7 A/m² 7,7 A/m²

Enrichissements Desulfuromonas spp : 3 ± 2 /1000 Geoalkalibacter subterraneus : 2 ± 0 /1000

B1 / Paramètres abiotiques (pH, AGV)

25

Sélection d’espèces majoritaires dans le biofilm électroactif quelles que soient les conditions de pH et de composition en substrat. Dominance ou co-dominance


Desulfuromonas acetoxidans : - Issue de sédiments marins - Bond et al., 2002 (0,16 A/m²) Geoalkalibacter subterraneus : - En culture mixte : 4,2 à 8,9 A/m²

(Micelli et al., 2012) - Etude en culture pure (Carmona,

Pierra et al., 2013, Badalamenti et al., 2013) : mécanisme de transfert direct

Bond et al., 2002; Micelli et al., 2012; Carmona et al., 2013; Badalamenti et al., 2013

Espèces majoritaires B1 / Paramètres abiotiques (pH, AGV)

Espèces minoritaires dans l’inoculum

26




en MEC




l’inoculum C



- pH 8 - pH 6

=> Construction du biofilm

D. acetoxidans G. subterraneus

Conclusions & Perspectives Construction du biofilm Contexte Travaux de Thèse

Existe-t-il une synergie entre Geoalkalibacter subterraneus et Desulfuromonas acetoxidans ?

Lavage des

cellules

Lavage des

cellules

27

Souches de collection

28

100/0 80/20 50/50 20/80 0/100

Desulfuromonas acetoxidans

Geoalkalibacter subterraneus 5,0 A/m²

1,9 A/m²


R1 R2 R3

Ratio d’inoculation D. acetoxidans / G. subterraneus

100/0 80/20 47/53 05/95% 0/100

Densité de courant maximale A/m² 1,9 3,1 5,8 4,4 5,0

Temps de latence (j) 40 20 15 2 4

Ratio final dans le biofilm

D. acetoxidans / G. subterraneus

100/0 02/98 02/98 02/98 0/100

29

dominance systématique de Geoalkalibacter subterraneus (temps de latence plus court que Desulfuromonas acetoxidans)


30

Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives conclusionss intermédiaires Contexte



milieu salin à pH8




en MEC


Dominance systematique de

G. subterraneus & D. acetoxidans Construction du

biofilm en culture pure => dominance de

G. subterraneus

Recherche d’une stratégie d’acclimatation de l’inoculum qui permettrait la formation de biofilms reproductibles



l’inoculum C



- pH 8 - pH 6


31

Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives B2 / Nature et adaptation de l’inoculum Contexte

Acetate

CO2

Fe(III)

Fe(II)

e-

8 e-

Acetate

2 CO2

8 H+

4 H2O

8e-

L’enrichissement sur Fe(III) : • améliore l’électroactivité après enrichissement d’un biofilm préformé (Wang et al., 2010)

• diminue l’électroactivité du biofilm après 25 cycles d’enrichissement de boues anaérobies (Kim et al., 2005)

Suivi des communautés microbiennes

Objectifs

32

4x

4x

Sediments

4x

4x

Etude de l’effet de l’enrichissement sur Fe(III) sur :

• Les performances bioélectrochimiques

• La structure de la communauté microbienne du biofilm et de la culture

liquide

E1

E2

E3

B0

B1

B2

B3

Anode

CxHyOz CO2

e-

Oxydes de Fe(III)

CxHyOz CO2

e-


Principe

33

𝑄𝑚𝑎𝑥 𝐶 = 𝑖 𝑡 𝑑𝑡

Anode

CxHyOz

CO2

e-

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 10 20 30 40

J(A

:m²)

Temps (jours)

0

500

1 000

1 500

2 000

2 500

3 000

3 500

4 000

4 500

0 10 20 30 40

Q(C

)

Temps (jours)

𝐶𝐸 = 𝑛𝑒−𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑓é𝑟é𝑠

𝑛𝑒−𝑡ℎé𝑜𝑟𝑖𝑞𝑢𝑒 (𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡)

Temps de latence

Qmax Charge transmise :

Rendement faradique :

Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives Contexte


Vmax

B2 / Nature et adaptation de l’inoculum

1 étape

d’enrichissement pour

augmenter le rendement

faradique de 30,4±4% à

99±7% et la vitesse de

transfert d’électrons

Dégradation des

performances à la

troisième étape

d’enrichissement

Augmentation du temps

de latence

Electroactivité du

biofilm:

de 1,6 to 4,5 A/m²


34


0

5

10

15

20

25

30

35

0

100

200

300

400

500

B0 B1 B2 B3

Vm

ax (

C/j

)

biofilms (dQ/dt)max (C/d)

Lag Phase (d)

Tem

ps

de

late

nce

(j)

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

B0 B1 B2 B3

Re

nd

em

en

t fa

rad

iqu

e (

%)

biofilms

Transfert d’électrons

35

•SSCP = technique d’empreinte moléculaire

•1 espèce => 1 pic

•Aire sous chaque pic => abondance relative de l’espèce dans la

communauté microbienne

Empreinte

moléculaire Raclage du

biofilm

Centrifugation de

la culture liquide Pyroséquençage

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Espèces Abondance

re

lative

(%

)

1 2 3 4



Temps d’elution

Espèce 1

Inte

nsité

de

flu

ore

sce

nce Espèce 2

Profil CE-SSCP

4x

4x Sédiments

4x

4x E1

E2

E3

B0

B1

B2

B3


36


Structure des communautés microbiennes

Sediments

Structures de communautés

similaires

(1 ou 2 espèces majoritaires)

Forte simplification de

la communauté

microbienne

Profils CE-SSCP

E1

E2

E3

B0

B1

B2

B3


37

Structure des communautés microbiennes B2 / Nature et adaptation de l’inoculum

Augmentation du

temps de latence /

emergence de

Marinobacterium sp

0

20

40

60

80

100

B0 B1 B2 B3

Ab

on

dan

ce r

ela

tive

(%

)

L’électroactivité du

biofilm est améliorée

avec l’apparition de

Geoalkalibacter

subterraneus au 1er

enrichissement sur

Fe(III)


38

0

5

10

15

20

25

30

35

0

100

200

300

400

500

B0 B1 B2 B3

Vm

ax (

C/d

)

biofilms (dQ/dt)max (C/d)

Lag Phase (d)

Tem

ps

de

late

nce

(j)


Biofilms Enrichissements sur Fe(III)

• Enrichissement sur Fe(III) : Geobacteraceae & Geoalkalibacter subterraneus

• Enrichissement sur électrode : Geoalkalibacter subterraneus & Marinobacterium sp.

• Sélection de Geoalkalibacter subterraneus en 1 cycle d’enrichissement

• Cycles d’enrichissement répétés => émergence d’une autre Geobacteraceae

=> diminution des performances électroactives.


39


Propriété de respiration sur Fe(III) non transférable sur anode Richter et al., 2007

40

Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives Conclusions intermédiaires Contexte



milieu salin à pH8




en MEC





G. subterraneus

Stratégie d’enrichissement => Pré-acclimatation de

l’inoculum en 1 cycle

Effet de l’ajout de biomasse exogène sur le biofilm ?


l’inoculum


- pH 8 - pH 6




41


Objectif C / Perturbations biotiques sur le biofilm

42

pH6

pH7

pH8

pH7

Témoin

CE-SSCP

Ce (%) Jmax (A/m²)

Conclusions & Perspectives C / Perturbations biotiques sur le biofilm Contexte Travaux de Thèse

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20 25 30 35De

nsi

té d

e c

ou

ran

t J

(A/m

²)

temps (j)

RBC-1

RBC-2

RBC-3

RBC-4

Acétate

Ajout de Biomasse

Retrait électrodes (biofilm)


35gNaCl/L

Biomasse

exogène

CE (%)

Jmax (A/m²) Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3

Témoin CE 108% 88% 101%

Jmax 9,3±0,1 9,4±0,5 9,2±0,6

pH6 CE 123% 93% 108%

Jmax 9,8±1,0 9,4±1,2 5,7±0,1

pH7 CE 154% 168% 156%

Jmax 7,7±0,2 10,8±1,3 4,1

pH8 CE 105% 132% 105%

Jmax 9,6±0,8 8,4±0,9 5,4±0,5


43

Impact sur l’électroactivité

• Diminution de jmax

• Épaississement du biofilm

Changement de communautés microbiennes ?

C / Perturbations biotiques sur le biofilm

44 pH8

Témoin


Burmolle et al., 2006

Freguia et al., 2007

C / Perturbations biotiques sur le biofilm

Quantités de bactéries équivalentes (qPCR) Épaississement du biofilm par Exopolymères (EPS) Transfert de substrat ralenti dans le biofilm Diminution de jmax

Communautés microbiennes

45

Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives Conclusions intermédiaires Contexte



milieu salin à pH8




en MEC





G. subterraneus



Couplage avec biomasse exogène issue de fermentation saline =>

Pas de contamination/production d’EPS


- pH 8 - pH 6 B2

Nature et adaptation de l’inoculum


- pH 8 - pH 6




46





en MEC



milieu salin à pH8





G. subterraneus





Conclusions intermédiaires


- pH8 - pH6 B2

Nature et adaptation de l’inoculum




47

CONCLUSION GENERALE Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives Contexte


G. subterraneus & D. acetoxidans


milieu salin à pH8


Construction du biofilm en culture

pure => dominance de G. subterraneus





A partir d’un même inoculum de départ & en condition saline

Communautés microbiennes différentes

Activités différentes




milieu salin à pH8








48

PERSPECTIVES Travaux de Thèse Conclusions & Perspectives Contexte

• Interactions entre G. subterraneus & D. acetoxidans ?

100/0 80/20 50/50 20/80 0/100




milieu salin à pH8








49



• Pré-acclimatation sur Fe(III) avec d’autres inocula

100/0 80/20 50/50 20/80 0/100




milieu salin à pH8








50




• Action des paramètres biotiques et abiotiques sur les communautés microbiennes en réacteur continu

100/0 80/20 50/50 20/80 0/100




milieu salin à pH8








51




• Action des paramètres biotiques et abiotiques sur les communautés microbiennes en réacteur continu

• Orientation de la fermentation vers la production d’acétate

100/0 80/20 50/50 20/80 0/100

2 CH3COOH

52

Nicolas BERNET, Eric TRABLY &

Jury : E.LOJOU, P. FONTANILLE, C. GHOMMIDH, B.ERABLE, L PREZIOSZI-BELLOY

& • Comité de thèse : A. BERGEL, T. BOUCHEZ • L’équipe défi H12 / ANR • Jean-Jacques GODON • Alessandro CARMONA, • Caroline RIVALLAND (Stagiaire Master 2) • Anaïs BONNAFOUS

& • le LBE • ma famille, mes amis

53

Merci de votre attention

Melanie Pierra PhD defense : Coupling dark fermentation and microbial electrolysis for hydrogen production : formation and conservation of electroctive biofilm.

Environment

fermentation et

guo et

rozendal et

hallembeck et benemann

s4la fermentationhawkes

agvb2nature et adaptation

formation et maintenance

o22 h2oliu et