MADX-IFU-CUS-501-DE, R04 2016/09 MassARRAY Dx Colon Panel Gebrauchsanweisung, MADX-IFU-CUS-501-DE, R04 2016/09 Das MassARRAY ® Dx Colon Panel ermöglicht die Erkennung und Identifizierung der häufigsten KRAS-, BRAF-, NRAS- und PIK3CA-Genmutationen, die das Ansprechen auf Therapien gegen Kolorektalkarzinome beeinflussen, unter Verwendung des MassARRAY ® Dx Systems (Agena Bioscience, Inc., San Diego, California, USA), basierend auf der MALDI-TOF-Massenspektrometrie (matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight). Für die Verwendung zur In-vitro-Diagnostik 40110 120 Tests 2016/09 Agena Bioscience GmbH Mendelssohnstr. 15d – 22761 Hamburg, Deutschland Amtsgericht Hamburg HRB 57315 Tel. +49 (0)40 899 676 0 Fax +49 (0)40 899 676 10 [email protected] www.agenabio.com www.agenabio.com
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MassARRAY Dx Colon Panel - agenacx.com€¦ · bestimmten vollständig oder partiell mutierten Genotyp eines Wildtyps aus der analysierten Probe verknüpft ist ... cetuximab in metastatic
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3) KLINISCHE BEDEUTUNG ......................................................................................................................................... 3
8) STABILITÄT UND LAGERUNG.................................................................................................................................. 9
A. AUSWAHL DER BIOLOGISCHEN PROBEN ...................................................................................................... 12
B. DNA-EXTRAKTION ............................................................................................................................................. 12
C. AMPLIFIKATION .................................................................................................................................................. 13
D. BEHANDLUNG MIT SAP ..................................................................................................................................... 14
E. EXTENSIONSREAKTION MIT IPLEX PRO ......................................................................................................... 16
F. KONFIGURATION DER PLATTE IN DER TYPER-SOFTWARE ......................................................................... 18
G. TRANSFER DER EXTENSIONSPRODUKTE AUF EINEN SPECTROCHIP-ARRAY ......................................... 20
H. SPEKTRENAUFZEICHNUNG IM MASSARRAY DX ANALYZER ....................................................................... 27
I. ERGEBNISANALYSE .......................................................................................................................................... 31
13) GRENZEN DES VERFAHRENS .......................................................................................................................... 37
Agena Bioscience®, MassARRAY®, iPLEX® und SpectroCHIP® sind eingetragene Marken von Agena Bioscience,
Inc. (Kalifornien, USA). Agena Bioscience ist eine Marke von Agena Bioscience, Inc.
iGenetics® ist eine eingetragene Marke von BiMind S.a.s. (Jesi, Italien).
Die in diesem Dokument erwähnten Namen und Marken sind auch dann gesetzlich geschützt, wenn dies nicht
ausdrücklich angegeben ist.
12) ANALYSEVERFAHREN A. AUSWAHL DER BIOLOGISCHEN PROBEN
B. DNA-EXTRAKTION
C. AMPLIFIKATION
D. BEHANDLUNG MIT SAP
E. EXTENSIONSREAKTION MIT IPLEX PRO
F. KONFIGURATION DER PLATTE IN DER TYPER 4.0 SOFTWARE
F1. IMPORT DER ASSAY-DESIGN-DATEI MIT DEM MASSARRAY TYPER ASSAY EDITOR
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MassARRAY® Dx Colon Panel 40110 MADX-IFU-CUS-
501-DE, R04 2016/09
F2. ANLEGEN EINER VIRTUELLEN PLATTE IM MASSARRAY TYPER PLATE EDITOR
G. TRANSFER DER EXTENSIONSPRODUKTE AUF EINEN SPECTROCHIP-ARRAY
G1. VORBEREITEN DES MASSARRAY DX NANODISPENSER RS1000
G2. ENTSALZUNG DER PRODUKTE DER EXTENSIONSREAKTION MIT IONENAUSTAUSCHER-HARZ
(CLEAN RESIN)
G3. TRANSFER DER EXTENSIONSPRODUKTE AUF EINEN SPECTROCHIP-ARRAY
H. SPEKTRENAUFZEICHNUNG IM MASSARRAY DX ANALYZER 4
H1. AUSWAHL DER ANALYSEPARAMETER MITHILFE DER CHIP-LINKER-SOFTWARE
H2. SPEKTRENAUFZEICHNUNG MITHILFE DER SPECTROACQUIRE-SOFTWARE
H3. ARBEITSVORGÄNGE NACH DER SPEKTRENAUFZEICHNUNG
I. ERGEBNISANALYSE
I.1 ERGEBNISANALYSE MIT DER MASSARRAY-TYPER-SOFTWARE
I.2 ERGEBNISANALYSE MIT DER IGENETICS-SOFTWARE
I.3 ÜBERPRÜFUNG DER SPEKTRENQUALITÄT/SICHTPRÜFUNG DER SPEKTREN IM MASSARRAY
TYPERANALYZER
I.4 WIEDERHOLUNG DER PROBENANALYSE
A. AUSWAHL DER BIOLOGISCHEN PROBEN
Die auf Mutationen der Gene KRAS, NRAS, BRAF und PIK3CA hin zu analysierenden biologischen DNA-Proben
müssen aus Gewebe des Primärtumors und/oder der Metastasen eines infiltrativen Karzinoms bestehen. Gewebe
von adenomatösen Läsionen oder nichtinvasiven Karzinomen sollte nicht verwendet werden. Auch entzündete oder
nekrotische Areale, gesunde Gewebeteile (z. B. Fett-, Muskel- oder Drüsengewebe) sowie desmoplastisches
Stroma sind zu vermeiden.
Die mittels einer Biopsie, Zytologie oder aus chirurgisch reseziertem neoplastischem Gewebe gewonnenen Proben
können entweder unmittelbar oder nach dem Einfrieren bei -80 °C bzw. in flüssigem Stickstoff oder auch nach der
Fixierung mit Formalin und der Einbettung in Paraffin verarbeitet werden.
Das zu untersuchende Gewebe muss mindestens 50 % Tumorzellen enthalten. Liegt der Anteil der Tumorzellen in
der biologischen Probe unter 50 %, sollte das Gewebe durch eine manuelle Makrodissektion auf dem Objektträger
oder direkt aus dem Paraffinblock oder durch eine Laser-Mikrodissektion angereichert werden. Die Verwendung von
Proben mit einem Gehalt von weniger als 100 neoplastischen Zellen wird nicht empfohlen.
Für die Analyse der Gene KRAS, NRAS, BRAF und PIK3CA sind 3–5 Schnitte kolorektales Gewebe von 10–20 µm
Dicke auf nicht silanisierten Objektträgern oder in 2-ml-Reaktionsgefäßen ausreichend.
In Paraffin eingebettete Gewebeschnitte müssen vor der DNA-Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel
entparaffiniert, mit Alkohol gespült und getrocknet werden.
B. DNA-EXTRAKTION
Das Verfahren ist in einer speziell für die DNA-Extraktion und die Verdünnung der DNA-Lösung vorgesehenen Umgebung mittels spezieller Materialien und Geräte durchzuführen.
Das MassARRAY Dx Colon Panel beinhaltet keine Reagenzien für die Extraktion von genomischer DNA (Human).
Es wird empfohlen, handelsübliche Kits zu verwenden, die mit Kieselgelmembranen oder Magnetkügelchen
funktionieren. Manuelle Extraktionsmethoden, bei denen Phenol eingesetzt wird oder Gewebematerial in basischer
Lösung im Autoklav gekocht wird und bei denen keine Aufreinigung erfolgt, sind zu vermeiden.
Bei der DNA-Extraktion sind die Hinweise zum Kit strikt zu befolgen.
Wenn das Extraktionsprotokoll die Verwendung ethanolhaltiger Waschpuffer vorsieht, ist es ratsam, vor der
abschließenden Elution eine weitere Zentrifugierung durchzuführen, um jegliche Ethanolspuren zu entfernen. Auf
diese Weise lässt sich eine potenzielle durch Ethanol bedingte Hemmung der Reaktion vermeiden.
Nach der Extraktion/Aufreinigung der DNA unverzüglich mit der Amplifikationsreaktion fortfahren oder die extrahierte
DNA bei -20 °C in Aliquote aufgeteilt lagern, um für den Fall, dass der Test mit derselben Probe wiederholt wird,
gleichbleibende Versuchsbedingungen zu gewährleisten.
Die Konzentration und die Qualität der extrahierten DNA werden mit einem Spektrophotometer bestimmt. Dabei ist
Folgendes zu beachten:
a. Eine geringere Menge der extrahierten Probe verwenden, sodass der Rest für die erforderlichen
Amplifikationsreaktionen ausreicht.
b. Proben verdünnen, bis die Konzentration im Linearitätsbereich des verwendeten Spektrophotometers liegt. (Es
wird dringend empfohlen, Geräte zu verwenden, die mit Mikrovolumen des extrahierten Materials funktionieren.)
c. Bitte beachten: Die Quantifizierung einer DNA-Probe ist unzuverlässig, wenn die verwendete
Extraktionsmethode die Zugabe einer Träger-RNA oder ähnlicher Moleküle im Lysepuffer erfordert.
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MassARRAY® Dx Colon Panel 40110 MADX-IFU-CUS-
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Die Konzentration des amplifizierbaren Targets in DNA-Proben, die aus paraffiniertem Gewebe (FFPE) extrahiert
wurden, wird bei stark fragmentierter DNA zu hoch eingeschätzt. Das liegt daran, dass der Absorptionsmesswert
proportional zur Gesamtmenge der tatsächlichen DNA ist, unabhängig von der Länge der Moleküle.
Es wird empfohlen, für die Amplifikationsreaktion 2,5 bis 25 ng/μl DNA zu verwenden.
C. AMPLIFIKATION
Das Verfahren im PCR-Vorbereitungsbereich mithilfe der dafür vorgesehenen Materialien und Geräte durchführen.
Vor der Herstellung des PCR-Mastermix die Pipetten und die Laboroberflächen mit speziellen
Dekontaminationsmitteln behandeln und nach Möglichkeit 30 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlen.
Die DNA-Proben sind im Verwendungszeitraum bei 4 ˚C zu lagern.
Die folgenden Thermocycling-Reaktionsbedingungen wurden unter Verwendung der im MassARRAY Dx Colon Panel
enthaltenen Reagenzien für die Amplifikation (Box 3/4 – Reagenzien für die Amplifikation) optimiert. Es wird ein PCR-
Mastermix hergestellt und dann jedem der 8 PCR-Primer zugegeben, um die 8 PCR-Cocktails herzustellen. In jede
Vertiefung der Reaktionsplatte werden 3 μl PCR-Cocktail und danach 2 μl DNA eingebracht (siehe Darstellung unten).
Daraus ergibt sich ein Ansatz von 5 μl für die PCR-Amplifikationsreaktion.
1. Alle Reagenzien vor der Verwendung auftauen.
2. Reaktionsgefäße und -streifen vor der Verwendung leicht auf dem Vortexer mischen und zentrifugieren.
3. Auf der Reaktionsplatte (SQ plate – skirted) markieren, welche Vertiefungen verwendet werden sollen. Hierbei
darauf achten, dass bei jedem Lauf mindestens eine negative Kontrolle (WATER) und eine positive Kontrolle
(Control DNA) mitgeführt werden.
4. Einen Colon status AMP strip II (PCR-Primer) vertikal auf dem entsprechenden SQ AMP rack platzieren. Die auf
dem Streifen aufgeprägte Nummer muss nach oben zeigen.
Jede Probe und jede Kontrolle muss parallel mit den 8 verschiedenen PCR-Primern amplifiziert werden, die
in den 8 Reaktionsgefäßen jedes Colon status AMP strip II (rot gekennzeichnet) enthalten sind.
Das nachstehende Schema zeigt eine volle Platte mit 10 klinischen Proben (DNA1–DNA10) und den Reaktionskontrollen (Control DNA, WATER). Das Probenraster „MassARRAY Dx Colon Panel Sample Grid; Lung and Colon“ (von AgenaCx.com heruntergeladen) mit dem Namen der 10 klinischen Proben beschriften.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
PCR MIX
1
B DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
PCR MIX
2
C DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
PCR MIX
3
D DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
PCR MIX
4
E DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
PCR MIX
5
F DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
PCR MIX
6
G DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
PCR MIX
7
H DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
PCR MIX
8
5. Den PCR-Mastermix in einem 1,5-ml-Röhrchen herstellen, wie in Tabelle C1 dargestellt. Die Werte sind für eine
volle 96-Well-Platte berechnet. Die Kalkulation berücksichtigt einen Überhang von 25 %.
Tabelle C1: Herstellung des PCR-Mastermix
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501-DE, R04 2016/09
Volumen
für
1 Reaktion
[in µl]
VOLLE PLATTE
Volumen für 8 Plexe x 12 Proben
(96 Reaktionen einschließlich 25 %
Überhang)
[in µl]
Kontrollspalte:
Reagens
hinzugefügt
WATER (small) 1,3 156,0
10x PCR Buffer 0,5 60,0
MgCl2 0,4 48,0
dNTP Mix 0,1 12,0
PCR Enzyme 0,2 24,0
Gesamtvolumen 2,5 300,0
6. Den PCR-Mastermix auf dem Vortexer mischen und abzentrifugieren.
7. Zur Herstellung des PCR-Cocktails in jede der 8 Vertiefungen des Colon status AMP strip II (PCR-Primer) 35 μl des
PCR-Mastermix geben.
8. Jedes Mal durch Auf- und Abpipettieren mischen.
Auf die Orientierung des Streifens achten. (Die auf dem Streifen aufgeprägte Nummer des Reaktionsgefäßes mit dem PCR MIX 1 muss in der ersten der obigen Vertiefungen platziert werden.)
9. Mit einer Mehrkanalpipette (0,5–10 µl) in jede Vertiefung der Reaktionsplatte (SQ plate – skirted) 3 µl des
entsprechenden PCR-Cocktails geben (siehe Darstellung des Layouts oben). Es ist nicht erforderlich, die Spitzen zu
wechseln.
10. In den Spalten 1–10 jeweils 2 µl der DNA-Proben in die Vertiefung geben. Die DNA Probe und den PCR-Cocktail
durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren mischen und die Spitzen wechseln. Es kann eine für 0,2–2 µl oder für 0,5–
10 µl geeignete Pipette verwendet werden.
11. In Spalte 11 jeweils 2 µl Control DNA als Wildtyp-Kontrolle in die Vertiefungen geben. Die DNA Probe und den PCR-
Cocktail durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren mischen und die Spitzen wechseln. Es kann eine für 0,2–2 µl
oder für 0,5–10 µl geeignete Pipette verwendet werden.
12. In Spalte 12 jeweils 2 µl WATER als negative Kontrolle in die Vertiefungen geben. Den Inhalt jeder Vertiefung durch
mehrfaches Auf- und Abpipettieren mischen und die Spitzen wechseln. Es kann eine für 0,2–2 µl oder für 0,5–10 µl
geeignete Pipette verwendet werden.
Das Endvolumen in jeder Vertiefung beträgt 5 µl.
13. Zum Schluss die Platte sorgfältig mit SQ sealing foil verschließen.
14. Die Platte kurz zentrifugieren.
15. Die Platte in den Thermocycler stellen.
16. Den Anweisungen in der Gebrauchsanleitung des Thermocyclers folgend das folgende PCR-Zyklusprofil einstellen.
Alternativ dazu die im Gerät gespeicherte Datei – sofern bereits vorhanden – abrufen. Nochmals überprüfen, ob die
Parameter korrekt eingestellt sind:
PCR-Profil für MassARRAY Dx*
Schritt 1 2 Minuten lang 95 °C
45 Zyklen
30 Sekunden lang 95 °C
30 Sekunden lang 56 °C
60 Sekunden lang 72 °C
Schritt 2 5 Minuten lang 72 °C
Schritt 3 5 Minuten lang 4 °C
Schritt 4 10 °C unbegrenzt lange (∞)
*Die Deckelheizung des Geräts auf 105 °C einstellen.
Nachdem die Amplifikationsreaktion abgeschlossen ist, mit dem nächsten Schritt (SAP-Behandlung) fortfahren oder die PCR-Platte bei -35/-20 °C bis zu zwei Wochen lang lagern.
D. BEHANDLUNG MIT SAP
Das Verfahren im Post-PCR-Bereich mithilfe der dafür vorgesehenen Materialien und Geräte durchführen. Zuvor die Pipetten und die Laboroberflächen mit speziellen Dekontaminationsmitteln behandeln und nach
Möglichkeit 30 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlen.
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MassARRAY® Dx Colon Panel 40110 MADX-IFU-CUS-
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Die folgenden Thermocycling-Reaktionsbedingungen wurden unter Verwendung der im MassARRAY Dx Colon Panel
enthaltenen Reagenzien (Box 4/4 – Reagenzien für die Extension) optimiert. Den SAP-Cocktail herstellen und in jede
Vertiefung der Reaktionsplatte 2 μl davon geben.
1. Alle Reagenzien vor der Verwendung auftauen.
2. Alle Reagenzgefäße vor der Verwendung leicht auf dem Vortexer mischen und zentrifugieren.
3. Falls die Platte mit den Amplifikationsprodukten bei -35/-20 °C gelagert wurde, die Platte auftauen und kurz
zentrifugieren.
4. Den SAP-Cocktail gemäß der nachstehenden Tabelle D3 herstellen. Die Werte sind für eine volle 96-Well-Platte
berechnet. Die Kalkulation berücksichtigt einen Überhang von 25 %.
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MassARRAY® Dx Colon Panel 40110 MADX-IFU-CUS-
501-DE, R04 2016/09
Tabelle D3: Herstellung des SAP-Cocktails
Volumen für
1 Reaktion
[in µl]
VOLLE PLATTE
Volumen für 8 Plexe x
12 Proben (96 Reaktionen
einschließlich
25 % Überhang) [in µl]
Kontrollspalte:
Reagens
hinzugefügt
WATER 1,53 183,6
SAP Buffer 0,17 20,4
SAP Enzyme 0,30 36,0
Gesamtvolumen 2,00 240,0
5. Den SAP-Cocktail durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren oder auf dem Vortexer mischen, anschließend kurz
zentrifugieren.
6. SQ sealing foil sehr vorsichtig von der Reaktionsplatte abziehen.
7. Um eine Kreuzkontamination durch Amplicons zu vermeiden, die SQ sealing foil sofort entsorgen, ohne sie auf eine
Arbeitsfläche zu legen/kleben.
8. Mit einem Mehrfachdispenser in jede Vertiefung derselben Platte 2 μl des SAP-Cocktails geben. Dieselbe 0,1-ml-
Spitze verwenden. Darauf achten, weder die Flüssigkeit in den Vertiefungen noch die Innenfläche der Vertiefungen
9. Zum Schluss die Platte sorgfältig mit SQ sealing foil verschließen.
10. Die Platte kurz zentrifugieren.
11. Die Platte in den Thermocycler stellen und die Proben gemäß dem nachstehenden Programm inkubieren. Nochmals
überprüfen, ob die Parameter korrekt eingestellt sind:
SAP-Profil für MassARRAY Dx*
Schritt 1 40 Minuten lang 37 °C
Schritt 2 5 Minuten lang 85 °C
Schritt 3 5 Minuten lang 4 °C
Schritt 4 10 °C unbegrenzt lange (∞)
*Die Deckelheizung des Geräts auf 105 °C einstellen.
Nachdem die SAP-Reaktion abgeschlossen ist, mit dem nächsten Schritt (Extensionsreaktion mit iPLEX Pro) fortfahren oder die PCR-Platte bei -35/-20 °C bis zu zwei Wochen lang lagern.
E. EXTENSIONSREAKTION MIT IPLEX PRO
Das Verfahren im Post-PCR-Bereich mithilfe der dafür vorgesehenen Materialien und Geräte durchführen. Zuvor die Pipetten und die Laboroberflächen mit speziellen Dekontaminationsmitteln behandeln und nach
Möglichkeit 30 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlen.
Die folgenden Thermocycling-Reaktionsbedingungen wurden unter Verwendung der im MassARRAY Dx Colon Panel
enthaltenen Reagenzien (Box 4/4 – Reagenzien für die Extension) optimiert. Es wird ein Extensions-Mastermix
hergestellt und dann jedem der 8 Extensions-Primer zugegeben, um die 8 Cocktails für die Extensionsreaktion
herzustellen. In jede Vertiefung der Reaktionsplatte werden 2 μl des Cocktails für die Extensionsreaktion eingebracht
(siehe Darstellung unten).
1. Alle Reagenzien vor der Verwendung auftauen.
2. Alle Reaktionsgefäße vor der Verwendung leicht auf dem Vortexer mischen und zentrifugieren.
3. Falls die Platte mit den mit SAP behandelten Amplifikationsprodukten bei -35/-20 °C gelagert wurde, die Platte
auftauen und kurz zentrifugieren.
4. Einen Colon status EXT strip II vertikal auf dem entsprechenden SQ EXT rack platzieren. Die auf dem Streifen
aufgeprägte Nummer muss nach oben zeigen.
Jede Probe und jede Kontrolle muss parallel mit den 8 verschiedenen Extensions-Primern verlängert werden, die in den 8 Reaktionsgefäßen jedes Colon status EXT strip II (grün gekennzeichnet) enthalten
sind. Das nachstehende Schema zeigt eine volle Platte mit 10 klinischen Proben (DNA1–DNA10) und den
Reaktionskontrollen.
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
EXT
MIX 1
B DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
EXT
MIX 2
C DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
EXT
MIX 3
D DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
EXT
MIX 4
E DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
EXT
MIX 5
F DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
EXT
MIX 6
G DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
EXT
MIX 7
H DNA
1
DNA
2
DNA
3
DNA
4
DNA
5
DNA
6
DNA
7
DNA
8
DNA
9
DNA
10
Control
DNA Water
EXT
MIX 8
5. Den Extensions-Mastermix gemäß der nachstehenden Tabelle E1 herstellen. Die Werte sind für eine volle 96-Well-
Platte berechnet. Die Kalkulation berücksichtigt einen Überhang von 25 %.
Tabelle E1: Herstellung des Extensions-Mastermix
Volumen
für
1 Reaktion
[in µl]
VOLLE PLATTE
Volumen für 8 Plexe x 12 Proben
(96 Reaktionen einschließlich
25 % Überhang)
[in µl]
Kontrollspalte:
Reagens
hinzugefügt
WATER 0,56 67,2
Buffer Plus (10x) 0,20 24,0
Termination Mix 0,20 24,0
Thermosequenase 0,04 4,8
Gesamtvolumen 1,00 120,0
6. Den Extensions-Mastermix auf dem Vortexer mischen und abzentrifugieren.
7. Zur Herstellung der Cocktails für die Extensionsreaktion in jede der 8 Vertiefungen des Colon status EXT strip II
(Extensions-Primer) 14 μl des Extensions-Mastermix geben.
8. Den Inhalt jeder Vertiefung durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren mischen.
Auf die Orientierung des Streifens achten.
9. SQ sealing foil sehr vorsichtig von der Reaktionsplatte abziehen.
10. Um eine Kreuzkontamination durch Amplicons zu vermeiden, die SQ sealing foil sofort entsorgen, ohne sie auf eine
Arbeitsfläche zu legen/kleben.
11. Mit einer Mehrkanalpipette (0,5–10 µl) in jede Vertiefung der Reaktionsplatte 2 µl des entsprechenden Cocktails für
die Extensionsreaktion geben (siehe Darstellung des Layouts oben). Nach jedem Transfer die Spitzen wechseln.
12. Zum Schluss die Platte sorgfältig mit SQ sealing foil verschließen.
13. Die Platte kurz zentrifugieren.
14. Die Platte in den Thermocycler stellen und die Proben gemäß dem nachstehenden Programm inkubieren. Nochmals
überprüfen, ob die Parameter korrekt eingestellt sind:
Profil der Extensionsreaktion mit MassARRAY iPLEX*
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MassARRAY® Dx Colon Panel 40110 MADX-IFU-CUS-
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Schritt 1 30 Sekunden lang 94 °C
40
Zyklen
5 Sekunden lang 94 °C
5
Zyklen
5 Sekunden lang 52 °C
5 Sekunden lang 80 °C
Schritt 2 3 Minuten lang 72 °C
Schritt 3 5 Minuten lang 4 °C
Schritt 4 10 °C unbegrenzt lange (∞)
*Die Deckelheizung des Geräts auf 105 °C einstellen.
Nachdem die Extensionsreaktion abgeschlossen ist, mit dem nächsten Schritt (Ionenaustauscher-Harz-Behandlung) fortfahren oder die Platte bei -35/-20 °C bis zu zwei Wochen lang lagern.
F. KONFIGURATION DER PLATTE IN DER TYPER-SOFTWARE
F1. Import der Assay-Design-Datei mit dem MassARRAY Typer Assay Editor
Die folgenden Schritte müssen nur bei der erstmaligen Verwendung des MassARRAY Dx Colon Panel ausgeführt werden.
1. Die Assay-Design-Datei (MassARRAY Dx Colon Panel.txt) von AgenaCx.com herunterladen (Product Support >
Application Updates > MassARRAY Dx System).
2. Die MassARRAY Typer V 4.0 Software aufrufen, die unter folgendem Pfad zu finden ist:
Desktop/MassARRAY/Typer4.0.
3. Auf das Symbol Assay Editor klicken.
4. Daraufhin wird ein Anmeldefenster geöffnet. Als Benutzerkennung (User ID) „charles“ und als Passwort „darwin“
eingeben. Der Name der Datenbank ist „AgenaDB“. Auf die Schaltfläche Connect klicken.
5. Mit der rechten Maustaste auf das Wurzelknoten-Symbol Assay Project/Assay Group/Plex Assay klicken und
Project Administrator wählen.
6. Daraufhin wird das Fenster Assay Project Administrator geöffnet. Um ein neues Projekt anzulegen, im oberen Feld
(Add new Assay Project) den Panel-Namen 40110_MassARRAY_Colon eingeben, dann auf Add und anschließend
auf Close klicken.
7. Im Fensterbereich Database Browser (linke Seite des Fensters) erscheint daraufhin ein neues Assay-Project-
Symbol .
8. Auf das Assay-Project-Symbol klicken und Import Assay Group in Designer Format wählen.
9. Das Fenster Import Assay/SNP Group in Design Format wird geöffnet. Die Kästchen für Design Summary und SNP
Group deaktivieren. Sicherstellen, dass neben Assay Group ein Häkchen gesetzt ist. Auf die Schaltfläche Browse
für die Assay-Gruppe (Assay Group) klicken.
10. Zu der in Schritt 1 heruntergeladenen Datei MassARRAY Dx Colon Panel.txt navigieren und auf Open klicken.
11. Import wählen.
12. Daraufhin erscheint folgende Meldung: Import completed. OK wählen.
13. Auf das Plus-Symbol neben dem Assay-Project-Symbol klicken, um die Unterordner anzuzeigen.
14. Durch Klicken auf das Assay-Group-Symbol werden alle in der betreffenden Assay-Gruppe (Assay Group)
gespeicherten Plexe angezeigt. Durch Klicken auf das Plex-Symbol werden alle im betreffenden Plex
gespeicherten Assays angezeigt.
F2. Anlegen einer virtuellen Platte im MassARRAY Typer Plate Editor
Schritt 5 ist nur beim ersten Lauf erforderlich und wenn ein weiterer Kunde oder ein weiteres Projekt angelegt
werden muss. Wenn die Kunden und Projekte bereits vorhanden sind, mit Schritt 6 beginnen.
Schritt 9 ist nicht erforderlich, wenn die entsprechenden Kunden (Sample Customers) und Projekte (Sample
Projects) bereits vorhanden sind.
Die Schritte 10–11 sind nicht erforderlich, wenn die Textdatei für die DNA-Proben-Gruppe bereits angelegt und
in die Datenbank importiert wurde.
1. Die MassARRAY Typer V 4.0 Software aufrufen, die unter folgendem Pfad zu finden ist:
Desktop/MassARRAY/Typer4.0.
2. Auf das Symbol Plate Editor klicken.
3. Daraufhin wird ein Anmeldefenster geöffnet. Als Benutzerkennung (User ID) „charles“ und als Passwort „darwin“
eingeben. Der Name der Datenbank ist „AgenaDB“. Auf die Schaltfläche Connect klicken.
4. In der linken unteren Ecke die Registerkarte Plate wählen.
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5. In der Datenbank einen Kunden und ein Projekt wählen, sofern nicht bereits geschehen:
5.1. Auf der Registerkarte Plate mit der rechten Maustaste auf das Wurzelknoten-Symbol klicken und New
Customer wählen.
5.2. Das Dialogfeld Create New Customer wird angezeigt. Eine Kunden-ID (Customer ID) eingeben und OK
wählen.
5.3. Auf der Registerkarte Plate erscheint die Kunden-ID aus dem vorangegangenen Schritt neben dem Customer-
Symbol .
5.4. Mit der rechten Maustaste auf das Customer-Symbol klicken und New Project wählen.
5.5. Das Dialogfeld Create New Project wird angezeigt. Die Projekt-ID (Project ID) 40110_MassARRAY_Colon
eingeben und auf OK klicken.
5.6. Auf der Registerkarte Plate erscheint unter dem Customer-Symbol das Project-Symbol mit der Projekt-ID
40110_MassARRAY_Colon.
6. Eine Platte anlegen:
6.1. Mit der rechten Maustaste auf das Project-Symbol klicken und New Plate wählen.
6.2. Im Dialogfeld Create New Plate die Platten-ID (Plate ID) eingeben.
6.3. Als Plattentyp 96 Well Plate wählen.
6.4. OK wählen.
6.5. Im Fensterbereich Plate Layout erscheint eine leere Platte (Plate-Symbol ).
7. Der Platte Assays zuordnen:
7.1. In der linken unteren Ecke die Registerkarte Assay wählen.
7.2. Zur Gruppe MassARRAY Dx Colon Panel navigieren. Auf das Symbol + neben dem Knoten klicken, um
diesen aufzuklappen, bis das Multiplex-Symbol erscheint. Multiplex 1–8 enthält die Assay-Informationen zu
jedem der 8 Plexe.
7.3. Die Platte gemäß dem Plattenlayout-Schema (Abbildung F1) anlegen: Auf der Registerkarte Plate Layout eine
oder mehrere Vertiefungen auswählen. Auf der Registerkarte Assay mit der rechten Maustaste auf den
Plex klicken, der den ausgewählten Vertiefungen zugeordnet werden soll, und Add plex wählen. Der
Hintergrund für die Vertiefungen ist jetzt eingefärbt, wobei die Farbe vom Multiplex Level abhängt.
8. In der linken unteren Ecke die Registerkarte Sample wählen.
9. In der Datenbank einen Kunden und ein Projekt wählen, sofern nicht bereits geschehen: 9.1. Auf der Registerkarte Sample mit der rechten Maustaste auf das Wurzelknoten-Symbol klicken und Add
New Sample Customer wählen.
9.2. Das Dialogfeld Add New Sample Customer wird angezeigt. Eine Kunden-ID (Sample Customer ID) eingeben
und OK wählen.
9.3. Mit der rechten Maustaste auf das Symbol Sample Customer ID klicken. Add New Sample Project
wählen.
9.4. Das Dialogfeld Add New Sample Project wird angezeigt. Eine Probenprojekt-ID (Sample Customer ID)
eingeben und OK wählen.
10. Eine Probenliste (als Textdatei) anlegen, sofern noch nicht geschehen: Excel oder Notepad öffnen und die Probennamen untereinander auflisten. Eine Überschrift ist nicht erforderlich. Die Datei als Textdatei (.txt) speichern.
11. Eine Probengruppe anlegen, sofern noch nicht geschehen: 11.1. Mit der rechten Maustaste auf die eben angelegte Probenprojekt-ID klicken. Add New Sample Group
wählen.
11.2. Daraufhin wird ein Dialogfeld angezeigt. Unter Group ID den Namen der Probenliste eingeben, die importiert
werden soll. Das Öffnen-Symbol wählen und zu der zuvor angelegten Probenliste (Textdatei) navigieren.
Wenn der Import erfolgreich war, zeigt das Feld unten die Proben in der Spalte Sample ID. OK wählen.
12. Der Platte Proben zuordnen:
12.1. Auf das Symbol + neben dem Knoten klicken, um diesen aufzuklappen, bis das Sample-Symbol erscheint.
12.2. Auf der Registerkarte Plate Layout eine oder mehrere Vertiefungen auswählen.
12.3. Auf der Registerkarte Sample mit der rechten Maustaste auf die Probe klicken, die den ausgewählten
Vertiefungen zugeordnet werden soll, und Add Sample wählen. Das X in den betreffenden Vertiefungen
verschwindet.
13. Nachdem die Platte angelegt wurde, auf das Symbol Save klicken. Wenn ein Lauf mehrere Platten umfassen soll,
eine weitere Platte wie oben beschrieben anlegen. Nachdem die Konfiguration der Platte(n) im Plate Editor
Abbildung F1: Plattenschema für eine volle 96-Well-Platte
G. TRANSFER DER EXTENSIONSPRODUKTE AUF EINEN SPECTROCHIP-ARRAY
Das Verfahren im Post-PCR-Bereich mithilfe der dafür vorgesehenen Materialien und Geräte durchführen.
Ausführlichere Informationen und wichtige Informationen zur Wartung sind dem MassARRAY Dx Nanodispenser
RS1000 User Guide zu entnehmen.
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G1. VORBEREITEN DES MASSARRAY DX NANODISPENSER RS1000
1. Aus reinem Ethanol (HPLC-Qualität) und Reinstwasser 100 ml Ethanol 50 % (v/v) herstellen.
2. 3-Pt Calibrant auftauen, auf dem Vortexer mischen und kurz zentrifugieren.
3. Den Abfalltank entleeren: Die Schnellkupplung des Abwasserschlauches in den Abwasseranschluss einstecken. Die
Kupplung so weit hineinschieben, bis sie mit einem Klicken einrastet. Die Entleerung beginnt, sobald die Kupplung
eingesteckt wurde. Sicherstellen, dass ein Auffangbehälter bereitsteht. Zum Entleeren des Abfalltanks werden keine
Softwarebefehle über den Berührungsbildschirm des Geräts eingegeben.
4. Den MassARRAY Dx Nanodispenser RS1000 einschalten.
5. Auf dem Computer mit dem Benutzernamen „Administrator“ und dem Passwort „admin“ anmelden. Die
Anwendungssoftware MassARRAY Dx Nanodispenser wird automatisch gestartet und zeigt einen
Anmeldebildschirm.
6. Auf das Feld type your user name des Anmeldebildschirms tippen und den Benutzernamen „actis“ eingeben, um
sich bei der Anwendungssoftware MassARRAY Dx Nanodispenser anzumelden. Auf das Feld type your password
tippen und das eigene Passwort eingeben. Siehe Abbildung G4. Das Fenster Main Menu wird angezeigt. Siehe
Abbildung G5.
Falls eine Warnmeldung angezeigt wird, bitte überprüfen, ob der Benutzername und das Passwort gültig sind.
7. Die Schaltfläche STATUS (am oberen Rand der meisten Bildschirme) überprüfen.
Wenn sie blinkt, bedeutet das, dass der Füllstand des Vorratstanks niedrig und/oder der Abfalltank voll ist. Auf die Schaltfläche STATUS tippen. Auf dem daraufhin angezeigten Bildschirm Machine Status (Abbildung G6) auf die Registerkarte Page 2 (am unteren Bildschirmrand) tippen. Sich vergewissern, dass die Anzeigen neben den
Füllstandsmeldungen für die verschiedenen Tanks nicht hellgrün leuchten.
Abbildung G2: (1) Vorratsflasche für Ultraschallwaschstation, (2) Ultraschallwaschstation, (3) Spülstation, (4) Trockenstation, (5) Kalibrantenreservoir, (6) SCOUT-Platte mit zwei SpectroCHIP-Arrays
Abbildung G3: (1) Dimple Plate speziell für Platten mit Rahmen und Rand, (2) Dose mit Ionenaustauscher-Harz Clean Resin, (3) Löffel und Schaber für das Ionenaustauscher-Harz
Abbildung G4: Anmeldebildschirm (Login)
Abbildung G5: Hauptmenü (Main Menu)
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8. Zu Beginn jedes Tages, an dem das Gerät betrieben wird, den Vorratstank auffüllen. In der Regel reicht eine
komplette Füllung des Vorratstanks für die Verarbeitung von acht bis zehn 96er-SpectroCHIP-Arrays aus. So viel
Wasser in den Tank füllen, wie für die am jeweiligen Tag geplante Anzahl von SpectroCHIP-Arrays benötigt wird.
8.1. Das Filterende des Einfüllschlauches (5/16" AD) mit der Metallarmatur in einen sauberen Behälter mit de
ionisiertem Wasser (18,2 MΩ/cm) einführen. – Für eine komplette Füllung reichen ca. 11 Liter (drei Gallonen).
Das offene Ende des Schlauchs fest in den Anschluss einschieben, bis es richtig sitzt (ca. 2 cm weit hinein).
8.2. Den Bildschirm Maintenance aufrufen. (Siehe Abbildung G7; auf einem beliebigen Bildschirm auf Back und
dann im Main Menu auf MAINTENANCE tippen.)
8.3. Im Bildschirm Maintenance auf SUPPLY TANK Kill tippen. Es wird eine Meldung angezeigt. Noch nicht auf
OK tippen. Das geschieht erst einige Schritte später.
8.4. Die Fronttür öffnen und die Frontklappe anheben, um die Steuerventile des Tanks zugänglich zu machen.
Immer wenn die Fronttür oder die Frontklappe geöffnet oder die rote Stopp-Taste gedrückt wird, löst ein Sicherheitsschalter aus und verhindert so den Betrieb des Geräts. Es erscheint die Meldung „Safety interlock is disengaged“ (siehe Abbildung G8). Um das Gerät weiter zu betreiben, die Fronttür und/oder die Frontklappe schließen oder die Stopp-Taste erneut drücken, sodass sie in ihre ursprüngliche Stellung zurückkehrt. In der Meldung über die Auslösung des Sicherheitsschalters auf HOME tippen. Der Dispensierkopf bewegt sich
daraufhin in die Startposition und das Gerät ist betriebsbereit.
8.5. Zum Befüllen des Vorratstanks die Tankventile auf „A2“ stellen, wie in der Meldung dargestellt (siehe
Abbildung G9).
WARNUNG! Die Ventilhebel der Tankventile nicht nach oben gestellt lassen, da in dieser Stellung der
Flüssigkeitsfluss gesperrt ist. Die Pumpen des Geräts werden beschädigt, wenn das Gerät bei dieser Hebelstellung
betrieben wird. Die Hebel müssen je nach gerade durchgeführtem Vorgang immer nach A oder B bzw. 1 oder 2 zeigen.
Abbildung G6: Seite 2 des Gerätestatus (Machine Status, Page 2)
Abbildung G7: Wartungsmenü (Maintenance Menu)
Abbildung G8: Warnung bezüglich der Auslösung des Sicherheitsschalters
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8.6. Die Frontklappe und die Fronttür schließen.
8.7. Auf OK tippen. Daraufhin beginnt eine Pumpe, das entionisierte Reinstwasser (18,2 MΩ/cm) in den
Vorratstank zu fördern. Warten, bis der Vorratstank voll ist. Ein interner Sensor überwacht den Tankfüllstand
und hält die Pumpe an, sobald der Tank voll ist. Es dauert ca. 15 Minuten, einen völlig leeren Tank zu füllen.
8.8. Falls die in den Tank gepumpte Flüssigkeitsmenge bereits ausreicht, auf Cancel tippen.
8.9. Nachdem der Tank komplett befüllt wurde, erscheint eine Aufforderung. Die Ventile in die Stellung „B1“ für den
normalen Betrieb bringen. Siehe Abbildung G10.
8.10. Die Frontklappe und Fronttür schließen und auf OK tippen. Die Zulaufleitungen werden vorgespült, um sie zu
entlüften.
8.11. Den Schlauch vom Einfüllanschluss lösen. Hierzu den inneren Ring gegen das Anschlussgehäuse drücken
und den Schlauch herausziehen. Es kann erforderlich sein, den Schlauch beim Herausziehen hin und her zu
drehen.
9. Die
Nadeln reinigen:
9.1. Im Bildschirm Maintenance auf SONICATOR SOLUTION Drain tippen. Der Rest der Ultraschalllösung fließt
aus der Ultraschallwaschstation ab.
9.2. Auf SONICATOR SOLUTION Fill tippen. Der Dispensierkopf bewegt sich nach rechts und gibt den Zugang zur
Ultraschallwaschstation frei.
9.3. Die Fronttür öffnen.
9.4. Die Ultraschallwaschstation manuell mit Ethanol 100 % befüllen.
9.5. Die Fronttür schließen und das Gerät in die Ausgangsstellung bringen.
9.6. Im Bildschirm Maintenance auf CLEAN DAILY tippen.
9.7. Daraufhin werden die Nadeln 30 Minuten lang in Ethanol getaucht. Siehe Abbildung G11.
10. Die Vorratsflasche für die Ultraschallwaschstation befüllen:
10.1. Mindestens 100 ml einer Lösung aus deionisiertem Reinstwasser und Ethanol 100 % im Volumenverhältnis
50 : 50 herstellen.
10.2. Im Bildschirm Maintenance auf SONICATOR SOLUTION Drain tippen.
10.3. Im Bildschirm Maintenance auf SONICATOR SOLUTION Fill tippen.
10.4. Die Vorratsflasche für die Ultraschallwaschstation aus dem Waschstationsbereich der Reinigungsstation
nehmen. Sobald die Vorratsflasche aus dem Waschstationsbereich gehoben wird, verschließt der
Kugelstopfen die Öffnung.
10.5. Die Vorratsflasche so drehen, dass die Reservoiröffnung nach oben zeigt, und sie mit der 50 : 50-Lösung aus
Wasser und Ethanol befüllen.
10.6. Die Vorratsflasche über ein Spülbecken halten und die Öffnung mit dem Daumen verschließen. Dann die
Vorratsflasche so drehen, dass die Reservoiröffnung nach unten zeigt. Der Kugelstopfen sinkt nun ab.
Abbildung G11: Tägliche Reinigung der Nadeln
Abbildung G12: Vorbereitung der Nadeln
Abbildung G13: Nadeln in Ethanol tauchen (SOAK)
Abbildung G9: Ventilstellung beim Befüllen des Vorratstanks – A2
Abbildung G10: Entleeren des Vorratstanks, Stellung während des normalen Betriebs – B1
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10.7. Den Daumen von der Öffnung nehmen, wenn sich der Kugelstopfen an der Flaschenöffnung befindet. Der
Kugelstopfen verschließt nun die Öffnung. Während der Kugelstopfen die Flasche verschließt, kann eine kleine
Menge der Lösung aus der Flasche austreten.
10.8. Die Vorratsflasche (mit der Öffnung nach unten) wieder auf den Waschstationsbereich der Reinigungsstation
stellen und fest einsetzen, sodass der O-Ring den Übergang zwischen Flasche und Waschstation abdichtet.
10.9. Nun füllt sich die Ultraschallwaschstation mit Flüssigkeit aus der Vorratsflasche. Der größte Teil des
Flascheninhalts fließt in die Ultraschallwaschstation.
10.10. Die Fronttür schließen.
11. Die Nadeln eintauchen:
11.1. Im Bildschirm Maintenance auf COMPLETE CYCLE tippen.
11.2. Im daraufhin angezeigten Fenster wash cycles 10 volle Zyklen (cycles) auswählen und auf OK klicken. Siehe
Abbildung G12.
11.3. Im Bildschirm Maintenance auf CLEAN DAILY tippen.
11.4. Im Fenster daily pin cleaning auf SOAK tippen. Der Zähler hält an und die Nadeln bleiben in der Flüssigkeit.
Siehe Abbildung G13.
Falls der Nanodispenser an diesem Tag bereits benutzt wurde und am selben Tag noch weitere Transfers von Proben auf einen SpectroCHIP-Array erfolgen sollen, kann Schritt 9 (Nadeln reinigen) entfallen. Allerdings muss mithilfe der Funktion SOAK sichergestellt werden, dass die Nadeln die ganze Zeit über in Flüssigkeit
getaucht bleiben.
G2. ENTSALZUNG DER PRODUKTE DER EXTENSIONSREAKTION MIT IONENAUSTAUSCHER-HARZ (CLEAN RESIN)
Bei der Handhabung jeglicher Ausrüstungsgegenstände, Komponenten und Reagenzien wie etwa Clean Resin
müssen Handschuhe und eine Schutzbrille getragen werden. Solange Clean Resin nicht gebraucht wird, den Behälter fest verschlossen halten. Andernfalls trocknet das
Ionenaustauscher-Harz aus. Diese Arbeitsschritte auf einer sauberen Kunststoffunterlage durchführen. Das von der Dimple-Plate
abgeschabte überschüssige Ionenaustauscher-Harz fällt auf die Kunststoffunterlage und kann zur späteren Verwendung direkt wieder in den zugehörigen Behälter gegeben werden.
Vor der Verwendung des Ionenaustauscher-Harzes überprüfen, ob sich dessen Farbe und Beschaffenheit gegenüber dem ursprünglichen Zustand nicht verändert haben.
1. Die Reaktionsplatte erforderlichenfalls auf Raumtemperatur auftauen lassen.
2. Die Reaktionsplatte kurz zentrifugieren.
3. 3 Löffel Clean Resin auf eine saubere, trockene Dimple-Plate transferieren (15 mg Ionenaustauscher-
Harz/Vertiefung). Sicherstellen, dass die Dimple-Plate für Platten mit Rahmen geeignet ist.
4. Das Clean Resin mit dem Schaber auf der Dimple-Plate verteilen, sodass es sich gleichmäßig in allen
Vertiefungen absetzt.
5. Überschüssiges Ionenaustauscher-Harz mit dem Schaber von der Dimple-Plate schaben.
6. Die Platte mit dem Ionenaustauscher-Harz 5–10 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen, bis die Farbe
des Ionenaustauscher-Harzes etwas heller wird und es eher gelb als braun aussieht. Das kann je nach
Luftfeuchtigkeit unterschiedlich lange dauern.
7. SQ sealing foil sehr vorsichtig von der Reaktionsplatte abziehen. Um eine Kreuzkontamination durch Amplicons
zu vermeiden, die SQ sealing foil sofort entsorgen, ohne sie auf eine Arbeitsfläche zu legen/kleben.
8. Während die Platte mit dem Ionenaustauscher-Harz trocknet, in jede Vertiefung der Reaktionsplatte 41 µl
WATER MS plus zugeben. Das Endvolumen pro Vertiefung beträgt 50 µl (5 µl PCR + 2 µl SAP + 2 µl iPLEX-
Extensionsreaktion + 41 µl Water MS plus).
9. Um in jeder Vertiefung das getrocknete Ionenaustauscher-Harz hinzuzufügen, die Probenplatte vorsichtig über
Kopf drehen, auf die Dimple-Plate herabsenken und darauf absetzen. Dabei müssen die Vertiefungen der
Probenplatte auf die harzgefüllten Vertiefungen ausgerichtet sein.
10. Die Probenplatte und die Dimple-Plate weiter zusammenpressen und umdrehen, sodass jetzt die Dimple-Plate
auf der Probenplatte liegt.
11. Leicht auf die Dimple-Plate klopfen, damit das Ionenaustauscher-Harz in die Vertiefungen mit den Proben fällt.
12. Die Dimple-Plate abnehmen.
13. Die Reaktionsplatte mit SQ sealing foil verschließen und kurz zentrifugieren, um jegliche Luftblasen zu
entfernen.
14. Die Reaktionsplatte mindestens 15 Minuten lang 360° um ihre Längsachse drehen. Sicherstellen, dass sich das
Ionenaustauscher-Harz gut mit der Reaktionslösung vermischt.
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15. Die Platte mindestens 15 Minuten lang bei 560 x g zentrifugieren.
Wenn nicht gleich mit dem Transferschritt fortgefahren wird, die Reaktionsplatte bis zu zwei Wochen lang bei -35/-20 °C lagern.
G3. TRANSFER DER EXTENSIONSPRODUKTE AUF EINEN SPECTROCHIP-ARRAY
1. Die SQ sealing foil sehr vorsichtig von der Reaktionsplatte abziehen, um jegliche Kreuzkontamination zwischen den
Vertiefungen zu vermeiden; die Folie auf sich selbst falten und sofort entsorgen, ohne sie auf irgendeine
Arbeitsfläche zu legen/kleben.
2. Die Fronttür öffnen.
3. Die Reaktionsplatte auf der Position MTP 1 des Nanodispensers platzieren. Die Position A1 zeigt nach unten links.
Die Position MTP 1 ist die Position links auf dem Gerät.
4. Den SpectroCHIP-Array aus der Originalverpackung nehmen und den Barcode in der linken unteren Ecke beachten.
5. Den SpectroCHIP-Array auf Position 1 der SCOUT-Platte (oben links auf der SCOUT-Platte) platzieren. Den
SpectroCHIP-Array so positionieren, dass sich der Barcode in der linken unteren Ecke befindet.
Bei der Handhabung von SpectroCHIP-Arrays müssen immer neue Handschuhe getragen und die bereitgestellte Pinzette verwendet werden. Die Oberfläche des SpectroCHIP-Arrays auf keinen Fall berühren.
6. Die SCOUT-Platte so auf der Arbeitsfläche ausrichten, dass die abgeschrägten Ecken nach rechts zeigen.
7. 60 µl 3-Pt Calibrant in das Kalibrantenreservoir pipettieren.
8. Die Fronttür des Nanodispensers schließen.
9. Die Funktion SOAK (Eintauchen der Nadeln) abbrechen.
10. Auf HOME tippen.
11. Auf Back tippen, um ins Hauptmenü (Main Menu) zurückzukehren.
12. TRANSFER wählen.
13. Um den Inhalt einer (1) Reaktionsplatte auf einen (1) SpectroCHIP-Array zu transferieren, MTP 1 auswählen und auf
Continue tippen. Siehe Abbildung G14.
14. Um den Inhalt von zwei Reaktionsplatten auf zwei SpectroCHIP-Arrays zu transferieren, MTP 1 and 2 auswählen
und auf Continue tippen.
15. Die MTP-Position mit Continue bestätigen oder mit Back zum vorangegangenen Bildschirm zurückkehren, um dort
die andere Option auszuwählen. Siehe Abbildung G15.
16. Die SpectroCHIP-Position mit Continue bestätigen oder mit Back zum vorangegangenen Bildschirm zurückkehren,
um dort die andere Option auszuwählen. Siehe Abbildung G16.
17. Auf run tippen, um den Transfer zu starten.
Überprüfen, ob der oben links in der Ecke angezeigte Methodendateiname der gewünschten Transfermethode (MTP 1 und 2 bzw. MTP 1) entspricht.
18. Der Bildschirm zur Vorbereitung der Spülstation (rinse station preparation) erscheint. Auf OK tippen und
überwachen, wie die Spülstation kurz anläuft. Wenn aus den Aufstiegsröhren der Spülstation Wasser fließt, arbeitet
die Spülstation ordnungsgemäß.
Abbildung G14: Je nachdem, ob ein oder zwei Platten transferiert werden sollen, eine Vorgehensweise wählen
Abbildung G15: MTP-Position bestätigen
Abbildung G16: SpectroCHIP-Position bestätigen
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19. Danach erscheint eine Aufforderung (siehe Abbildung G19):
• Auf YES tippen, wenn die Spülstation ordnungsgemäß gearbeitet hat.
• Auf RETRY tippen, um den Test der Spülstation zu wiederholen.
• Auf NO tippen, wenn die Spülstation nicht ordnungsgemäß gearbeitet hat.
Der Transfer beginnt, nachdem bestätigt wurde, dass die Spülstation ordnungsgemäß arbeitet. Bei Verwendung des
Standard-Array-Formats mit 6 Nadeln dauert es ca. 20 Minuten, den Transfer von einer 96-Well-Mikrotiterplatte zu einem
96er-SpectroCHIP-Array durchzuführen.
Der Transfer kann jederzeit mithilfe der Schaltfläche STOP angehalten werden. Bevor der automatischen Betrieb
stoppt, wird der letzte Vorgang abgeschlossen. Bitte alle teilweise gespotteten SpectroCHIP-Arrays verwerfen und
überprüfen, ob das auf der Reaktionsplatte vorhandene Volumen ausreicht, um den Transfer mit einem neuen
SpectroCHIP-Array zu wiederholen. Andernfalls die Vertiefungen bis zum ursprünglichen Niveau auffüllen. Um das Gerät
sofort anzuhalten, die rote STOPP-Taste am Gerät – neben dem Bildschirm – drücken. Dadurch wird jede Bewegung
sofort gestoppt.
20. Nach Abschluss des
Dispensiervorgangs zeigt der Bildschirm im MTP-Diagramm alle Vertiefungen, aus denen Proben transferiert
wurden, und alle gespotteten Felder im Diagramm für den SpectroCHIP-Array. Die Schaltfläche RUN wird nicht
mehr als deaktiviert (grau) dargestellt. Siehe Abbildung G20.
21. Am Ende des Transfers erscheint ein Dialogfeld mit einer Warnmeldung – wie in Abbildung G21 dargestellt – falls
der Messwert des aufgebrachten Volumens in einem Feld den zulässigen Bereich für einen ordnungsgemäßen
Dispensiervorgang überschreitet. Auf OK klicken, um fortzufahren. Die Position der betroffenen Vertiefungen für
eine spätere Fehlerbehebung dokumentieren.
22. Im Bildschirm TRANSFER auf BACK tippen.
23. Im Bildschirm Main Menu auf VOLUME tippen. Daraufhin werden die Daten zu den gespotteten Volumina
angezeigt. Jeder Transfer wird mit der ID des zugehörigen SpectroCHIP-Arrays bezeichnet. Siehe Abbildung G22.
open wählen, um das gespottete Volumen anzuzeigen, oder cancel wählen, um zum Hauptbildschirm
zurückzukehren.
24. In einem beliebigen Bildschirm auf die Schaltfläche PARK tippen, um den Dispensierkopf anzuhalten. Der
Dispensierkopf bewegt sich und gibt den Zugang zur Arbeitsfläche frei.
25. Die Fronttür öffnen.
26. Die gefederten Positionshalter von der SCOUT-Platte wegziehen und diese von der Arbeitsfläche heben.
27. Die SpectroCHIP-Arrays mit einer Pinzette von der SCOUT-Platte abnehmen und in den Chip-Träger des
MassARRAY Analyzer einsetzen, um sie sofort zu messen.
28. Die Reaktionsplatte(n) von der SCOUT-Platte nehmen und für weitere Dispensiervorgänge aufbewahren oder
entsorgen. Die Reaktionsplatte kann bis zu zwei Wochen bei -35/-20 °C gelagert werden.
Abbildung G17: Transfer von der MTP zum SpectroCHIP-Array
29. Die SCOUT-Platte wieder auf die Arbeitsfläche stellen und die Fronttür schließen.
30. Das Kalibrantenreservoir leeren und den Kalibranten für die zukünftige Verwendung in den
Kalibrantenvorratsbehälter zurückgeben. Den Kalibranten bei -20 ºC lagern. Das Kalibrantenreservoir mit WATER
MS plus reinigen.
3-Pt Calibrant aus dem Kit darf nicht öfter als 5 Mal eingefroren und aufgetaut werden.
31. Die Fronttür schließen.
32. Auf die Schaltfläche HOME tippen. Warten, bis sich der Dispensierkopf in die Startposition bewegt hat.
33. Im Bildschirm Maintenance auf COMPLETE CYCLE tippen.
34. Im daraufhin angezeigten Fenster wash cycles 3 volle Zyklen (cycles) auswählen und auf OK klicken.
35. Im Bildschirm Maintenance auf CLEAN DAILY tippen.
36. Im Fenster daily pin cleaning auf SOAK tippen. Der Zähler hält an und die Nadeln bleiben in der Flüssigkeit.
Falls am selben Tag noch weitere Transfers geplant sind, müssen die Nadeln bis zum nächsten Transfer in der
Flüssigkeit bleiben.
Falls das Gerät an diesem Tag nicht mehr gebraucht wird, die Vorratsflasche 50%igem Ethanol auffüllen, damit
die Nadeln über Nacht mit der Funktion SOAK in die Flüssigkeit eingetaucht werden können. Die Waschstation
vorher nicht leeren. Siehe die Schritte 10–11 in Abschnitt G1 (Vorratsflasche für Ultraschallwaschstation füllen
und Nadeln eintauchen).
Falls das Gerät länger als einen Tag nicht verwendet werden soll, das Gerät ausschalten. Dabei müssen die
Nadeln in die Ultraschalllösung der Waschstation getaucht und die Vorratsflasche mit 50%igem Ethanol
komplett gefüllt sein.
H. SPEKTRENAUFZEICHNUNG IM MASSARRAY DX ANALYZER
H1. AUSWAHL DER ANALYSEPARAMETER MITHILFE DER CHIP-LINKER-SOFTWARE
1. Die Chip-Linker-Software öffnen .
2. Das Passwort Darwin und den Benutzernamen Charles eingeben und Connect wählen. Das Fenster Chip Linker
wird angezeigt.
3. Im linken Fenster die zu analysierende Platte auswählen.
4. Folgende Optionen einstellen:
− Terminator Chemistry: iPLEX
− Process Method: Allelotype
− Dispenser: Nanodispenser 96 to 96
− Experiment name: Den Namen der ausgewählten Platte eintragen
− Chip barcode: Den Code eintragen, der auf der linken unteren Ecke des verwendeten SpectroCHIP-
Arrays steht
5. Add wählen. 6. Create und dann Exit wählen.
H2. SPEKTRENAUFZEICHNUNG MITHILFE DER SPECTROACQUIRE-SOFTWARE
1. Mit einem Doppelklick auf das Symbol Start All auf dem Desktop die Anwendungen AnalyzerControl, MassARRAY
Caller und SpectroACQUIRE starten. Auf dem Desktop erscheint das SpectroACQUIRE-Fenster.
Das Gerät MassARRAY Dx Analyzer 4 und alle drei Anwendungen müssen immer laufen. Sollte es erforderlich sein, sie auszuschalten bzw. zu beenden, bitte an den Kundendienst von Agena Bioscience wenden (E-Mail: [email protected]).
2. In der Symbolleiste von SpectroACQUIRE auf Probe Sample In/Out klicken, um den Chiphalter zur Probenkammer
(Position „sample out“) zu bewegen. Alternativ dazu die Taste für die manuelle Steuerung des Probentisches an der
Gerätefront drücken (siehe Abbildung H1).
3. Wenn die Taste für die manuelle Steuerung des Probentisches aufgehört hat zu blinken, den Deckel der
Probenkammer öffnen (Abbildung H2) und den Chiphalter herausnehmen (Abbildung H3). Die SpectroCHIP-Arrays
aus dem vorangegangenen Lauf mit einer Pinzette aus dem Chiphalter entnehmen.
4. Die zu verarbeitenden SpectroCHIP-Arrays mit einer Pinzette in den Chiphalter einsetzen (Position 1 ist links,
Position 2 rechts).
Das Logo von Agena Bioscience auf dem SpectroCHIP-Array muss sich an der Unterkante des Chiphalters befinden, und jeder SpectroCHIP-Array muss korrekt eingesetzt sein, sodass der Chiphalter mit der Oberfläche der SpectroCHIP-Arrays eben abschließt. Außerdem ist vor dem Beladen sicherzustellen, dass die Proben getrocknet sind und sich auf dem SpectroCHIP-Array, dem Chiphalter sowie in der gesamten Probenkammer einschließlich des O-Rings keine Flüssigkeit und kein Staub befinden (siehe Abbildungen H2/H3).
Es ist wichtig, dass sich während eines Laufs immer zwei SpectroCHIP-Arrays im Chiphalter befinden. Wenn nur ein SpectroCHIP-Array verarbeitet werden soll, diesen in Chip-Position 1 einsetzen und den zuvor verarbeiteten SpectroCHIP-Array in Position 2 lassen.
5. Den Chiphalter mit dem zu analysierenden SpectroCHIP-Array wieder korrekt in der Probenkammer platzieren.
6. Den Deckel der Probenkammer fest herunterdrücken und in der Symbolleiste von SpectroACQUIRE Probe Sample
In/Out wählen.
7. Den Deckel heruntergedrückt lassen, bis das Zischgeräusch aufhört.
Die Taste für die manuelle Steuerung des Probentisches hört auf zu blinken, sobald sich der Chiphalter zur Position „sample in“ bewegt hat. Die Bereitschaftsanzeige des Analyzer 4 leuchtet, wenn ein Unterdruck von 5 x 10-6 mbar erreicht ist. Das dauert ungefähr zwei Minuten.
8. Auf der Registerkarte Automatic Run Setup das Kästchen neben Chip 1 und – sofern der zweite Chip analysiert
werden soll – das Kästchen neben Chip 2 markieren. Sicherstellen, dass im Bereich Geometry Use Calibration
Wells und Auto Teach Geometry ausgewählt sind.
Aus Sicherheitsgründen immer die Option Turn off HV after last chip is complete aktivieren, damit nach
Abschluss der Datenaufzeichnung automatisch die Hochspannung ausgeschaltet wird.
Abbildung H1: Manuelle Steuerung des Probentisches
Abbildung H2: Deckel der Probenkammer
Abbildung H3: Chiphalter und O-Ring der Probenkammer
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9. Überprüfen, ob die Bereitschaftsanzeige Ready auf der frontseitigen Anzeige des Geräts inzwischen grün leuchtet
und ein Unterdruck von mindestens 3 x 10-6 mbar erreicht wurde, damit der Lauf gestartet werden kann.
10. In der Symbolleiste von SpectroACQUIRE auf die Schaltfläche Start Autorun klicken.
Während der automatischen Verarbeitung zeigt die Registerkarte Automatic Run ein farbcodiertes Bild der beiden Chip-Positionen. Gelb zeigt den derzeit verarbeiteten SpectroCHIP-Array an; Grün zeigt an, dass die Verarbeitung abgeschlossen ist, und Rot zeigt einen Fehler an.
Am Ende der Aufzeichnung werden die erzeugten Spektren automatisch gespeichert und stehen sofort für die Analyse mit der MassARRAY Typer und iGenetics ® Software zur Verfügung.
Abbildung H4: Registerkarte Automatic Run Setup
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H3. ARBEITSVORGÄNGE NACH DER SPEKTRENAUFZEICHNUNG
MassARRAY Dx Nanodispenser RS1000
1. Die Dimple-Plate und den Schaber über einer sauberen Kunststoffunterlage leicht ausschütteln, um alle
Ionenaustauscher-Harz-Rückstände zu beseitigen. (Das geht leichter, wenn die Ionenaustauscher-Harz-Rückstände
getrocknet sind.)
Von Zeit z u Zeit müssen diese Platten mit Reinstwasser gereinigt und vor der nächsten Verwendung getrocknet werden.
2. Im Bildschirm Main Menu auf SHUT DOWN tippen.
3. Im eingeblendeten Dialogfenster zum Herunterfahren auf SHUT DOWN tippen. Daraufhin wird eine Meldung
angezeigt. Angeben, ob die Gerätekonfigurationsdatei (DispenseCONFIG.xml) gespeichert werden soll. Die Datei
DispenseCONFIG.xml enthält Konfigurationsparameter für das Gerät (zum Beispiel die derzeit geladenen
Verfahrens- und Dispensiereinstellungen).
YES: Speichert die aktuelle Gerätekonfiguration in der Datei DispenseCONFIG.xml. Die
Parametereinstellungen in der Konfigurationsdatei werden beim nächsten Start des Geräts verwendet. In der
Regel empfiehlt es sich, die Konfigurationsdatei zu speichern, sodass das Gerät die zuletzt verwendeten
Einstellungen der Konfigurationsparameter verwendet. Falls Unsicherheit besteht, ob Änderungen an den
Parametern vorgenommen wurden, oder falls unabsichtlich Änderungen vorgenommen wurden, NO wählen.
Beim nächsten Programmstart werden dann die letzten bekannten (und wahrscheinlich funktionierenden)
Einstellungen wieder geladen.
NO: Die aktuelle Konfiguration wird nicht gespeichert. Die zuletzt in der Datei DispenseCONFIG.xml
gespeicherten Konfigurationsparameter werden beim nächsten Einschalten des Geräts verwendet.
5. Nach der Wahl von YES oder NO wird Windows beendet und der eingebaute Computer ausgeschaltet. Es dauert
ungefähr eine Minute, den eingebauten Computer herunterzufahren. Dann erscheint auf dem Berührungsbildschirm
folgende Meldung: PC NO INPUT SIGNAL
6. Den Netzschalter des Geräts auf OFF (O) stellen, um das Gerät ganz auszuschalten.
7. Die Fronttür öffnen. Sicherstellen, dass sich der Dispensierkopf in der Parkposition befindet. Den Dispensierkopf
vorsichtig nach unten in das Flüssigkeitsreservoir drücken, sodass die Nadelhohlräume vollkommen mit Flüssigkeit
gefüllt sind.
Die Nadeln dürfen zwischen den Transfers nie der Luft ausgesetzt sein.
MassARRAY Dx Analyzer 4
Die analysierten SpectroCHIP-Arrays müssen im Gerät verbleiben und können bei der nächsten Verwendung ersetzt
und entsorgt werden.
Aus Sicherheitsgründen muss immer überprüft werden, ob die Hochspannung nach Abschluss der
Datenaufzeichnung ausgeschaltet wurde. (Siehe Abbildung H4: Es sollte immer Turn off HV after last chip is complete
3. In den Bereich des Spektrums hineinzoomen, der den zu überprüfenden Assay enthält, und anhand folgender
Aspekte die Übereinstimmung mit dem von der iGenetics-Software ermittelten Ergebnis kontrollieren:
Ausreichende DNA-Qualität und -Quantität – dadurch zu bestätigen, dass kein oder nur ein geringer UEP-Peak
vorhanden ist.
Zuverlässigkeit der von der Software angezeigten Peaks – zu ermitteln durch folgende Maßnahmen:
a. Vergleich jedes Peaks mit den entsprechenden Peaks der Control DNA. b. Sorgfältige Kontrolle der Zentrierung der Peaks an der Stelle der erwarteten Masse (gepunktete Linie),
um sicherzustellen, dass der Peak, auf dem das Ergebnis beruht, kein Addukt darstellt. c. Kontrolle der Peakmorphologie: Gelegentlich können unerwartete Peaks geringer Intensität erzeugt
werden, die mit einer charakteristischen Einbuchtung vor den Hauptpeaks einhergehen (siehe Abbildung I5) und nicht auf einen echten Mutationspeak, sondern auf ein Artefakt hindeuten.
I5: Kontrolle der Peakmorphologie. Die Pfeile zeigen auf Artefakte.
I.4 WIEDERHOLUNG DER PROBENANALYSE
1. Alle Proben, bei denen die Analyse fehlgeschlagen ist oder ein unklares Ergebnis geliefert hat (wie in Tabelle I1
oder Abschnitt 14: Fehlerbehebung beschrieben) müssen – beginnend mit der DNA-Amplifikation – nochmals
getestet werden. Die Notwendigkeit zur Wiederholung einzelner Assays ist auf der Grundlage folgender Kriterien zu
beurteilen:
Obligatorisch, wenn eine Probe nach Abschluss aller Überprüfungsmaßnahmen in Bezug auf einen
Marker „UNSPECIFIED“ oder „FAILED“ und für alle anderen Marker „WT“ ist. Nach Ermessen des Bedieners, wenn eine Probe in Bezug auf einen oder mehrere Marker
„UNSPECIFIED“ oder „FAILED“ ist, aber gleichzeitig bei anderen Markern, die mit der zu untersuchenden krebsbezogenen Pharmakogenetik eng verknüpft sind, eine Mutation aufweist.
Nicht erforderlich, wenn die Qualitätskontrolle des Spektrums zu der Beurteilung führt, dass alle zu dem
nichtspezifizierten Assay gehörenden Peaks Hintergrund- oder Addukt-Artefakte darstellen. 2. Wenn die Qualitätskontrolle des Spektrums zu der Beurteilung führt, dass eines der Peaks eines IND-Assays
(indeterminate, unbestimmter Assay) das Vorhandensein eines mutierten Allels anzeigen könnte, an den
[verwendete Kits: Myriapod® Cancer status Cod. SQ020 (Diatech Pharmacogenetics)] oder mittels direkter
Sequenzierung und Myriapod® Colon Status Cod. SQ010 (Diatech Pharmacogenetics).
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zu sehen:
Genotyp im
MassARRAY Dx
Colon Panel
Getestete
Proben
Proben, die mindestens
einer alternativen
Identifizierung
entsprechen
KRAS mutiert 129 129/129
BRAF mutiert 16 16/16
NRAS mutiert 21 21/21
PIK3CA mutiert 18 18/18
Wildtyp 194 194/194
Erforderliche Mindestmenge an DNA
Zur Evaluierung der analytischen Sensitivität des MassARRAY Dx Colon Panel wurden die folgenden Proben mit
variierender Replikationsanzahl in unabhängigen Experimenten getestet:
1) Human-DNA vom Wildtyp, standardisiert auf 100 ng/Reaktion und 1 ng/Reaktion (DNA aus kommerziell erhältlichem
menschlichem Placentagewebe – Cod. D7011, Sigma).
2) Drei DNA-Proben für die interne Verwendung, mit bekannten Mutationen (durch die Mischung der DNA mehrerer
Tumorzelllinien gewonnen), analysiert in unterschiedlich hoher Menge/mit variierender Replikationsanzahl, wobei die
DNA-Menge bis auf 1 ng/Reaktion gesenkt wurde.
Alle Proben wurden durch eine spektrophotometrische Analyse mit OPTIZEN POP BIO (Mecasys Ltd) quantifiziert.
Die erforderliche Mindestmenge an DNA betrug 1 ng/Reaktion.
Sensitivität (Nachweisgrenze eines mutierten Allels)
Die Sensitivität des MassARRAY Dx Colon Panel wurde für ausgewählte Mutationen evaluiert. Zur Bestimmung des
erforderlichen Mindestanteils der nachweisbaren mutierten Allele wurden Verdünnungsreihen mutierter DNA in
unterschiedlichen Mischungsverhältnissen mit Wildtyp-DNA getestet. Es wurden Mutationshäufigkeiten von 20 %, 10 %,
5 % und 2,5 % getestet. Die Ergebnisse belegen, dass das System in der Lage ist, Mutationen ab einer Häufigkeit von
2,5 % zu detektieren.
46
MassARRAY® Dx Colon Panel 40110 MADX-IFU-CUS-
501-DE, R04 2016/09
Die nachstehende Tabelle enthält Beispiele:
Mutation (Veränderung der Nukleotidsequenz) Sensitivität für mutierte Allele (in %) ID
Cosmic
KRAS G12V (35G>T) 2,5 520
BRAF V600E (1799T>A) 10 476
NRAS Q61K (181C>A) 5 580
NRAS G12D (35G>A) 5 564
PIK3CA E542K (1624G>A) 5 760
Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit
Zur Evaluierung der Reproduzierbarkeit und der Wiederholbarkeit der Testergebnisse mit dem Kit „Myriapod® Colon
status prototype“ wurde dieselbe Probenplatte aus dem Test der analytischen Sensitivität mit „prototype“-Kits aus zwei
verschiedenen Lots in vier unabhängigen Analyseläufen getestet. Die Analyseläufe wurden von drei Bedienern an vier
verschiedenen Tagen durchgeführt. Alle Wildtyp- und Mutationsproben und deren Replikate wurden in allen Analyseläufen gemäß der Gebrauchsanweisung
für Myriapod Colon status mit einer Reproduzierbarkeit von 100 % korrekt genotypisiert.
Folgende Proben wurden getestet:
1) Human-DNA vom Wildtyp, standardisiert auf 100 bzw. 1 ng/Reaktion (DNA aus kommerziell erhältlichem menschlichem Placentagewebe – Cod. D7011, Sigma);
2) Mutationsproben A, B, C und D, hergestellt durch Mischen der DNA mehrerer Tumorzelllinien und standardisiert auf 1 ng/Reaktion.
Probe Genotyp Anzahl der
Replikate
Anzahl der
Analyseläufe Ergebnis
H-DNA Placenta Wildtyp 4 4 16/16 Wildtyp für alle
Targets
A
KRAS G12V (35G>T)
2 4
8/8 mutiert für die
spezifischen Targets,
Wildtyp für die anderen
Targets
KRAS Q61L (182A>T)
PIK3CA E542K (1624G>A)
NRAS G12D (35G>A)
B
BRAF V600K (1798_1799delGTinsAA)
2 4
8/8 mutiert für die
spezifischen Targets,
Wildtyp für die anderen
Targets
NRAS Q61R (182A>G)
PIK3CA E545K (1633G>A)
KRAS G13D (38G>A)
PIK3CA H1047R (3140A>G)
C
BRAF V600E (1799T>A)
2 4
8/8 mutiert für die
spezifischen Targets,
Wildtyp für die anderen
Targets
KRAS G12A (35G>C)
NRAS Q61K (181C>A)
D
NRAS G13D (38G>A)
1 4
4/4 mutiert für die
spezifischen Targets,
Wildtyp für die anderen
Targets
KRAS G12C (34G>T)
PIK3CA H1047L (3140A>T)
47
MassARRAY® Dx Colon Panel 40110 MADX-IFU-CUS-
501-DE, R04 2016/09
16) ANHANG A: LISTE DER MIT DEM MASSARRAY DX COLON PANEL(1, 2)
DETEKTIERBAREN MUTATIONEN
Analysierte häufige Mutationen Nachweisbare
Sekundärmutationen
Gen
NCBI
-Ref.-
Seq.
Exon
HGVS-Nomenklatur Ergebnis lt.
iGenetics-
Software
HGVS-Nomenklatur
CDS-Mutation AA-Mutation CDS-
Mutation
AA-
Mutation
KR
AS
NM
_004985.3
2
c.34G>A p.(Gly12Ser) p.G12S
c.33_34delT
GinsTA p.(Gly12Ser)
p.A11>
?
c.34_36delG
GTinsAGA p.(Gly12Arg) p.G12R
c.34_35delGGinsAT p.(Gly12Ile) p.G12I
c.34_35delGGinsAA p.(Gly12Asn) p.G12N
c.34G>T/c.34_36delGG
TinsTGC p.(Gly12Cys) p.G12C
c.34_36delG
GTinsTGG p.(Gly12Trp)
p.G12
W
c.34_35delGGinsTA p.(Gly12Tyr) p.G12Y
c.34_35delGGinsTT p.(Gly12Phe) p.G12F
c.34_35delGGinsCT p.(Gly12Leu) p.G12L
c.34G>C p.(Gly12Arg) p.G12R
c.35_36delGTinsAA/c.3
5_36delGTinsAG p.(Gly12Glu) p.G12E
c.35_36delG
TinsAC p.(Gly12Asp) p.G12D
c.35G>T p.(Gly12Val) p.G12V
c.35_36delGTinsTC/c.3
5delG
p.(Gly12Val)/p.(Gly1
2fs*3)
p.G12V
(c.35_36GT>
TC)/p.G12fs*
3
c.35G>C p.(Gly12Ala) p.G12A
c.35G>A p.(Gly12Asp) p.G12D
c.38G>C p.(Gly13Ala) p.G13A c.36_37insG
CG
p.(Gly12_Gly1
3insAla)
p.G12_
G13ins
A
c.37G>T/c.36_37delTGi
nsAT p.(Gly13Cys) p.G13C
c.37G>C p.(Gly13Arg) p.G13R
c.37G>A p.(Gly13Ser) p.G13S
c.38G>T/c.38_39delGCi
nsTG/c.38_39delGCins
TT
p.(GLy13Val) p.G13V
c.38G>A/c.38_39delGCi
nsAT p.(Gly13_Asp) p.G13D
c.38_40delG
CGinsACA
p.(Gly13_Val1
4delinsAspIle)
p.G13_
V14>DI
c.38_39delG
CinsAG p.(Gly13_Glu) p.G13E
c.38_39delG
CinsAA p.(Gly13_Glu) p.G13E
48
MassARRAY® Dx Colon Panel 40110 MADX-IFU-CUS-
501-DE, R04 2016/09
KR
AS
NM
_004985.3
3
c.175G>T p.(Ala59Ser) p.A59S
c.175G>A p.(Ala59Thr) p.A59T
c.175G>C p.(Ala59Pro) p.A59P
c.176C>A p.(Ala59Glu) p.A59E
c.176C>G p.(Ala59Gly) p.A59G
c.176C>T p.(Ala59Val) p.A59V
c.181C>A/c.180_181del
TCinsCA/c.180_181del
TCinsAA
p.(Gln61Lys) p.Q61K
c.181C>G p.(Gln61Glu) p.Q61E
c.182A>C p.(Gln61Pro) p.Q61P
c.182A>T p.(Gln61Leu) p.Q61L
c.182A>G p.(Gln61Arg) p.Q61R
c.183A>C p.(Gln61His) p.Q61H
c.183A>T p.(Gln61His) p.Q61H c.182_183del
AAinsGT p.(Gln61Arg) p.Q61R
c.183A>G p.(Gln61Gln) p.Q61=
KR
AS
NM
_004985.3
4
c.349A>G p.(Lys117Glu) p.K117E
c.349A>C p.(Lys117Gln) p.K117Q
c.349A>T p.(Lys117Ter) p.K117*
c.351A>T p.(Lys117Asn) p.K117N
c.351A>C p.(Lys117Asn) p.K117N
c.351A>G p.(Lys117Lys) p.K117=
c.350A>G p.(Lys117Arg) p.K117R
c.350A>T p.(Lys117Ile) p.K117I
c.350A>C p.(Lys117Thr) p.K117T
c.436G>A p.(Ala146Thr) p.A146T
c.436G>C p.(Ala146Pro) p.A146P
c.436G>T p.(Ala146Ser) p.A146S
c.437C>T p.(Ala146Val) p.A146V
c.437C>G p.(Ala146Gly) p.A146G
c.437C>A p.(Ala146Glu) p.A146E
BR
AF
NM
_004333.4
15
c.1781A>G p.(Asp594Gly) p.D594G
c.1781A>T p.(Asp594Val) p.D594V
c.1781A>C p.(Asp594Ala) p.D594A
c.1798G>A p.(Val600Met) p.V600M c.1797_1798i
nsACA
p.(Thr599_Val
600insThr)
p.T599
_V600i
nsT
c.1798G>T/c.1798_179
8delGinsTACA
p.(Val600Leu)/p.(Va
l600delinsTyrMet)
p.V600L/p.V6
00>YM
c.1798G>C p.(Val600Leu) p.V600L
c.1798_1799ins18
p.(Thr599_Val600in
sAspPheGlyLeuAla
Thr)
p.T599_V600i
nsDFGLAT
c.1799_1800delTG>ins
AT/c.1799_1800delTG>
insAC/c.1799_1800delT
G>insAA
p.(Val600Asp)/p.(Va
l600Glu)
p.V600D/p.V6
00E
c.1799_1814
delinsA
p.(Val600_Ser
605delinsAsp)
p.V600
_S605>
D
c.1799_1814
delinsATGT
p.(Val600_Ser
605delinsAsp
Val)
p.V600
_S605>
DV
c.1799_1815
delinsAAAAG
p.(Val600_Ser
605delinsGluL
ys)
p.V600
_S605>
EK
c.1799_1804
delTGAAATin
sATA
p.(Val600_Ser
602delinsAspT
hr)
p.V600
_S602>
DT
c.1797_1799delAGTins
GAG p.(Val600Arg) p.V600R
c.1798_1799delGTinsA
A p.(Val600Lys) p.V600K
c.1798_1799delGTinsA
G p.(Val600Arg) p.V600R
c.1798_1799delGTinsC
G p.(Val600Arg) p.V600R
49
MassARRAY® Dx Colon Panel 40110 MADX-IFU-CUS-
501-DE, R04 2016/09
c.1798_1799delGTinsC
A p.(Val600Gln) p.V600Q
c.1799T>A p.(Val600Glu) p.V600E c.1799_1800
delTG
p.(Val600fs*11
)
p.V600f
s*11
c.1799T>C p.(Val600Ala) p.V600A
c.1799T>G p.(Val600Gly) p.V600G
c.1799_1801delTGA p.(Val600_Lys601d
elinsGlu)
p.V600_K601
>E
c.1801A>G p.(Lys601Glu) p.K601E
PIK
3C
A
NM
_006218.2
1
c.113G>A p.(Arg38His) p.R38H
c.113G>T p.(Arg38Leu) p.R38L
c.241G>A p.(Glu81Lys) p.E81K
c.241G>C p.(Glu81Gln) p.E81Q
c.263G>A p.(Arg88Gln) p.R88Q
c.263G>T p.(Arg88Leu) p.R88L
c.263G>C p.(Arg88Pro) p.R88P
c.277C>T p.(Arg93Trp) p.R93W
c.277C>A p.(Arg93Arg) p.R93R
c.277C>G p.(Arg93Gly) p.R93G
c.323G>A p.(Arg108His) p.R108H
c.323G>C p.(Arg108Pro) p.R108P
c.323G>T p.(Arg108Leu) p.R108L
PIK
3C
A
NM
_006218.
2
2 c.353G>A p.(Gly118Asp) p.G118D
PIK
3C
A
NM
_006218.2
4
c.1035T>A p.(Asn345Lys) p.N345K
c.1035T>G p.(Asn345Lys) p.N345K
c.1035T>C p.(Asn345Asn) p.N345=
PIK
3C
A
NM
_006218.2
7
c.1258T>C p.(Cys420Arg) p.C420R
c.1258T>A p.(Cys420Ser) p.C420S
c.1258T>G p.(Cys420Gly) p.C420G
PIK
3C
A
NM
_006218.2
9
c.1616C>G p.(Pro539Arg) p.P539R
c.1616C>A p.(Pro539His) p.P539H
c.1624G>A p.(Glu542Lys) p.E542K c.1624_1625
delGAinsAG p.(Glu542Arg)
p.E542
R
c.1624G>C p.(Glu542Gln) p.E542Q
c.1624G>T p.(Glu542Ter) p.E542*
c.1645G>A p.(Asp594Asn) p.D549N
c.1645G>C p.(Asp594His) p.D549H
c.1645G>T p.(Asp594Tyr) p.D549Y
c.1633G>A p.(Glu545Lys) p.E545K
c.1633G>C p.(Glu545Gln) p.E545Q
c.1633G>T p.(Glu545Ter) p.E545*
c.1634A>C p.(Glu545Ala) p.E545A
c.1634A>G p.(Glu545Gly) p.E545G
c.1634A>T p.(Glu545Val) p.E545V
c.1635G>C p.(Glu545Asp) p.E545D
c.1635G>T p.(Glu545Asp) p.E545D
c.1635G>A p.(Glu545Glu) p.E545=
c.1636C>A p.(Gln546Lys) p.Q546K
c.1636C>G p.(Gln546Glu) p.Q546E
c.1636C>T p.(Gln546Ter) p.Q546*
c.1637A>C p.(Gln546Pro) p.Q546P
c.1637A>G p.(Gln546Arg) p.Q546R
c.1637A>T p.(Gln546Leu) p.Q546L
PIK
3C
A
NM
_006218
.2
20
c.3062A>G p.(Tyr1021Cys) p.Y1021C
c.3062A>T p.(Tyr1021Phe) p.Y1021F
c.3062A>C p.(Tyr1021Ser) p.Y1021S
c.3073A>G p.(Thr1025Ala) p.T1025A
50
MassARRAY® Dx Colon Panel 40110 MADX-IFU-CUS-
501-DE, R04 2016/09
c.3073A>T p.(Thr1025Ser) p.T1025S
c.3073A>C p.(Thr1025Pro) p.T1025P
c.3075C>T p.(Thr1025Thr) p.T1025=
c.3075C>A p.(Thr1025Thr) p.T1025=
c.3127A>G p.(Met1043Val) p.M1043V
c.3127A>T p.(Met1043Leu) p.M1043L
c.3127A>C p.(Met1043Leu) p.M1043L
c.3129G>A p.(Met1043Ile) p.M1043I
c.3129G>C p.(Met1043Ile) p.M1043I
c.3129G>T p.(Met1043Ile) p.M1043I
c.3139C>T p.(His1047Tyr) p.H1047Y
c.3139C>G p.(His1047Asp) p.H1047D
c.3139C>A p.(His1047Asn) p.H1047N
c.3140A>C p.(His1047Pro) p.H1047P
c.3140A>G p.(His1047Arg) p.H1047R
c.3140A>T p.(His1047Leu) p.H1047L
c.3145G>A p.(Gly1049Ser) p.G1049S
c.3145G>C p.(Gly1049Arg) p.G1049R
c.3145G>T p.(Gly1049Cys) p.G1049C
NR
AS
NM
_002524.4
2
c.34G>A p.(Gly12Ser) p.G12S
c.34G>C p.(Gly12Arg) p.G12R
c.34G>T p.(Gly12Cys) p.G12C
c.34_35delGGinsAA p.(Gly12Asn) p.G12N
c.34_35delGGinsCC p.(Gly12Pro) p.G12P
c.34_35delGGinsTA p.(Gly12Tyr) p.G12Y
c.35G>A p.(Gly12Asp) p.G12D
c.35G>C p.(Gly12Ala) p.G12A
c.35G>T p.(Gly12Val) p.G12V
c.37G>A p.(Gly13Ser) p.G13S
c.37G>C p.(Gly13Arg) p.G13R
c.37G>T p.(Gly13Cys) p.G13C
c.37_38delGGinsAA p.(Gly13Asn) p.G13N
c.37_38delGGinsTA p.(Gly13Tyr) p.G13Y
c.38G>A p.(Gly13Asp) p.G13D
c.38G>C p.(Gly13Ala) p.G13A
c.38G>T/c.38_39delGTi
nsTC p.(Gly13Val) p.G13V
c.52G>C p.(Ala18Pro) p.A18P
c.52G>T p.(Ala18Ser) p.A18S
c.52G>A p.(Ala18Thr) p.A18T
NR
AS
NM
_002524.4
3
c.181C>A p.(Gln61Lys) p.Q61K
c.181C>G p.(Gln61Glu) p.Q61E
c.181_182delCAinsAG p.(Gln61Arg) p.Q61R
c.181_182delCAinsTT p.(Gln61Leu) p.Q61L
c.181_183delCAAinsAA
G p.(Gln61Lys) p.Q61K
c.182A>C p.(Gln61Pro) p.Q61P
c.182A>G p.(Gln61Arg) p.Q61R
c.182A>T p.(Gln61Leu) p.Q61L
c.182_183delAAinsGG/
c.182_183delAAinsTG
p.(Gln61Arg)/p.(Gln
61Leu)
p.Q61R/p.Q6
1L c.183A>G p.(Gln61Gln) p.Q61Q
c.183A>C p.(Gln61His) p.Q61H
c.183A>T p.(Gln61His) p.Q61H
c.175G>A p.(Ala59Thr) p.A59T
c.175G>C p.(Ala59Pro) p.A59P
c.175G>T p.(Ala59Ser) p.A59S
c.176C>A p.(Ala59Asp) p.A59D
c.176C>G p.(Ala59Gly) p.A59G
c.176C>T p.(Ala59Val) p.A59V
NR
AS
NM
_002524.4
4
c.349A>G p.(Lys117Glu) p.K117E
c.349A>C p.(Lys117Gln) p.K117Q
c.349A>T p.(Lys117Ter) p.K117*
c.350A>G p.(Lys117Arg) p.K117R
c.350A>C p.(Lys117Thr) p.K117T
c.350A>T p.(Lys117Met) p.K117M
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MassARRAY® Dx Colon Panel 40110 MADX-IFU-CUS-
501-DE, R04 2016/09
c.351G>C p.(Lys117Asn) p.K117N
c.351G>T p.(Lys117Asn) p.K117N
c.351G>A p.(Lys117Lys) p.K117=
c.436G>A p.(Ala146Thr) p.A146T
c.436G>C p.(Ala146Pro) p.A146P
c.436G>T p.(Ala146Ser) p.A146S
c.437C>A p.(Ala146Asp) p.A146D
c.437C>G p.(Ala146Gly) p.A146G
c.437C>T p.(Ala146Val) p.A146V
Hinweis 1: Durch Schrägstrich „/“ getrennte Mutationsbezeichnungen stellen nicht unterscheidbare Mutationen dar.
Hinweis 2: In derselben Zeile beschriebene Mutationen sind nicht unterscheidbar.
17) ANHANG B: VERWENDUNG DER RECALL-FUNKTION Die Recall-Funktion der Chip-Linker-Software wird verwendet, nachdem ein SpectroCHIP-Array mit fehlerhaften
Einstellungen verarbeitet wurde – wenn z. B. einer oder mehreren Vertiefungen einer Platte der oder die falschen
Assay(s) bzw. der oder die falschen Probe(n) zugewiesen wurden. Hierfür muss im Plate Editor eine neue Platte mit den
korrekten Informationen erstellt werden. Wenn hingegen beispielsweise in der Chip-Linker-Software die Optionen
Process Method und/oder Dispenser falsch eingestellt waren, braucht keine neue Platte erstellt zu werden (Schritt 1
überspringen).
1. Wenn die Plattenkonfiguration im Plate Editor fehlerhaft war, also der oder die falschen Assay(s) bzw. die falschen
Probe(n) verwendet wurden, muss eine neue Platte erstellt werden, die die korrekten Informationen enthält.
2. Auf dem Windows-Desktop des Computers im MassARRAY Dx Analyzer 4 auf das Symbol Chip Linker
doppelklicken, um die Anwendung zu starten.
3. Daraufhin wird das Fenster MassARRAY Typer Chip Linker angezeigt. Als Benutzerkennung (User ID) „charles“ und
als Passwort „darwin“ eingeben, um sich bei der Datenbank anzumelden. In der Dropdownliste den DB-Host
auswählen („AgenaDB“) und auf Enter klicken.
4. Im Auswahlfenster die neue, korrekte Platte in der Verzeichnisstruktur auswählen.
5. Im rechten oberen Teil des Fensters die geeigneten Analyseeinstellungen auswählen und einen Barcode oder einen
Namen für die Platte eingeben.
6. Auf die Schaltfläche Recall klicken.
7. Daraufhin erscheint das Dialogfeld Select Recall Chip. Den nochmals zu verarbeitenden SpectroCHIP-Array
auswählen (dargestellt durch das Symbol ).
8. Auf die Schaltfläche Recall klicken.
Der Vorgang zum erneuten Aufruf des SpectroCHIP-Arrays kann eine kurze Zeit dauern.
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MassARRAY® Dx Colon Panel 40110 MADX-IFU-CUS-
501-DE, R04 2016/09
18) ANHANG C: ERSTELLUNG EINER XML-DATEI Zur Fehlerbehebung oder wenn die Interpretation eines Spektrums unklar ist, können die Daten aus dem TyperAnalzyer
mit dem Kundendienst von Agena Bioscience ausgetauscht werden. Hierzu werden alle oder die vom Benutzer
ausgewählten Vertiefungen im aktiven Chip in eine XML-Datei exportiert, die an den Kundendienst gesendet werden
kann. Die XML-Datei kann in die TyperAnalyzer-Software geladen werden.
1. In TyperAnalyzer die zu exportierende Platte auswählen.
2. In der Menüleiste File Save All Wells to File wählen.
3. Im daraufhin angezeigten Dialogfeld ein Zielverzeichnis auswählen, einen Dateinamen (.xml) eingeben und auf
Save klicken.
XML-Dateien sind in der Regel sehr groß. Aufgrund der Größenbeschränkungen für E-Mails die Datei bitte in komprimierter Form (gezippte Datei) senden.