Materijal i metode · 2021. 1. 4. · Tabela 1. Po~etni broj `ivih bakterijskih }elija Eksperimentalna grupa Zapremina bakterijske kulture mL Broj bakterija 109 mL–1 I 1 0.218 II

Iva Atanaskovi}

Ispitivanje uticaja bakterijeEscherichia coli na procesbiosinteze hlorofila a i bkod klica p{enice (Triticumvulgare L.)

Klice p{enice (Triticum Vulgare L.) tretirane surazli~itim koncentracijama bakterijske kulture Esch-erichia coli radi utvr|ivanja uticaja ove bakterije naproces biosinteze hlorofila i rast i razvoj klica. Ueksperimentu je kori{}ena metoda decimalnog raz-bla`enja radi odre|ivanja po~etne brojnosti bakteri-ja u eksperimentalnim grupama. Kori{}ena je i spek-trofotometrijska metoda za utvr|ivanje koncentracijesintetisanog hlorofila u tretiranim uzorcima. Rezultatisu pokazali da sa porastom koncentracije bakterijskekulture kojom su klice tretirane raste i koncentracijasintentetisanog hlorofila, kao i masa nadzemnih, ze-lenih delova klica. Pretpostavlja se da pozitivanuticaj bakterije poti~e od njene sposobnosti da sinte-ti{e vitamine K i B, no ta pretpostavka ovim ekspe-rimentom nije dokazivana i to mo`e biti tema zaneko naredno nau~no istra`ivanje. Pokazano je dase eventualnim tretiranjem zemlji{ta |ubrivom kojesadr`i ovu bakterijsku kulturu mo`e pove}ati njegovaplodnost i omogu}iti bolji biljni prinos.

Uvod

Najva`nija svojstva zemlji{ta, prvenstveno stru-ktura i plodnost, uslovljena su aktivnim radom mi-kroorganizama u njemu. Bez njihovog prisustva,zemlji{te nikad ne bi dobilo organske materije, pos-talo plodno i sposobno da snabdeva biljni svet (\uki}i Jemcev 2000).

U zemlji{tu su od svih mikroorganizama kvanta-tivno najzastupljenije bakterije. One sa biljkama stu-paju u najrazli~itije vrste simbiotskih odnosa. Osim

{to omogu}avaju proces kru`enja materije, bakterijeisto tako mogu spre~iti razvoj fitopatogena, stvaraju}imnoga jedinjenja antibiotskog efekta. Prisustvo bak-terija tako|e mo`e imati negativan efekat na biljni or-ganizam (\uki} i Jemcev 2000).

Bakterija Escherichia coli prirodni je stanovnikdigestivnog trakta `ivotinja (Simi} 1988). Stajsko |u-brivo doprinosi plodnosti zemlji{ta, a u njemu su pri-sutne mnoge bakterije digestivnog trakta, pa postojiverovatno}a da ova bakterija mo`e aktivno uticati na`ivotne procese biljaka. Jedna od bitnih jedinjenjakoje ova bakterija mo`e sintetisati i osloba|ati u spo-lja{nju sredinu su vitamini K i B, jedinjenja neopho-dna u `ivotu kako `ivotinja, tako i biljaka (Simi}1988).

Cilj ovog istra`ivanja je da se odredi kakav efe-kat bakterija E. coli ima na razvoj p{eni~nih klica,odnosno kakav je njen uticaj na proces biosintezehlorofila a i b.

Materijal i metode

Semena p{enice (Triticum vulgare L.), proizvo-|a~a Floridabel, starost tri godine isklijavana su umraku, a potom su klice tretirane razli~itim koncen-tracijama bakterijske suspenzije Escherichia coli.Klice su raspore|ene u ~etiri eksperimentalne grupe,gde je prva tretirana sa 1 mL, druga sa 2 mL, tre}a sa4 mL, a ~etvrta sa 8 mL bakterijske suspenzije. Pra}enje uticaj bakterije na rast i koncentraciju sintetisanoghlorofila. Merena je zelena biljna masa nadzemnihdelova klica. Koncentracija sintenzovanog hlorofila ai b odre|ena je spektrofotometrijski.

Tretiranje klica bakterijskom kulturom. Seme-na su isklijavana u mraku, na temperaturi 25±2°C, navla`noj vati u termostatu. Nakon isklijavanja, u 10

ZBORNIK RADOVA 2009 BIOLOGIJA • 189

Iva Atanaskovi} (1993), Beograd, Kneza Milo{a 64,u~enica 1. razreda gimnazije „Sveti Sava“ uBeogradu

MENTOR: Jelena Savi}, dipl. biolog,XII beogradska gimnazija

Petrijevih {olja stavljeno je po 20 klica na sterilnuvatu. Transport semena iz termostata u Petrijeve {o-lje vr{en je u odsustvu Sun~eve svetlosti. Time jespre~en proces biosinteze hlorofila pre tretiranja kli-ca bakterijskom kulturom.

Prekono}na kultura E. coli razre|ena je meto-dom decimalnih razbla`enja. Bakterijska suspenzijaje koncentrovana tako {to je iz epruveta sa razbla-`enjem 10–6 sterilno pipetirano po 1 mL kulture uPetri {olje prve grupe, po 2 mL u drugu grupu, po 4mL u tre}u grupu i po 8 mL u ~etvrtu grupu. Petagrupa je kontrolna i nije tretirana bakterijskomsuspenzijom. Brojnost bakterija u kulturi kojom suklice tretirane tako|e je odre|ena metodom decima-lnih razbla`enja (Kne`evi}-Vuk~evi} i Simi} 1997).

Tokom no}i klice su ostavljene na podlozi sa ba-kterijskom kulturom i tako izlo`ene uticaju bakterija.Ukupno trajanje tretmana je 72 h. Ujutru su izlo`eneSun~evoj svetlosti da bi se podstakla biosinteza hlo-rofila. Svakodnevno su zalivane ~esmenskom vo-dom, i to sa po 5 mL po Petri {olji. Vata i vodakojom su semena tretirana sterilisane su u autoklavu(T = 121°C, P = 1.2 bar), radi sigurnosti da su kliceizlo`ene samo uticaju bakterije Escherichia coli.

Odre|ivanje koncentracije hlorofila a i b u

p{eni~nim klicama. Kada su se listovi p{enice do-voljno razvili i ozeleneli pristupilo se odre|ivanjukoncentracije hlorofila a i b metodom spektro-fotometrije iz dva koraka (]ulafi} et al. 1992). Uprvom koraku izvr{ena je acetonska ekstrakcijahlorofila iz uzoraka svake grupe. Zatim je pomo}uspektrofotometra odre|ena apsorbanca acetonskogekstrakta klica iz svih pet grupa. Apsorbance sumerene na 663 nm, 645 nm i 720 nm. Merenja suponovljena po dva puta za svaki uzorak i izra~unataje srednja vrednost za svaku talasnu du`inu. Hlorofilne apsorbuje svetlost na talasnoj du`ini od 720 nm,pa je merenjem na toj talasnoj du`ini odre|enaapsorbanca svih drugih pigmenata i ne~isto}a prisu-tnih u ekstraktu. Oduzimanjem te apsorbance od onena 663 nm dobijena je apsorbanca hlorofila a, dok jeoduzimanjem od apsorbance na 645 nm dobijenaapsorbanca hlorofila b (Sari} 1979). Kori{}enjemformule: Ca = 14.92A663 – 2.9A645 dobijena jekoncentracija hlorofila a, dok je koncentracijahlorofila b dobijena kori{}enjem formule: Cb == 25.21A645 – 5.15A663 (]ulafi} et al. 1992).Sabiranjem vrednosti Ca i Cb dobijena je ukupnakoncentracija hlorofila u uzorku.

Rezultati i diskusija

Po~etna brojnost `ivih bakterijskih }elija E. coliu uzorcima kojim su eksperimentalne grupe tretiranedata je u tabeli 1. U tabeli 2 data je masa nadzemnihdelova klica izmerena u eksperimentalnim grupama.Iz grafikona prikazanog na slici 1 vidi se porast bi-ljne mase sa porastom intenziteta tretmana bakterij-skom suspenzijom. Kontrola je imala manje biljnemase od eksperimentalnih grupa, svega 0.08 g. Naj-vi{e biljne mase izmereno je u IV grupi, gde je bilooko 5 puta vi{e biljne mase nego u kontroli.

Tabela 1. Po~etni broj `ivih bakterijskih }elija

Eksperimentalna

grupa

Zapreminabakterijske

kulture �mL�

Broj bakterija�109 mL–1

�

I 1 0.218II 2 0.437III 4 0.874

IV 8 1.748

Tabela 2. Masa nadzemnih delova klica ueksperimentalnim grupama

Eksperimentalna

grupa

m �g�

K1 0.068K2 0.083K srednja vrednost 0.075I1 0.233I2 0.161I srednja vrednost 0.197II1 0.292II2 0.242II srednja vrednost 0.267III1 0.306III2 0.254III srednja vrednost 0.280IV1 0.394IV2 0.367

IV srednja vrednost 0.380

190 • PETNI^KE SVESKE 67 DEO II

U tabeli 3 date su koncentracije sintetisanog hlo-rofila a i b u eksperimentalnim grupama. Iz grafikonaprikazanog na slici 2 vidi se porast koncentracijesintetisanog hlorofila sa porastom koncentracije bak-terijske suspenzije kori{}ene u tretmanu. Kontrola jeimala manje koncentracije hlorofila od eksperimen-talnih grupa, svega 4 µmol/L. Najve}a koncentracijahlorofila izmerena je u IV grupi, gde je sintetisanooko sedam puta vi{e hlorofila nego u kontroli.

Tako|e su zapa`eni crveni regioni na stabaocimaklica u eksperimentalnim grupama (slika 3C), dok ukontroli pojave crvenila nije bilo. Zato se pretpo-

stavlja da je ova pojava upravo posledica tretmanabakterijskom kulturom.

Na koji na~in je bakterijska kultura pomogla pro-ces fotosinteze hlorofila ovim eksperimentom nijeutvr|ivano, ali mo`emo pretpostaviti koji bi moglibiti uzroci povoljnog ishoda tretmana:

1. Vitamin K je jedinjenje prisutno u svim zele-nim delovima biljke. No, njegova funkcija u biljnomorganizmu nije jo{ potpuno jasna i odre|ena. Ovaj vi-tamin znatno je zastupljeniji u zelenim nego u osta-lim delovima biljke. On se bolje sinteti{e u klicamaizlo`enim svetlosti, nego u onima koje su rasle u

ZBORNIK RADOVA 2009 BIOLOGIJA • 191

Tabela 3. Koncentracija hlorofila a i b u eksperimentalnim grupama. Ca – koncentracija hlorofila a,Cb – koncentracija hlorofila b, Ca+b – ukupna koncentracija hlorofila.

Eksp. grupa A645 A663 Ca �µmol/L� Cb �µmol/L� Ca+b �µmol/L�

K1 0.07 0.17 2.46 0.85 3.31K2 0.11 0.23 3.11 1.58 4.69K srednja vrednost 0.09 0.2 2.78 1.21 4I1 0.23 0.62 8.58 2.83 11.42I2 0.17 0.56 7.85 1.5 9.36I srednja vrednost 0.2 0.59 8.21 2.16 10.39II1 0.37 0.85 11.67 4.89 16.57II2 0.28 0.75 10.42 3.29 13.72II srednja vrednost 0.32 0.8 11.04 4.09 15.14III1 0.39 1.04 14.39 4.69 19.07III2 0.41 1.07 14.8 4.91 19.71III srednja vrednost 0.4 1.05 14.59 4.8 19.39IV1 0.57 1.51 20.93 4.91 25.84IV2 0.62 1.63 22.53 7.25 29.78

IV srednja vrednost 0.59 1.57 21.73 6.09 27.81

Slika 1. Masa nadzemnih delova klica

Figure 1. Overall mass of seedling’s green parts (controlfollowed by groups I-IV)

Slika 2. Ukupna koncentracija hlorofila a i b

Figure 2. Concentration of chlorophyll a and b (controlfollowed by groups I-IV)

192 • PETNI^KE SVESKE 67 DEO II

Slika 3. Kontrola (K), I, II, III i IV grupa 24 ~asa nakon tretmana. Na poslednjem snimku (C) prime}uju se crveniregioni na klicama (ovde izra`eni tamnom nijansom)

Figure 3. Control (K) and treated samples (I, II, III and IV) 24 h after the treatment. Red regions of the seedlingscan be noticed on photo C (seen as a darker shade)

mraku i nisu sintetisale hlorofil. Zato se pretpostavljada je njegova funkcija povezana sa procesom biosin-teze hlorofila (Dam i Glavind 1938). Postoji i funkci-ja ovog vitamina u procesu fotosinteze, no ona nijejo{ potpuno definisana i odre|ena (Bishop 1958). Ba-kterija Escherichia coli je sposobna da sinteti{e ovajvitamin u svojim metaboli~kim procesima (Simi}1988) i mogla je pospe{iti proces biosinteze hlorofilaupravo ovim jedinjenjem.

2. Vitamin B je jedinjenje koje se uglavnom skla-di{ti u listovima biljke, jedinjenje koje biljka mo`e isama sintetisati, ali u ekstremno stresnim uslovima,kao prilikom presa|ivanja, uzima}e ga iz spolja{njesredine. Dokazano je da je ovaj vitamin bitan simula-tor rasta korena i ~esto se dodaje razli~itim vrstama|ubriva (Bonnet i Greene 1939). Bakterija Escheri-chia coli sposobna je da sinteti{e i osloba|a u spo-lja{nju sredinu ovaj vitamin (Dempsey 1971), pa je iovom sposobno{}u mogla doprineti razvitku p{eni~-nih klica. Tokom izvo|enja eksperimenta klice supreno{ene sa podloge na kojoj su isklijale na podlogusa bakterijskom suspenzijom. Tada je verovatno do{lodo mehani~kih o{te}enja ve} isklijalih koren~i}a. Mogu-}e je da su klice u eksperimentalnim grupama boljepro{le kroz ovu vrstu stresa i da su se bolje primilena novu podlogu nego one u kontrolnoj grupi, upravozbog prisustva vitamina B u spolja{njoj sredini.

3. U hranljivom medijumu nalaze se mnoge or-ganske materije koje su bakterije mogle razlo`iti donivoa neorganskih jedinjenja, koje su potom biljkemogle iskoristiti u svojim metaboli~kim procesima.[to je vi{e hranljivih ~estica, to biljka proizvede vi{eenergije, pa samim tim mo`e br`e da raste i da sin-teti{e vi{e hlorofila. U kontroli jedini izvor neorgan-skih ~estica bili su oni joni dostupni u ~esmenskojvodi kojom su klice zalivane, te su se zato one slabijerazvile od klica u eksperimentalnim grupama. Ve}nakon 24 h tretmana prime}uje se razlika u koli~inibiljne mase; naro~ito je uo~ljiva razlika izme|u kon-trolne i ~etvrte grupe (slika 3).

Zaklju~ak

Ovim ispitivanjem utvr|eno je da sa porastomkoncentracije bakterijske suspenzije kojom su klicetretitane raste i koncentracija sintetisanog hlorofila,kao i koli~ina biljne mase u eksperimentalnim gru-pama. Najvi{e biljne mase i sintetisanog hlorofilaizmereno je u ~etvrtoj grupi, gde je tretman bio naj-intenzivniji. Pretpostavlja se da je ovakav uticaj

bakterije uslovljen njenom sposobno{}u da sinteti{evitamine K i B, no ovim eksperimentom ta pretpo-stavka nije dokazivana. Pretpostaljamo da se dodava-njem ove bakterije u |ubrivo mo`e pobolj{ati plodnostzemlji{ta i omogu}iti bolji rast biljaka.

No da bi se ovo saznanje zaista moglo primenitiu proizvodnji |ubriva, neophodno je uraditi podrob-nija istra`ivanja. Bitno je utvrditi pri kojim koncen-tracijama bakterijske suspenzije njen uticaj postaje{tetan bo biljku. Osim ispitivanja uticaja bakterije nabiljku, treba se svakako usredsrediti i na njene odno-se sa drugim stanovnicima slo`enog zemlji{nog eko-sistema, tako da mo`emo biti sigurni da |ubrivooboga}eno kulturom E. coli ne}e naru{iti mikro-ravnote`u zemlji{ta.

Literatura

Bishop N. I. 1958. Vitamin K, an essential factorfor the photochemical activity of isolatedchloroplasts. Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America, 44:501.

Bonnet J., Greene J. 1938. Vitamin B1 and thegrowth of green plants. Bot. Gaz., 100: 226

]ulafi} Lj., Cerovi} Z., Naunovi} G., Konjevi} R.1992. Fiziologija biljaka – praktikum. Beograd:Nau~na knjiga

Dam H., Glavind J. 1938. Vitamin K in the plant.Biochem. J., 32: 1018

Dempsey W. B. 1971. Role of Vitamin B6Biosynthetic Rate in the Study of Vitamin B6Synthesis in Escherichia coli. Journal ofbacteriology, 108: 1001.

\uki} D. A., Jemcev V. 2000. Mikrobiologija.Beograd: Vojna knjiga

Kne`evi}-Vuk~evi} J., Simi} D. 1997. Metode umikrobiolgiji-prvi deo. Beograd: Biolo{ki fakultetUniverziteta u Beogradu

Sari} M. 1979. Fiziologija biljaka. Beograd:Nau~na knjiga

Simi} D. 1988. Mikrobiologija. Beograd: Nau~naknjiga

Vuki}evi} J. K., Simi} D. 1997. Metode umikrobiologiji – prvi deo. Beograd: Biolo{kifakultet

ZBORNIK RADOVA 2009 BIOLOGIJA • 193

Iva Atanaskovi}

Impact of Escherichia coli on theProcess Of Chlorophyll Biosynthesisand Growth and Development ofWheat (Triticum vulgare L.) Seedlings

I this research wheat seedlings were treated withdifferent concentrations of Escherichia coli bacterialculture to determine the impact of the bacteria onthe process of chlorophyll biosynthesis and growthand development of seedlings. The experiment usedthe decimal dilution method to determine the initialnumber of bacteria in the experimental groups, and aspectrophotometer for determining the concentrationof chlorophyll in treated samples. The resultsshowed that the chlorophyll concentration in seed-lings increases with increasing concentrations ofbacterial cultures. This increasing pattern has alsobeen found in the overall mass of seedlings’ greenparts. It is assumed that the positive impact of thebacteria comes from its ability to synthesize vita-mins K and B. It was shown that the possible treat-ment of soils with fertilizer containing this bacterialculture can increase its fertility and enable betterplant yield.

194 • PETNI^KE SVESKE 67 DEO II