Dirección: Dirección: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293 Contacto: Contacto: [email protected]Tesis Doctoral Mecanismos de inmunorregulación Mecanismos de inmunorregulación en la esquistosomiasis murina en la esquistosomiasis murina Rutitzky, Laura I. 2004 Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias Biológicas de la Universidad de Buenos Aires Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the Master's and Doctoral Theses Collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Cita tipo APA: Rutitzky, Laura I.. (2004). Mecanismos de inmunorregulación en la esquistosomiasis murina. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3705_Rutitzky Cita tipo Chicago: Rutitzky, Laura I.. "Mecanismos de inmunorregulación en la esquistosomiasis murina". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2004. http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3705_Rutitzky
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Mecanismos de inmunorregulación en la esquistosomiasis murina · Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser acompañada por
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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Mecanismos de inmunorregulaciónMecanismos de inmunorregulaciónen la esquistosomiasis murinaen la esquistosomiasis murina
Rutitzky, Laura I.
2004
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the Master's and Doctoral Theses Collection of the Central LibraryDr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied bythe corresponding citation acknowledging the source.
Cita tipo APA:
Rutitzky, Laura I.. (2004). Mecanismos de inmunorregulación en la esquistosomiasis murina.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3705_Rutitzky
Cita tipo Chicago:
Rutitzky, Laura I.. "Mecanismos de inmunorregulación en la esquistosomiasis murina". Tesisde Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2004.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3705_Rutitzky
Universidad de Buenos AiresFacultad de Ciencias Exactas y Naturales
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“Mecanismos de inmunorregulación en laesquistosomiasis murina”
Autor: Lic. Laura I. Rutitzky
Director: Dr. Miguel J. Stadecker
m37o5vLugar de Trabajo:
Departamento de Patología, Tufts University School of Medicine, Boston,Massachusetts, Estados Unidos.
-2004
0 O O D 0‘
A mi mamá Elsa, a mis hermanas Mariana y Nora y a mi papáBernardo (1938-1980).
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer principalmente al Dr. Miguel J. Stadecker por haberme dado laoportunidad de realizar esta tesis en su laboratorio y por haberme guiado y brindado suexperiencia a lo largo de estos casi seis años de trabajo en conjunto. También le quieroagradecer el excelente trato personal que tuvo conmigo que me ayudó a hacer este trabajoen EEUU. lejos de mi familia y de muchos de mis amigos.
A mis hermanas y mamá por haberme ayudado con las averiguaciones y los trámites y porsu apoyo en general para que yo pueda hacer este doctorado a la distancia.
A las Dras. Marta Finiasz y Susana Fink por haberme introducido en el mundo de lainmunología, por haber estado siempre cerca mío y por ayudarme con la escritura encastellano de esta tesis.
A los Dres. María Marta de Elizalde de Bracco y Martín Isturiz por los encuentros que mededicaron en cada una de mis visitas a Buenos Aires para darme sus consejos acerca de miproyecto de tesis.
A mis compañeros de laboratorio, los que están y los que ya se fueron: Héctor, I-Iiroko,Samantha, Gerardo, Eduardo, Jennifer, Jing y Jessica por su buena predisposición enayudarme con los gigantescos experimentos, por enseñarme muchas de las técnicas queutilicé para la tesis o simplemente por compartir el espacio y el trabajo de cada dia.
A Allen Parmelee por haberme enseñado a usar el citómetro de flujo, por su paciencia enresolver mis mil y una dificultades con ese aparato y las computadoras y por habermehecho el sorting de las células no apoptóticas.
A Archie Artz y a Ana Bonadio por facilitarme muchas de las dificultades que traía ladistancia.
A mis muy queridas amigas biólogas Paula, Alina, Cecilia, Valeria, Ana y Bárbara.
A Paula, otra vez, por su compañia, por su espíritu alentador y por la enorme ayuda en lacompaginación de esta tesis.
A mis otros muy queridos amigos Macario e Isabel que me acompañaron bien de cerca entodo lo que fue este proceso de vivir y hacer la tesis en EEUU.
Y por último, agradezco a los ratones BL/6 y CBA su participación protagónica en estatesis, sin la cual no hubiera podido hacer ni uno de los experimentos.
ÍNDICE
Resumen l
Summary 2
Publicaciones 3
Abreviaturas 4
CAPÍTULO l Introducción General
Epidemiología 5
Antecedentes históricos 7
El parásito que causa la esquistosomiasis 7
El ciclo de vida del esquistosoma 7
La enfermedad esquistosomiasis 9
El modelo murino de esquistosomiasis ll
El papel de los huevos del parásito 12
La respuesta inmune asociada con la esquistosomiasis 14Granulomas 18
Citoquinas 19
Apoptosis 20
Coestimulación 22
Tratamiento, control y desarrollo de una vacuna 23
Objetivos 26
Materiales y Métodos 27
CAPÍTULO ll Efecto de la inmunización de ratones BL/6 con SEA/CFA en el
desarrollo de la inmunopatología asociada con la esquistosomiasis.
Introducción 34
Resultados 36
Discusión 45
CAPÍTULO Ill Papel de la apoptosis de los linfocitos T CD4+de los granulomashepáticos en las cepas de ratones que desarrollan alta y bajapatología en esquistosomiasis.
Introducción
Resultados
Discusión
49
50
62
CAPÍTULO IV Efecto del bloqueo del mecanismo de coestimulaciónICOS-B7RP-l en el desarrollo de la inmunopatología asociadacon la esquistosomiasis
Introducción 66
Resultados 67
Discusión 73
DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES 76
BIBLIOGRAFÍA 83
RESUMEN
La esquistosomiasis continúa siendo una de las enfermedades parasitarias con mayorprevalencia en el mundo. En la esquistosomiasis causada por S. mansoni, los huevos de los gusanoshelmintos desencadenan un proceso de inflamación ganulomatosa hepática con desarrollo de fibrosisque esta mediado por linfocitos T CD4+ específicos para los antígenos del huevo (SEA). En elmodelo murino de la enfermedad, los ratones de la cepa CBA desarrollan alta patología caracterizadapor granulomas grandes y una pronunciada respuesta de linfocitos T hacia el SEA, mientras que losratones de la cepa BL/6 desarrollan baja patología con granulomas de tamaño significativamentemenor y una respuesta más atenuada de linfocitos T. En la fase aguda de la enfermedad en ambascepas se desarrolla una respuesta de citoquinas del tipo Thl. Sin embargo, en el transcurso de la fasecrónica se observa una respuesta combinada de citoquinas Thl/Th2 en los ratones de la cepa CBA,mientras que en los ratones de la cepa BL/6 la respuesta de citoquinas se polariza hacia una del tipo
Los experimentos que se describen a continuación se realizaron con el fin de investigarcómo el ambiente de citoquinas, la apoptosis de los linfocitos T CD4+ y los mecanismos decoestimulación influyen el desarrollo de la inmunopatologia inducida por los huevos en el modelomurino de la infección con esquistosoma y sus consecuencias en la enfermedad.
l. Se usó un modelo artificial de alta patología producido por la inmunización de ratonesBL/6 con SEA en adyuvante completo de Freund (CFA) para estudiar el papel de las respuestas decitoquinas del tipo Thl vs. Th2 en el desarrollo de la inmunopatologia. Los resultados mostraron quela inmunización con SEA/CFA indujo un cambio en la producción de citoquinas hacia un perfil Thlpor una población numéricamente estable de linfocitos T CD4' específicos para el SEA que secorrelacionó con una cxacerbación grave de la inmunopatologia y con la muerte prematura de losratones.
2. Se estudiaron el papel de la apoptosis de linfocitos T CD4" en el desarrollo de lainmunopatologia y el posible mecanismo inductor de este tipo de muerte celular comparando variosparámetros inmunológicos relacionados con los linfocitos T CD4+ entre las dos cepas de ratonespolares, CBA y BL/6. Los resultados demostraron que la apoptosis de linfocitos T CD4‘ de losgranulomas y de los ganglios linfáticos mesentéricos (GLM) fue más elevada en la cepa de bajapatología BL/6 que en la cepa de alta patología CBA como consecuencia de la falta de producción dela IL-2. El tratamiento in vivo de los ratones BL/6 con lL-2 recombinante resultó en un aumento dela patología hepática y una disminución de la apoptosis de linfocitos T CD4".
3. Finalmente, se examinó el papel del mecanismo ICOS-B7RP-l (coestimulador inducibleproteína-l relacionada a B7) en el desarrollo de la inmunopatologia por medio del tratamiento deratones BL/6 infectados con un anticuerpo monoclonal (AcMo) que bloquea a ICOS. Los resultadosmostraron que el sistema de coestimulación ICOS-B7RP-l ayuda principalmente a controlar laproducción de IFN-y por linfocitos T específicos para el SEA y así promover un ambiente decitoquinas Th2 que lleva a limitar el daño hepático en la cepa de baja patología BL/6.
Estos hallazgos contribuyen a nuestro conocimiento de los mecanismos que regulan larespuesta inmune en la esquistosomiasis murina. Ellos proveen nuevas evidencias de cómo loslinfocitos T CD4’ regulan Ia inmunopatologia, confirmando que el establecimiento de un ambientede citoquinas del tipo Th2 se correlaciona con la protección hacia esta infección por helmintos y quela apoptosis es un mecanismo para controlar los linfocitos T CD4" que median la inmunopatologia.Los resultados presentados en esta tesis podrían ser utilizados para diseñar c implementar estrategiasque resulten en un mejoramiento general de la inmunopatologia asociada con la enfermedad.
SUMMARY
Schistosomiasis continues to be one of the most prevalent parasitie infections in the world.In schistosomiasis mansoni, helminth parasite eggs preeipitate an intrahepatic granulomatous andfibrosing inflammatory process, which is mediated by, and dependent on, MHC class lI-restrictedCD4+ T helper lymphoeytes specific for schistosome egg antigens (SEA). ln the mouse model of thedisease, CBA mice develop high pathology characterized by large granulomas and strong eggantigen-speeifie T cell responses whereas C57BL/6 (BL/6) mice develop low pathology withsignificantly smaller granulomas and a more attenuated T cell response to the SEA. While in theacute phase of the disease both strains develop a Thl type cytokine response, during the chronicphase CBA miee exhibit a Thl/Th2 type response whereas BL/6 mice bias their cytokine response toa Th2 phenotype.
The following experiments were undertaken to further investigate how the prevailingcytokine environment, CD4+ T cell apoptosis and T cell costimulatory pathways influence thedevelopment of the egg-indueed immunopathology in the experimental murine schistosome infectionand the outcome of the disease:
l. An artificial model of high pathology by immunization of BL/ó mice with SEA incomplete Freund’s adjuvant (CFA) was used to study the role of Thl vs. Th2 cytokine responses inthe development of egg-induced immunopathology. The results showed that the immunization withSEA/CFA induced a Thl shift in the cytokine production by a numerically stable population of SEAspecifie CD4+ T cells that correlated with a severe exaeerbation of the immunopathology and deathof these otherwise low pathology mice.
2. The role of CD4+ T cell apoptosis in the egg-induced immunopathology, and the possibleunderlying mechanisms that account for this type of cell death, were studied by comparing severalimmune parameters related to CD4" T cells between the two polar strains of mice, CBA and BL/6.The results demonstrated that CD4+ T cell apoptosis of granuloma and mesenteric lymph node cellswas higher in the low pathology BL/6 strain than in the high pathology CBA strain as a result of lL-2deprivation. The in vivo treatment of BL/6 mice with recombinant lL-2 resulted in increased hepaticpathology and decreased CD4‘ T cell apoptosis.
3. Finally, the role of the lCOS-B7RP-l (inducible costimulatory molecule-B7-relatedprotein-l) costimulatory pathway on the development of egg-induced immunopathology wasexamined by treating infected BL/6 mice with a blocking mAb against lCOS. The results showedthat the ICOS-B7RP-l costimulatory pathway servcs primarily to control lFN-y production by SEAspecific T lymphocytes, thereby promoting a Th2 cytokine environment conducive to limited hepaticdamage in the low pathology BL/6 strain.
These findings contribute to our knowledge on the mechanisms that regulate the immuneresponse in murine schistosomiasis. They provide new insights on how CD4‘ T lymphoeytesregulate immunopathology; confirm that the establishment of a Th2 cytokine environment eorrelateswith host protection in this helminth infection and demonstrate that apoptosis represents a significantmeans of controlling the CD4‘ T cells that mediate the immunopathology. The results presented inthis thesis may serve to devise and implement strategies for amelioration of the immunopathology inthis disease.
PUBLICACIONES
Relacionadas con esta tesis:
- Apoptosís by neglect of CD4+ Th cells in granulomas: a novel effector mechanism
involved in the control of egg-induced immunopathology in murine schistosomiasis.
Rutitzky LI, Mirkin GA, Stadecker MJ. J. Immunol. 2003 Aug. 15; l7l(4):1859-67.
- Disruption of the ICOS-B7RP-l costimulatory pathway leads to enhanced hepatic
immunopathology and increased gamma interferon production by CD4 T cells in murine
schistosomiasis. Rutitzky LI, Ozkaynak E, Rottman JB, Stadecker MJ. Infect. Immun.
2003 Jul; 71(7):4040-4.
- Thl-polarizing immunization with egg antigens correlates with severe exacerbation of
immunopathology and death in schistosome infection. Rutitzky LI, Hernandez HJ,
Stadecker MJ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001 Nov 6; 98(23):l3243-8. Epub 2001 Oct
23.
No relacionadas con esta tesis:
Genetic analysis of the immunopathology in murine shcistosomiasis. Rutitzky LI,
Hernandez HJ, Yím YS, Ricklan DE, Finger E, Mohan C, Wakeland K, Stadecker MJ. J.
Immunol. 2004 (aceptado, en revisión).
- IL-lO is crucial for the transition from acute to chronic disease state during infection of
mice with Schistosoma mansoni. Sadler CH, Rutitzky LI, Stadecker MJ, Wilson RA.
Eur. J. Immunol. 2003 Apr; 33(4):880-8.
- Diminished immunopathology in Schistosoma mansoni infection following intranasal
administration of cholera toxin B-immunodominant peptide conjugate correlates with
enhanced transforrning growth factor-beta production by CD4 T cells. Hernandez HJ,
Rutitzky LI, Lebens M, Holmgren J, Stadecker MJ. Parasite Immunol. 2002 Aug;
24(8):423-7.
AcMo
BSA
CFA
CG
CGLM
CPA
CPM
i.v.
kb
kDa
KO
NaN;
PBS
s.c.
SEA
T. amb.
Th
WT
ABREVIATURAS
anticuerpo monoclonal
seroalbúmina bovina
adyuvante completo de Freund
células de granuloma
células de ganglio linfático mesentérico
célula presentadora de antígeno
cuentas por minuto
desvío estándar
enzyme-linked immuno sorbent assay
error estándar
ganglio linfático mesentérico
interferón gama
inmunoglobulina
interleuquina
intraperitoneal
intravenoso
kilobase
kilodalton
knock out
azida sódica
solución salina tarnponada con fosfato
subcutáneo
antígenos solubles del huevo
temperatura ambiente
T helper
factor de necrosis tumoral
wild type
CAPÍTULO I
Introducción General
Laura I. Rutitzkv Capítulo l
INTRODUCCIÓN GENERAL
EPIDEMIOLOGÍA:
La esquístosomiasis o bilharziasis en una enfermedad parasitaria crónica causada por
helmintos trematodos del género Schistosoma. Cinco de las especies de este género son
parásitos de humanos (S. mansoni, S. haematobium, S. japonicum, S. intercalatum y S.
mekongi) mientras que muchas otras afectan a distintos animales como aves y otros
mamíferos.
La esquístosomiasis es endémica en varios países tropicales y subtropicales de
África, América Central, América del Sur y Asia. Según el último censo de la Organización
Mundial de la Salud, afecta crónicamente a unas 200 millones de personas y se estima que
otras 650 millones están en peligro de contraer la infección (WHO 1993). Aproximadamente
la mitad de la morbilidad y de la mortalidad debida a la esquístosomiasis ocurre en África,
donde 100 millones de personas se encuentran infectadas, con una estimación de 280.000
muertes por año debido a infecciones con S. mansom' y S. haematobium (van der Werf,
Bosompem et al. 2003). La muerte se debe generalmente a complicaciones de un síndrome
de hipertensión portal con ascitis y hematemesis en el caso de infecciones intestinales por S.
mansom', y a cáncer de vejiga o a una deficiencia renal en el caso de infecciones del tracto
urinario por S. haematobium. Aunque la esquístosomiasis es prevenible y tratable, todavía
causa considerable morbilidad y mortalidad en regiones tropicales del mundo. A nivel
mundial, pocos individuos mueren por esquístosomiasis, comparativamente con otras
enfermedades, pero la enfermedad cobra una gran importancia ya que produce incapacidad
crónica (Bica, Harner et al. 2000; Pearce y MacDonald 2002).
Las malas condiciones sanitarias de los lugares donde la enfermedad es endémica
permite que los huevos excretados por las personas infectadas contaminen las aguas de
lagos, ríos, canales y arroyos donde habitan los caracoles hospedadores intermediarios. Los
avances en la agricultura y las represas, al mismo tiempo que incrementan la producción del
cultivo y el desarrollo del suministro del agua, también incrementan la exposición al agua
contaminada. Además, las fiJentes de agua estancada ofrecen un medio favorable para la
supervivencia de los caracoles hospedadores, un componente crítico para la diseminación
continua de la enfermedad.
Laura I. Rutitzkv Capitulo I
Los trabajadores adultos en áreas rurales, empleados en el comercio agrícola o de
pesca en agua dulce, están en un gran riesgo de contraer esquistosomiasis. Además, la
enfermedad afecta con mucha frecuencia a niños, causando deterioro en los patrones de
crecimiento y reduciendo su capacidad intelectual. Se reportó que en el Noreste de Brasil, la
capacidad de trabajo de la población rural se vio seriamente reducida debido a la debilidad y
letargo producidos por la enfermedad. Como muchos de los efectos adversos de la
esquistosomiasis aparecen varios años después de contraída la infección, la severidad de la
enfermedad puede no ser detectada y en muchos casos no se infiere una relación causal
hacia la misma.
Aproximadamente 75 países de áreas tropicales y subtropicales de África, Asia,
América del Sur y el Caribe tienen focos endémicos de esquistosomiasis (Figura 1). De las
diversas especies de esquistosoma las más importantes a nivel epidemiológico son: S.
mansoní (Arabia, África, América del Sur y Caribe), S. haematobíum (África y el Medio
Oriente) y S. japonicum (Japón, China y Filipinas) (Noble 1982; Smithers y Doenhoff
1982). Los países que no tienen esquistosomiasis, pero se encuentran cercanos a áreas
endémicas pueden tener focos endémicos menores no detectados (Butterworth, Dunne et al.
1996). Muchas de las especies de esquistosomas infectan a animales que sirven de
reservorios naturales y permiten que se mantenga una transmisión de la enfermedad en
forma constante (Mott, Nuttall et al. 1995).
FIGURA l: Distribución geográfica de la esquistosomiasis.
Laura l. Rutitzkv Capítulo l
ANTECEDENTES HISTÓRICOS:
La esquístosomiasis en una enfermedad ancestral cuyos primeros registros datan de
los egipcios, unos 4.000 años atrás (Smithers y Doenhoff 1982). Las pruebas de que la
esquístosomiasis existió en aquellos tiempos las otorgó Ruffer en 1910 quien identificó
huevos de esquistosomas en tejidos de momias que databan de entre 1.250-l.000 años AC
(Ruffer 1910). Más tarde, se observaron casos de infección con esquístosomiasis entre
miembros de la armada francesa instalada en Egipto entre 1799-1801 (Hoeppli 1973;
Adamson 1976; Cox 2002). Sin embargo, la primera identificación del parásito
esquistosoma en el hombre la hizo Theodor Bilharz en 1851, quien recuperó gusanos adultos
de las venas mesentéricas de un cadáver (Bilharz 1853; Cox 2002)
EL PARÁSITO QUE CAUSA LA ESQUISTOSOMIASIS:
Esquistosoma significa etimológicarnente “cuerpo hendido”. Son parásitos
pertenecientes al phylum Platíhelmintos, clase Trematode, orden Strigeatoida, familia
Schistosomatidae y género Schistosoma. Este mismo grupo monofilético incluye a otras
familias de gusanos parásitos encontrados en invertebrados inferiores.
EL CICLO DE VIDA DEL ESQUISTOSOMA:
Los gusanos del género Schistosoma se caracterizan por tener un ciclo de vida que
alterna entre formas de vida libre y formas parasitarias y entre un hospedador intermediario,
donde el parásito cumple con el ciclo de vida asexual, y un hospedador definitivo donde
cumple con el ciclo de vida sexual. Todos ellos tienen a un caracol de agua como
hospedador intermediario y a un vertebrado como hospedador definitivo.
La infección en humanos por S. mansoni se produce cuando las personas entran en
contacto con agua contaminada con las cercarias infectivas liberadas por los caracoles (paso
1, Figura 2). Las cercarias, con ayuda de su cola en forma de pinza y de la síntesis de
proteasas, penetran la piel (paso 2) (McKerrow, Pino-Heiss et al. 1985). Una vez dentro del
hospedador, pierden la cola y se transforman en esquistosómulas quienes están
especialmente adaptadas para vivir en el medioambiente salino del cuerpo humano (paso 3)
(Warren 1978). Al cabo de 2-3 días en la piel, las larvas entran en el torrente sanguíneo y
circulan hacia los pulmones donde sufren distintas transformaciones anatómicas, fisiológicas
Laura I. Rutitzkv Capítulo I
y bioquímicas que les facilitan la migración intravascular. Las larvas salen de los pulmones
y son transportadas por la sangre arterial hacia las venas mesentéricas donde se alojan y
maduran al estadío adulto; después de 4-6 semanas de producida la infección (pasos 4 y 5)
(Warren 1978; Boros 1986). Allí, las hembras y los machos se aparean y producen los
huevos que contienen al embrión llamado miracidio (paso 6). La hembra se ubica en la
hendidura del cuerpo del macho adulto, permaneciendo así durante el resto de sus vidas,
entre 5 y 10 años y produciendo alrededor de 300 huevos por día (Bica, Hamer et al. 2000).
Los huevos liberados por las hembras son transportados por la sangre y con ayuda de la
secreción de enzimas proteolíticas producidas por el miracidio y de los granulomas que
generan, atraviesan la pared de las venas, pasan a través de la lámina propia, el epitelio
intestinal y llegan hacia el lumen desde donde salen al exterior junto con las heces (paso 7)
(Von Lichtenberg, Smith et al. 1971; Pelley 1977).
FIGURA 2: Ciclo de vida del esquistosoma
o la cercanase Ilberadel caracol AI estadio infectlvo:m‘bgommi (estadiodevidalibre) Aon“ d d Midentrodelcaracol) A =“a b para ias" coM' ‘A/lyv
y luego de penetrar le piel la cercariaV Í v ' epierde lacola,convirtiéndoseen
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Si las heces que contienen los huevos llegan al agua, los huevos eclosionan liberando a los
miracidíos quienes con ayuda de su cuerpo ciliado nadan en búsqueda del caracol específico
(pasos 8 y 9). Una vez dentro del caracol, cada miracidio madura a un esporozoito madre y
se localiza en el tracto digestivo, luego se divide asexualmente produciendo los esporozoitos
hijos quienes migran hacia las glándulas digestivas (hepatopáncreas) del caracol donde se
transforman en cercarias (paso 10). Ante estímulos de luz y temperatura adecuados, las
cercarias se liberan de los caracoles, nadan para encontrar su hospedador definitivo y así
perpetuar el ciclo (paso 1) (Warren 1978).
LA ENFERMEDAD ESQUISTOSOMIASIS:
Más del 50% de los huevos producidos es retenido en la microvasculatura hepática y
otros tejidos del hospedador donde desencadena una reacción inflamatoria granulomatosa
que con el tiempo lleva al desarrollo de fibrosis. Es por esto que la sintomatología clínica en
esquistosomiasis no se debe tanto a la presencia de los gusanos, sino a la respuesta inmune
montada contra los huevos que ellos producen (Boros y Warren 1970).
Una vez dentro del humano, S. mansoni y S. japonicum se alojan en las venas
mesentéricas inferiores y superiores cercanas a los intestinos, mientras que S. haemalobium
se localiza en las venas del plexo alrededor de la vejiga (Warren 1978).
De las especies de esquistosoma que infectan al humano, S. mansoni es la que está
mejor estudiada ya que su ciclo de vida se puede mantener fácilmente en el laboratorio, es la
especie más prevalente e infecta a un mayor número de personas en todo el mundo y causa
una enfermedad hepática que puede llevar a la muerte del paciente (Smithers y Doenhoff
1982)
La enfermedad causada por S. mansoni se presenta en dos fases bien diferenciadas:
una primera “fase aguda” que abarca las primeras 5-6 semanas de la infección y una “fase
crónica” que comienza a desarrollarse aproximadamente a partir de la 7ma. semana
(Andrade y Andrade 1970; Al Adnani 1985; Boros 1989). La fase aguda en humanos se
presenta generalmente en personas no-inmunes. Esta fase está caracterizada por fiebre alta,
denominada fiebre de Katayama, eosinofilia, diarrea y en algunos casos edema, urticaria,
Laura l. Rutitzkv Capítulo l
linfoadenopatía y artralgia. Ocurre antes de la aparición de los huevos del parásito en las
heces del paciente y los síntomas que se presentan son generalmente transitorios y
desaparecen espontáneamente con el pasaje hacia la fase crónica (Ramos-Morales,
Sotomayor et al. 1968). Por el contrario, la fase crónica presenta distintas manifestaciones
clínicas de severidad variable (Andrade y Van Marck 1984; Boros 1989). La mayoría de los
individuos infectados desarrolla la enfermedad crónica de manera relativamente
asintomática denominada “intestinal”, la que está caracterizada por una baja carga
parasitaria y por la presencia de sangre en las heces, leve dolor abdominal y diarrea. Una
menor proporción de pacientes (5-lO%) desarrolla, en cambio, la forma crónica más severa
denominada “hepatoesplénica” que involucra seriamente al hígado y al bazo. Esta forma
hepatoesplénica, como su nombre lo indica, se caracteriza por desencadenar
hepatoesplenomegalia, fibrosis hepática y peri-portal, hipertensión portal con obstrucción,
hemorragia gastrointestinal, ascitis, varices esofágicas y comúnmente la muerte (Gigase
1982; Raia, Mies et al. 1985; De Cock 1986; Dunne y Pearce 1999).
Los estudios de campo en áreas endémicas, junto con los experimentos en modelos
animales, demostraron que la genética del hospedador, la intensidad de la infección, la
sensibilización intrauterina a antígenos del esquistosoma y la coinfección con otras
enfermedades, determinan el desarrollo de la respuesta inmune y así, la gravedad de la
enfermedad (Arap Siongok, Mahmoud et al. 1976; Cheever, Duvall et al. 1987; Marquet,
Abel et al. 1996; Secor, del Corral et al. 1996; Karanja, Colley et al. 1997; Halim, Garry et
al. 1999; Montesano, Colley et al. 1999).
En los humanos el diagnóstico de la enfermedad se hace usualmente por métodos
directos y/o inmunológicos. La detección microscópica de huevos en las heces (Técnica de
Kato-Katz, (Katz, Chaves et al. 1972)) o en la orina se realiza fácilmente ya que los huevos
de las especies de Schisrosoma son bien característicos. Sin embargo, este método tiene el
problema de que la excreción de los huevos tiene fluctuaciones diarias y que las infecciones
con baja carga parasitaria no son detectadas. También se realizan biopsias de mucosa rectal
que resultan ser más sensibles que la detección de huevos en las heces. Los métodos
inmunológicos que se aplican para el diagnóstico están dirigidos a detectar en el suero los
anticuerpos especificos contra los distintos estadios del parásito (Tsang y Wilkins 1991) o a
detectar antígenos del esquistosoma por medio de ensayos de ELISA (Deelder, Qian et al.
Laura l. Rutitzkv Capítulo l
1994). En los individuos con la enfermedad avanzada, el grado de hepatoesplenomegalia y
la presencia de fibrosis en el hígado, diagnosticadas por ecografías, se utilizan para
determinar la gravedad de la enfermedad.
EL MODELO MURINO DE ESQUISTOSOMIASIS:
El modelo murino de esquistosomiasis fue descripto originalmente por Warren y
DeWitt en 1958 (Warren y Dewitt 1958). Estos investigadores observaron que los ratones
infectados con S. mansoní desarrollaban hepatomegalia, esplenomegalia, hipertensión portal
y várices esofágicas similares a las que se producen en los humanos. Años más tarde, estos
descubrimientos fueron confirmados por von Lichtenberg (von Lichtenberg 1962) y por
Cameron y Bhattacharyya (Cameron y Bhattacharyya 1965). La disponibilidad del modelo
murino posibilitó el estudio y el esclarecimiento de cómo los gusanos S. mansom' causan la
enfermedad.
Así como ocurre en los humanos, entre las diferentes cepas de ratones también hay
una notoria variación “clínica”. En el modelo murino de la enfermedad, el tamaño de los
granulomas hepáticos, fácilmente de medir sobre preparados de tejido teñidos con
hematoxilina y eosina, se usa como indicador de la severidad de la enfermedad. Así
entonces, las cepas CS7BL/6, l29/Sv (ambas H-Zb)y BALB/c (H-Zd) son las que desarrollan
la enfermedad más moderada con granulomas hepáticos de un tamaño pequeño, y las cepas
CBA/J y C3H/l-IeN (ambas H-Zk) las que desarrollan la forma más severa de la enfermedad,
típicamente con granulomas más grandes, significativa fibrosis y muerte más temprana
durante la infección (Cheever, Duvall et al. 1987) (Tabla I). En el ratón, esta variación en la
patología se correlaciona directamente con la magnitud de la respuesta inmune
desencadenada por los antígenos solubles del huevo de esquistosoma (SEA, del inglés
soluble egg-antigens). Así, los linfocitos de los ratones de las cepas que desarrollan
naturalmente la enfermedad más severa, CBA/J y C3H/HeN, proliferan significativamente
más en respuesta al SEA que las mismas células de las cepas con baja patología, C57BL/6,
129/Sv y BALB/c.
TABLA I: Resumen de las cepas de ratón utilizadas como modelos en la
esquistosomiasis murina experimental y sus correlatos “clínicos” e inmunológicos.
BALB/c (H-2d)Inmunopatología en el granulomas grandes con granulomas chicos conhígado extendida inflamación hacia poca inflamación hacia
el parénquima el parénquimaMortalidad a causa de la Alta bajainfección
Proliferación de linfocitos T Alta bajaRespuesta de citoquinas Thl/Th2 Th2
EL PAPEL DE LOS HUEVOS DEL PARÁSITO:
Los estudios realizados en el modelo murino de la infección con esquistosoma dieron
evidencias directas de que el estadío de huevo del parásito es el que induce la patología. En
uno de los primeros estudios realizados para determinar la forma parasitaria responsable de
la enfermedad, se inyectaron a tres grupos de ratones por vía intravenosa (i.v.) con gusanos
vivos, con gusanos muertos o con extractos de gusanos vivos. Este estudio demostró que
sólo cuando había producción de huevos los animales desarrollaban granulomas,
hepatomegalia, esplenomegalia, hipertensión portal y várices esofágicas (Warren 1961). La
presencia de toxinas producidas por los gusanos adultos no se consideró como una causa
posible ya que la enfermedad no se manifestaba cuando los ratones eran infectados con
gusanos hembras o gusanos machos solamente o cuando estos recibieron inyecciones de
extractos de gusanos vivos (Boros y Warren 1970).
Mientras que estos estudios demostraron que los huevos del parásito son los
responsables de causar la enfermedad, ellos no identificaron los componentes que
Laura l. Rutitzkv Capítulo l
estimulaban la reacción inflamatoria granulomatosa. Los primeros estudios enfocados hacia
determinar la fuente de los antígenos inmunogénicos del huevo que estimulan la respuesta
inflamatoria mediada por linfocitos T, los realizaron Boros y Warren (Boros y Warren 1970)
quienes utilizaron el modelo de granulomas en pulmón descripto por von Lichtenberg
(Peterson y Von Lichtenberg 1965). Este modelo tiene la ventaja de que genera granulomas
en forma sincronizada en un período de tiempo corto y permite delinear la dinámica de la
evolución e involución de las lesiones, excluyendo los cambios histopatológicos que ocurren
en el proceso granulomatoso en los animales infectados. Estos investigadores se basaron en
la teoría de que los antígenos que desencadenan una respuesta granulomatosa deberían
inducir una sensibilización inmunológica. Para esto contaron con tres grupos de ratones a los
que les inyectaron en forma intraperitoneal (i.p.): a) huevos intactos muertos por sucesivos
calentamientos y congelamientos, b) homogenatos de huevos, preparados por sonicación y
molido c) sobrenadantes que contenían sólo los fluidos de los huevos que habían sido
homogenizados. Luego, a estos tres grupos de ratones sensibilizados los inyectaron en forma
i.v. con huevos vivos de esquistosomas y observaron la formación de los granulomas en los
pulmones. Los resultados mostraron que los huevos intactos muertos, los homogenatos de
huevos y el sobrenadante que contenía a los fluidos fueron efectivos en sensibilizar a los
ratones para la formación de granulomas alrededor de los huevos inyectados, sugiriendo que
los antígenos solubles derivados de los huevos eran los responsables de la inducción de la
reacción granulomatosa. En este mismo trabajo se demostró que este material soluble que
contenía a los antígenos estaba presente en los fluidos liberados por la eclosión natural de
los huevos del parásito ya que las cáscaras y los miracidios aislados luego de la eclosión no
sensibilizaban a los ratones para formar granulomas (Boros y Warren 1970). Estos
resultados fueron confirmados por Hang et al. quienes demostraron que los huevos
depletados del fluido o de los embriones, tampoco eran eficientes en inducir la formación de
granulomas (Hang, Warren et al. 1974).
Más tarde, estudios bioquímicos del SEA mostraron que éste estaba compuesto por
proteínas, glucoproteínas y polisacáridos y que los inmunógenos que estimulaban la
formación de granulomas, la proliferación y producción de citoquinas de los linfocitos eran
principalmente las glucoproteínas (Pelley, Pelley et al. 1976; Boros, Tomford et al. 1977;
Brown, Remold et al. 1977; Carter y Colley 1978; Weiss, Aronstein et al. 1987; Ham,
Laura I. Rutitzkv Capítulo I
Danko et al. 1989; Lukacs y Boros 1991). A pesar de que estos ensayos apuntaron a estudiar
el potencial patogénico de los antígenos, todavía no había una identificación precisa de cada
una de las moléculas componentes del SEA. Hoy se sabe que el SEA contiene al menos 30
componentes proteicos de pesos moleculares de entre < 25 a > 200 kDa y algunos de éstos
ya se han caracterizado bioquímica e inmunológicamente (Figura 3). Si bien es improbable
que todos estos componentes sean inmunogénicos, varios de ellos contribuirían a
sensibilizar al sistema inmune del hospedador para inducir la formación de los granulomas
(Stadecker, Hernandez et al. 2001).
FIGURA 3: Perfil de un gel de poliacrilamida (SBS-PAGE) de las proteínas del SEA teñidas con negroamido. Se muestran 30 bandas distinguibles. Cuatro de las bandas son antígenos que están caracterizadosbioquímica e inmunológicamente y se indican con sus respectivos nombres. Los estándares de pesosmoleculares están indicados a la izquierda. Frs. = fiacciones.
LA RESPUESTA INMUNE ASOCIADA CON LA ESQUISTOSOMIASIS:
Una primera infección con los esquistosomas ocurre, generalmente, sin una marcada
resistencia del sistema inmune del hospedador. De este modo, a lo largo de su desarrollo
14
Laura l. Rutitzky Capítulo l
desde la esquistosómula hasta el gusano adulto, los esquistosomas evitan la respuesta
inmune por varios mecanismos distintos como la inducción de moléculas anti-inflamatorias
(Ramaswamy, Kumar et al. 2000), la inhibición de la función de células linfoideas (Angeli,
Faveeuw et al. 2001) y cubriéndose en la superficie con antígenos del hospedador (Goldring,
Clegg et al. 1976; Simpson, Singer et al. 1983; Davies, Shoemaker et al. 1998; Loukas,
Jones et al. 2001). A pesar de estas primeras estrategias de evasión, el sistema inmune del
hospedador logra reaccionar contra los gusanos, pero falla en destruirlos.
Se demostró que mientras los huevos de los esquistosomas son los responsables de
causar la enfermedad, el principal factor en la inmunopatogénesis asociada con la
esquistosomiasis es la respuesta granulomatosa mediada por los linfocitos T del hospedador
(Boros y Warren 1970; Boros 1986). Como se mencionó anteriormente, la respuesta crónica
granulomatosa alrededor de los huevos del parásito junto con el desarrollo de fibrosis, son
las causas principales de la enfermedad hepatoesplénica, la más severa en los humanos
(Boros 1989).
El proceso de formación de los granulomas es una reacción celular de
hipersensibilidad retardada (DTH, del inglés delayed-type hypersensitivity). En uno de los
primeros estudios clásicos se demostró que los ratones previamente expuestos a huevos de
esquistosoma, mostraban una acelerada formación de granulomas que era específica y podía
ser transferida por leucocitos del hospedador, pero no por su suero
(Warren, Domingo et al. 1967). En la esquistosomiasis, este tipo de respuesta inmune está
mediada por linfocitos T CD4+ restringidos por el Complejo Mayor de Histocompatibilidad
(CMI-I) de clase II específicos para el SEA (Mathew y Boros 1986) y varios estudios
demostraron que los granulomas no se forman en ratones atímicos (Phillips, DiConza et al.
1977), o en ratones que no expresan las cadenas a y B del receptor T (Iacomini, Ricklan et
al. 1995), o ratones knock out (KO) para los genes del CMH de clase II o el gen 1 activador
de la recombinasa (Rag-l) (Hernandez, Wang et al. 1997) remarcando el papel fundamental
de los linfocitos T CD4+ en el desarrollo de la inmunopatología.
Una observación importante que surgió inicialmente del uso del modelo de la
enfermedad en el ratón, fue que la reacción granulomatosa a los huevos del parásito
disminuía en tamaño con el progreso de la infección. Conjuntamente con esta disminución,
se producía un mejoramiento en la patofisiología de la enfermedad. Este fenómeno fue
Laura I. Rutitzkv Capítulo l
denominado desensibilización endógena o inmunomodulación (Andrade y Warren 1964;
Domingo y Warren 1968; Boros, Pelley et al. 1975; Colley 1975). A lo largo del tiempo se
postularon algunos mecanismos que explicarían este proceso que opera tanto en el ratón
como en el humano, como por ejemplo, la presencia de linfocitos T CD8+ supresores
(Phillips, Lin et al. 1991; Chensue, Warmington et al. 1993; Pedras-Vasconcelos y Pearce
1996), la regulación cruzada de citoquinas producidas por linfocitos del tipo Thl y Th2
(Pearce, Caspar et al. 1991; Malaquias, Falcao et al. 1997), el desarrollo de linfocitos anti
idiotípicos (Colley, Montesano et al. 1999), entre otros.
Hoy se sabe que en los individuos que desarrollan la enfermedad más grave, no se
produce la inmunomodulación del tamaño de los granulomas (Colley, Garcia et al. 1986).
Durante el curso de la infección el hospedador está expuesto constantemente a una
variedad amplia de antígenos liberados por los gusanos adultos y los huevos. En los
humanos la respuesta inmune de anticuerpos hacia S. mansoni es compleja y se describió
que algunos anticuerpos interfieren con la eliminación del parásito mientras que otros
participan en la resistencia a la re-infección (Dunne, Grabowska et al. 1988; Demeure, Rihet
et al. 1993; Naus, Kimani et al. 1999).
En general, los linfocitos Th CD4+ de ratones se pueden dividir en dos
subpoblaciones de acuerdo al tipo de citoquinas que producen. Los linfocitos productores de
interleuquina-2 (IL-2) e interferón-gama (IFN-y) se denominan linfocitos del tipo Thl y
aquéllos que producen IL-4, IL-5 e IL-lO, se denominan del tipo Th2 (Mossmann y
Coffman 1989).
En la esquistosomiasis, la primera respuesta inmune adaptativa que se induce está
polarizada hacia un perfil de citoquinas pro-inflamatorias Thl y se mantiene hasta el
momento en que empieza la producción de los huevos, alrededor de la 5ta. semana después
del inicio de la infección, momento en el cual comienza la formación de los granulomas. En
las siguientes dos semanas, el proceso de formación de los granulomas alcanza su pico
mientras que el perfil de citoquinas, bajo condiciones normales, carnbia hacia uno del tipo
Th2, anti-inflamatorio (Vella y Pearce 1992; Stadecker y Hernandez 1998) (Figura 4).
Laura I. Rutitzkv Capítulo I
Esquistosómulas12"’I“’
Adultos WWIWyFIGURA 4: Desarrollo de la respuesta inmune durante la infección. En el transcurso de la
infección, la respuesta inmune progresa a través de dos fases. En las primeras 3-5 semanas (fase aguda),
durante las cuales el hospedador está expuesto a los parásitos inmaduros que migran por el cuerpo, la respuesta
dominante es del tipo Thl. A medida que los parásitos maduran, se aparean y comienzan a producir los huevos,
entre la 5ta. y 6ta. semana, la respuesta inmune cambia notoriamente hacia una respuesta del tipo T112.Esta
respuesta es inducida principalmente por los huevos del parásito. Durante la fase crónica de la enfermedad, la
respuesta Th2 es modulada y los granulomas que se forman alrededor de los huevos nuevos son de tamaño
menor (inmunomodulación). Figura traducida de Ia originalpresente en el artículo de Pearce E, J. y MacDonaIdA.S. Nat, Rev.
Immunal. 2002 Jul;2(7):499-511.
La IL-4 (Pearce, Cheever et al. 1996), algunos mecanismos coestimuladores como
B7-CD28 (Hemandez, Sharpe et al. 1999) y CD40-CD154 (MacDonald, Patton et al. 2002),
junto con un cambio en el mecanismo de activación de las células presentadoras de
antígenos (CPA), desde la vía clásica hacia la vía alternativa (Goerdt y Orfanos 1999) y la
presencia de los linfocitos B (Hernandez, Wang et al. 1997), todos, contribuyen a este pasaje
de Thl a Th2. La evolución de este pasaje está acompañada por la producción abundante de
anticuerpos IgG e IgE y por la inducción de respuestas de linfocitos T CD8+ (Phillips, Lin et
al. 1991; Chensue, Warmington et al. 1993; Pedras-Vasconcelos y Pearce 1996). El papel de
los linfocitos T 78 no parece importante en la respuesta inmune asociada a la enfermedad
(Iacomini, Ricklan et al. 1995).
Laura I. Rutitzky Capítulo I
-GRANULOMAS:
Los granulomas son lesiones formadas por una matriz de fibras de colágeno y
agregados inflamatorios compuestos principalmente por eosinófilos, macrófagos,
neutrófilos y linfocitos (Boros y Warren 1970). Como se mencionó anteriormente, la
formación de los granulomas hepáticos en la infección por S. mansoni es un proceso
mediado por linfocitos T CD4+restringidos por el CMH de clase II (Mathew y Boros
1986; Hernandez, Wang et al. 1997) (Figura 5). Los granulomas pueden ser
considerados como lesiones necesarias para proteger al hospedador ya que se
demostró que los ratones deficientes en moléculas CD4 son incapaces de formar
granulomas y mueren debido a los efectos tóxicos de ciertas proteínas del huevo
sobre los hepatocitos (Amiri, Locksley et al. 1992). Rodeando al huevo, el
granuloma esencialmente lo aísla del tejido hepático y permite que el hígado
continúe con su función normal. A largo plazo, cuando los huevos mueren y los
granulomas se resuelven, se desarrolla fibrosis del tejido (Boros 1989). Esto lleva al
incremento de la presión sanguínea portal y al desarrollo de várices esofágicas. La
causa más común de muerte debido a la esquistosomiasis es el sangrado de las
Varices.
BL/6 CMH clase I KO(No linf. T CD8+)
CMH clase II K0(No linf. T CD4“)
FIGURA 5: La formación de granulomas es dependiente de los linfocitos T CD4+.En la figura se observan
granulomas hepáticos alrededor de un huevo sobre secciones de tejido teñidas con hematoxilina y eosina. A, un
ratón BL/6 wild type (WT); B, un ratón BL/6 deficiente en linfocitos T CD8+donde no se observan diferencias
cualitativas ni cuantitativas respecto del WT y C, un ratón deficiente en linfocitos T CD4Jrdonde no se forman
los granulomas alrededor de los huevos.
-CITOQUTNAS:
Los esquistosomas, como otros helmintos (Gause, Urban et al. 2003),
inducen normalmente en el hospedador una característica respuesta crónica de
citoquinas del tipo Th2 que los hace un sistema modelo para el estudio del desarrollo
y la función de este tipo de respuesta inmune.
En trabajos realizados sobre la esquistosomiasis experimental, usando a los
ratones de la cepa BL/6, de baja patología, se estableció que durante el transcurso de
la fase aguda se presenta una primera respuesta inmune pro-inflamatoria del tipo
Thl , con producción de IL-12, IFN-y e lL-2 y a medida que la enfermedad pasa a la
fase crónica, esta respuesta Thl es reemplazada por una del tipo Th2, con producción
principalmente de IL-4 e IL-lO, que es importante para controlar el daño hepático
(Pearce, Caspar et al. 1991; Stadecker y Flores Villanueva 1994). Los eosinófilos
presentes en los granulomas son una fuente importante de IL-4 y ayudan a asegurar
la respuesta del tipo Th2 protectora (Rumbley, Sugaya et al. 1999).
A diferencia de los ratones BL/6, en las cepas que desarrollan alta patología,
CBA/J y C3H/HeN, la respuesta Th] desencadenada durante la fase aguda continúa a
lo largo del desarrollo de la respuesta Th2 característica de la fase crónica. Todavía
no se conocen las causas de este fenómeno, pero estarían relacionadas posiblemente
con el reconocimiento a antígenos diferentes que inducen preferentemente una fuerte
respuesta Thl restringida por H-2k (Hernandez, Edson et al. 1998). En estas cepas de
ratones el mecanismo de inmunomodulación no es tan evidente.
En el humano, la fase aguda de la enfermedad se caracteriza por la presencia
del factor de necrosis tumoral (TNF, del inglés tumor necrosis factor) en el plasma y
por la producción de niveles altos de TNF, IL-l e IL-6 por células de sangre
periférica estimuladas con antígenos del parásito (de Jesus, Silva et al. 2002).
Presumiblemente, en la progresión natural de la enfermedad, la respuesta Th2
específica a los antígenos del huevo, regula negativamente la producción y las
funciones efectoras de los mediadores pro-inflamatorios Thl. En especial, la
producción de la IL-lO en este período cumple un papel crucial (Flores Villanueva,
Chikunguwo et al. 1993; Montenegro, Miranda et al. 1999).
Laura I. Rutitzkv Capítulo l
Los pacientes que desarrollan la forma severa hepatoesplénica de la
enfermedad en su fase crónica, muestran una respuesta de citoquinas del tipo Thl
con niveles bajos o indetectables de IL-lO, mientras que los pacientes que presentan
la forma leve intestinal de la esquistosomiasis desarrollan una respuesta de
citoquinas del tipo Th2 (Malaquias, Falcao et al. 1997; Mwatha, Kimani et al. 1998).
Se propuso un papel central para el TNF en el desarrollo de los granulomas
en base a que una dosis de TNF inyectada en ratones infectados que presentan severa
inmunodeficiencia combinada (SCID) es suficiente para inducir una lesión alrededor
de los huevos y evitar fallas en la función hepática (Amiri, Locksley et al. 1992). Un
posible mecanismo por el cual el TNF cumpliría con su función es la regulación
positiva de las moléculas de adhesión intracelular-1 (ICAM-l, del inglés intracelular
adhesión molecule-l), que media las interacciones entre células y su migración a
través del endotelio (Ritter y McKerrow 1996).
En la tabla II se muestra un resumen del papel de las citoquinas involucradas
en la inmunopatología de la esquistosomiasis.
TABLA II: Principales funciones de la citoquinas involucradas en la inmunopatología
de la esquistosomiasis.
Pro-inflamatorias
TNF-a Respuesta en la fase aguda TGF-BHepatotóxicas Pro-flbrótica
-APOPTOSIS:
La apoptosis o muerte celular programada, es un proceso fisiológico,
regulado genéticamente, por el cual se eliminan las células que no están cumpliendo
con su función específica o células innecesarias (Van Parijs, Biuckians et al. 1998;
20
Laura l. Rutitzkv Capítulo l
Van Parijs, Peterson et al. 1998; Lenardo, Chan et al. 1999; Rathmell y Thompson
2002). Este mecanismo ya fue involucrado en la regulación de la respuesta inmune
de muchas enfermedades parasitarias como las causadas por otras especies de
helmintos (Kalinkovich, Weisman et al. 1998); leishmaniasis (Desbarats, Stone et al.
2000), filariasis (Jenson, O'Connor et al. 2002), malaria (Sanchez-Torres, Rodriguez
Ropon et al. 2001; Wipasa, Xu et al. 2001) y enfermedad de Chagas (Lopes, da
Veiga et al. 1995; Martins, Cardoso et al. 1998).
La célula apoptótica se caracteriza por perder volumen, tener la membrana
plasmática distorsionada, presentar condensamiento del núcleo con agregación de la
cromatina y producir la degradación del ADN en fragmentos nucleosomales por
medio de endonucleasas. Estos cambios ocurren después de una cascada de
señalización y pasos que son mediados por proteasas denominadas caspasas
(Cisteína-Aspartato-proteasas) que regulan proteínas pro- y anti-apoptóticas y que
pueden ser inducidas por dos mecanismos principales, uno activo o extrínseco y otro
pasivo o intrínseco (Lenardo, Chan et al. 1999; Tesciuba, Subudhi et al. 2001).
En los linfocitos T, los mecanismos de apoptosis activa son los que se
desencadenan generalmente a través de un receptor como por ejemplo, el sistema
compuesto por Pas/FasL, que son moléculas miembros de la familia del receptor del
TNF y su ligando TNF (TNFR/TNF). Hasta el momento no se conocen con precisión
los mecanismos moleculares que controlan la expresión de estos receptores
inductores de la apoptosis activa; algunos factores nucleares como el NFIT, NFKB y
la proteína-1 específica, entre otros, se asociaron a la activación de la expresión de
FasL (Kavurma y Khachigian 2003). Otra forma de apoptosis es la inducida por
linfocitos T CD8+ que cumple un papel fundamental en las infecciones virales. Estos
linfocitos citotóxicos, al igual que las células NK (natural killer), utilizan más de un
mecanismo para inducir apoptosis; entre ellos se encuentra el mediado por perforina
y granzima (Apasov y Sitkovsky 1993; Vaux y Strasser 1996).
En oposición a los mecanismos de apoptosis inducida por activación, está la
apoptosis pasiva que se desencadena por la falta de factores de crecimiento (Cohen,
Duke et al. 1992; van Neerven, Sparholt et al. 1998; Van Parijs, Biuckians et al.
1998; Lenardo, Chan et al. 1999; Rathmell y Thompson 2002). Esta forma de
2|
Laura I. Rutitzkv Capítulo l
apoptosis parece ser independiente de la expresión de miembros de la familia
TNFR/TNF y puede ser inhibida por la IL-2 o por la expresión de miembros de la
familia de moléculas BCI-2 (Mogil, Radvanyi et al. 1995; Akbar, Borthwick et al.
1996; Van Parijs, Ibraghimov et al. 1996). Hasta el momento se identificaron más de
20 miembros de la familia Bcl-2, incluyendo proteínas que suprimen la apoptosis
(Bol-2, Bcl-XL, MCL-l, A1, Bcl-W y Bcl-G) y proteínas que promueven la
apoptosis (Bax, Bak, Bok, Bad, Bid, Bik y Biml) induciendo la liberación de
citocromo c de la mitocondria (Adams y Cory 1998).
-COESTIMULACIÓN:
Para ser activados apropiadamente, los linfocitos T necesitan recibir por lo
menos dos señales independientes, una antígeno-específica a través del receptor T y
otra segunda señal a trave's de las moléculas de coestimulación necesarias para
aumentar la producción de citoquinas, la proliferación, promover la supervivencia de
las células, inducir diferenciación hacia células efectoras o de memoria y permitir la
cooperación con otras celulas. Es por esto que la coestimulación es un mecanismo
que hace más que aumentar los eventos desencadenados a través del reconocimiento
antígeno-receptor; interactúa con señales antígeno específicas en forma sinérgica
para permitir la activación completa de los linfocitos. Así, las moléculas
coestimuladoras deben inducir una señal positiva y no solamente incrementar la
avidez del receptor T (como puede ser el caso de las moléculas de adhesión) o
aumentar el reclutamiento de enzimas tirosina quinasas al complejo del receptor T
(como es el caso de los co-receptores CD4 y CD8) (Frauwirth y Thompson 2002).
Los receptores de las moléculas de coestimulación se pueden subdividir en
dos clases en base a sus homologías en las secuencias de aminoácidos. La primera
clase incluye a CD28 y al coestimulador inducible (ICOS, del inglés inducible
costimulator). CD28 e ICOS tienen como ligandos a miembros de la familia de
moléculas B7. Los linfocitos T no activados expresan en forma constitutiva a CD28
y reciben la segunda señal a través de las moléculas B7-l y B7-2 presentes en células
presentadoras de antígeno (CPA) (Lenschow, Walunas et al. 1996). A diferencia de
los linfocitos T no activados, los linfocitos efectores utilizan un repertorio diferente
Laura l. Rutitzkv Capítulo l
de moléculas de coestimulación para proveer la segunda señal. Entre éstas, está
ICOS que se induce en tejidos donde se desencadenan respuestas celulares del tipo
Thl como Th2 (Sperling y Bluestone 2001). La proteína-l relacionada a B7 (B7RP
l, del inglés B7-related protein-l, también denominada B7h o LICOS) es el ligando
de ICOS y se encuentra presente principalmente en CPA de órganos linfoides como
timo y bazo, pero también se lo encuentra en órganos no linfoides como riñón,
pulmón y testículo (Aicher, Hayden-Ledbetter et al. 2000).
Otros dos receptores, CTLA-4 (del inglés cytotoxic T-lymphocyte-associated
protein-4) y PD-l (del inglés programmed death-1), comparten una homología
estructural con esta clase y también se unen a moléculas que pertenecen a la familia
de las B7, pero las evidencias muestran que ambos receptores tienen efectos
inhibitorios y por esto no serían considerados como coestimuladores. Por el
contrario, estas proteínas podrían ser calificadas como reguladores negativos de la
coestimulación.
La segunda clase de receptores de coestimulación son miembros de la familia
del receptor del TNF. Ella incluye a CD40, OX-40, 4-lBB (CD137), CD3O y a
CD27. Los ligandos de estos receptores, CD40L (CD154), OX-4OL, 4-lBBL
(CD137L), CD30L y CD27L son miembros de la familia del TNF y se encuentran
unidos a membrana (Frauwirth y Thompson 2002).
TRATAMIENTO, CONTROL Y DESARROLLO DE UNA VACUNA:
Actualmente el helminticida más utilizado para tratar la esquistosomiasis es el
Praziquantel. Una única dosis oral de 40 mg/kg de Praziquantel es generalmente suficiente
para curar pacientes en un 60-90% y reducir la cantidad de huevos excretados en un 90
95%. A pesar del progreso que se logró con la quimioterapia, todavía hay una significativa
diseminación de la enfermedad, especialmente en el oeste africano (Capron, Capron et al.
2002). La quimioterapia, incluso cuando se aplica en forma masiva, tiene la limitación de
que no impide la re-infección, que ocurre normalmente en las áreas endémicas de la
enfermedad y la prevalencia alcanza rápidamente (6-8 meses) los niveles iniciales. Además,
se necesita de una infraestructura importante para que la droga que se suministra cubra
regularmente toda el área endémica, lo que hace que la quimioterapia sea un abordaje muy
23
Laura l. Rutitzkv Capítulo l
costoso. Asimismo, aunque todavía no hay evidencias de especies de esquistosomas
resistentes al Praziquantel, en varios países se está reportando la presencia de una menor
susceptibilidad a la droga.
Resulta imposible erradicar completamente a la esquistosomiasis porque los
esquistosomas infectan a muchos animales que sirven de reservorios naturales y permiten la
continua transmisión del parásito (Mott, Nuttall et al. 1995). Algunas intervenciones
importantes para el control de la enfermedad son la reducción de la fecundidad del parásito,
la educación sanitaria, la provisión de agua limpia (Engels, Chitsulo et al. 2002) y el control
químico o biológico de los caracoles que actúan como intermediarios. Si bien un abordaje
multidisciplinario es lo más conveniente para reducir la transmisión, resulta muy costoso
para los países donde se presenta la enfermedad. La estrategia actual de control de la
Organización Mundial de la Salud está dirigida a reducir la morbilidad que causa la
enfermedad por medio de la terapia con drogas o el desarrollo de vacunas más que a
erradicar la enfermedad (WHO 1985).
El desarrollo de una vacuna que pueda prevenir la infección o proveer al menos una
inmunidad parcial resultaría, entonces, esencial para el control de esta importante
enfermedad parasitaria. La posibilidad de adquirir inmunidad está basada en el hecho de que
la prevalencia y la intensidad de la infección normalmente decrecen con la edad. Habría dos
posibilidades para una inmunointervención en esquistosomiasis, la primera es el clásico
abordaje de una vacuna con antígenos del patógeno como para preparar las defensas del
hospedador en el momento de la infección. Con esta idea se identificaron varios antígenos
del gusano y del huevo que dieron pruebas de una protección limitada ante la infección. Sólo
una de ellas está siendo probada en humanos (Bergquist 2002). El otro abordaje para una
inmunointervención sería lograr regular negativamente la excesiva inmunopatología
mediada por los linfocitos T CD4+. Este concepto se basa en la asunción de que la inducción
de tolerancia a una cantidad de antígenos resultaría en una disminución de la magnitud de la
respuesta inflamatoria. Actualmente existen varias estrategias para inducir tolerancia in vivo
hacia péptidos y proteínas usando por ejemplo péptidos análogos con propiedades
antagonistas a aquéllos inmunodominantes o usando agentes que previenen o inhiben la
activación de los linfocitos T, como es el caso de la IL-lO. Todavía es necesario investigar si
estas estrategias serán exitosas en la esquistosomiasis experimental o si se pueden
24
Laura l. Rutitzkv Capítulo l
implementar en la esquistosomiasis humana, pero en cualquier caso, su realización
dependerá en parte de la identificación de los inmunógenos críticos de los antígenos del
huevo y de sus epítopes para los linfocitos T (Stadecker y Hernandez 2001).
Actualmente existe una vacuna experimental que se aplica a animales infectados de
laboratorio y consiste en cercarias atenuadas por radiación UV o gama (Reynolds y Ham
1992; Coulson 1997; Wilson, Coulson et al. 1999). Los resultados del uso de esta vacuna
son promisorios porque protege a los animales de contraer la infección, pero su aplicación
en humanos no es posible ya que las vacunas de parásitos atenuadas no son consideradas
seguras o prácticas dado que no hay ningún control de la localización del parásito una vez
dentro del cuerpo humano.
OBJETIVOS
Como objetivo principal de esta tesis se propone estudiar nuevos mecanismos de
inmunorregulación en esquistosomiasis en las cepas de ratón que desarrollan naturalmente
baja y alta patología. En particular, se tratará de definir el papel que cumple un ambiente
dominado por citoquinas del tipo Thl vs. uno dominado por citoquinas del tipo Th2 en el
desarrollo de la enfermedad. También se propone estudiar la función de la apoptosis de
linfocitos T CD4+ comparando dos cepas de ratones que desarrollan distinto grado de
inmunopatología. Asimismo, es igualmente importante ampliar el conocimiento de los
sistemas coestimuladores que influencian los mecanismos efectores de los linfocitos T CD4+
que median la enfermedad.
OBJETIVO l: Definir el papel que cumplen las respuestas de citoquinas del tipo Thl
vs. Th2 en el desarrollo de la inmunopatología asociada con la enfermedad.
OBJETIVO 2: Estudiar el papel que cumple la apoptosis de los linfocitos T CD4+en el
desarrollo de la inmunopatología asociada con la enfermedad.
OBJETIVO 3: Estudiar el papel que cumple el mecanismo de coestimulación ICOS
B7RP-l en la inmunopatogénesis de la enfermedad.
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales e infección: Se usaron ratones hembras C57BL/6 (BL/6), 129/Sv y CBA/J (CBA).
Para el estudio del objetivo 2 se usaron también ratones hembras BL/6 o 129/Sv KO para
diferentes moléculas como: Fas, FasL y CMH de clase I. Los ratones fueron comprados en
The Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Se obtuvieron caracoles Biomphalaria
glabrata infectados con S. mansom’del Biomedical Research Institute (Baltimore, MD). Los
ratones fueron infectados con 80 cercarias de S. mansom' (cepa Puerto Rico) i.p.
Preparación del antígeno SEA: El extracto de antígenos solubles del huevo de S. mansoni se
compró en forma liofilizada en el Center for Tropical Diseases (University of Massachusetts
at Lowell, Lowell, MA). Se procedió a resuspenderlo, ultracentrifugarlo y a determinar la
concentración de proteína de la preparación con el uso del Kit BCA (Pierce, Rockford, lL).
El antígeno se usó a 20 pg/ml en los ensayos de producción de citoquinas in vitro y esa
concentración fue la máxima utilizada en los ensayos de proliferación de linfocitos T.
Preparación del AcMo anti-ICOS.
El AcMo de rata anti-ICOS 12A8 (lgGZb) es un anticuerpo que bloquea la interacción entre
ICOS y B7RP-l (Ozkaynak, Gao et al. 2001). La vida medía del AcMo 12A8 in vivo es de
15 horas, pasadas las 72 horas el título cae por debajo del umbral de detección. El AcMo de
rata YK9 (Millenium Pharmaceutical) es el isotipo que file utilizado como control. Los
AcMo se inyectaron por vía i.p., en dosis diarias de 100 pg en 0.5 ml de PBS. Los
tratamientos se realizaron en grupos de 10 ratones, comenzando cuatro semanas después de
la infección y continuando hasta la 7ma. semana.
Inmunizaciones y otros tratamientos in vivo (SEA-CFA -adyuvante completo de Freund-.
lL-2 hr -humana recombinante- y AcMo -anticuegpo monoclonal- anti-ICOS): Para el
estudio del objetivo l se probaron dos adyuvantes para emulsionar al SEA. Se usaron el
CFA y TiterMax. Se probaron inmunizaciones i.p. y subcutáneas (s.c.) con 50 ug/ml del
antígeno SEA emulsionado en el adyuvante o solubilizado en PBS como control. Otro grupo
de animales control recibió sólo el adyuvante. Se probaron protocolos de una y dos
Laura l. Rutitzkv Capítulo l
inmunizaciones a lo largo de 7-8 semanas de infección. Para el estudio del objetivo 2 se
inyectó la lL-2 hr (Chiron Corporation, Emeryville, CA) i.p. en tres dosis diferentes (2.000
4.000, 20.000-40.000 o 200.000-400.000 IU/ratón) a tres grupos de ratones C57BL/6, en
días altemados comenzando en la 5ta. semana después de la infección y continuando hasta la
semana 8va. cuando se sacrificaron a los ratones tratados y controles no tratados. Para el
estudio del objetivo 3 se inyectó diariamente el AcMo anti-ICOS murino (12A8, lgGZb)
(Millennium Phannaceuticals, Inc. Cambridge, MA) en forma i.p. a una concentración de
lOOpg/ml, empezando en la 4ta. semana de infección y continuando hasta la semana 7ma.
cuando se sacrificaron a los ratones tratados y controles no tratados. Se usó como control de
isotipo el anticuerpo monoclonal YK9.
Preparación de las células: Para aislar las células de granulomas de los hígados de los
ratones infectados en los tiempos de infección indicados, se hizo la disección en forma
aséptica de 5 a 10 órganos que se juntaron por grupo y luego se homogeneizaron para
obtener una preparación de granulomas en suspensión. Después de varios lavados con PBS
los granulomas se resuspendieron en una solución de colagenasa a una concentración de
lmg/ml (Clostridium histolyticum blend collagenase "H", Sigma, St. Louis, MO) y se
realizó una incubación de l h a 37 °C con agitación suave. Las células de los granulomas
liberadas en el sobrenadante se colectaron y lavaron dos veces con medio de lavado (RPMI
1640 conteniendo 1 mM de aminoácidos no esenciales, 80 ug/ml de estreptomicina, 80
IU/ml de penicilina, lO mM de HEPES, 2 mM de glutamina, l mM de piruvato de sodio y 6
x 10'5M de B-mercaptoetanol). Luego se lisaron los glóbulos rojos con una solución de Tris
cloruro de amonio a pH 7.2 por 15 min. sobre hielo.
Se aislaron también las células de 5 a 10 ganglios linfáticos mesentéricos y bazos
combinados de cada uno de los grupos de animales infectados en los tiempos de infección
indicados. Los tejidos se disgregaron con el uso de fórceps. Se lisaron los glóbulos rojos y
las células se lavaron con el medio de lavado.
Los linfocitos T CD4+ fueron purificados de las suspensiones de células totales de 5 a 10
ganglios linfáticos mesentéricos por selección negativa mediada por complemento. Las
células se incubaron por 45 min. a 37 °C en una columna empacada con una malla de nylon.
Las células no-adherentes recuperadas por elusión de la columna se incubaron luego con los
28
Laura 1. Rutitzkv Capítulo I
anticuerpos monoclonales (AcMo) presentes en los sobrenadantes de cultivo de los
siguientes hibridomas: M5/114.15.2 (ATCC TIB 120) contra I-Ek/I-Ab/I-Ed/I-Aq en una
dilución 126.7;J l 1d.2 (ATCC TIB 183) contra HSA (del inglés heat stable antigen) en una
dilución 1:10 y 3.155 (ATCC TIB 211) contra CD8 en una dilución 1:30 por 25 min. a 4 °C.
Se realizó una segunda incubación en presencia de una solución que contenía 15 % de suero
de conejo como fuente de complemento durante 25 min. a 37 °C. Los tratamientos con los
AcMo y el complemento se repitieron una vez más y las células muertas fueron eliminadas
en un último paso por medio de un gradiente de densidad (lympholyte). La pureza de la
población de linfocitos T CD4+ se corroboró por citometría de flujo y fue usualmente de más
del 95%. Se contaron aquellas células que excluyeron al colorante Azul Trypan para llevar
las suspensiones celulares a las concentraciones necesarias.
Ensayos de proliferación celular: Se realizaron cultivos de las células totales de ganglio
linfáticos mesentérico durante 96 h a una concentración de 2.5x105 células/pozo en
presencia de SEA a 1.25, 5, y 20 ug/ml en un volumen final de 200 ul. Los pozos controles
incluyeron células cultivadas en ausencia de SEA, para conocer los niveles basales de
proliferación, y células cultivadas en presencia de IL-2 hr, para controlar la viabilidad de las
células. Durante las últimas 18 h de cultivo se agregó 3H-timidina a una concentración de
0.5 uCi/pozo y se midió su incorporación en las células en un contador de centelleo.
Para la proliferación de células de granulomas en un primer paso se procedió a incubar la
preparación celular por 45 min. a 37 °C en una columna empacada con una malla de nylon
para descartar las células adherentes. Luego de la elusión de la columna, las células no
adherentes se cultivaron a una concentración de 4 x 105 células/pozo junto con APC
irradiadas a una concentración también de 4 x 105células/pozo. El cultivo de las células no
adherentes de los granulomas se incubó de la misma manera que se mencionó para las
células totales de ganglios linfáticos mesentérico.
Para el caso de la proliferación de los linfocitos T CD4+ purificados, la incubación se realizó
con 1.5 x 105linfocitos T CD4+/pozo junto con 2.5 x 105APC/pozo previamente irradiadas.
Tratamiento in vitro con IL-2: Para realizar estos ensayos se aislaron células de granulomas
como se describió previamente. Primero las células se tiñeron con 7-AAD 20pg/ml (Sigma)
29
Laura l. Rutitzkv Capítulo l
durante 20 minutos en hielo y luego se lavaron en PBS. Las células no apoptóticas (7-AAD
negativas) se seleccionaron en un instrumento MoFlo (Cytomation). Luego se
resuspendieron a una concentración de 2x106 células/ml y se cultivaron en medio
suplementado con la cantidad indicada de IL-2 murina recombinante (IL-2 rm, BD
PharMingen) y/o AcMo anti IL-2 murina (clon S4B6 BD, PharMingen), durante 48 h.
Después de este tiempo la apoptosis de la población de linfocitos T CD4+ se midió
utilizando el ensayo de TUNEL que se describe más adelante.
Determinación de citoguinas en sobrenadantes de cultivo: Las células de los granulomas
(células totales), de los ganglios linfáticos mesentéricos y de los bazos se cultivaron a una
concentración de 5 x lO6células/ml en presencia o ausencia de 20 ¡tg/ml de SEA en placas
de 48 pozos en un volumen final de l ml. Se cultivaron los linfocitos T CD4+ purificados de
ganglios linfáticos mesentéricos a una concentración de 1 x lO6células/ml junto con 4 x 106
células/ml de APC irradiadas. Se recolectaron los sobrenadantes de las células de
granulomas después de 36 h de cultivo y los de las células de ganglios linfáticos
mesentéricos y bazos, luego de 24 h y 48 h. En ellos se midieron las concentraciones de las
citoquinas IFN-y, IL-2, TNF-a, IL-l2 (p40), IL-4, IL-5, IL-lO e IL-l3 por ELISA. Todos los
anticuerpos específicos para las citoquinas, las citoquinas estándares y los protocolos se
obtuvieron de las compañías BD-PharMingen (San Diego, CA) y R&D (Minneapolis, MN).
Inducción de la producción de citoguinas intracelulares: Se incubaron las suspensiones
celulares de los granulomas a una concentración de 2 x lO6células/ml por 24-36 h a 37 °C
en presencia de 20 ug/ml de SEA seguido de una incubación de 5 h en presencia de 50
ng/ml de PMA (Sigma), 500 ng/ml ionomicina (Sigma) y 2 ug/ml de monensina (Sigma)
para re-estimular la producción de citoquinas e inhibir su secreción respectivamente.
Citometría de flujo: Los grupos de células de granulomas, ganglios linfáticos mesentéricos y
bazos se marcaron directamente ex vivo y después de distintos tiempos de cultivo a una
concentración de 2 x 106 células/ml con y sin SEA a 20 ug/ml. Las células se lavaron dos
veces con buffer de marcación (1X PBS/l%BSA/0.l%NaN3), se resuspendieron a una
concentración de 2 x 107 células/ml en buffer de bloqueo que contenía 0.3 mg/ml de IgG
30
Laura l. Rutitzkv Capítulo l
total de rata y se incubaron por lO min. a 4 °C con el propósito de inhibir el pegado
inespecífico de los anticuerpos. Las alícuotas de 50 ul con 1 x 106células se incubaron por
30 min. a 4 °C con anticuerpos fluorescentes específicos para distintos marcadores
fenotípicos (CD3, CD4, CD8, Fas, FasL, CD25 y CD69). Para el análisis combinado de
apoptosis y citoquinas intracelulares se marcaron las células con PE anti-CD4 y 7-AAD y
luego de fijarlas durante l h a T amb. con una solución de paraforrnaldehído al 2% y
penneabilizarlas por 15 min. a T amb. con buffer saponina al 0.1% que contenía 300 ug/ml
de IgG total de rata, se procedió a la marcación intracitoplasmática con anticuerpos
biotinilados específicos para IFN-y, IL-2, IL-5 e IL-lO, diluidos 1/100 en el mismo buffer
saponina conteniendo la solución de bloqueo. Para visualizar la marca de citoquinas, se
realizó un siguiente paso de revelado incubando las células por 20 min. sobre hielo en la
solución permeabilizadora de saponina 0.1% que contenía estreptavidina-FITC a una
dilución 1/1000.
Detección de apoptosis por el ensayo de TUNEL (del inglés, Terminal deoxynucleotidyl
transferase (TdT)-mediated dUTP Nick End-Labeling): Para la detección de apoptosis de los
linfocitos T CD4+, primero se marcaron los grupos de las células de los ganglios y de los
granulomas con los AcMo anti-CD3 PerCP y anti-CD4 PE. Las células se fijaron luego
durante l h a T amb. con una solución de paraforrnaldehído al 4%, se perrneabilizaron con
una solución de detergente Tritón y se sometieron a la técnica de TUNEL (Gorczyca, Gong
et al. 1993). Se incubaron las células durante 1 h a 37 °C con una solución que contenía a la
enzima TdT y a los nucleótidos dUTP marcados con FITC (protocolo del kit In situ cell
death kit-Fluorescein, Roche, Indianapolis, IN). Luego de una hora de incubación las células
se lavaron con PBS 1X y se resuspendieron en una solución de paraforrnaldehído al 1% para
su análisis por citometría de flujo. El control negativo de este ensayo se realizó incubando a
las células con los nucleótidos dUTP marcados y sin la enzima TdT.
Análisis histopatológicos y morfometría de granulomas hepáticos: Se tomaron muestras de
los hígados de cada ratón perteneciente a cada grupo a los distintos tiempos de infección
indicados, se fijaron en buffer formalina al lO % y se procedió con el análisis
histopatológico de rutina. Se cortaron secciones de 5 um de espesor que se tiñeron con
Laura l. Rutitzkv Capítulo l
hematoxilina y eosina. Los tejidos se analizaron en forma cualitativa y cuantitativa. La
cantidad de inflamación granulomatosa alrededor de los huevos del parásito en los hígados
se cuantificó con la ayuda del programa de computación Image-Pro Plus (Media
Cybemetics, Silver Spring, MD). Los granulomas se midieron sobre portaobjetos
codificados sin conocer el grupo de ratones al que pertenecían y sólo aquellos granulomas
que mostraban un huevo en posición central fueron cuantificados.
Cuantificación de enzimas hepáticas en suero: Se obtuvieron los sueros de ratones normales
e infectados durante 7 semanas por sangrado de uno de los ojos con posterior separación
por coagulación de la sangre. En las muestras de individuales de suero se cuantificaron los
niveles de las enzimas hepáticas aspartato aminotransferasa (AST) y alanina
aminotransferasa (ALT) por métodos colorimétricos.
Northern blot de los ARNm de ICOS y B7RP-1:
Las sondas utilizadas para detectar el ARN mensajero (ARNm) de ICOS y B7RP-l son las
mismas que han sido previamente descriptas por (Ozkaynak, Gao et al. 2001). El ARN total
se obtuvo por el método de guanidina-tiocianato-fenol-clorofonno (Chomczynski y Sacchi
1987), a partir de ce'lulas hepáticas de ratones control o infectados con S. mansom'. La
electroforesis se hizo en geles de agarosa-formaldehído (1,2%) sembrados con 25ug de
ARN de cada muestra, y con una cantidad necesaria de estándares de peso molecular entre
0.24 y 9.5 kb (Invitrogen). Una vez concluida la corrida electroforética, el ARN se transfirió
a una membrana Nytran-Supercharge (Schleicher & Schuel) en buffer CSS 20X (cloruro de
sodio 3M, citrato de sodio 0.3M) durante 16 horas. El ARN se ligó a la membrana
exponiéndola en un incubador de radiación ultravioleta Stratalinker (Stratagene). Las sondas
para ICOS y para B7RP-1 se marcaron con 32P-dCTPcon la preparación Prime-It lI
(Stratagene). La hibridación se llevó a cabo en un incubador con rotor a 68 °C, en botellas
con solución Express-Hyb (Clontech). Una vez terminada la hibridación, las membranas se
lavaron a T. amb. con buffer CSS 20X con SDS al 0.05%, y luego se lavaron dos veces más
a 50 °C en buffer CSS (diluido 12200)con SDS al 0.1%. La membrana se expuso a una
película autoradiográfica para detectar la señal del 32Pde las sondas. Antes de hibridar
Laura I. Rutitzkv Capítulo l
nuevamente, la membrana se lavó a 95 °C con una solución de SDS al 5%, y luego se
expuso durante 10 minutos para confirmar la desaparición de la sonda precedente.
Análisis estadístico: Para determinar las diferencias estadísticamente significativas entre los
grupos de ratones, los datos se analizaron con los tests de ANOVA y Student’s t de dos
colas usando el programa de computación Prism versión 3.0. Diferencias entre los datos con
un p < 0.05 se consideraron significativas.
CAPÍTULO II
Efecto de la inmunización de ratones BL/6 conSEA/CFA en el desarrollo de la inmunopatología
asociada con la esquistosomiasis
INTRODUCCIÓN
Un factor importante que todavía no se ha esclarecido en el campo de la
esquistosomiasis es el papel que desempeñan las citoquinas provenientes de las
subpoblaciones de linfocitos Th CD4+ en la inmunopatología de la enfermedad. Se sabe que
los granulomas hepáticos pueden formarse tanto en un ambiente dominado por citoquinas
del tipo Thl como del tipo Th2. Estudios que abordaron este tema demostraron que clones
de linfocitos Thl eran capaces de mediar la formación de granulomas (Chikunguwo,
Kanazawa et al. 1991) y que los linfocitos Thl eran críticos en la fase aguda de la infección
donde se presenta una reacción pro-inflamatoria vigorosa caracterizada por la presencia de
IFN-y e IL-2. Por el contrario, la detección de citoquinas del tipo Th2 (IL-4 e IL-5) en
respuesta al SEA, durante el pico de la formación de granulomas después de 7-8 semanas de
infección, sugirió que estos linfocitos Th2 cumplen un papel patogénico (Pearce, Caspar et
al. 1991). Con el tiempo este concepto se reforzó aun más y se postuló que los linfocitos Thl
inhibían la patología y como consecuencia la estimulación de un fenotipo Thl podía ser
beneficiosa para mejorar y prevenir la enfermedad (Wynn, Eltoum et al. 1994; Wynn,
Cheever et al. 1995). El uso de ratones knock out (KO) para citoquinas no ha aportado
respuestas claras a esta controversia ya que actualmente existen en la literatura varios
artículos que proponen que los linfocitos Th2 son necesarios (Kaplan, Whitfield et al. 1998)
o no (Hernandez, Wang et al. 1997) para la formación de granulomas y que tanto el IFN-y
como la IL-4, influyen en forma positiva o negativa, o son esencialmente neutros en el
desarrollo de las lesiones hepáticas (Wynn, Eltoum et al. 1993; Wynn, Jankovic et al. 1995;
Akhiani, Lycke et al. 1996; Pearce, Cheever et al. 1996; Rezende, Oliveira et al. 1997).
Al analizar la producción de citoquinas por células de GLM de ratones infectados en
respuesta al SEA, se encontró una asociación entre un ambiente dominado por citoquinas
Thl y una inmunopatología aumentada. Del resultado de estos estudios se supo que en los
ratones de baja patología BL/6, la respuesta inicial en la fase aguda es del tipo Th] y que
con el tiempo es reemplazada por una del tipo Th2 (Stadecker y Hernandez 1998), mientras
que en la cepa CBA de alta patología, la respuesta Thl persiste durante el desarrollo de la
respuesta Th2 (Hernandez, Edson et al. 1998) en la fase crónica de la enfermedad.
Laura l. Rutitzkv Capítulo ll
Uno de los pocos estudios en humanos que encontró una correlación de la respuesta
inmune de pacientes con el grado de severidad de la enfermedad causada por S. mansoni en
la fase crónica, mostró que en los pacientes hepatoesplénicos la respuesta inmune era del
tipo Thl y presentaba altos niveles plasmáticos de los receptores de tipo I y II para el TNF,
mientras que los individuos que tenían la enfermedad intestinal, más moderada, pero igual
intensidad de infección (basada en la cantidad de huevos en las muestras de materia fecal)
mostraban una respuesta del tipo Th2 y bajos niveles plasmáticos del receptor soluble para
el TNF (Mwatha, Kimani et al. 1998).
Debido a esta diversidad de las respuestas de citoquinas asociadas a las diferentes
manifestaciones de la enfermedad en los humanos y en las distintas cepas de ratón,
actualmente existen puntos de vista antagónicos respecto del papel que desempeñan las dos
subpoblaciones de linfocitos Th CD4+ en la inmunopatología relacionada con la
esquistosomiasis. En esta controversia, algunos grupos de investigadores en
esquistosomiasis creemos que el mantenimiento de la respuesta pro-inflamatoria Thl es
responsable, en parte, de la mayor patología presente en las cepas de ratón que no se
polarizan completamente hacia un perfil Th2 durante la etapa crónica de la enfermedad.
Actualmente no se conocen con certeza las causas de esta respuesta inmune mixta, como
tampoco se saben los motivos de la variada patogénesis de la enfermedad entre las distintas
cepas de ratón o en los humanos, aunque se cree que éstas se deben no sólo al balance entre
las subpoblaciones de linfocitos Th] y Th2, sino también a la influencia de factores
genéticos del hospedador (Cheever, Duvall et al. 1987; Marquet, Abel et al. 1996; Secor, del
Corral et al. 1996), a la intensidad de la infección (Arap Siongok, Mahmoud et al. 1976), al
reconocimiento por parte de los linfocitos T CD4+ de un repertorio distinto de antígenos
presentes en los huevos del parásito (Hernandez, Trzyna et al. 1997) y a la sensibilización
intrauterina (Montesano, Colley et al. 1999).
Para definir mejor el papel de las citoquinas en la respuesta inmune e
inmunopatología, se inmunizaron ratones de la cepa BL/6 con SEA en CFA una vez antes y
otra vez durante la infección con S. mansoni el propósito de inducir una repuesta de
citoquinas del tipo Thl que se prolongue en el tiempo y se comparó la respuesta inmune y la
inmunopatología de estos ratones con la de los ratones BL/6 no inmunizados cuya respuesta
inicial Thl normalmente cambia a una Th2.
RESULTADOS
- Elección del adyuvante, cantidad de inyecciones y vía de inmunización.
En experimentos piloto se compararon dos adyuvantes distintos, CFA y TiterMax,
para emulsionar al SEA e inmunizar a los ratones de la cepa BL/6. El CFA fue más potente,
ya que indujo una respuesta de citoquinas Thl (por células de GLM estimuladas in vitro con
SEA) más elevada que el TiterMax. Se seleccionó la vía de inyección subcutánea (s.c.) dado
que la vía intraperitoneal (i.p.) causaba, a lo largo de las 7 semanas de infección, peritonitis
con adherencias inflamatorias que impedían la disección de los órganos al momento de
sacrificar a los animales y realizar los experimentos. Del mismo modo, se eligió aplicar dos
inyecciones, una antes y otra durante el transcurso de la infección.
- La inmunización con SEA/CFA exacerba severamente la inmunopatología inducida
por los huevos y aumenta la mortalidad de los ratones.
Los ratones de la cepa BL/6 se separaron en diferentes grupos para ser inmunizados
con SEA/CFA, SEA/PES (grupo SEA) o CFA/PBS (grupo CFA) con el propósito de
estudiar el efecto de estas inmunizaciones en la respuesta inmune y en la inmunopatología
durante la infección con S. mansoni. Llamativamente, en cada uno de los experimentos,
algunos de los ratones que pertenecían al grupo SEA/CFA murieron durante el transcurso de
la 7ma. semana de infección (Tabla I).
TABLA I: Mortalidad de los ratones a las 7 semanas de infección
Grupo de ratones Mortalidad"inmunizado SEA/CFA 12/33”
Buó inmunizado SEA 0/18inmunizado CFA 2/38control 0/24
CBA control 0/20
" número de ratones muertos/número de ratones infectados en cuatro experimentosb Significativamente diferente del grupo BL/6 control (p < 0.01)
Los hígados de los ratones que murieron antes de completar la 7ma. semana de
infección presentaron una marcada inflamación granulomatosa e infiltraciones en el
parénquima hepático, causando necrosis. Mostraron también una dilatación intestinal severa
36
Laura I. Rutitzkv Capítulo II
con hemorragia de la mucosa. Los pulmones de estos mismos ratones exhibieron
infiltraciones densas de células inflamatorias y una gran cantidad de huevos, posiblemente
debido a los “shunts” entre la circulación sistémica y la circulación portal.
Los higados de los ratones del grupo SEA/CFA que completaron las 7 semanas de
infección, también mostraron un sorprendente aumento del tamaño de los granulomas en
comparación con los higados de los ratones de los grupos controles inmunizados y no
inmunizados. Como se muestra en las Figuras 1 y 2, los granulomas de los ratones del grupo
SEA/CFA fueron aproximadamente el doble en tamaño que los granulomas de los ratones
BL/6 controles, y excedieron aun más el tamaño de los granulomas de los ratones de la cepa
CBA que naturalmente desarrollan alta patología. Por el contrario, los granulomas de los
ratones de los grupos controles SEA y CFA no se diferenciaron significativamente en su
tamaño con respecto a los de los ratones del grupo control, no inmunizado. Los granulomas
de los higados de los ratones del grupo SEA/CFA estaban compuestos por una población
mixta de células inflamatorias: eosinófilos, neutrófilos, macrófagos (algunos de ellos con
pigmentos derivados del parásito), y linfocitos, con una expandida matriz extracelular poco
colagenizada que rodeaba a los infiltrados celulares, pero que no parecía cualitativamente
distinta de la de los ratones de los grupos controles. Cabe destacar la presencia de
numerosos focos pequeños de células inflamatorias dispersos por todo el parénquima
hepático. Estos infiltrados intersticiales fueron mucho menos evidentes o fueron inexistentes
en todos los grupos controles.
FIGURA l: Histología hepática a las 7 semanas de infección.
A, se muestra una sección de hígado de un ratón BL/6 del grupo
inmunizado con SEA/CFA donde se observan granulomas
grandes e inflamación intersticial marcada en el parénquima
hepático (indicada con las flechas). En el inserto se muestran con
un aumento mayor los agregados de células inflamatorias. B, se
muestra una sección de hígado de un ratón BL/6 del grupo no
inmunizado control donde se observan granulomas más pequeños
con poca inflamación intersticial en el parénquima. El aumento
utilizado para tomar las fotografias de los paneles A y B fire de
BUG SEA 21.26 :l: ¡.43 ND 3313 2 ¡.97 ND ND NDCFA 27.6] t 6.72 ¡6.28 a 0.74 40.33 a 3.73 ND 8.76 2 2.62 ¡0.95 2 0.73
control 24.22 t 3.40 ¡9.3¡ t 2.6| 39.36 :t 294 38.¡9 t 7. ¡9 ¡3.79 i 2.43 ¡7.02 e l.68
CBA control 42.53 2 5.62 "’ 5.30 t 2. ¡4 ‘" 53.82 2 ¡.00 ‘" 28. ¡4 e 7. ¡2 18.63 a: 3.99 ¡8.53 2 ¡.40
Se cultivaron con SEA las células totales de ganulonns, GLM y bazos durante 36 h y luego se tiñeron con los AcMo anti-CD3 y anti-CD4 o
anti-C03 y anti-CDS. Los porcentajes mostrados pertenecen a hs cálulas presentes en la región de linfoc'nosdefinida en base al tamañoy
la complejidad de las células.
' Significammente diferente del grupo BUó control (p < 0.05)ND = no detennimdo.
DISCUSIÓN
La inmunización con SEA/CFA de ratones BL/6 infectados con esquistosomiasis que
naturalmente desarrollan baja patología, indujo un marcado cambio del perfil de citoquinas
Th2 a un perfil Thl que correlacionó con una exacerbación significativa de la
inmunopatología en estos ratones. Una proporción importante de ratones BL/6 inmunizados
con SEA/CFA murió antes de completar la 7ma. semana de infección. Todos los ratones del
grupo BL/6 SEA/CFA tuvieron más patología hepática, caracterizada por el gran tamaño de
los granulomas alrededor de los huevos del parásito. Hubo también una notoria infiltración
de células inflamatorias mono y polinucleares independiente de los granulomas en el
parénquima. Este marcado incremento en patología no se observó en ninguno de los grupos
controles de ratones BL/6 y fue todavía mayor que en los ratones CBA que normalmente
desarrollan alta patología.
El aumento de la inmunopatología observado en los ratones BL/6 inmunizados con
SEA/CFA se correlacionó claramente con un cambio generalizado hacia un perfil de
citoquinas Thl. Las células de los granulomas, de los GLM y de los bazos estimuladas con
SEA produjeron citoquinas Thl, que contrastaron marcadamente con el perfil Th2 de los
45
Laura l. Rutitzkv Capítulo ll
grupos BL/6 controles no inmunizados o inmunizados sólo con SEA o CFA. Este mismo
patrón cambiado de citoquínas se encontró en cultivos de linfocitos T CD4+ purificados de
los GLM, sugiriendo que fueron estos linfocitos los responsables del perfil modificado de
secreción, dado que estas células son susceptibles a la presencia del antígeno.
No se encontró una diferencia significativa en la proporción de linfocitos T CD4+
presente en los granulomas, GLM o bazos de los ratones BL/6 inmunizados con SEA/CFA
con respecto a los ratones BL/6 de los grupos controles por lo que se infirió que la gran
diferencia en la magnitud de la inmunopatología se asocia con un cambio en la secreción de
citoquínas de una población numéricamente estable de linfocitos T CD4+ específicos para el
SEA. Esta idea se reforzó al no encontrar diferencias en los niveles de proliferación de las
células totales de GLM en respuesta al SEA entre los grupos BL/6 experimental y controles.
Sin embargo, hubo una reducción significativa en la proporción de linfocitos T CD8+ en los
granulomas de los ratones BL/6 inmunizados con SEA/CFA, que no pudo ser atribuida a un
desproporcionado aumento en la proporción de linfocitos T CD4+. Queda todavía sin
explicar si esta reducción en los linfocitos T CD8+ afecta la secreción de citoquínas de los
linfocitos T CD4+ o la formación de los granulomas en este modelo de inmunización, pero la
observación de esta disminución es consistente con la función reguladora que se le adjudicó
a los linfocitos T CD8+ en el proceso de inmunomodulación (Boros 1986; Phillips, Lin et al.
1991; Chensue, Warmington et al. 1993; Pedras-Vasconcelos y Pearce 1996).
El marcado aumento en la inmunopatología como consecuencia de la inmunización
con SEA/CFA en los ratones BL/6 revela algunas diferencias interesantes con la cepa CBA
que naturalmente desarrolla alta patología. En los ratones BL/6 inmunizados con SEA/CFA
las citoquínas Thl reemplazan al característico fenotipo Th2 de esta cepa a las 7 semanas de
infección, mientras que en la cepa CBA (y otra cepa H-Zk)los ratones muestran y mantienen
una aumentada y mezclada producción de citoquínas de los dos tipos, Thl y Th2
(Hernandez, Edson et al. 1998). Además, la exacerbada patología en los ratones BL/6
inmunizados con SEA/CFA no está asociada con un cambio en la proporción de linfocitos T
CD4+, mientras que en la cepa CBA, estas células son proporcionalmente el doble entre la
población de linfocitos T de los granulomas.
Los ratones CBA y los BL/6 SEA/CFA son así dos ejemplos de inmunopatología
severa en la esquistosomiasis experimental. La inmunopatología en los ratones CBA parece
46
Laura l. Rutitzkv Capítulo ll
estar basada en la presencia de un número elevado de linfocitos T CD4+ activados que está
determinado genéticamente, mientras que en los ratones BL/6 SEA/CFA la exacerbada
inmunopatología es producto de la inmunización con el antígeno específico en combinación
con un adyuvante potente, pero por ninguno de estos dos factores por sí solos, que conduce a
una inversión hacia un perfil de citoquinas Thl producidas por los linfocitos T CD4+.
Los linfocitos T son capaces de cambiar la polarización de citoquinas, sin embargo
todavía no se conocen con exactitud los factores que determinan un dado patrón de
expresión y secreción y es muy probable que se deba a varios mecanismos distintos
(Constant y Bottome 1997; Kelso 1999; Murphy, Ouyang et al. 2000). Es posible también
que las poblaciones de linfocitos T CD4+polarizadas induzcan a e interactúen con CPA que
presentan distintas formas de activación y distintas propiedades (Goerdt y Orfanos 1999;
Stadecker 1999). Más allá de estos aspectos, ambos modelos de alta patología tienen en
común la presencia del llamativo y más o menos dominante componente de citoquinas Thl.
En resumen, estos resultados indican que un ambiente dominante en citoquinas Thl
es compatible con, sino directamente asociado al desarrollo de la enfermedad severa y la
muerte. Aunque esta idea no sea consistente con la noción previa de que los linfocitos Thl
inhiben la patología en la esquistosomiasis (Wynn, Eltoum et al. 1994), los resultados
presentados aquí no niegan que sea posible el desarrollo de los granulomas en un ambiente
dominado por citoquinas Th2. De hecho, los fenotipos Thl o Th2 parecen estar asociados
con la inducción de formas particulares de inmunopatología. En un ambiente Thl, los
granulomas que se forman alrededor de los huevos de los esquistosomas están menos
circunscriptos, están generalmente acompañados por grandes modificaciones en el
parénquima hepático que los rodea; los hígados presentan infiltraciones inflamatorias en los
lóbulos con daño hepatocelular y necrosis; condiciones que pueden resultar en la muerte
prematura del animal infectado (Brunet, Finkelman et al. 1997; Hernandez, Sharpe et al.
1999). Por el contrario, un ambiente Th2 induce a la formación de granulomas mejor
conformados, más fibróticos (Chiaramonte, Donaldson et al. 1999; Fallon, Richardson et al.
2000) con poco daño hepatocelular a su alrededor lo que lleva a una supervivencia más larga
del animal infectado. Este concepto está de acuerdo con estudios recientes realizados en
individuos infectados con esquistosomiasis, en los que pacientes con la forma
hepatoesplénica, más severa de la enfermedad, mostraron un ambiente polarizado hacia un
47
Laura I. Rutitzkv Capítulo ll
perfil de citoquinas Thl (Mwatha, Kimani et al. 1998), mientras que en los pacientes con la
enfermedad menos severa, la forma intestinal, se observó un ambiente dominante en
citoquinas Th2, anti-inflamatorias (Araujo, de Jesus et al. 1996; Malaquias, Falcao et al.
1997). Entre las citoquinas Th2, la IL-lO cumple un papel regulador de la función in vitro de
linfocitos T CD4+ específicos para el SEA provocando una inhibición de la secreción de
citoquinas pro-inflamatorias y regulando negativamente la expresión de las moléculas B7 en
las CPA. Del mismo modo, la IL-lO suprime in vivo la patología en el modelo murino de la
enfermedad ya que el tratamiento con la proteína de fusión IL-lO-Ig inhibe la formación de
los granulomas en los ratones infectados (Flores Villanueva, Reiser et al. 1994; Flores
Víllanueva, Zheng et al. 1996; Bosshardt, Freeman et al. 1997; Falcao, Malaquias et al.
1998). La IL-lO también fue asociada con el desarrollo de la enfermedad menos grave,
intestinal, en la esquistosomiasis humana (Malaquias, Falcao et al. 1997; Correa-Oliveira,
Malaquias et al. 1998; Montenegro, Miranda et al. 1999).
En conclusión, estos resultados obtenidos de los experimentos realizados con ratones
infectados de la cepa BL/6 de baja patología, describen una forma específica de
inmunización que lleva a una significativa exacerbación de las manifestaciones
inmunopatológicas de la enfermedad y a la muerte de los ratones, en un contexto
caracterizado por una inversión en la secreción de citoquinas hacia un perfil Thl. Estos
resultados implican que las estrategias para promover un fenotipo Th2 podrían resultar en
una mejoría general de la inmunopatología asociada con la forma severa de la
esquistosomiasis y aclaran la controversia a la que se hizo mención en la introducción de
este capítulo respecto del papel que cumplen las subpoblaciones Thl y Th2 de linfocitos T
CD4+en la inmunopatología de la esquistosomiasis murina.
CAPÍTULO III
Papel de la apoptosis de los linfocitos T CD4+ de losgranulomas hepáticos en las cepas de ratones que
desarrollan alta y baja patología en esquistosomiasis
INTRODUCCIÓN
Las cepas de ratones BL/6 y CBA representan dos ejemplos polares de
inmunopatología en la esquistosomiasis experimental. Hasta el momento no se conocen
muchas de las razones por las cuales estas cepas de ratones desarrollan distintos tipos de
inmunopatología cuando son sometidas a la misma carga parasitaria. Así como diferentes
patrones de citoquinas (Stadecker y Hernandez 1998) o diferentes respuestas a antígenos del
huevo (Hernandez, Edson et al. 1998) cumplen un papel decisivo en dirigir la respuesta
inflamatoria granulomatosa, los posibles mecanismos efectores que se utilizan para llevar a
cabo esto todavía no han sido esclarecidos. Uno de estos posibles mecanismos es la
apoptosis de los linfocitos T CD4+ que median la inmunopatología asociada con la
enfermedad.
La apoptosis o muerte celular programada, generalmente dependiente de los niveles
locales de la citoquina IL-2, puede ocurrir tanto en forma activa, a través de señales
iniciadas por un receptor de membrana (muerte inducida por activación, o muerte por
instrucción) o en forma pasiva, a través de la pérdida de señales de transducción debido a la
falta de factores de crecimiento que promueven la supervivencia de las células (Van Parijs,
Biuckians et al. 1998; Van Parijs, Peterson et al. 1998; Lenardo, Chan et al. 1999; Rathmell
y Thompson 2002). Como ejemplos, en el proceso de selección tímica o luego de la
expansión clonal inducida por el antígeno, la apoptosis cumple un papel importante en
remover los linfocitos T. En el primer caso se produce apoptosis por mecanismos pasivos y
en el segundo caso, por mecanismos activos.
Ha sido demostrado que muchos patógenos son capaces de desarrollar mecanismos
que promueven la muerte de ce'lulas linfoides (Lopes, da Veiga et al. 1995; Kalinkovich,
Weisman et al. 1998; Martins, Cardoso et al. 1998; Desbarats, Stone et al. 2000; Sanchez
Torres, Rodriguez-Ropon et al. 2001; Wipasa, Xu et al. 2001; Jenson, O'Connor et al. 2002).
En esquistosomiasis, también se postuló la presencia de apoptosis en linfocitos (Rumbley,
Zekavat et al. 1998; Lundy, Lerman et al. 2001). Esta idea fue más tarde reforzada por la
observación de que los linfocitos T de pacientes con esquistosomiasis intestinal son más
susceptibles a apoptosis que los linfocitos T de pacientes con la forma hepatoesplénica grave
(Carneiro-Santos, Martins-Filho et al. 2000). Como mecanismos, se propusieron a las
49
Laura I. Rutitzkv Capítulo III
citoquinas IL-4 e IL-lO (Estaquier, Marguerite et al. 1997; Lundy y Boros 2002) y al sistema
Fas/FasL (Lundy, Lerman et al. 2001; Rumbley, Sugaya et al. 2001) como inductores de la
apoptosis de los linfocitos T.
Debido a la disparidad en las manifestaciones de la enfermedad entre las distintas
cepas de ratón, podría pensarse que la apoptosis de linfocitos T CD4+, si fuera relevante para
el desarrollo de la inmunopatología, variaría de acuerdo al background genético del
hospedador. Por esto la comparación de la apoptosis de linfocitos provenientes de
granulomas de ratones que desarrollan alta y baja patología y el conocimiento del
mecanismo apoptótico por el cual esos linfocitos mueren, podrían aportar interesantes
resultados.
RESULTADOS
- Los ratones infectados de las cepas BL/6 y CBA presentan diferencias en la
inmunopatología y en algunos parámetros inmunológicos de los linfocitos T.
Como se mencionó en la introducción general, el tamaño de los granulomas se usa
comúnmente como un indicador de la severidad de la enfermedad en los ratones infectados
con esquistosomas (Cheever, Duval] et al. 1987). A partir de los datos de varios
experimentos, se confirmó que 8 semanas después de la infección, en el momento del pico
de la respuesta inmune, los granulomas hepáticos de los ratones de la cepa BL/6 son
significativamente menores que los granulomas hepáticos de los ratones de la cepa CBA
(Figura 1A). El análisis por citometría de flujo de las células que componen los granulomas
mostró que existe una menor proporción de linfocitos T CD4+ en los ratones BL/6 que en los
ratones CBA (Figura 1B). También se observó que la proliferación celular en respuesta al
SEA, luego de realizar la necesaria depleción de las células inhibitorias adherentes de los
granulomas (Flores Villanueva, Harris et al. 1994), estaba marcadamente disminuida en las
células provenientes de cepa BL/6 (Figura 1C). En cambio, en las células de los GLM de las
dos cepas de ratones, se observó una proporción similar de linfocitos T CD4+ (Figura 1D),
pero la cepa BL/6 también mostró niveles significativamente más bajos de proliferación
celular comparados con los de la cepa CBA (Figura IE).
50
WO...
Laura I. Rutítzky Capítulo Ill
Para explicar la diferencia en el tamaño de los granulomas, el menor porcentaje de
linfocitos T CD4+ en los granulomas y la desproporcionada disminución en la respuesta
proliferativa de las células de los ratones infectados BL/6, se investigó la apoptosis de los
linfocitos T CD4+ como un posible mecanismo que opere diferencialmente en cada una de
estas dos cepas estudiadas.
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Tambodogranulams
(wn‘x10‘)
o sus cu
CG BL/6 CG CBA
:oooo+ CGBUG
E -o—CG CBA«l a zooooi 1'3 i
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0.1115 0.31: 1.25 5 zo
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1zoooo+CGLM BUG
E —°—CGLM CBA
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FIGURA l: Tamaño de los granulomas hepáticos y parámetros inmunológicos de los linfocitos T en los ratones BL/6y CBA a las 8 semanas de infección. A, Tamaño de los granulomas hepáticos. Las barras representan las medias de lasáreas i ES de 75 a 100 granulomas/grupo, cada grupo estuvo conformado por 5-10 ratones. Los granulomas de los ratonesBL/ó fueron significativamente más chicos que los de los ratones CBA (p < 0.001). B, Proporción de linfocitos CD3+CD4+en los granulomas ex vivo. Los resultados mostrados son porcentajes de linfocitos CD3+CD4+ en la región de linfocitos,definida en base al tamaño y a la complejidad de las células. Los ratones BL/6 tienen menor proporción de linfocitos TCD4+ que los ratones CBA. C, Proliferación de las células no-adherentes de los granulomas. Los resultados mostrados estánexpresados como la media de CPM de determinaciones en triplicados d:ES. La respuesta proliferativa de las células de losratones BL/6 fue significativamente más baja que la de los ratones CBA (p < 0.01). D, Proporción de linfocitos CD3‘“CD4+en los GLM vivo. Los resultados mostrados son porcentajes de linfocitos CD3+CD4+ en la región de linfocitos, definida enbase al tamaño y la complejidad de las células. E, Proliferación de las células totales de los GLM. Los resultados estánexpresados como la media de CPM de determinaciones en triplicados i ES. La respuesta proliferativa de las células de losratones BL/6 fue significativamente más baja que la de los ratones CBA (p < 0.001). CG = células de granulomas. CGLM =células de ganglios linfáticos mesentéricos.
51
Laura I. Rutitzkv Capítulo Ill
- La apoptosis de los linfocitos T CD4+es significativamente más alta en los ratones
infectados BL/6, de baja patología.
A través del análisis de los niveles de apoptosis por medio de la técnica de TUNEL
(del inglés Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP Nick End
Labeling), se encontró que los linfocitos T CD4+ de granulomas de la cepa BL/6 presentan
significativamente más apoptosis que las mismas células de los ratones CBA. Esta diferencia
en apoptosis fue consistente durante la 7ma. y 9na. semana de infección, las cuales están
caracterizadas por presentar el pico en el proceso de formación de los granulomas y,
permaneció hasta la semana 11era., durante la fase temprana de inmunomodulación (Figura
2A). El porcentaje de linfocitos T CD4+ apoptóticos en las células provenientes de los
granulomas incrementó aun más después de un cultivo de 36 h (Figura 2C). La detección de
la apoptosis tanto ex vivo (Figura 2B) como después del cultivo de 36 h en presencia (Figura
2D) o ausencia de SEA en células aisladas de los GLM de ratones infectados, también
mostró un mayor porcentaje de linfocitos T CD4+ apoptóticos en la cepa BL/6, aunque la
diferencia no fue tan pronunciada como en las células de los granulomas. Cabe destacar que
la estimulación antigénica in vitro no tuvo influencia en los resultados ya que los niveles de
apoptosis de linfocitos T CD4+ de los granulomas o de los GLM fueron esencialmente los
mismos en presencia o ausencia de SEA en todas las semanas de infección estudiados (datos
no mostrados).
- BUG E CBA FIGURA2: Porcentajede linfocitosT CD4+apoptóticos en granulomas y en GLM deratones BL/6 y CBA infectados. Los linfocitosCD3+CD4+ provenientes de los granulomas (A)o de los GLM (B) de los ratones BL/6 muestranex vivo niveles de apoptosis significativamente
Ex vivo más altos que las mismas células de los ratonesCBA en todos los tiempos de infecciónestudiados (p < 0.05). Los linfocitos CD3+CD4+provenientes de los granulomas (C) o de losGLM (D) de los ratones BL/6 muestran, despuésde 36 h de cultivo en presencia de SEA, nivelesde apoptosis significativamente más altos quelas mismas células de los ratones CBA en todoslos tiempos estudiados (todos los p < 0.05). Las
so 50 35h de cum“, barras representan medias de porcentajes delinfocitos T CD3+CD4+ apoptóticos i ES de
Células de granulomas Células de GLM
%decélulasapoptóticasCDs+CD4+
40 40
lo 3° entre 2 y ll experimentos realizados en formaindependiente para cada tiempo de infección y
2° 2° cada condición.
10 10
0 O
7 s 9 11 7 a
Semanas después de la infección
- La apoptosis de los linfocitos T CD4+de la cepa BL/6 no está mediada por Fas y FasL.
Como paso siguiente se estudió el mecanismo que induce la apoptosis de los
linfocitos T CD4+ de los granulomas de los ratones BL/6.
La apoptosis inducida por activación de las células es un mecanismo que puede
involucrar distintos receptores de membrana. En el caso de los linfocitos T CD4+ periféricos,
este mecanismo está generalmente inducido por el receptor Fas (CD95, APO/l), que es un
miembro de la familia de receptores de TNF (Lenardo, Chan et al. 1999). El hecho de no
haber encontrado diferencias en los niveles de apoptosis entre las células que habían sido
cultivadas con o sin SEA, junto con la baja expresión de los marcadores de activación CD25
(Nelson y Willerford 1998; Papiemik, de Moraes et al. 1998) y CD69 (Ziegler, Ramsdell et
al. 1994) por parte de los linfocitos T CD4+ de los granulomas y de los GLM de la cepa
BL/6 (Tabla I) comparado con la cepa CBA, sugirió que la apoptosis observada en esta cepa
no era debido a la activación de estas células. Sin embargo, se estudió formalmente el
mecanismo Fas/FasL especialmente porque ya había sido implicado en la apoptosis de
linfocitos T CD4+ de bazos de ratones infectados con esquistosomiasis (Lundy, Lerman et
al. 2001; Lundy y Boros 2002). El análisis de las células de los granulomas por citometría de
flujo después de 36 h de cultivo en presencia de SEA mostró un porcentaje
significativamente menor en la expresión de Fas en los linfocitos CD3+CD4+ de la cepa
BL/6. La expresión de FasL fue también significativamente menor en las células de los
granulomas de la cepa BL/6 comparado con la cepa CBA que presenta baja apoptosis
(Figura 3A). El estudio de la apoptosis en células de granulomas aisladas de ratones BL/6
infectados y deficientes en Fas (BL/6 Ipr) o FasL (BL/6 gld) mostró que no hubo diferencias
significativas respecto de los BL/6 WT control (Figura 3B). El tamaño de los granulomas
hepáticos entre estos tres grupos tampoco difirió significativamente luego de 8 semanas de
infección (Figura 3C). Claramente, estos resultados indican que Fas y FasL no controlan la
apoptosis de los linfocitos T CD4+ de los granulomas de ratones de la cepa BL/6 y tampoco
intervienen en la formación de los granulomas hepáticos.
53
MCU...CC..."'C‘
Laura l. Rutitzkv Capítulo III
TABLA I: Expresión ex vivo de los marcadores de activación CD25 y CD69 en los linfocitos T CD4+de
los ratones BL/6 y CBA infectados durante 8 semanas.
Células de los granulomas
CBA BL/6 CBABL/6
Células de los GLM
CD25 (%) 12.68 á: 2.31
CD69 (%) 54.6 :l:0.36a 79.2 i 1.7
18.05 i 0.47 11.28 i 1.37 12.5 i 0.68
25.9i 3.62 35.75i 3.98
Los resultados son medias de porcentajes i DS de 2-3 experimentos independientes.Los porcentajes son en base a las células presentes en al región de linfocitos.aSignificativamente diferente del grupo CBA (p < 0.05).
A
70 - CGBUG5° * :1 CGCBA
É 50
¡,3 4oO
g 303a 20
*10
0CD3+CD4+Fas+ FasL+
B
BLIGWT BL/6 Ipr Bus gId
i
gi w gg 3 ¿il 25.00 % g«3 i z
al mitL
I VApoptOSIs
C15 - susWT
_ BLI6Ipr¡zi BLI6gld
.n o
Tamañodegranulomas
(¡imzx10‘)
0|
FIGURA 3: Expresión de Fas y FasL en losgranulomas de los ratones BL/6 y CBA infectadosdurante 8 semanas y el papel de Fas y FasL en laapoptosis de los linfocitos T CD4+ y en lainmunopatología hepática de ratones BL/6 WT,BL/6 lpr y BL/6 gld infectados durante 8 semanas.A, Los linfocitos T CD3‘LCD4Jrde los granulomas delos ratones BL/6 expresan significativamente menosFas que las mismas células de los ratones CBA. Lascélulas totales de los granulomas de los ratones BL/óexpresan significativamente menos FasL que lascélulas totales de los granulomas de los ratones CBA(ambos p < 0.01). Las barras representan las mediasde porcentajes i ES de 3-6 experimentosindependientes. B, Los histogramas muestranporcentajes de apoptosis de linfocitos CD3+CD4+ delos granulomas en cada uno de los grupos de ratonesinfectados durante 8 semanas. Los niveles deapoptosis no difieren significativamente entre los tresgrupos. La línea punteada indica el control negativode la técnica de TUNEL sin la enzima TdT como seindica en Materiales y Métodos. C, Tamaño de losgranulomas hepáticos en los mismos tres grupos deratones BL/6. Las barras representan medias deltamaño de los granulomas hepáticos en cada uno delos grupos de ratones. Las diferencias entre los gruposno fueron estadísticamente significativas. CG =células de granulomas.
54
- La apoptosis de los linfocitos T CD4+de la cepa BL/6 no está mediada por linfocitos T
CD8+.
Los linfocitos T CD8+ han sido involucrados en la modulación negativa de la
respuesta inmune e inmunopatología en la esquistosomiasis murina (Phillips, Lin et al. 1991;
Chensue, Warmington et al. 1993; Pedras-Vasconcelos y Pearce 1996). Por lo tanto, se
consideró la posibilidad de que estas células puedan ejercer su función promoviendo la
apoptosis de los linfocitos T CD4+ patogénicos. Esta consideración se basó en que los
granulomas de la cepa BL/6 presentan una mayor proporción de linfocitos T CD8+ que los
granulomas de la cepa CBA (Figura 4A). Sin embargo, la deplecíón de linfocitos T CD8+
no tuvo efecto en los niveles de apoptosis de los linfocitos T CD4+ después de que las
células hayan sido cultivadas durante 36 h. Este resultado se obtuvo tanto en células
provenientes de la cepa BL/6 como provenientes de la cepa CBA (Figura 4B).
Para estudiar in vivo la función de los linfocitos T CD8+ en la apoptosis de linfocitos
T CD4+, se infectaron ratones de la cepa BL/6 KO para el gen [32microglobulina (Bzm), que
no expresan las moléculas del CMH de clase I en sus células y por consiguiente no
desarrollan linfocitos T CD8+. En este caso, se observó que los ratones deficientes en las
moléculas del CMH de clase I infectados después de 8 semanas con S. mansoni mostraron
los mismos niveles de apoptosis en los linfocitos T CD4+ aislados de los granulomas que las
mismas células aisladas de los ratones BL/6 WT después de haber sido cultivadas durante 36
h en presencia de SEA. Ambos grupos BL/6 mostraron significativamente más apoptosis
que el grupo CBA (Figura 4C). En este caso tampoco hubo diferencia en el tamaño de los
granulomas entre el grupo BL/6 deficiente en linfocitos CD8+, y el grupo BL/6 WT control.
Estos resultados demuestran claramente que los linfocitos T CD8+ no regulan la apoptosis de
los linfocitos T CD4+ y tampoco intervienen en la formación de los granulomas hepáticos de
los ratones de la cepa BL/6.
Laura I. Rutitzky Capítulo lll
A CG BL/6 CG CBA
FIGURA 4: Linfocitos T CD8+ en losgranulomas de los ratones BL/6 y CBA y supapel en la apoptosis de los linfocitos TCD4+ in vitro e in vivo en ratones infectadosdurante 8 semanas. A, Proporción delinfocitos T CD3+CD8+ en los granulomas.Los resultados mostrados son porcentajes de
"ïg‘fi'""“ïV'mgy de linfocitos CD3+CD8+ en la región de“WDS” linfocitos, definida en base al tamaño y
complejidad de las células. Los ratones BL/6B tienen mayor proporción de linfocitos T
CD3+CD8+ que los ratones CBA. B, Lascélulas de los granulomas de los ratones BL/6
Anti-CDS-'>Anti-C03->
w -CG totalesBUS y CBA se depletaron (depl.) o no de linfocitos
ao fágll'egecgiaBus T CD8.+ y cultivadas durante 36 h ence depl.decoaCBA presenc1a de SEA. Los resultados muestran el
porcentaje de linfocitos T CD4+ apoptóticosen cada grupo celular. La apoptosis delinfocitos T CD4+ no fue afectada por la
° depleción de linfocitos T CD8+ en ninguna delas dos cepas de ratones. C, La apoptosis delinfocitos T CD4+ de los granulomas después
c de 36 h de cultivo con SEA de los dos gruposde ratones BL/6 no fue significativamente
%decélulasapoptóticas
coa+cn4+
N a
r, -ce sus . . . .g 25 WCG BusKoparaCM“dm] distinta entre ellos y ambas Idifirleronrá; ¡o :¡cc CBA s1gn1ficat1vamente de la apoptOSIS de losÉs 15 linfocitos T CD4+ de los ratones CBA (p <2 ri 0.01 .És 1o )0
.3oo
- Las células de los granulomas y de los ganglios linfáticos mesentéricos de la cepa BL/6
producen niveles significativamente más bajos de las citoquinas Thl IL-2 e IFN-y que
las mismas células de la cepa CBA.
La disponibilidad de factores de crecimiento es indispensable para mantener la
Viabilidad de las células; en el caso de los linfocitos T, las citoquinas son esenciales para
promover la expresión de moléculas anti-apoptóticas como Bcl-2 y Bcl-X (Rathmell y
Thompson 2002). Dado que los resultados anteriores parecen excluir a la activación como
56
Laura I. Rutitzkv Capítulo lll
mecanismo inductor de la apoptosis en los linfocitos T CD4+ de los granulomas de los
ratones BL/6, se investigó si la causa no podía estar relacionada a una insuficiente
producción de citoquinas. Para ello, se estudió la respuesta de citoquinas al SEA de las
células aisladas de los granulomas y de los GLM de ratones BL/6 y CBA infectados durante
8 semanas, utilizando la técnica de ELISA para medir la concentración de las citoquinas en
sobrenadantes de cultivo. Los resultados mostraron que tanto las células de los granulomas
como las de los GLM de los ratones BL/6 estimuladas con SEA entre 24 y 48 h, produjeron
significativamente menos IL-2 e IFN-y que las mismas células de los ratones CBA. La
producción de IL-5 e IL-lO no difirió significativamente entre las dos cepas en ninguna de
las dos poblaciones celulares estudiadas (Figura 5).
A- CGBLIGEICG CBAfi nN
ao ¡_|
CIIN.E:15'g 0.60
g É. 0.5c a 0.429 co y 0.3N.‘s 0.25o 0.1
5 o oo ’ lL-2 [FN-y IL-5 lL-10
- CGLMBLIGB I::| CGLMCBA
I’ll']N
¿o ¡__..|
Concentracióndecitoquinas
(ng/ml)
°.0.o.°.0N¡A¿hIllm
oo oa
lL-2 IFN-‘y L-5 |L-10
FIGURA 5: Producción de citoquinas por las células de los granulomas y de los GLM de los ratonesBL/6 y CBA a las 8 semanas de infección. A, los resultados muestran los niveles de citoquinasproducidos por las células de los granulomas en respuesta a la estimulación con SEA después de 36 h decultivo. Cada barra representa la media de determinaciones en triplicados i ES. Los niveles de IL-2 eIFN-y fueron significativamente menores en el grupo BL/6 que en el grupo CBA (p < 0.05), los niveles deIL-5 e IL-lO no fueron significativamente distintos entre los dos grupos. B, los resultados muestran losniveles de citoquinas producidos por las células de los GLM en respuesta a la estimulación con SEAdespués de 24 h (para la IL-Z) o de 48 h de cultivo (para le IFN-y, la IL-S y la IL-lO). Cada barrarepresenta la media de determinaciones en triplicados 2+:ES. Se restaron los niveles de las citoquinas encultivos no estimulados con el antígeno. Los niveles de IL-2 e IFN-y fueron significativamente menoresen el grupo BL/6 que en el grupo CBA (p < 0.01), los niveles de lL-5 e IL-lO no fueronsignificativamente distintos entre las dos cepas. CG = células de granulomas. CGLM = células de ganglioslinfáticos mesente’ricos.
Laura l. Rutitzkv Capítulo lll
- La apoptosis de los linfocitos T CD4+ productores de citoquinas es mayor en las
células de los granulomas de los ratones BL/6.
La producción de las cuatro citoquinas, IL-2, IFN-y, IL-S e IL-lO se estudió con
mayor detalle, a nivel intracitoplasmático, por medio de citometría de flujo para analizar
cómo el ambiente afecta la viabilidad de las células que conforman la lesión granulomatosa.
Este estudio se llevó a cabo cultivando las células de los granulomas en presencia de SEA
durante 24-36 h seguido de una re-estimulación de 5 h con PMA y ionomicina, y monensina
que inhibe la secreción celular. Las células luego se tiñeron con el colorante para detectar al
ADN dañado 7-AAD, el AcMo anti-CD4 y los AcMo específicos para las distintas
citoquinas. Los datos en la Tabla II muestran que hubo un mayor porcentaje de linfocitos T
CD4+Thl y Th2 apoptóticos en los granulomas de los ratones BL/6 que, junto con el menor
porcentaje de linfocitos T CD4+ (Figura 1B), se correlacionó bien con la marcada
disminución de los niveles de citoquinas en los sobrenadantes de cultivo (Figura 5A). Es
importante destacar que la mayor diferencia en la producción de citoquinas entre los
linfocitos T CD4+ apoptóticos y viables, entre los ratones BL/6 y CBA, se observó en las
células productoras de IL-2, ya que un 77% de los linfocitos T CD4+ que producían IL-2
eran apoptóticos en la cepa BL/6 mientras que sólo el 37% de ellos resultó apoptótico en la
cepa CBA.
TABLA Il: Porcentajes de linfocitos T CD4+viables y apoptóticos productores de citoquinas en los
granulomas hepáticos de los ratones BL/ó y CBA infectados durante 8 semanas.
- El agregado in vitro de IL-2 recombinante previene la apoptosis de los linfocitos T
CD4+de los granulomas hepáticos de la cepa BL/6.
Los niveles bajos de la citoquina IL-2 y la viabilidad disminuida de los linfocitos T
CD4+ de los ratones BL/6 tienen una importancia especial ya que la IL-2 y una de sus
citoquinas asociadas, la IL-lS, son los principales factores de crecimiento para los linfocitos
58
Laura I. Rutitzkv Capítulo III
T (Waldmann, Tagaya et al. 1998). Para estudiar si hubo un efecto directo entre la gran
proporción de linfocitos T CD4+ apoptóticos y los bajos niveles de IL-2, se agregó en forma
exógena IL-2 rm a cultivos de células de granulomas, las cuales previamente habían sido
seleccionadas por ser no apoptóticas en base a la marcación negativa para el colorante 7—
AAD. Las células utilizadas se aislaron de los granulomas hepáticos de ratones de la cepa
BL/6 infectados durante 8 semanas. Se hizo un cultivo de 48 h en ausencia o presencia de
diferentes concentraciones de mr IL-2 y se midieron, por medio de la te’cnicade TUNEL, los
niveles de apoptosis en los linfocitos T CD4+. Como se muestra en la Figura 6, la presencia
de lL-2 rrn redujo hasta un 45% el porcentaje de apoptosis en los linfocitos T CD4+. Esta
disminución de apoptosis en presencia de IL-2 rm fue revertida con el agregado de un AcMo
neutralizante de la actividad de la IL-2. Cabe destacar que el agregado de IL-2 rm no
modificó el número total de ce'lulas recuperadas después de las 48 h de cultivo, demostrando
que la disminución en apoptosis no fue causada por un aumento de la cantidad de células
debido a la proliferación en respuesta a la IL-2. La reducción de apoptosis por acción de la
IL-2 rm fue más significativa que la que se observó por el efecto del agregado de IL-15 rm.
Se probó también el agregado de IL-4 rm, ya que esta citoquina es un importante factor de
crecimiento para linfocitos Th2 (Murphy y Reiner 2002), pero no tuvo ninguna
consecuencia sobre la apoptosis (Figura 7). Varios intentos de rescatar a los linfocitos T
CD4+ de la cepa BL/6 de la apoptosis utilizando sobrenadantes de cultivo provenientes de
células de la cepa CBA fracasaron, posiblemente debido a que la concentración final o la
estabilidad en solución de los factores de crecimiento no fue suficiente como para ejercer un
efecto biológico (datos no mostrados).
FIGURA 6: Efecto del agregado de IL-245 rm in vitro en la apoptosis de los linfocitos4o T CD4+ de los granulomas de los ratones35 BL/6 infectados durante 8 semanas. Las
barras representan medias de porcentajes delinfocitos T CD4+ apoptóticos i DS dedeterminaciones en duplicados de unexperimento representativo de tres. Elporcentaje de linfocitos T CD4+ apoptóticosdisminuyó significativamente en presencia de50 U/ml y 100 U/ml de IL-2 rm (ambos p <
- 50 100 100 100 |L-2 rm (Ulml) 0.05)
¿ANNM 0010010
%decélulasapoptóticas
C03+CD4+
001
- - - 100 400 AcMo anti IL-2 (ng/ml)
59
Laura I. Rutitzky Capítulo III
%decélulasapOptóticas
CD3+CD4+
20
IL-15 rm (ng/ml)
%decélulasapoptóticas
c03+co4+
10020
lL-4 rm (ng/ml)
FIGURA 7: Efecto del agregado de lL-15 rm e IL-4 rm in vitro en la apoptosis de los linfocitos T CD4+de los granulomas de los ratones BL/6 infectados durante 8 semanas. A, La adición de IL-15 rm in vitroinhibe la apoptosis de los linfocitos T CD4+ de los granulomas de los ratones BL/6 infectados. Las barrasrepresentan medias de porcentajes de linfocitos T CD4+apoptóticos i DS de determinaciones por duplicado deun experimento representativo de tres. El porcentaje de linfocitos T CD4+ apoptóticos disminuyósignificativamente con el agregado de 100 ng/ml de IL-15 rm (p < 0.05). B, La adición de IL-4 rm in vitro noinhibe la apoptosis de los linfocitos T CD4+ de los granulomas de los ratones BL/6 infectados. Las barrasrepresentan medias de porcentajes de linfocitos T CD4+apoptóticos i DS de determinaciones en duplicados deun experimento representativo de tres. El porcentaje de linfocitos T CD4+ apoptóticos no varió con el agregadode concentraciones distintas de IL-4 rm.
- La administración in vivo de IL-2 recombinante reduce significativamente la
apoptosis de los linfocitos T CD4+y exacerba la inmunopatología en los ratones BL/6.
Para estudiar si la IL-2 desempeña un papel regulador en la apoptosis de los
linfocitos T CD4+ in vivo, se inyectaron cantidades crecientes de IL-2 rh por vía i.p. en
ratones BL/6 durante la 5ta. y 8va. semana de infección. A las 8 semanas se sacrificaron los
ratones y se midió la apoptosis de los linfocitos T CD4+ por medio de la técnica de TUNEL.
Como se muestra en la Figura 8A, la proporción de linfocitos T CD4+ que se encontraban
apoptóticos ex vivo fue significativamente menor tanto en los granulomas como en los GLM
60
Laura I. Rutitzkv Capítulo Ill
del grupo de animales BL/6 tratados con la IL-2 rh. Llamativamente, esta disminución en los
niveles de apoptosis estuvo acompañada por un significativo agrandamiento del tamaño de
los granulomas hepáticos en el grupo BL/6 tratado con IL-2 rh (Figura 8B). Estos resultados
demuestran claramente que la IL-2, per se, puede prevenir el desarrollo de apoptosis en
linfocitos T CD4+ lo cual conlleva a una exacerbación de la inflamación granulomatosa en
los hígados de los ratones infectados de la cepa BL/6.
A
3 7.g - Notratado"og 6 mTratado con IL-29.3 5(B a) 4II)
L; 8a o 30o 2'U
.\° 1
occ; CGLM
15g - Notratadog m Tratado con IL-2É B10N v5, ><a, N
z: 5 5¡CtuE(B¡_
0
FIGURA 8: Efecto del tratamiento in vivode ratones infectados BL/6 con IL-2 recombinante humana enla apoptosis de linfocitos T CD4+ de granulomas y en la inmunopatología hepática. A, Los resultadosmuestran porcentajes de linfocitos T CD4+ apoptóticos de granulomas y de los GLM, ex vivo, en grupos deratones BL/6 tratados o no con IL-2 rh. El porcentaje de linfocitos T CD4+ apoptóticos disminuyósignificativamente en los ratones tratados con IL-2. Las barras representan medias de porcentajes de linfocitosT CD4+apoptóticos de determinaciones en duplicados de un experimento representativo de dos realizados (p <0.01). B, Se evaluó el tamaño de los granulomas hepáticos en los mismos dos grupos de ratones. Losgranulomas del grupo BL/6 tratado con IL-2 rh fueron significativamente más grandes que los granulomas delgrupo BL/ó no tratado a las 8 semanas de infección (p < 0.001). Las barras representan medias de las áreas de70-90 granulomas medidos por grupo i ES.
61
DISCUSIÓN
En este capítulo se examinó la apoptosis de los linfocitos T CD4+ presentes en los
granulomas de los higados de ratones infectados con S. mansoni como un mecanismo
efector que explique las diferencias en la respuesta inmune y en la inflamación
granulomatosa entren las cepas BL/6, de baja patología, y CBA, de alta patología. Los
resultados muestran una mayor proporción de linfocitos T CD4+ apoptóticos en los
granulomas y en los GLM de los ratones BL/6 que de los ratones CBA infectados. Estos
resultados indican que la magnitud de la inmunopatología mediada por los linfocitos T CD4+
se correlaciona inversamente con los niveles de apoptosis de estas mismas células. La falta
de efecto de la estimulación antigénica sobre los niveles de apoptosis junto con la menor
expresión del receptor Fas, del receptor de alta afinidad para la IL-2, CD25, como asi
también del marcador de activación temprana CD69, sugirieron que la apoptosis de los
linfocitos T CD4+ observada en los ratones BL/6 no era inducida por la activación de las
células. De hecho, el mecanismo efector de la muerte celular inducida por activación más
probable, el que involucra a Fas y a FasL, se excluyó formalmente al demostrar que los
niveles de apoptosis de los linfocitos T CD4+ y la inmunopatología de los ratones BL/6
deficientes en Fas (lpr) o en FasL (gld) eran similares a los de los ratones BL/6 WT contro].
El mecanismo de apoptosis por activación que involucra al TNF (Lenardo, Chan et
al. 1999) no se tomó en consideración en este estudio ya que no se detectó TNF-or en
sobrenadantes de cultivo de las células de granulomas de ratones de la cepa BL/6 (Figura 3
del capítulo II de esta tesis).
También se estudió en detalle el papel de los linfocitos T CD8+ como posibles
inductores de la apoptosis de linfocitos T CD4+ debido a que se encontró que estas células
estaban significativamente aumentadas en los granulomas de los ratones BL/6 comparado
con los de los ratones CBA. Además, los linfocitos T CD8+ han sido involucrados en el
proceso de inmunomodulación de la patología en esquistosomiasis (Boros 1986; Phillips,
Lin et al. 1991; Chensue, Warmington et al. 1993; Pedras-Vasconcelos y Pearce 1996). La
apoptosis de los linfocitos T CD4+ fue similar en poblaciones celulares de granulomas
depletadas de linfocitos T CD8+ y en aquellas no depletadas después de 36 h de cultivo,
como así también en granulomas de los ratones BL/6 deficientes en linfocitos T CD8+
62
Laura l. Rutitzkv Capítulo lll
comparado con los granulomas de ratones los BL/6 WT controles. Estos resultados
permitieron descartar al mecanismo de apoptosis mediado por linfocitos T CD8+ como
inductores de la apoptosis de los linfocitos T CD4+ in vitro e in vivo. Además, los linfocitos
T CD8+ tampoco modificaron los niveles de inmunopatologia hepática como se había
demostrado en estudios previos (Hernandez, Wang et al. 1997) ya que el tamaño de los
granulomas fue igual en los ratones BL/6 deficientes en linfocitos T CD8+ que en los ratones
BL/6 WT control.
La producción llamativamente baja de IL-2 por las células de los granulomas y de
los GLM de los ratones BL/6 sugirió que la apoptosis de los linfocitos T CD4+ podía
deberse a la falta de esta citoquina dado que la IL-2 representa el factor de crecimiento más
importante para los linfocitos T (Taniguchi y Minami 1993; Waldmann, Tagaya et al. 1998).
Esta hipótesis se puso a prueba y se corroboró al demostrar que el agregado exógeno de lL-2
recombinante revirtió significativamente la apoptosis de los linfocitos T CD4+ de los
granulomas de los ratones BL/6 tanto in vitro como in vivo. La reversión in vitro file más
significativa con el agregado de IL-2 que con el de lL-lS y la IL-4 no produjo ningún efecto
sobre la apoptosis de los linfocitos T CD4+. Fue más importante todavia demostrar que la
disminución en apoptosis luego del tratamiento in vivo de los animales con la IL-2 rh se
correlacionó con un agrandamiento del tamaño de los granulomas hepáticos. Este resultado
podría interpretarse como que el tratamiento con IL-2 rh incrementó la supervivencia de los
linfocitos T CD4+ que son las células que median la inmunopatologia de la enfermedad
produciendo un incremento de la patología de los animales tratados. Es importante destacar
que había sido demostrado que inyecciones de IL-2 rh o del anticuerpo anti-IL-2 en
animales infectados con esquistosomiasis exacerbaban o mejoraban respectivamente la
inmunopatología en ratones de las cepas CBA y C3H de alta patología (Mathew, Ragheb et
al. 1990; Cheever, Finkelman et al. 1992), pero es estos trabajos, la apoptosis no había sido
estudiada.
Como se mencionó, la apoptosis de los linfocitos T cumple un papel importante en el
control de la patología asociada con otras enfermedades parasitarias (Lopes, da Veiga et al.
1995; Kalinkovich, Weisman et al. 1998; Martins, Cardoso et al. 1998; Desbarats, Stone et
al. 2000; Sanchez-Torres, Rodriguez-Ropon et al. 2001; Wipasa, Xu et al. 2001; Jenson,
O'Connor et al. 2002). En esquistosomiasis, la apoptosis de linfocitos T de granulomas de la
63
Laura l. Rutitzkv Capítulo lll
cepa BL/6 la describió por primera vez Rumbley et al. (Rumbley, Zekavat et al. 1998). Estos
autores postularon más tarde que la apoptosis era inducida por el SEA y que estaba mediada
por el receptor Fas, aunque en esa investigación se necesitó de una muy alta concentración
de antígeno para alcanzar un efecto relativamente modesto sobre la apoptosis in vitro
(Rumbley, Sugaya et al. 2001; Lundy y Boros 2002). Lundy y Boros (Lundy y Boros 2002)
reportaron de modo similar que Fas mediaba la apoptosis de linfocitos T CD4+ aislados de
los bazos de ratones infectados, que esta apoptosis estaba mediada por linfocitos B-la que
expresaban a CD5 y a FasL y que ejercían su efecto induciendo la producción de IL-4 e IL
lO por parte de los linfocitos T CD4+ estimulados con SEA. Sin embargo, este mecanismo
de apoptosis no se pudo demostrar en los linfocitos T CD4+ de los granulomas. Este último
estudio se hizo en ratones infectados de la cepa CBA de alta patología en la que, si la
apoptosis cumpliera alguna función in vivo, no parecería tener ningún efecto protector para
el hospedador. Finalmente, para explicar el cambio gradual hacia un perfíl de citoquinas Th2
en los ratones de la cepa BL/6, Estaquier et al. (Estaquier, Marguerite et al. 1997) sugirieron
que los linfocitos productores de citoquinas Thl, eran depletados por el mecanismo de
apoptosis inducida por activación y que este mecanismo involucraba a la IL-lO. De los
resultados obtenidos con la tinción combinada de apoptosis con citoquinas
intracitoplasmáticas se observa que hubo una mayor proporción de linfocitos T CD4+
apoptóticos productores de IL-2 en los ratones BL/6, pero también los linfocitos T CD4+
productores de IFN-y, IL-S e IL-lO presentaron más apoptosis en los ratones BL/6 que en los
CBA (Tabla II).
En resumen, este estudio deja abierta la posibilidad de que exista más de un
mecanismo de apoptosis y también sugiere que las diferentes cepas de ratones pueden
presentar apoptosis a través de diferentes mecanismos. Un estudio reciente realizado por
Cameiro-Santos et al. (Cameiro-Santos, Martins-Filho et al. 2000) en esquistosomiasis
humana tiene una importancia particular ya que demostró que en los pacientes con
esquistosomiasis intestinal, la forma moderada de la enfermedad, los linfocitos T presentan
más apoptpsis que en los pacientes con la enfermedad hepatoesplénica, más severa. Este
estudio le aporta una relevancia especial a la apoptosis como un posible mecanismo
regulador de la severidad de la enfermedad in vivo.
64
Laura l. Rutitzkv Capítqu lll
De este y otros estudios se desprende que la apoptosís, tanto en forma pasiva (por la
falta de lL-2) como activa, puede ser un mecanismo efector útil para remover linfocitos T
CD4+ patogénicos, aunque es poco probable que este mecanismo sea el único que cumpla
con esta función. Muy probablemente, los niveles de inmunopatología están determinados
genéticamente y deben ser el producto de la disponibilidad, del estado de activación y de la
función de los linfocitos T CD4+ específicos para los antígenos del huevo del parásito. Así,
en la cepa de baja patología, que debe comenzar con un repertorio numéricamente menor, la
regulación negativa de los linfocitos T CD4+puede alcanzarse combinando niveles elevados
de muerte de linfocitos T CD4+, como quedó demostrado con los resultados de este capítulo,
y con tolerancia periférica de estas mismas células por medio de anergia (Stadecker y Flores
Villanueva 1994) o supresión activa (Phillips, Lin et al. 1991; Chensue, Warmington et al.
1993; Pedras-Vasconcelos y Pearce 1996), mecanismos que posiblemente están presentes en
un ambiente dominado por citoquinas anti-inflamatorias y CPA activadas por la vía
alternativa (GoerdtyOrfanos 1999; Stadecker 1999). Por el contrario, la patología alta puede
ser el resultado de un repertorio numéricamente mayor de linfocitos T CD4+ específicos para
el SEA, bajos niveles de apoptosís, ausencia de tolerancia periférica y un ambiente marcado
por citoquinas pro-inflamatorias y CPA activadas por la vía clásica (Stadecker 1999).
El diseño e implementación de estrategias que induzcan y mantengan la modulación
negativa de los linfocitos T CD4+ patogénicos tendrá una importancia especial en aquellos
individuos que sufren de, o son propensos a, contraer la enfermedad más severa.
CAPÍTULO IV
Efecto del bloqueo del mecanismo de coestimulaciónICOS-B7RP-1 en el desarrollo de la inmunopatología
asociada con la esquistosomiasis
Laura I. Rutitzkv Capítulo IV
INTRODUCCIÓN
La inmunopatología en esquistosomiasis es dependiente de linfocitos T CD4+
específicos para los antígenos del huevo. En general, los linfocitos que sólo reciben
estimulación a través de su receptor T (TCR) fallan en montar una respuesta adecuada ya
que no producen citoquínas, no proliferan y generalmente mueren por apoptosis o se
vuelven anérgicos a una estimulación subsiguiente. Para ser activados apropiadamente los
linfocitos necesitan recibir también la señal a través de las moléculas de coestimulación.
CD28 es la molécula coestimuladora clave para la activación de linfocitos T naïve o en
reposo (Lenschow, Walunas et al. 1996; Frauwirth y Thompson 2002), pero ella no realiza
todas las funciones coestimuladoras ya que la producción de citoquínas efectoras como el
IFN-y o la IL-4 por linfocitos puede ser estimulada a niveles normales por CPA que no
expresan a B7-1 o a B7-2 (Whitmire y Ahmed 2000).
La expresión del coestimulador inducible (ICOS) está aumentada en linfocitos Thl y
Th2 durante la fase inicial de diferenciación y sus niveles de expresión permanecen elevados
en los linfocitos Th2 y decrecen en los linfocitos Th] (McAdam, Chang et al. 2000; Sperling
y Bluestone 2001). La expresión de B7RP-l (del inglés B7-related protein-1), el ligando de
ICOS, también parece aumentar en respuesta a estímulos inflamatorios como IFN-y o TNF
ot (Aicher, Hayden-Ledbetter et al. 2000) mientras que, ante los mismos estímulos no se
induce la expresión de B7-l o B7-2. La interacción entre ICOS y B7RP-l puede aumentar la
producción de ciertas citoquínas aunque parece no tener un efecto mayor sobre la
proliferación celular.
El papel que cumple el sistema coestimulador CD28-B7 en la esquistosomiasis
murina ya fue estudiado. Sus funciones principales son coestimular la proliferación y el
cambio a la expresión de citoquínas hacia un perfil Th2, dado que ratones de la cepa 129/Sv
deficientes en B7-l y B7-2 infectados con S. mansoni muestran una profunda inhibición de
la proliferación de sus linfocitos junto con una ausencia de producción de citoquínas del tipo
Th2 en respuesta al SEA a las 7-8 semanas de infección (Hernandez, Sharpe et al. 1999).
Otro estudio reciente investigó el papel del mecanismo coestimulador CD40-CD154 en
contexto con el modelo murino de esquistosomiasis (MacDonald, Patton et al. 2002). Este
estudio describió una morbilidad alta y una mortalidad incrementada que se asociaron con
66
Laura l. Rutítzky Capítulo IV
un profundo impedimento de expresar las citoquinas de tipo Th2 en los ratones KO que no
expresan CD154.
En este capítulo, se propone estudiar el papel del mecanismo coestimulador ICOS
B7RP-1 en la inmunopatología asociada con la enfermedad. La hipótesis es que en el
modelo murino de esquistosomiasis, la interacción entre ICOS y B7RP-l favorecería al
pasaje de la respuesta inicial de citoquinas del tipo Thl hacia la respuesta del tipo Th2, con
lo que el bloqueo de este sistema, tendría efectos en el desarrollo de la inmunopatología
asociada con la enfermedad.
RESULTADOS
- Estudio de la inducción de los ARNm de ICOS y B7RP-l en células de hígados de
ratones BL/6 durante el transcurso de la enfermedad.
Primero, para determinar si el mecanismo ICOS-B7RP-l participaba en la infección
con esquistosomiasis, se estudió la expresión de estas dos moléculas a 0, 2, 4, 5, 6 y 7
semanas después de la infección. Para ello, se extrajo el ARN total de los hígados de ratones
normales o infectados durante distintos tiempos y se analizó la expresión de los genes por
medio de Northern blots. Como se observa en la Figura l, ambos mensajeros fueron
expresados constitutivamente a niveles bajos en animales no infectados, la expresión de
ICOS y su ligando B7RP-l comenzó a aumentar a partir de la 2da. semana de infección y
los dos mensajeros fueron progresivamente regulados positivamente alcanzando un pico de
expresión a la 6ta. semana y decreciendo luego de las 7 semanas de infección. La sonda para
ICOS reveló dos bandas discretas, una de 3.6 kb y otra de 1.7 kb (Mages, Hutloff et al.
2000), mientras que la sonda para B7RP-l mostró una única banda de 2.9 kb. Al realizar la
densitometría de las bandas se obtuvo que los ARNm de ICOS y B7RP-l estaban 4 veces
íncrementados en las células de los hígados de los ratones infectados durante 6 semanas
respecto de los animales no infectados.
67
Laura I. Rutitzkv Capítulo IV
0 2 4 5 6 7 Semanas después de la infección
_ 3.6 kb
ICOS_ 1.7 kb
B7RP-l 2.9 kb
GAPDH
FIGURA l: Análisis por Northern blot para detectar la expresión de los ARNm de ICOS y B7RP-l en
hígados de ratones infectados con esquistosomiasis. Los Northern blots se realizaron con ARN de los
hígados de ratones BL6 infectados a 2, 4, 5, 6, y 7 semanas como así también de ratones no infectados
controles. El control de carga se realizó con la sonda del ADNc del gen GADPH. Se usaron muestras de ARN
de dos ratones para cada tiempo.
- El bloqueo del mecanismo coestimulador ICOS-B7RP-l exacerba la patología
hepática.
Los resultados anteriores demuestran que ICOS y B7RP-1 son regulados
positivamente durante el curso de la infección. Para poder estudiar el efecto de este
mecanismo en el desarrollo de la respuesta inmune e inmunopatología, se trataron
diariamente durante la máxima expresión de ambas moléculas (entre la 4ta. y la 7ma.
semana), ratones de la cepa BL/6 con inyecciones de un AcMo que bloquea la interacción
entre ICOS y su ligando B7RP-1. Otro grupo de ratones BL/6 infectado fue tratado con un
AcMo control del mismo isotipo que el AcMo anti-ICOS. Un tercer grupo de ratones BL/6
infectados se dejó como control sin tratar. En la 7ma. semana después de la infección se
sacrificaron los animales, se tomaron las muestras de los hígados y se realizó la
histopatología de los tejidos de los tres grupos de ratones. Los ratones pertenecientes al
68
4.4.4.-—.4.
Laura I. Rutitzkv Capítulo IV
grupo BL/6 tratado con el AcMo anti-ICOS presentaron granulomas prominentes e
infiltrados difusos de células inflamatorias con focos de necrosis dispersos por todo el lóbulo
hepático (Figura 2A y 2B); estos infiltrados celulares junto con la necrosis de hepatocitos
fueron mínimos o ausentes en el grupo BL/6 no tratado (Figura 2C) y en el grupo tratado
con el anticuerpo control (dato no mostrado).
FIGURA 2: Histopatología hepática a las 7 semanas de infección. A, se muestra una sección de hígado
perteneciente a un ratón BL/6 infectado y tratado con el AcMo anti-ICOS donde se observan granulomas con
uno o más huevos y una inflamación del parénquima pronunciada (indicada por las flechas) y focos de
dilatación sinusoidal (más claros en 1a porción central superior de la foto). B, se muestra una sección del
mismo hígado que en el panel A, donde se observa un área de necrosis debido a la infiltración de células
inflamatorias. C, se muestra una sección de hígado perteneciente a un ratón del grupo BL/6 no tratado donde se
observan granulomas más definidos sin daño del parénquima Los granulomas son más grandes en el panel A.
El aumento utilizado para tomar las fotografias de los paneles A y C fue de lOOXy el del panel B fue de 400X.
69
Laura l. Rutitzkv Capítulo IV
La magnitud del daño hepatocelular correlacionó bien con los niveles en suero de las
enzimas hepáticas AST y ALT, que estuvieron elevadas significativamente en el grupo de
ratones que recibió el tratamiento anti-ICOS (Figura 3). Cuando los preparados de hígado se
sometieron al análisis morfométrico de los granulomas, se observó que en el grupo tratado
con el AcMo anti-ICOS los granulomas eran significativamente más grandes que los del
grupo tratado con el AcMo control y el grupo no tratado control (Figura 4), sin embargo, la
composición celular (típicamente de eosinófilos, neutrófilos, macrófagos y linfocitos) entre
el grupo experimental y los grupos controles no fue diferente.
- AcMoanti-ICOS- AcMocontrol:1 Notratado
.L OO
AST(IU/L) ALT(IU/L) 50
Grupo
FIGURA 3: Niveles séricos de las enzimas hepáticas a las 7 semanas de infección. Se obtuvo suero de los
ratones pertenecientes a cada grupo infectados y se midieron los niveles de las enzimas AST y ALT por
métodos colorimétricos. Las barras representan los niveles medios de las enzimas en suero de cuatro
ratones/grupo :b ES, expresados en unidades íntemacionales/litro (IU/L). Los niveles de AST y ALT son
significativamente más altos en e] grupo tratado con el AcMo anti-ICOS que en los grupos controles tratados y
no tratados (p < 0.05). Se restaron los niveles de las enzimas en sueros de ratones BL/6 normales, no
infectados.
70
Laura I. Rutitzkv Capítulo IV
- AcMoanti-ICOS- AcMocontrolI: Notratado18
16141210
8
642
0Grupo
Tamañodegranulomas(pm2x10‘4)
FIGURA 4: Tamaño de los granulomas hepáticas a las 7 semanas de infección. Las barras representan la
media de las áreas de inflamación granulomatosa i ES. Estas áreas fueron significativamente más grandes en
el grupo tratado con el AcMo anti-ICOS en comparación con las áreas de los granulomas de los ratones del
grupo tratado con el AcMo control de isotipo (p < 0.01) o el grupo no tratado (p < 0.05).
- El bloqueo de ICOS-B7RP-1 induce un incremento en la producción de IFN-y en las
células de los granulomas y los ganglios linfáticos mesentéricos.
El estudio del efecto del bloqueo de ICOS en la secreción de citoquinas por
linfocitos estimulados con SEA fue particularmente interesante, considerando que los
ratones BL/6 normalmente muestran una respuesta polarizada hacia un perfil Th2 alrededor
de la 7ma. semana de infección (Stadecker y Hernandez 1998). Los resultados revelaron que
las células de los granulomas, de los GLM y los linfocitos T CD4+ purificados de los GLM
del grupo tratado con el AcMo anti-ICOS produjeron significativamente más IFN-y que los
otros dos grupos. En comparación, el tratamiento con el AcMo anti-ICOS sólo indujo
cambios menores en la secreción de la IL-4 e IL-10 por las mismas poblaciones celulares
(Figura 5). De estas dos citoquinas Th2, sólo la concentración de IL-lO estuvo reducida
significativamente en los sobrenadantes de cultivo de las células de los granulomas, pero no
en los sobrenadantes de cultivo de las células totales de GLM ni de linfocitos T CD4+ de los
ratones que recibieron el tratamiento con el AcMo anti-ICOS. La producción de la IL-4 no
se modificó en las células de los granulomas y aumentó en las dos poblaciones celulares de
71
Laura I. Rutitzkv Capítulo IV
los GLM del grupo tratado con el AcMo anti- ICOS. En resumen, estos patrones de
citoquinas demuestran un cambio hacia un perfil pro-inflamatorio Thl particularmente si se
compara con las variaciones menores de las citoquinas Th2, IL-4 e IL-lO. Cabe destacar,
especialmente, la disminución en la producción de IL-lO por las células de los granulomas.
.AcMo anti-ICOS -AcMo control El Notratado
IFN-Iy lL-4 lL-10
0.02 ** 0.075" 0.25
Células degranulomas
0.4 **
Células deGLM (totales)
Células deGLM (linf. T CD4+)
Concentracióndecitoquinas(ng/ml)
Grupo
FIGURA 5: Producción de citoquinas por las células de los granulomas y de los ganglios linfáticos
mesentéricos estimuladas con SEA a las 7 semanas de infección. Las barras representan medias de
determinaciones en triplicados de los niveles de cada citoquina i ES en cada una de las poblaciones celulares
pertenecientes a los tres grupos de ratones. Las diferencias estadísticamente significativas entre el grupo AcMo
anti-ICOS y el grupo AcMo control se indican con uno (p < 0.01) o dos (p < 0.001) asteriscos. GLM =
ganglios linfáticos mesentéricos.
72
DISCUSIÓN
Se precisan diferentes sistemas coestimuladores para proveer a los linfocitos T con
las señales necesarias para que éstos se activen, se expandan clonalmente y produzcan las
citoquinas necesarias para montar la respuesta inmune. En este capítulo se estudió el papel
del mecanismo ICOS-B7RP-l sobre la inmunopatología durante la esquistosomiasis murina
Tanto ICOS como B7RP-l fueron regulados positivamente en las células de los hígados de
los ratones después de la 4ta. semana de infección. Esta inducción observada de ICOS y
B7RP-l en los hígados podría provenir respectivamente de los linfocitos T activados y de
las CPA que van siendo reclutadas al sitio donde se produce la inflamación. Para bloquear la
interacción entre ICOS y B7RP-l se trataron diariamente ratones BL/6 con un AcMo anti
ICOS. Este bloqueo tuvo un efecto notable en la patología hepática como quedó manifestado
por el aumento del tamaño de los granulomas y la presencia de inflamación en el
parénquima con necrosis hepatocelular, consecuencias que fueron acompañadas por un
brusco incremento de los niveles en suero de las enzimas hepáticas AST y ATL. Estos
cambios se correlacionaron con un marcado aumento de la producción de IFN-y por las
células de los granulomas y de los GLM. Este aumento significativo del IFN-y después del
bloqueo de ICOS en contexto con una inmunopatología hepática exacerbada, fue una clara
indicación de un ambiente pro-inflamatorio, ya que las citoquinas anti-inflamatorias IL-4 e
IL-lO mostraron un cambio relativamente menor con el tratamiento. En particular, la
pequeña pero significativa reducción en los niveles de IL-lO, específicamente localizada en
el lugar de las lesiones granulomatosas, podría ser un factor importante en la exacerbación
de la inmunopatología hepática y estaría de acuerdo con observaciones previas que vinculan
a esta citoquina anti-inflamatoria con la regulación negativa de la inflamación
granulomatosa en esquistosomiasis (Flores Villanueva, Reiser et al. 1994; Flores
Villanueva, Zheng et al. 1996; Sadler, Rutitzky et al. 2003).
Como se mencionó, en los ratones de la cepa de baja patología BL/6 infectados con
S. mansoni se presenta una primera respuesta al SEA de citoquinas por-inflamatorias del
tipo Thl que rápidamente cambia hacia una anti-inflamatoria del tipo Th2 (Pearce, Caspar et
al. 1991; Stadecker y Flores Villanueva 1994). Los resultados obtenidos en respuesta al
tratamiento con el AcMo anti-ICOS apoyan la noción de que el bloqueo de lCOS-B7RP-l
73
Laura l. Rutitzkv Capítulo lV
interfiere con esta transición normal y que esto trae aparejado un neto incremento de la
patología hepática. Un aumento en la inmunopatología en contexto con una prominente
respuesta del tipo Thl ocurre normalmente en los ratones de la cepa CBA que naturalmente
desarrollan alta patología (Cheever, Duvall et al. 1987), como así también en ratones
deficientes en las moléculas B7-1 y B7-2 (Hernandez, Sharpe et al. 1999) o en ratones
deficientes en las citoquinas anti-inflamatorias IL-4 (Pearce, Cheever et al. 1996) e IL-lO
(Sadler, Rutitzky et al. 2003) o las dos (Hoffmann, Cheever et al. 2000). Una relativa
dominancia Thl incluyendo al TNF-a y al óxido nítrico (Pearce, Cheever et al. 1996),
combinada posiblemente con una mayor dispersión de los productos nocivos de los huevos
del parásito, podrían explicar la incrementada inflamación y el daño hepático presentes en
los ratones tratados con el AcMo anti-ICOS.
Otros estudios mostraron que a pesar de que ICOS es expresado tanto en linfocitos
Thl como en Th2, su expresión persiste en niveles altos en linfocitos Th2 (McAdam, Chang
et al. 2000). Cabe destacar que la disrupción del mecanismo ICOS-B7RP-l fue beneficiosa
cuando se trataron enfermedades en donde una respuesta Th2 es dominante como ser el caso
del asma (Gonzalo, Tian et al. 2001; Tesciuba, Subudhi et al. 2001). Además, el bloqueo de
ICOS-B7RP-1 aumentó la expresión de IFN-y y exacerbó los síntomas en el modelo de la
encéfalomielitis alérgica, una enfermedad mediada por linfocitos Thl (Rottman, Smith et al.
2001). Todos estos estudios coinciden con éste en cuanto muestran que el mecanismo ICOS
B7RP-l favorece un perfil Th2 y/o inhibe a los linfocitos Thl, pero, sin embargo, otros
estudios encontraron que ICOS-B7RP-l regula tanto respuestas Thl como Th2 (Kopf, Coyle
et al. 2000; Ozkaynak, Gao et al. 2001; Greenwald, McAdam et al. 2002). Parece ser,
entonces, que el efecto final de este mecanismo coestimulador depende del modelo en
estudio.
En resumen, estos resultados demuestran que el mecanismo de coestimulación
ICOS-B7RP-l funciona principalmente para limitar la producción de IPN-y y siendo así un
elemento importante en la transición hacia un perfil de citoquinas Th2 característico de una
infección con esquistosoma en ratones de la cepa BL/6. De hecho, varios mecanismos de
coestimulación para linfocitos T parecen contribuir con este propósito, tanto disminuyendo
la producción de citoquinas pro-inflamatorias del tipo Thl o aumentando la producción de
citoquinas anti-inflamatorias del tipo Th2, o ambas funciones. De esta manera, en
74
Laura l. Rutitzkv Capítulo IV
esquistosomiasis, la coestimulación hacia una polarización Th2 parece ser crítica para
disminuir la respuesta inmunopatológica aguda del hospedador y así tener un efecto
beneficioso en su supervivencia. Próximos estudios permitirán establecer si una
coestimulación inapropiada está asociada con un mayor riesgo de contraer la forma grave de
la enfermedad y si la manipulación de las moléculas de coestimulación puede ser usada para
controlar la respuesta inmune mediada por los linfocitos T CD4+.
DISCUSIÓN GENERAL YCONCLUSIONES
Laura l. Rutitzkv Discusión General y (‘
DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES
La esquistosomiasis continúa siendo un problema grave de salud pública en muchos
países tropicales y subtropicales del mundo, a pesar de la disponibilidad de drogas para
tratar la enfermedad y de los grandes progresos que se hicieron en sanidad y educación. Una
inmunoterapia efectiva es, por lo tanto, un abordaje teóricamente ideal para reducir el
impacto devastador de la esquistosomiasis, tanto a nivel individual como poblacional. Para
poder desarrollar vacunas u otras terapias inmunológicas, es aún necesario ampliar nuestros
conocimientos de la respuesta inmune a este parásito.
Es evidente que, para esta coevolución exitosa que lleva miles de años entre los
esquistosomas y sus hospedadores, la reacción inmunopatológica contra los huevos tiene
que haber cumplido un papel ventajoso tanto para el parásito como para el hospedador. Para
el hospedador, la inmunopatología es en la mayoría de los casos limitada y posiblemente
beneficiosa ya que protege de los productos nocivos liberados por los huevos y de los
mediadores inflamatorios, pero en una minoría de los casos, esta reacción puede ser dañina y
hasta mortal. Para el parásito, sin embargo, la inmunopatología es esencial ya que le facilita
la migración de los huevos a través de la pared del intestino para así salir al exterior y
perpetuar la especie. Pruebas claras de esto son que en ratones infectados con S. mansoni
tratados con inmunosupresores como corticoides, se retrasa la maduración de los parásitos
(Coker 1957) o que los individuos que tienen una cantidad disminuida de linfocitos T CD4+,
presentan una reducción de huevos del parásito en sus heces (Karanja, Colley et al. 1997).
Es así como en la esquistosomiasis, la supervivencia del hospedador depende de la
habilidad en montar una apropiada y balanceada respuesta de linfocitos T que sea capaz de
orquestar el desarrollo de los granulomas, prevenir los efectos debilitantes de la enfermedad
en su fase aguda y minimizar la morbilidad grave que ocurre en la fase crónica. Más del
90% de los individuos infectados en las áreas endémicas parecen cumplir con los requisitos
necesarios para llevar una enfermedad relativamente tolerable. Por el contrario, el 5-10%
restante de las personas infectadas fracasa en montar una respuesta inmune adecuada para
sobrevivir a la enfermedad.
El objetivo principal de esta tesis fue estudiar nuevos mecanismos de
inmunorregulación en la esquistosomiasis murina que puedan explicar cómo se lleva a cabo
76
Laura l. Rutitzkv Discusión Genera] y (‘ '
la respuesta inmune en las cepas de ratones que, como ocurre en los humanos, desarrollan
naturalmente baja y alta patología. Dado que la inmunopatología de la enfermedad está
mediada por linfocitos T CD4+, se quiso estudiar más en detalle determinadas funciones
inmunológicas de estas células que caractericen y diferencien a cada una de las formas
polares de la enfermedad.
Si bien estaba descripto que los ratones de la cepa de baja patología BL/6 presentan
en las primeras semanas de la infección una respuesta hacia el SEA de citoquinas del tipo
Thl y que luego con el transcurso de la enfermedad esta respuesta cambia hacia un perfil
Th2 (Vella y Pearce 1992; Stadecker y Hemandez 1998; Pearce y MacDonald 2002), hasta
el presente había dudas sobre el papel que cumplían cada uno de estos grupos de citoquinas
en la generación de la inmunopatología. A cada uno de estos grupos se le había atribuido a
la vez un papel patogénico o anti-patogénico de acuerdo al grupo de investigadores que
interpretaba los resultados. Como se mencionó en la introducción del capítulo II esta
controversia existió por años en el campo de la esquistosomiasis y no había un consenso
entre los grupos de investigadores acerca de qué tipo de respuesta se debía inducir al
considerar inmunointervenciones para tratar la enfermedad. Esta vez se decidió inducir una
respuesta Thl prolongada en el tiempo y estudiar los efectos de esta intervención en la
inmunopatología por medio de una inmunización, sin manipulaciones genéticas, en los
ratones que normalmente cambian su perfil de citoquinas hacia uno Th2. La idea de realizar
un tratamiento in vivo en los ratones infectados se basó en que muchos de los resultados que
se habían obtenido del uso de ratones deficientes para citoquinas o sus receptores, aportaron
conclusiones contradictorias.
Las cepas de ratones BL/6 y CBA representan dos modelos polares de
inmunopatología en la esquistosomiasis murina experimental y muchas de las diferencias se
deben a factores genéticos intrínsecos de cada cepa (Cheever, Duvall et al. 1987). Sin
embargo, todavía no se conocen con exactitud los mecanismos inmunes que llevan a esta
marcada diferencia. En el campo de la esquistosomiasis, al día de hoy, no hay suficientes
estudios que comparen las respuestas inmunes de las cepas de ratones que desarrollan las
formas polares de la enfermedad. La hipótesis de que la apoptosis de los linfocitos T CD4+
podía cumplir un papel importante en el control de la patología surgió de las observaciones
de que los ratones BL/6 que desarrollan la forma leve de la enfermedad presentan
Laura l. Rutitzkv Dicmrción General y F
granulomas hepáticos de tamaño menor que los ratones CBA que desarrollan la enfermedad
grave; que los niveles de proliferación de sus linfocitos en respuesta a los antígenos del
huevo son significativamente más bajos y que la proporción de linfocitos T CD4+ en los
granulomas de estos mismos ratones es significativamente menor. Estos tres hallazgos
podían ser explicados por una mayor proporción de linfocitos T CD4+ que mueren por
apoptosis en la cepa BL/6 comparada con la cepa CBA.
Respecto de los mecanismos coestimuladores que operan entre los linfocitos T CD4+
y las células presentadoras de antígenos en esquistosomiasis, se conocía el papel de CD28
B7 (Hemandez, Sharpe et al. 1999) y CD40-CD154 (MacDonald, Patton et al. 2002), pero
todavía no se había estudiado uno de los últimos mecanismo descriptos en la literatura
compuesto por ICOS y su ligando B7RP-l (Mages, Hutloff et al. 2000; McAdam, Chang et
al. 2000). La hipótesis de que este mecanismo operaría ayudando en la transición normal de
la respuesta inicial de citoquinas del tipo Thl hacia la respuesta Th2 se basó en los
resultados obtenidos de los estudios previos de CD28-B7 y CD40-CD154 ya que ambos
cumplen con esta función, como así también del papel de ICOS-B7RP-l en otras
enfermedades mediadas por citoquinas Thl (Rottman, Smith et al. 2001) o Th2 (Gonzalo,
Tian et al. 2001; Tesciuba, Subudhi et al. 2001). Así entonces, para el estudio de ICOS
B7RP-l se eligió a la cepa BL/6 ya que naturalmente su respuesta de citoquinas se polariza
hacia un perfil Th2 y se estudió el efecto del bloqueo de la interacción entre ICOS y B7RP-l
en la inmunopatología asociada con la esquistosomiasis.
A continuación se resumen las conclusiones más sobresalientes de los resultados
obtenidos en esta tesis.
- Sobre el papel de las respuestas de citoquinas ThI vs. Th2 en el desarrollo de Ia
inmunopatología dela enfermedad:
o Los ratones BL/6 infectados con esquistosomiasis e inmunizados con SEA/CFA
desarrollan una patología hepática severa y mueren prematuramente.
78
Laura l. Rutítzky Discusión General y (‘ '
- La inmunización con SEA/CFA induce un cambio de citoquinas en granulomas,
GLM y bazos hacia un perfil Thl. Este cambio se produce sin una alteración en la
proporción de linfocitos T CD4+, lo que sugiere una variación en el perfil de secreción
de citoquinas.
- Estos resultados demuestran que un ambiente dominado por citoquinas del tipo
Thl con reducidos niveles de citoquinas del tipo Th2, exacerba la gravedad de la
enfermedad.
o Estos hallazgos concuerdan con estudios realizados en humanos, en los que las
citoquinas Thl predominan en la forma hepatoesplénica (más severa), mientras que las
citoquinas Th2 son dominantes en la forma intestinal (leve) de la enfermedad.
- Sobre el papel de Ia apoptosis de los linfocitos T CD4+en el desarrollo de la
inmunopatología de la enfermedad:
Los ratones BL/6 desarrollan granulomas hepáticos más pequeños, una respuesta
proliferativa reducida hacia los antígenos solubles del huevo y una menor proporción
de linfocitos T CD4+en los granulomas en comparación con los ratones CBA.
- La proporción de linfocitos T CD4+que mueren por apoptosis en los granulomas
de los ratones BL/6 es significativamente más elevada que la proporción de los
linfocitos T CD4+ de los granulomas de los ratones CBA.
- La apoptosis de los linfocitos T CD4+en los granulomas no está mediada por Fas
FasL o por linfocitos T CD8+,sino que se produce por una importante disminución de
los niveles de IL-2, el principal factor de crecimiento para los linfocitos T.
La apoptosis de los linfocitos T CD4+ de los granulomas cumple un papel
protector importante en el control de la inmunopatología inducida por los huevos del
parásito en los ratones que desarrollan la forma leve de la esquistosomiasis.
Laura l. Rutitzkv Discusión General y (‘ '
- Sobre el papel del mecanismo de coestimulación ICOS-B 7RP-I en el desarrollo
dela inmunopatología de la enfermedad:
' La expresión de ICOS y B7RP-l aumenta durante la infección con esquistosoma
en las células del hígado de los ratones.
- El mecanismo coestimulatorio ICOS-B7RP-l en la esquistosomiasis ayuda a
limitar la producción de IFN-y y de esta manera cumple un papel importante
facilitando la transición hacia un perfil Th2 durante la fase crónica de la enfermedad.
- El bloqueo de ICOS interfiere con la transición normal hacia un perfil Th2 y esto
se correlaciona con un daño hepático mayor manifestado por un incremento del
tamaño de los granulomas, más inflamación del parénquima y un aumento
significativo en la producción de las enzimas hepáticas AST y ALT.
En vista de los resultados obtenidos en esta tesis, las diferencias entre las cepas de
baja y alta patología en la esquistosomiasis murina experimental parecen deberse a
mecanismos inmunológicos diversos, ya que tanto la presencia de niveles elevados de
citoquinas del tipo Th] como los niveles bajos de apoptosis de linfocitos T CD4+ son
aspectos que también fueron asociados con la forma más severa de la enfermedad en
humanos (Mwatha, Kimani et al. 1998; Carneiro-Santos, Martíns-Filho et al. 2000). Todavía
queda por esclarecer si disfunciones en los mecanismos de coestimulación conducen, de la
misma manera, al desarrollo de la forma clínica grave de la enfermedad en humanos.
A continuación presento el esquema diseñado en el laboratorio del Dr. Miguel
Stadecker donde vamos incluyendo los nuevos descubrimientos hechos por nuestro y otros
laboratorios sobre los mecanismos de inmunorregulación en la esquistosomiasis. En él
resalto mis tres contribuciones.
80
Laura I. Rutitzkv níemeión General v F '
Mecanismos de inmunopatología en la esquistosomiasis
Citoquim‘ Fulldón Citoqulna FunciónIL-12
Pro' IL-101L" inflamatoria ‘nfi' .
a TGEB inflamatorias
N0 .argmasa‘r >
anti
ILZ activación de linf. T Inflamatorlaexpansión clonal
IFNW activación de CPAanti-fibrófim pro-fibrótica
Diagrama esquemático de la respuesta inmune e inmunopatología durante la infección con S. mansoni. El primercontacto de los gusanos y sus huevos con el hospedador induce una respuesta de citoquinas del tipo Thl que estácaracterizada por la presencia de las citoquinas lL-12, IL-l, TNF-a producidas por las CPA activadas por la vía clásica ypor las citoquinas del tipo Thl lL-2 e [FN-y producidas por los linfocitos T CD4+. Esta respuesta de citoquinas cambiarápidamente hacia una del tipo Th2, que está caracterizada, de manera similar, por la presencia de ciertas citoquinasproducidas por CPA activadas por la vía alternativa, entre ellas IL-lO y TGF-B y por la citoquinas del tipo Th2 IL-4, IL-5IL-lO e lL-l3 producidas por los linfocitos T CD4+.Los fenotipos opuestos de las CPA cumplirían un papel importante enla inducción y la transición Thl —>ThZ y así determinarían la naturaleza de la inmunopatología resultante causada por lainfección. El recuadro central superior describe a los factores que facilitan el pasaje Thl —->Th2 y que promueven unarespuesta inmunopatológica controlada y beneficiosa para el hospedador. En cambio, las condiciones descriptas en elrecuadro central inferior impiden el pasaje Thl ——>Th2 y conducen al desarrollo de una inmunopatología más severa y a lamuerte del hospedador.
81
Laura I. Rutitzkv Discusión General y F ‘
En resumen, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis aportan nuevos
conocimientos sobre las fimciones de los linfocitos T CD4+ que regulan la inmunopatología
en la esquistosomiasis murina experimental. De esta manera, los mecanismos descriptos
aquí podrán ser evaluados para diseñar estrategias moduladoras que resulten en un
mejoramiento general de la patología asociada con la enfermedad.
MLM!) A, ‘ MIGUELJ STADECKER,MD, PHDLOTVDJC \l Professmof Pathology
Tuhs Univ. School of Medicine136 Harrison AvenueBoston, MA 02111
82
BIBLIOGRAFÍA
BIBLIOGRAFÍA
Adams, J. M. and S. Cory (1998). "The Bel-2 protein family: arbiters of cell survival." Science 281(5381):1322-6.
Adamson, P. B. (1976). "Schistosomiasis in antiquity." Med. Hist. 20(2): 176-88.Aicher, A., M. Hayden-Ledbetter, et al. (2000). "Characterization of human inducible costimulator ligand
expression and function." J. Immunol. 164(9): 4689-96.Akbar, A. N., N. J. Borthwick, et al. (1996). "lnterleukin-2 receptor common gamma-chain signaling
cytokines regulate activated T cell apoptosis in response to grth factor withdrawal: selectiveinduction of anti-apoptotic (bcl-2, bcl-xL) but not pro-apoptotic (bax, bcl-xS) gene expression."Eur. J. Immunol. 26(2): 294-9.
Akhiani, A. A., N. Lycke, et al. (1996). "Lack of interferon-gamma receptor does not influence theoutcome of infection in murine schistosomiasis mansoni." Scand. J. Immunol. 43(3): 257-62.
Al Adnani, M. S. (1985). "Concomitant immunohistochemical localization of fibronectin and collagen inschistosome granulomata." J. Pathol. l47(2): 77-85.
Amiri, P., R. M. Locksley, et al. (1992). "Tumour necrosis factor alpha restores granulomas and inducesparasite egg-laying in schistosome-infected SCID mice." Nature 356(6370): 604-7.
Andrade, Z. and K. S. Warren (1964). "Mild prolonged schistosomiasis in mice: alteration in host responsewith time and the development of portal fibrosis." Trans. R. Soc. Trap. Med. va. 72: 316-321.
Andrade, Z. A. and S. G. Andrade (1970). "Pathogenesis of schistosomal pulmonary arteritis." Am J TropMed Hyg 19(2): 305-10.
Andrade, Z. A. and E. Van Marck (1984). "Schistosoma! glomerular disease (a review)." Mem. lnst.Oswaldo Cruz 79(4): 499-506.
Angeli, V., C. Faveeuw, et al. (2001). "Role of the parasite-derived prostaglandin D2 in the inhibition ofepidennal Langerhans cell migration during schistosomiasis infection." J. Exp. Med. l93(lO):l 135-47.
Apasov, S. and M. Sitkovsky (1993). "Highly lytic CD8+, alpha beta T-cell receptor cytotoxic T cells withmajor histocompatibility complex (MHC) class l antigen-directed cytotoxicity in beta 2mícroglobulin, MHC class l-deficient mice." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(7): 2837-4l.
Arap Siongok, T. K., A. A. Mahmoud, et al. (l976). "Morbidity in Schistosomiasis mansoni in relation tointensity of infection: study of a community in Machakos, Kenya." Am. J. Trop. Med. Hyg. 25(2):273-84.
Araujo, M. l., A. R. de Jesus, et al. (¡996). "Evidence of a T helper type 2 activation in humanschistosomiasis." Eur. J. Immunol. 26(6): ¡399-403.
Bergquist, N. R. (2002). "Schistosomiasis: from risk assessment to control." Trends Parasitol. 18(7): 30914
Bica, l., D. H. Hamer, et al. (2000). "Hepatic schistosomiasis." lnfect. Dis. Clin. North. Am. 14(3): 583604, viii.
Bilharz, T. (1853). "Femere mittheilungen iiber Distomun haematobium." Z. Wiss. Zool. 4: 454-456.Boros, D. (1989). "Immunopathology of Schistosoma mansoni infection." Clinical ‘ " ' ' ' Reviews
2(3): 250-269.Boros, D. and K. Warren (1970). "Delayed hypersensitivity-type granuloma formation and dermal reaction
induced and elicited by a soluble factor isolated from schistosoma mansoni soluble eggs." J. Exp.MLd. 132(3): 488-507.
Boros, D. L. (1986). "lmmunoregulation of granuloma formation in murine schistosomiasis mansoni." mN. Y. Acad. Sci. 465: 313-23.
Boros, D. L., R. P. Pelley, et al. (1975). "Spontaneous modulation of granulomatous hypersensitivity inschistosomiasis mansoni." J. Immunol. ¡14(5): 1437-41.
Boros, D. L., R. Tomford, et al. (1977). "lnduction of granulomatous and elicitation of cutaneoussensitivity by partially purified SEA of Schistosoma mansoni." J. Immunol. 118( l ): 373-6.
Bosshardt, S. C., G. L. Freeman, Jr., et al. (1997). “IL-10 deficit correlates with chronic,hypersplenomegaly syndrome in male CBA/J mice infected with Schistosoma mansoni." Parasitelmmunol. 19(8): 347-53.
Brown, A., H. Remold, et al. (1977). "Partial purification of antigens from eggs of Schistosoma mansonithat elicit delayed hypersensitivity." J. lmmunol. 119(4): 1275-l278.
83
Laura l. Rutitzkv Biblio rafia
Brunet, L. R., F. D. Finkelman, et al. (¡997). "IL-4 protects against TNF-alpha-mediated cachexia anddeath during acute schistosomiasis." .l. Immunol. ¡59(2): 777-85.
Butterworth, A. E., D. W. Dunne, et al. (1996). "Immunity and morbidity in Schistosoma mansoníinfection: quantitative aspects." Am J Trop Med Hyg 55(5 Suppl): 109-15.
Cameron, G. R. and K. K. Bhattacharyya (1965). "Portal Hypertension in Experimental Schistosomiasis." LPathol. Bacteriol. 89: l-12.
Capron, A., M. Capron, et al. (2002). "Vaccine development against schistosomiasis from concepts toclinical trials." Br. Med. Bull. 62: 139-48.
Cameiro-Santos, P., O. Martins-Filho, et al. (2000). "Apoptosis: a mechanism of immunoregulation duringhuman Schistosomiasis mansoni." Parasite Immunol. 22(6): 267-77.
Carter, C. E. and D. G. Colley (¡978). "An electrophoretic analysis of Schistosoma mansoni soluble eggantigen preparation." J. Parasitol. 64(3): 285-90.
Cheever, A., R. Duvall, et al. (1987). "Variation of hepatic fibrosis and granuloma size among mousestrains infected with Schistosoma mansoni." Am. J. Trop. Med. Hyg. 37(1): 85-97.
Cheever, A. W., F. D. Finkelman, et al. (1992). "Treatment with anti-lL-2 antibodies reduces hepaticpathology and eosinophilia in Schistosoma mansoní-infected mice while selectiver inhibiting Tcell lL-S production." J. Immunol. l48(lO): 3244-8.
Chensue, S. W., K. S. Wannington, et al. (l993). "Evolving T cell responses in murine schistosomiasis.Th2 cells mediate secondary granulomatous hypersensitivity and are regulated by CD8+ T cells invivo." J. Immunol. ¡51(3): l39l-400.
Chiaramonte, M. G., D. D. Donaldson, et al. (1999). "An lL-l3 inhibitor blocks the development of hepaticfibrosis during a T-helper type 2-dominated inflammatory response." J Clin lnvest 104(6): 777-85.
Chikunguwo, S., T. Kanazawa, et al. (1991). "The cell-mediated response to schistosomal antigens at theclonal level. ln vivo functions of cloned murine egg antigen-specific CD4 + T helper type llymphocytes." Joumal of Immunology ¡47(1 l): 3921-3925.
Chomczynski, P. and N. Sacchi (1987). "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium"' J ‘ phenol- " ' m extraction." Anal Biochem ¡62(1): 156-9.
Cohen, J. J., R. C. Duke, et al. (1992). "Apoptosis and programmed cell death in immunity." Annu. Rev.Immunol. lO: 267-93.
Coker, C. M. (1957). "Effect of cortisone on natural immunity to Schistosoma mansoni in mice." Proc. Soc.Exp. Biol. Med. 96(1): l-3.
Colley, D. G. (l975). "lmmune responses to a soluble schistosomal egg antigen preparation during chronicprimary infection with Schistosoma mansoní." J. lmmunol. ¡15(1): 150-6.
Colley, D. G., A. A. Garcia, et al. (1986). "lmmune responses during human schistosomiasis. Xll.Differential responsiveness in patients with hepatosplenic disease." Am. J. Trop. Med . Hyg.35(4): 793-802.
Colley, D. G., M. A. Montesano, et al. (1999). "lnfection-stimulated or perinatally initiated idiotypicinteractions can direct differential morbidity and mortality in schistosomiasis." Microbes Infect.¡(7): 517-524.
Constant, S. L. and K. Bottome (1997). "lnduction of Thl and Th2 CD4+ T cell responses: the alternativeapproaches." Annu. Rev. Immunol. 15: 297-322.
Conca-Oliveira, R., L. C. Malaquias, et al. (1998). "Cytokines as detenninants of resistance and pathologyin human Schistosoma mansoni infection." Braz. J. Med. Biol. Res. 31(1): l7l-7.
Coulson, P. S. (1997). "The radiation-attenuated vaccine against schistosomes in animal models: paradigmfor a human vaccine?" Adv. Parasitol. 39: 271-336.
Cox, F. E. (2002). "History of human parasitology.“ Clin Microbiol Rev l5(4): 595-612.Davies, S. J., C. B. Shoemaker, et al. (I998). "A divergent member of the transforming growth factor beta
receptor family from Schistosoma mansoni is expressed on the parasite surface membrane." LBiol. Chem. 273(18): 11234-40.
De Cock, K. M. (1986). "Hepatosplenic schistosomiasis: a clinical review." Q_L|_t27(6): 734-45.de Jesus, A. R., A. Silva, et al. (2002). "Clinical and immunologic evaluation of 3l patients with acute
schistosomiasis mansoní." J. Infect. Dis. 185(l): 98-105.Deelder, A. M., Z. L. Qian, et al. (1994). "Quantitative diagnosis of Schistosoma infections by
measurement of circulating antigens in serum and urine." Trop. Geogr. Med. 46(4 Spec No): 2338.
84
Laura l. Rutitzkv Biblio rafia
Demeure, C. E., P. Rihet, et al. (1993). "Resistance to Schistosoma mansoni in humans: influence of thelgE/lgG4 balance and lgGZ in immunity to reinfection afier chemotherapy." .l. Infect. Dis. ¡68(4):1000-8.
Desbarats, J., J. E. Stone, et al. (2000). "Rapid early onset lymphocyte cell death in mice resistant, but notsusceptible to Leishmania major infection." Apoptosis 5(2): 189-96.
Domingo, E. O. and K. S. Warren (1968). "Endogenous desensitization: changing host granulomatouresponse to schistosome eggs at different stages of infection with schistosoma mansoni." Am. J.Pathol. 52(2): 369-79.
Dunne, D. W., A. M. Grabowska, et al. (¡988). "Human antibody responses to Schistosoma mansoni: theinfluence of epítopes shared between different life-cycle stages on the response to theschistosomulum." Eur. J. lmmunol. 18(1): 123-31.
Dunne, D. W. and E. J. Pearce (1999). "lmmunology of hepatosplenic schistosomiasis mansoni: a humanperspective." Microbes Infect. 1(7): 553-60.
Engels, D., L. Chitsulo, et al. (2002). "The global epidemiological situation of schistosomiasis and newapproaches to control and research." Acta Trop. 82(2): 139-46.
Estaquier, J., M. Marguerite, et al. (1997). “lnterleukin-lO-mediated T cell apoptosis during the T helpertype 2 cytokine response in murine Schistosoma mansoni parasite infection." Eur. Cytokine Netw.8(2): 153-60.
Falcao, P. L., L. C. Malaquias, et al. (1998). "Human Schistosomiasis mansoni: lL-lO modulates the invitro granuloma formation." Parasite lmmunol. 20(10): 447-54.
Fallon, P. 0., E. J. Richardson, et al. (2000). "Schistosome infection of transgenic mice defines distinct andcontrasting pathogenic roles for IL-4 and lL-l3: lL-l3 is a profibrotic agent." J. lmmunol. 164(5):2585-91.
Flores Villanueva, P. 0., S. M. Chikunguwo, et al. (1993). "Role of lL-lO on antigen-presenting cellfunction for schistosomal egg- specific monoclonal T helper cell responses in vitro and in vivo." Llmmunol. 151(6): 3192-8.
Flores Villanueva, P. 0., T. S. Harris, et al. (1994). "Macrophages from schistosomal egg granulomasinduce unresponsiveness in specific cloned Th-l lymphocytes in vitro and down-regulateschistosomal granulomatous disease in vivo." J. lmmunol. 152(4): 1847-55.
Flores Villanueva, P. 0., H. Reiser, et al. (¡994). "Regulation of T helper cell responses in experimentalmurine schistosomiasis by IL-lO. Effect on expression of B7 and B7-2 costimulatory molecules bymacrophages." J. lmmunol. ¡53(1 l): 5190-9.
Flores-Villanueva, P. 0., X. X. Zheng, et al. (1996). "Recombinant lL-lO and lL-lO/Fc treatment downregulate egg antigen- specific delayed hypersensitivity reactions and egg granuloma formation inschistosomiasis." J. lmmunol. ¡56(9): 3315-20.
Frauwirth, K. A. and C. B. Thompson (2002). "Activation and inhibition of lymphocytes by costimulatíon."J. Clin. Invest. 109(3): 295-9.
Gause, W. C., J. F. Urban, et al. (2003). "The immune response to parasitic helminths: insights from murinemodels." Trends lmmunol 24(5): 269-77.
Gigase, P. L. (1982). "Hepatosplenic human schistosomiasis; progress and problems." Acta Leiden 49: 4l53.
Goerdt, S. and C. E. Orfanos (1999). "Other functions, other genes: alternative activation of antigenpresenting cells." lmmunity 10(2): 137-42.
Goldring, O. L., J. A. Clegg, et al. (1976). "Acquisition of human blood group antigens by Schistosomamansoni." Clin. Exp. lmmunol. 26(l): 181-7.
Gonzalo, J. A., J. Tian, et al. (200i). "ICOS is critical for T helper cell-mediated lung mucosalinflammatory responses." Nat. lmmunol. 2(7): 597-604.
Gorczyca, W., J. Gong, et al. (1993). "Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by thein situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays." Cancer Res. 53(8):¡945-51.
Greenwald, R. J., A. J. McAdam, et al. (2002). "Cutting edge: inducible costimulator protein regulates bothThl and Th2 responses to cutaneous leishmaniasis." J. lmmunol. 168(3): 991-5.
Halim, A. B., R. F. Garry, et al. (l999). "Effect of schistosomiasis and hepatitis on liver disease." Am. J.Trop. Med. Hyg. 60(6): 915-20.
Hang, L. M., K. S. Warren, et al. (l974). "Schistosoma mansoni: antigenic secretions and the etiology ofegg granulomas in mice." Exp. Parasitol. 35(2): 288-98.
85
Laura l. Rutitzkv Biblio rafía
Ham, D., K. Danko, et al. (1989). "Schistosoma mansoni: the host immune response to egg antigens. l.Partial characterization f cellular and humoral responses to pl fi'actions of soluble egg antigens." Llmmunol. l42(6): 2061-2066.
Hernandez, H. J., C. M. Edson, et al. (1998). "Schistosoma mansoni: genetic restriction and cytokineprofile of the CD4 + T helper cell response to dominant epitope peptide of major egg antigen Smp40." Exp. Parasitol. 90(1): 122-30.
Hernandez, H. J., A. H. Sharpe, et al. (1999). "Experimental murine schistosomiasis in the absence of B7costimulatory molecules: reversal of elicited T cell cytokine profile and partial inhibition of egggranuloma formation." J. lmmunol. ¡62(5): 2884-9.
Hernandez, H. J., W. C. Trzyna, et a1. (1997). "Differential antigen recognítion by T cell populations fromstrains of mice developing polar forms of granulomatous inflammation in response to eggs ofSchistosoma mansoni." Eur. J. lmmunol. 27(3): 666-670.
Hernandez, H. J., Y. Wang, et al. (1997). "ln infection with Schistosoma mansoni, B cells are required forT helper type 2 cell responses but not for granuloma formation." J. lmmunol. ¡58(10): 4832-7.
Hernandez, H. J., Y. Wang, et al. (1997). "Expression of class ll, but not class l, major histocompatibilitycomplex molecules is required for granuloma formation in infection with Schistosoma mansoni."Eur. J. lmmunol. 27(5): 1170-1176.
Hoeppli, R. (1973). "Morphological changes in human schistosomiasis and certain analogies in ancientEgyptian sculpture." Acta Trop. 30(1): l-l 1.
Hoffmann, K. F., A. W. Cheever, et al. (2000). "lL-lO and the dangers of immune polarization: excessivetype l and type 2 cytokine responses induce distinct forms of lethal immunopathology in murineschistosomiasis." J. lmmunol. ¡64(12): 6406-16.
lacomini, J., D. Ricklan, et al. (1995). "T cells expressing the 76 T cell receptor are not required for egggranuloma formation in schistosomiasis." Eur. J. lmmunol. 25(4): 884-888.
Jenson, J. S., R. O'Connor, et al. (2002). "lnfection with Brugia microfilariae induces apoptosis of CD4(+)T lymphocytes: a mechanism of immune unresponsiveness in filariasis." Eur. J. lmmunol. 32(3):858-67.
Kalinkovich, A., Z. Weisman, et al. (1998). "Decreased CD4 and increased CD8 counts with T cellactivation is associated with chronic helminth infection." Clin. Exp. lmmunol. ¡14(3): 414-21.
Kaplan, M. H., .1. R. Whitfield, et al. (1998). "Th2 cells are required for the Schistosoma mansoni egginduced granulomatous response." J. lmmunol. 160(4): 1850-6.
Karanja, D. M., D. G. Colley, et al. (1997). "Studies on schistosomiasis in western Kenya: l. Evidence forimmune- facilitated excretion of schistosome eggs from patients with Schistosoma mansoni andhuman immunodeficiency virus coinfections." Am. J. Trop. Med. Hyg. 56(5): 515-21.
Katz, N., A. Chaves, et al. (1972). "A simple device for quantitative stool thick-smear technique inSchistosomiasis mansoni." Rev. lnst. Med.Trop. Sao Paulo 14(6): 397-400.
Kavurma, M. M. and L. M. Khachigian (2003). "Signaling and transcriptional control of Fas Iigand geneexpression." Cell Death Differ. 10(1): 36-44.
Kelso, A. (1999). "Educating T cells: early events in the differentiation and commitment of cytokineproducing CD4+ and CD8+ T cells." Springer Semin. lmmunopathol. 21(3): 231-48.
Kopf, M., A. J. Coyle, et al. (2000). "lnducible costimulator protein (lCOS) controls T helper cell subsetpolarization after virus and parasite infection." J. Exp. Med. l92(l): 53-61.
Lenardo, M., K. M. Chan, et al. (1999). "Mature T lymphocyte apoptosis--immune regulation in a dynamicand unpredictable antigenic environment." Annu. Rev. lmmunol. 17: 221-53.
Lenschow, D. J., T. L. Walunas, et al. (1996). "CD28/B7 system of T cell costimulation." Annu.Rev.lmmunol. 14: 233-58.
Lopes, M. F., V. F. da Veiga, et al. (1995). "Activation-induced CD4+ T cell death by apoptosis inexperimental Chagas' disease." J. lmmunol. [54(2): 744-52.
Loukas, A., M. K. Jones, et al. (2001). "Receptor for Fc on the surfaces of schistosomes." Infect. lmmun.69(6): 3646-51.
Lukacs, N. and D. Boros (1991). "Identification of larval cross-reactive end egg-specífic antigens involvedin granuloma formation in murine schistosomiasis mansoni." Infect. lmmun. 59(9): 3237-3242.
Lundy, S. K. and D. L. Boros (2002). "Fas ligand-expressing B-la lymphocytes mediate CD4(+)-T-cellapoptosis during schistosomal infection: induction by interleukin 4 (IL-4) and lL-lO." Infect.lmmun. 70(2): 812-9.
86
Laura l. Rutitzkv Biblio rafia
Lundy, S. K., S. P. Lerman, et al. (2001). "Soluble egg antigen-stimulated T helper lymphocyte apoptosisand evidence for cell death mediated by FasL(+) T and B cells during murine Schistosomamansoni infection." Infect. Immun. 69(l): 27l-80.
MacDonald, A. S., E. A. Patton, et al. (2002). "Impaired Th2 Development and Increased Monality DuringSchistosoma mansoni lnfection in the Absence of CD40/CDl54 Interaction." J. Immunol. ¡68(9):4643-9.
Mages, H. W., A. Hutloff, et al. (2000). "Molecular cloning and characterization of murine ICOS andidentification of B7h as ICOS ligand." Eur. J. Immunol. 30(4): lO40-7.
Malaquias, L. C., P. L. Falcao, et al. (1997). "Cytokine regulation of human immune response toSchistosoma mansoni: analysis of the role of lL-4, lL-S and lL-lO on peripheral bloodmononuclear cell responses." Scand. J. Immunol. 46(4): 393-8.
Marquet, S., L. Abel, et al. (1996). "Genetic localization of a locus controlling the intensity of infection bySchistosoma mansoni on chromosome 5q3 l-q33." Nat. Genet. 14(2): 181-4.
Martins, G. A., M. A. Cardoso, et al. (l998). "Nitric oxide-induced apoptotic cell death in the acute phaseof Trypanosoma cruzi infection in mice." Immunol. Lett. 63(2): l 13-20.
Mathew, R. C. and D. L. Boros (1986). "Anti-L3T4 antibody treatment suppresses hepatic granulomaformation and abrogates antigen-induced interleukin-2 production in Schistosoma mansoniinfection." lnfect. Immun. 54(3): 820-6.
Mathew, R. C., S. Ragheb, et al. (1990). "Recombinant lL-2 therapy reverses diminished granulomatousresponsiveness in anti-L3T4-treated, Schistosoma mansoni-infected mice." J. Immunol. ¡44(11):4356-61.
McAdam, A. J., T. T. Chang, et al. (2000). "Mouse inducible costimulatory molecule (ICOS) expression isenhanced by CD28 costimulation and regulates differentiation of CD4+ T cells." .l. Immunol.165(9): 5035-40.
McKerrow, J. H., S. Pino-Heiss, et al. (l985). "Purification and characterization of an elastinolyticproteinase secreted by cercariae of Schistosoma mansoni." J. Biol. Chem. 260(6): 3703-7.
Mogil, R. J., L. Radvanyi, et al. (1995). "Fas (CD95) participates in peripheral T cell deletion andassociated apoptosis in vivo." Int. Immunol. 7(9): 1451-8.
Montenegro, S. M., P. Miranda, et al. (1999). "Cytokine production in acute versus chronic humanSchistosomiasis mansoni: the cross-regulatory role of interferon-gamma and interleukin- lO in theresponses of peripheral blood mononuclear cells and splenocytes to parasite antigens." J. lnfect.D_is_.l79(6): 1502-14.
Montesano, M. A., D. G. Colley, et al. (1999). "Neonatal exposure to idiotype induces Schistosomamansoni egg antigen-specific cellular and humoral immune responses.“ J. Immunol. 163(2): 898905
Mossmann, T. and R. Coffman (1989). "TH-l and TH-2 cells: different patterns of lymphokine secretionlead to different properties." Ann. Rev. Immunol. 7: l45-l73.
Mon, K. E., l. Nuttall, et al. (1995). "New geographical approaches to control of some parasitic zoonoses."Bull. World Health Organ. 73(2): 247-57.
Murphy, K. M., W. Ouyang, et al. (2000). "Signaling and transcription in T helper development." Annu.Rev. Immunol. [8: 451-94.
Murphy, K. M. and S. L. Reiner (2002). "The lineage decisions of helper T cells." Nat. Rev. Immunol.2(12): 933-44.
Mwatha, .l. K., G. Kimani, et al. (1998). "High levels ofTNF, soluble TNF receptors, soluble [CAM-l, andIFN- gamma, but low levels of lL-S, are associated with hepatosplenic disease in humanschistosomiasis mansoni." J. Immunol. 160(4): 1992-9.
Naus, C. W., G. Kimani, et al. (1999). "Development of antibody isotype responses to Schistosomamansoni in an immunologically naive immigrant population: influence of infection duration,infection intensity, and host age." Infect. Immun. 67(7): 3444-5].
Nelson, B. H. and D. M. Willerford (1998). "Biology of the interleukin-2 receptor." Adv. Immunol. 70: l81
Noble, E. R. (1982). "Presidential address. Parasites can never do only one thing." J. Parasitol. 68( l): 3-7.Ozkaynak, E., W. Gao, et al. (2001). "lmportance of lCOS-B7RP-l costimulation in acute and chronic
allograf‘trejection." Nat. lmmunol. 2(7): 591-6.Papiemik, M., M. L. de Moraes, et al. (1998). "Regulatory CD4 T cells: expression of lL-2R alpha chain,
resistance to clonal deletion and lL-2 dependency." lnt. lmmunol. 10(4): 371-8.
87
Laura l. Rutitzkv Biblio rafia
Pearce, E., P. Caspar, et al. (|99|). "Downregulation of Thl cytokine production accompanies induction ofTh2 responses by a parasitic helminth, Schistosoma mansoni." J. Exp. Med. 173(l): l59-I66.
Pearce, E. J., A. Cheever, et al. (1996). "Schistosoma mansoni in lL-4-deficient mice." lnt. lmmunol. 8(4):435-44.
Pearce, E. J. and A. S. MacDonald (2002). "The immunobiology of schistosomiasis." Nat. Rev. Immunol.2(7): 499-5l l.
Pedras-Vasconcelos, J. A. and E. J. Pearce (1996). "Type l CD8+ T cell responses during infection withthe helminth Schistosoma mansoni." J. Immunol. 157(7): 3046-53.
Pelley, R., R. Pelley, et al. (1976). " Schistosoma mansoni soluble egg antigens. l. Identification andpurification of three major antigens. and the employment of radioimmunoassay for their furthercharacterization." J. Immunol. 117(5 Pt l): 1553-1560.
Pelley, R. P. (1977). "Purification of Schistosoma mansoni egg antigens: theory and practice." Am. J. Trop.Med. Hyg. 26(6 Pt 2): 104-12.
Peterson, W. P. and F. Von Lichtenberg (1965). "Studies on granuloma formation. lV. ln vivo antigenicityof schistosome egg antigen in lung tissue." J. Immunol. 95(5): 959-65.
Phillips, S. M., J. J. DiConza, et al. (1977). "Schistosomiasis in the congenitally athymic (nude) mouse. l.Thymic dependency of eosinophilia, granuloma formation, and host morbidity." J. lmmunol.118(2): 594-9.
Phillips, S. M., J. J. Lin, et al. (1991). "Resistance in muríne schistosomiasis is contingent on activated lL-2receptor-bearing L3T4+ lymphocytes, negatively regulated by Lyt-2+ cells, and uninfluenced bythe presence oflL-4." J. lmmunol. 146(4): l335-40.
Raia, S., S. Mies, et al. (1985). "Portal hypertension in schistosomiasis." Clin Gastroenterol 14(1): 57-82.Ramaswamy, K., P. Kumar, et al. (2000). "A role for parasite-induced PGE2 in lL-lO-mediated host
immunoregulation by skin stage schistosomula of Schistosoma mansoni." J. Immunol. 165(8):4567-74.
Ramos-Morales, F., Z. R. Sotomayor, et al. (l968). "Manson's schistosomiasis in Puerto Rico. Clinicalanalysis of 1,845 untreated patients." Bull. N. Y. Acad. Med. 44(3): 317-31.
Rathmell, J. C. and C. B. Thompson (2002). "Pathways of apoptosis in lymphocyte development,homeostasis, and disease." _Ce_ll109 Suppl: 897-107.
Reynolds, S. R. and D. A. Ham (1992). "Comparison of irradiated-cercaria schistosome vaccine modelsthat use 15- and SO-kilorad doses: the lS-kilorad dose gives greater protection, smaller liver sizes,and higher gamma interferon levels after challenge." Infect. lmmun. 60(1): 90-4.
Rezende, S. A., V. R. Oliveira, et al. (1997). "Mice lacking the gamma interferon receptor have an impairedgranulomatous reaction to Schistosoma mansoni infection." Infect. lmmun. 65(8): 3457-6].
Ritter, D. M. and J. H. McKerrow (1996). "lntercellular adhesion molecule l is the major adhesionmolecule expressed during schistosome granuloma formation." Infect. lmmun. 64(1 l): 4706-l3.
Rottman, J. B., T. Smith, et al. (2001). "The costimulatory molecule lCOS plays an important role in theimmunopathogenesis of EAE." Nat. lmmunol. 2(7): 605-1 l.
Ruffer, M. A. (l9lO). "Note on the presence of "Bilharzia Haematobia" in Egyptian mummies of thetwentieth dynasty." Br. Med. J. i: l6.
Rumbley, C. A., H. Sugaya, et al. (1999). "Activated eosinophils are the major source of Th2-associatedcytokines in the schistosome granuloma." J. lmmunol. ¡62(2): 1003-9.
Rumbley, C. A., H. Sugaya, et al. (2001). "Elimination of lymphocytes, but not eosinophils, by Fasmediated apoptosis in murine schistosomiasis." Am. J. Trop. Med. Hyg. 65(5): 442-9.
Rumbley, C. A., S. A. Zekavat, et al. (l998). "The schistosome granuloma: characterization of lymphocytemigration, activation, and cytokine production." J. lmmunol. ¡61(8): 4129-37.
Sadler, C. H., L. l. Rutitzky, et al. (2003). "IL-lO is crucial for the transition from acute to chronic diseasestate during infection of mice with Schistosoma mansoni." Eur. J. lmmunol. 33(4): 880-8.
Sanchez-Torres, L., A. Rodriguez-Ropon, et al. (200]). "Mouse splenic CD4+ and CD8+ T cells undergoextensive apoptosis during a Plasmodium chabaudi chabaudi AS infection." Parasite Immunol.23(12): 617-26.
Secor, W. E., H. del Corral, et al. (l996). "Association of hepatosplenic schistosomiasis with HLADQBl*0201." J. lnfect. Dis. 174(5): 1131-5.
Simpson, A. J., D. Singer, et al. (1983). "Evidence that schistosome MHC antigens are not synthesized bythe parasite but are acquired from the host as intact glycoproteins." J. lmmunol. ¡31(2): 962-5.
88
Laura l. Rutitzky Biblio raña
Smithers, S. and M. Doenhoff (1982). Schistosomiasis. ' ' of Parasitic Diseases. S. C. a. Warren.Oxford, Blackwell Scientific: 5527-607.
Sperling, A. l. and J. A. Bluestone (2001). "ICOS costimulation: It's not just for Th2 cells anymore." MImmunol. 2(7): 573-4.
Stadecker, M. J. (1999). "The regulatory role of the antigen-presenting cell in the development of hepaticimmunopathology during infection with Schistosoma mansoni." Pathobiology 67(5-6): 269-72.
Stadecker, M. J. and P. O. Flores Villanueva (1994). "Accessory cell signals regulate Th-cell responses:from basic immunology to a model of helminthic disease." mmunol. Today 15(12): 571-4.
Stadecker, M. J. and H. J. Hernandez (1998). "The immune response and immunopathology in infectionwith Schistosoma mansoni: a key role of major egg antigen Sm-p40." Parasite Immunol. 20(5):217-21.
Stadecker, M. J., H. J. Hernandez, et al. (200]). "The identification and characterization of newimmunogenic egg components: implications for evaluation and control of the immunopathogenicT cell response in schistosomiasis." Mem. lnst. Oswaldo Cruz 96 Suppl: 29-33.
Taniguchi, T. and Y. Minami (1993). "The lL-2/lL-2 receptor system: a current overview." M 73(1): 5-8.Tesciuba, A. G., S. Subudhi, et al. (200]). "lnducible costimulator regulates Th2-mediated inflammation,
but not Th2 differentiation, in a model of allergic airway disease.“ .l. Immunol. 167(4): 1996-2003.Tsang, V. C. and P. P. Wilkins (l99l). "lmmunodiagnosis of schistosomiasis. Screen with FAST-ELISA
and confirm with immunoblot." Clin. Lab. Med. 11(4): 1029-39.van der Werf, M. J., K. M. Bosompem, et al. (2003). "Schistosomiasis control in Ghana: case management
and means for diagnosis and treatment within the health system." Trans. R. Soc. Trop. Med. HVR.97(2): 146-52.
van Neerven, R. J., S. H. Sparholt, et al. (l998). "Preserved epitope-specific T cell activation byrecombinant Bet v l-MBP fusion proteins." Clin. Exp. Allergy 28(4): 423-33.
Van Parijs, L., A. Biuckians, et al. (1998). "Functional roles of Fas and Bcl-2-regulated apoptosis of Tlymphocytes." J. Immunol. 160(5): 2065-71.
Van Parijs, L., A. lbraghimov, et al. (¡996). "The roles of costimulation and Fas in T cell apoptosis andperipheral tolerance." mmunig 4(3): 321-8.
Van Parijs, L., D. A. Peterson, et al. (1998). "The Fas/Fas ligand pathway and Bcl-2 regulate T cellresponses to model self and foreign antigens." mmunig 8(2): 265-74.
Vaux, D. L. and A. Strasser (l996). "The molecular biology of apoptosis." Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A93(6): 2239-44.
Vella, A. T. and E. J. Pearce (1992). "CD4+ Th2 response induced by Schistosoma mansoni eggs developsrapidly, through an early, transient, Th0-like stage." J. Immunol. ¡48(7): 2283-90.
von Lichtenberg, F. (1962). "Host response to eggs of Schistosoma mansoni. l. Granuloma formation in theunsensitized laboratory mouse." Amer. J. Pathol. 41: 7l l.
Von Lichtenberg, F., T. M. Smith, et al. (1971). "New model for schistosome granuloma formation using asluble egg antigen and bentonite particles." Nature 229(528 l): 199-200.
Waldmann, T., Y. Tagaya, et al. (1998). "lnterleukin-2, interleukin-lS, and their receptors.“ lnt. Rev.Immunol. 16(3-4): 205-26.
Warren, K. S. (196]). "The etiology of hepato-splenic Schistosomiasis mansoni in mice." Am. J. Trop.Med. Hyg. 10: 870-6.
Warren, K. S. (1978). "The pathology, pathobiology and pathogenesis of schistosomiasis." Nature273(5664): 609-12.
Warren, K. S. and W. B. Dewitt (l958). "Production of portal hypertension and esophageal varices in themouse." Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 98(1): 99-101.
Warren, K. S., E. O. Domingo, et al. (1967). "Granuloma formation around schistosome eggs as amanifestation of delayed hypersensitivity." Am. J. Pathol. 51(5): 735-56.
Weiss, J. B., W. S. Aronstein, et al. (1987). "Schistosoma mansoni: stimulation of artificial granulomaformation in vivo by carbohydrate detenninants." Exp. Parasitol. 64(2): 228-36.
Whitmire, J. K. and R. Ahmed (2000). "Costimulation in antiviral immunity: differential requirements forCD4(+) and CD8(+) T cell responses." Curr. Opin. Immunol. 12(4): 448-55.
WHO (¡993). "World Health Organization: The control of schistosomiasis. Second report of the WHOExpert Committee" World Health Org. Tech. Rep. Ser. 830: l-86
Wilson, R. A., P. S. Coulson, et al. (1999). "Immune responses to the radiation-attenuated schistosomevaccine: what can we learn from knock-out mice?" Immunol. Len. 65(1-2): l 17-23.
89
Laura I. Rutitzkv Biblio rafia
Wipasa, J., H. Xu, et al. (200]). "Apoptotic deletion of Th cells specific for the l9-kDa carboxyI-terminalfragment of merozoite surface protein l during malaria infection." J. Immunol. ¡67(7): 3903-9.
Wynn, T. A., A. W. Cheever, et al. (1995). "An IL-lZ-based vaccination method for preventing fibrosisinduced by schistosome infection." Nature 376(654l): 594-6.
Wynn, T. A., l. Eltoum, et al. (¡993). "Analysis of cytokine mRNA expression during primary granulomaformation induced by eggs of Schistosoma mansoni." J. Immunol. ¡51(3): 1430-40.
Wynn, T. A., l. Eltoum, et al. (l994). "Endogenous interleukin 12 (IL-12) regulates granuloma formationinduced by eggs of Schistosoma mansoni and exogenous IL-12 both inhibits and prophylacticallyimmunizes against egg pathology." J. Exp. Med. l79(5): 1551-61.
Wynn, T. A., D. Jankovic, et al. (1995). "IL-¡2 exacerbates rather than suppresses T helper 2-dependentpathology in the absence of endogenous ¡FN-gamma." J. Immunol. 154(8): 3999-4009.
Ziegler, S. F., F. Ramsdell, et al. (1994). "The activation antigen CD69." Stem Cells 12(5): 456-65.