Meditsiiniline Keemia Analüütiline keemia, Instrumentaalanalüüs

Meditsiiniline Keemia

Analüütiline keemia, Instrumentaalanalüüs

Elektroforees ja massispektromeetria

8. Detsember 2008

Eva-Ingrid Rõõm

2

Elektroforees (EP)• Forees tuleneb kreeka verbist phorēsis <

phorein, mis tähendab (pidevalt, jätkuvalt) tassima, kandma.

• Seega elektroforees on lihtsustatult “elektri poolt kandmine”.

• Elektroforees eraldab aineid nende liikumiskiiruse järgi elektriväljas.

• Lahutatavad ained peavad esinema ioonidena.

• Ioone liigutatakse vastavalt vastasmärgiliste laengute tõmbumise põhimõttele.

3

Elektroforees (EP)• Iooni liikumiskiirus elektriväljas :

= eE = eV/Le – elektroforeetiline liikuvus, ainele iseloomulik

suurus, mille absoluutväärtus kasvab proportsionaalselt osakese summaarse laenguga z ja kahaneb proportsiaonaalselt osakesele keskkonna poolt avaladatava takistusega (tugevalt sõltuvuses osakese suurusest ja massist m). Summaarselt negatiivse laenguga ioonide korral on väärtus negatiivne.

E – elektrivälja tugevusV - elektrivälja potentsiaal, elektroodide vaheline

potentsiaal (V, voltides)L – elektroodide vaheline kaugus

4

Elektroosmoos• Vedeliku liikumist elektriväljas nimetatakse

elektroosmootseks voolamiseks. Liikumiskiirus: = eoE

eo – elektroosmootne liikuvus, sõltub selles sisalduvate ioonide suunatud liikumisest ühelt elektroodilt teiseni ja ka EP anuma kujust. Mõjutama hakkab EO tulemusi kapillaar-elektroforeesis.

E – elektrivälja tugevus• Seega summaarne iooni liikumiskiirus elektriväljas

ja LAHUSES: = (eo + e)E

• Negatiivselt laetud iooni korral on e negatiivse väärtusega.

• Seega võib iooni summaarne liikumine toimuda nii katoodi kui anoodi suunas.

5

Elektroforeesi liigid• Elektroforees jaotatakse

– Planaarseks elektroforeesiks (Slab electrophpresis, SEP)

– Kapillaarelektroforeesiks (Capillary electrphoresis, CEP)

• Planaarelektroforeesi läbiviimiseks kasutatakse peamiselt õhukesi geelikihte, kuid mõnikord ka paberit.

• Kapillaarelektroforeesi korral kasutatakse ülipeeneid (läbimõõt m-tes), vajaliku täidisega torusid, mida nimetatakse kapillaarideks.

6

Planaarelektroforees

• Peale proovi lahutamist saab proovi ilmutada tindiga või vaadata eeltöödeldud proovi UV-lambi abil

• Harilikult võrreldakse proovi teadaolevate näidistega või uuritakse andmebaase

• Proovi saab vajadusel välja lõigata ja edasi uurida/töödelda

• PE plaat võib olla asetatud nii püsti kui pikali

• Plaadi vastasservad on ühendatud elektroodi-dega, mis tekitavad plaadis proovi lahuta-miseks vajaliku elektrivälja

• Plaadi ühe elektroodi (harilikult katoodi) poolses otsas on proovi-lahuse jaoks süvikud

• Peale proovi sisestamist lülitatakse sisse alalisvool ja proov lahutub vastavalt selle komponentide liikumiskiirusele

7

Kapillaarelektroforees• Kapilaarkolonn on

mõlemat otsa pidi puhveralhustes, mis sisaldavad ka elektroode

• Ühest ostast sisestatakse proovilahus kas rõhu muutuse abil või elektivälja toimel

• Proov lahutatakse kapillaris vastavalt komponentide liikumiskiirusele elektriväljas

• Kapillari väljundotsa lähedale on paigal-datud detektor, mis mõõdab kapillari läbivad ained

• Tulemusena saadakse elektrofero-gramm, milles iga piigi pindala on võrdeline antud aine kogusega proovis

+ + -Kõrgepinge allikas

Lähteanum puhverlahusega

Proovilahus

Kogumisanum puhverlahusega

KapillaarDetektor

aeg

8

Elektroforeesi meetodid• Erinevate lahutusmeetodite järgi

jaotatakse elektroforees– Tsoonelektroforees (ZE)– Geelelektroforees (GE)– Isoelektriline fokusseerimine (IEP)– Isotahhoforees (ITP)

• Kõiki meetodeid on võimalik kasutada nii SEP kui CEP korral.

9

Tsoonelektroforees (ZE)

• Antud meetodi korral on puhverlahuse koostis kogu lahutusalas ühesugune

• Jaotumine toimub nii EP kui EO tulemusel• Meetod on eelkõige sobilik väiksemate

ioonide lahutamiseks: atomaarsed ioonid (Cl-, Mg+), väiksemad anorgaanilised (NO3

-, NH4+) ja orgaanilised (suhkrud,

aminohapped) molekulaarioonid.

+-Katood AnoodA- B- C-

Puhver

10

Isotahhoforees (ITP)

• Antud meetodis valitakse kaks erinevat puhver-lahust nii, et lähtepuhverlahuse ioonide liikuvus oleks väiksem kui lõpp-puhverlahuse ioonide liikuvus ning kõigi uuritavas aines sisalduvate ioonide liikuvuste väärtused on nende kahe vahel.

• Rakendades elektrivälja hakkavad kõik ioonid liikuma vastavalt nende liikumiskiirusele ( = eoE).

• Lahuses tekkiva potentsiaalivälja tõttu järjestuvad selles olevad ioonid vastavalt nende liikuvustele.

• Peale järjestumist on kõigi ainete liikumiskiirus antud meedodi korral sama.

+-Katood AnoodA- B- C-

Madala liikuvusega puhver

Kõrge liikuvusega puhver

11

Isoelektriline fokusseerimine (IEF)

• Antud meetodi korral koosneb lähtepuhverlahus lahustist ja erinevatest ainetest – amfolüütidest – millel on nii katioonsed kui anioonsed omadused.

• Ka proovid on amfolüüdid, tavaliselt valgud või DNA, RNA

• Elektrivälja mõjul tekib puhverlahusest erinevate pH väärtustega gradient

• Proovi komponendid liiguvad sellise pH juurde, kus nende summarne ioonne laeng on neutraalne (oma pI ehk isoelektrilise punkti pH väärtuse juurde)

+-Katood AnoodA- B- C-OH- H+

Madal pH Kõrge pHPidev pH gradient

12

Geelelektroforees (GE)• Antud meetodi korral on lahutuskeskkonnaks geel • Geeli poorse struktuuri moodustavad polümeersed

ühendid (näiteks polüakrüülamiid või agaroos).• Poorimaatriksis olevas puhverlahuses toimub EF.• Antud meetodi korral on ainete lahutamise peamiseks

mõjutajaks nende massi ja laengu suhe m/z, kuna peamine takistus liikumisel on poorimaatriks.

• Kui ainele ja puhvrile lisatakse SDSi (naatrium-dodetsüülsulfaati) muudab see ainete laengu korreleeruvaks nende suurusega ja denatureerib uuritava aine. Tulemuseks on otseselt massist sõltuv ainete järjestumine elektroforeesi tulemu-sena. SDS PAGE on kõige laiemalt bioloogiliste proovide jaoks kasutatav EF meetod.

13

GE ja IEF• Bioloogiliste proovide

korral kasutataakse SDS PAGE tihti koos järgneva või eelenva IEFga (mis on samuti geelis läbi viidud).

• Esimese mõõtmise tulemusel geelis tekkinud aineterida asetatakse teise geeliplaadi algusesse esialgse lahutusega ristiolevas suunas

• Sellisel juhul saadakse lahutus nii ainete massi kui pI järgi.

pI

M

1. IEF

2. GE

14

Detektorid• Planaarse elektroforeesi korral tavaliselt

proov ilmutatakse erinevate tintidega või markeeritakse (eelenevalt) fluorestseeruvate markeritega UV-lambi all vaatamiseks

• Teiste võimalustena on kasutusel– Spektroskoopilised meetodid– Massispektromeetria– Elektrokeemilised meetodid– Radiomeetria

• Määramispiirid on väga madalad: määratav kogus on vahemikus 10-13...10-20 mooli.

15

Kasutusvaldkonnad• Tänapäeval on elektroforees väga levinud

just suuremate proovimolekulide analüüsimeetodina bioloogias, meditsiinis ja farmakoloogias.

• Tüüpiline on valkude ja DNA ning RNA analüüs.

• Eelkõige on kasutusel planaarne GE (eriti SDS PAGE) ja (geel)ITP kombineerituna erinevate eel- ja järeltöötlustega ning omavahel.

• EP abil saab eristada ka näiteks omavahel ainult ühe aminohappe või nukleotiidi võrra erinevaid valke või polünukleotiide

16

Massispektromeetria (MS)• Ainete määramine nende molekulidest tekitatud

ioonide m/z väärtuste abil• m – iooni mass• z – iooni laeng• Spektromeetria on tulnud sõnadest specere (L) –

vaatama, nägema ja metrum (L), metron (K) – mõõtma. Algselt mõeldi sp. all nähtava valguse spektri mõõtmist. Tänapäeval on spektromeetria mõiste laienenud kogu elektromagnetlainete skaala ulatusele ning hõlmab endas ka teisi skaalasid, nagu näiteks helilained ja massi-laengu suhed.

17

Massispektromeetria lihtsustatud põhimõte

• Analüüsimeetod, mille puhul:– Uuritavad molekulid (molekulmassiga M) aurustatakse– Need molekulid/aatomid ioniseeritakse– Tekivad ioonid M+, MH+ vms (molekulaarioonid)– Tekkinud ioonid on tihti kõrge energiaga ning

fragmenteeruvad osaliselt, tekivad mitmesugused väiksema massiga ioonid (ja neutraalsed fragmendid)

– Kõik ioonid suunatakse massianalüsaatorisse, mis registreerib nende masside ja laengute suhted m/z

• Massispektromeeter registreerib ainult laetud osakesi.

18

MassispektromeeterProovisisestussüsteem

Ionisatsiooniallikas

Massianalüsaator(id)

Detektor

Massispekter

Ioonid

Ioonid

Vaakum

• Massispektromeetria etapid:

1. Gaasifaasiliste ioonide genereerimine ja nende kiirendamine elektriväljas.

2. Ioonide eraldamine nende massi ja laengu suhte alusel elektri- ja/või magnetväljas.

3. Kindla massi ja laengu suhtega ioonide detekteerimine seadmega, mis on võimeline registreerima selleni jõudnud osakeste arvu.

• Tulemus: massispekter.

19

Ioonide tekitamine• Gaasifaasist

– EI (electron ionization) – levinuim gaasikromatograafi MS detektorite (GC-MS) korral.

– CI (chemical ionization)• Vedelast faasist

– ESI (electrospray ionization) – levinuim vedelikkromatograafi MS detektorite (LC-MS) korral.

– APCI (atmospheric pressure chemical ionization)• Tahkest faasist

– MALDI (matrix assisted laser desorption/ionization) – põhiliselt biokeemia rakendustes.

20

Elektronionisatsioon• Kõige levinum ioonide tekitamise meetod on

elektronionisatsioon (EI), mille puhul uuritavaid molekule pommitatakse elektronidega. – Elektronid “löövad molekulist välja” ühe elektroni ja

seeläbi omandab molekul positiivse laengu.M + e– M•+ + 2e–

– Tekkinud radikaaliooni nimetatakse molekulaariooniks.• Osakese liigse energia või ebapüsivuse tõttu võib

see laguneda – fragmenteeruda:M•+ E+ + R• M•+ O•+ + N

21

Elektropihustus-ionisatsioon (ESI)• Ioonid tekivad vahetult

lahuses elektrivälja toimel ja “aurustuvad” sealt välja– Enamasti protoneerumine:

M + H+ MH+

– Aurustumine tagatakse lahuse pihustamisega peeneteks tilkadeks

– Ioonid juhitakse massi-spektromeetri sisendisse elektrivälja abil

– ESI-MS on levinud detektor LC jaoks

HPLC sisend

Pihusti

Jäägid

kuum N2

Pihustus-gaas N2

+++

++

+ + + ++ + + +++ Massi-spektro-

meetrisse

Pinge ~3500V

22

EI massispekter

Molekulaarioon

ESI Massispekter• Ionisatsioon on

väga pehme – ei tekita fragmente.

• Iseloomulik on lisandioonide ja mitmelaenguliste ioonide teke.

• Ionisatsioon tekitab fragmente.

• Iseloomulik on ühelaenguliste ioonide teke.

23

MALDI• Matrix-assisted laser desorption/ionization.• Analüüsitav proov segatakse maatriksiga ja

aurutatakse kuivaks.• Kui sellisele proovile suunata laserkiir

(Nd:YAG), siis maatriks aurustub koos analüüdiga. Tekivad analüüdi ioonid.

• Maatriks peab neelama (elektromagnetkiirgust) kasutatava laseri sagedusel ja analüüt ei tohi sellel sagedusel kiirgust neelata.

• Väga pehme – väga vähe fragmente.• Põhiliselt annab ühelaengulisi ioone.

24

MALDI

EI, ESI ja MALDI

Iooniline

Molekul-mass

Polaarsus102

103

104

105

106

Apolaarne PolaarneKeskm. polaarne

EI

ESI

25

Massianalüsaatorid• Kõik massianalüsaatorid lahutavad ioone kas elektrivälja

ja/või magnetvälja mõjul muutes nende liikumise suunda (ja kiirust).

• Ioone liigutatakse vastavalt – vastasmärgiliste laengute tõmbumise põhimõttele – liikuvale laetud osakesele mõjuva magnetvälja toimele

• Mida väiksem on iooni mass, seda suurem on sama tugevusega välja mõju antud iooni kiirusele sama laengu korral.

• Kindla elektri- ja/või magnetvälja tugevuse korral jõuavad detektorisse ainult kindla m/z-ga ioonid (v.a. TOF).

• Kõik massianalüsaatorid töötavad sügava vaakumi tingimustes (10-6...-7 atm).

26

Massianalüsaatorid• Magnetiline ja elektrostaatiline sektor

– Enamasti mõlemad koos – topeltfokusseeriv MS– Klassikaline MS, põhimõtted küllalt lihtsad.– Kõrge lahutusvõimega.

• Kvadrupool ja ioonlõks– Kasutatakse kromatograafias detektoritena.

• Lennuaja (TOF) MS ja Orbitrap– Põhiliselt proteoomika rakendused.

• Ioontsüklotronresonants-MS– Kõige kõrgema lahutusvõimega.

27

Massianalüsaatorid• Lennuaja MS (time-of-flight, TOF)

Detektor

Signaal

1 Proov ioniseeritakse, saadakse M+ ioonid

Anood,U = 0 V

Katood,U = 1...10 kV

2 Proovi kiirendatakse elektrivälja impulsi abil

3 proov lahutub saadud kiirenduse mõjul vastavalt m/z suhtele: mida väiksem mass, seeda suurem on saavutatud kiirus (antud laengu korral)

4 Ühesuguse massiga ioonid jõuavad detektorini üheaegselt ja nende hulk on vastavuses mõõdetava signaali intensiivusega

Lahutusala

MALDI-TOF on kõige levinum MS meetod bioloogiliste proovide uurimisel

28

MS: Võtmeaspektid• Meetodi avastamispiir on väga madal• Selektiivsus: erinev kõrge lahutusega (HR) ja

madala lahutusega (LR) MS korral• LR-MS

– sama nominaalse m/z väärtusega ioonide jooned on täielikult kattunud

– Seetõttu on LR massispektromeetria enamasti kasutusel nii, et segudest on puhtad ained eelnevalt eraldatud: enamasti gaasikromatograafiliselt või vedelik-kromatograafiliselt

• HR-MS– Sama nominaalse m/z väärtusega ioonide jooned on

eristatavad

29

HR Massispekter• Kõigi spektrilõigul nähtavate ioonide

nominaalne m/z on 279!

30

Brutovalem täpsest massist• Kui massispektromeeter on piisavalt suure

lahutusega, siis võib täpne m/z anda peaaegu ühese brutovalemi.

• Näide: nominaalsele massile 60 vastavad järgmised brutovalemid: C2H4O2, CH4N2O, C3H8O, C2H8N2. Kui oleks teada täpne mass 60.02, siis sellele vastab C2H4O2

• NB! Aine ei pruugi olla identifitseeritud isegi kui brutovalem on üheselt teada! Samale brutovalemile võib vastata palju ühendeid.

31

Võtmeaspektid• Massispektri annavad põhimõtteliselt kõik ained• Puhaste ainete massispektrid on sageli

küllaltki karakteristlikud ja sobivad seetõttu hästi ainete identifitseerimiseks– Ainete massispektritest on koostatud suuri

andmebaase, mis on lisatud analüüsiaparaatide tarkvarale, ning millest tarkvara abil saab tundmatuid aineid otsida

– Mõned ained siiski ei anna (elektron-ionisatsiooniga) karakteristlikke massispektreid, kuna fragmenteeruvad väga ulatuslikult

32

Võtmeaspektid

• Meetodi puudused:– Aparatuur on kallis– Aparatuur on õrn ja kapriisne, oskamatul

käsitsemisel võib kergesti rikki minna– Aparatuur vajab asjatundlikku hooldust

33

Massispektromeeter kromatograafias• Detektorina kromatograafilises süsteemis

omab massispektromeeter eeliseid:– Kvalitatiivne info

• identifitseerimine (andmebaasid)• kinnitus, et piik kuulub analüüdile

– Kvantitatiivne• analüüs ainult ühe kindla massi alusel (SIC, EIC)

• Selektiivne detektor – võimaldab analüüsi teostada ka siis kui ainete piigid on kromatograafiliselt lahutumata.– Mass-kromatogramm sisaldab kolmemõõtmelist

informatsiooni: aeg, m/z ja intensiivsus.

34

Massispektromeeter kromatograafias• GC-MS – gaasikromatograafia detektorina on

massispektromeeter juba ammu rutiinkasutuses.– Kandegaasi hulk on väike, kuna kasutatakse

kapillaarkolonne.• LC-MS – uus meetod.

– Analüüsitavate ainete eraldamine eluendist on probleem, sest vedel keskkond ei sobi vaakumisse

– Liides (ESI, APCI), mis tagab analüüdi jõudmise massispektromeetrisse ilma eluendita, on jõudnud piisavale tehnilisele tasemele alles viimase 15 aasta jooksul.

35

Kirjandus• PRINCIPLES OF INSTRUMENTAL

ANALYSISSkoog D.A., Leary J.J. Fourth edition, Saunders

College 1992Skoog D.A., Holler F.J., Nieman T.A. Fifth edition,

Harcourt Brace 1998 • PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY

Lehinger A.L., Nelson D.L., Cox M.M. Second edition, Worth Publishers 1993

• Analüütilise keemia loengumaterjalid:http://tera.chem.ut.ee/~ivo/ak1/ak1_ms.pdfhttp://tera.chem.ut.ee/~ivo/ak2/ak2_ms.pdf