UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA MARITZA QUEIROZ SALAS MOSELLA Efeito do gene Autoimmune regulator (Aire) sobre a expressão de RNAs longos não codificadores em células tímicas epiteliais medulares Ribeirão Preto - SP 2015
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA
MARITZA QUEIROZ SALAS MOSELLA
Efeito do gene Autoimmune regulator (Aire) sobre a expressão de
RNAs longos não codificadores em células tímicas epiteliais
medulares
Ribeirão Preto - SP
2015
MARITZA QUEIROZ SALAS MOSELLA
Efeito do gene Autoimmune regulator (Aire) sobre a expressão de
RNAs longos não codificadores em células tímicas epiteliais
medulares
Ribeirão Preto - SP
2015
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-graduação em Imunologia
Básica e Aplicada da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, da
Universidade de São Paulo, para
obtenção do título de Mestre em
Ciências.
Área de Concentração: Imunologia
Básica e Aplicada
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Aleixo
da Silva Passos Júnior
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Mosella, Maritza Queiroz Salas Efeito do gene Autoimmune regulator (Aire) sobre a expressão de RNAs longos não codificadores em células tímicas epiteliais medulares. Ribeirão Preto, 2015 103p.; Il.;30cm Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientador: Passos, Geraldo Aleixo.
5.2 Silenciamento de Aire em mTEC 3.10 por RNA interferente (siRNA) .............. 47
5.3 Extração de RNA total ..................................................................................... 48
5.4 Quantificação e avaliação da pureza das preparações de RNA total .............. 50
5.5 Avaliação da integridade das preparações de RNA total ................................. 50
5.6 Reação de transcrição reversa dos mRNAs .................................................... 52
5.7 Reação de polimerização em cadeia quantitativa e em tempo real (qRT-PCR) ............................................................................................................................. 52
5.12 Aquisição de imagens de hibridação ............................................................. 56
5.13 Quantificação dos dados de microarrays ...................................................... 56
5.14 Análise dos dados de microarrays ................................................................ 57
5.14.1 Correção do background ............................................................................... 57
5.14.2 Normalização dos dados de microarrays ....................................................... 57
5.14.3 Correlação de Pearson .................................................................................. 57
5.14.4 Análise estatística dos dados para obtenção dos transcritos diferencialmente expressos ................................................................................................................. 58
5.14.5 Agrupamento hierárquico dos transcritos diferencialmente expressos .......... 58
5.15 Identificação das sequências dos RNAs longos não codificadores ............... 59
5.16 Classificação dos RNAs longos não codificadores ........................................ 59
5.17 Identificação e posicionamento dos genes codificadores mais próximos de loci de lncRNAs ..................................................................................................... 59
5.18 Análise do potencial codificador dos RNA longos não codificadores ............. 60
5.18.1 Análise do potencial codificador dos RNAs longos não codificadores por Coding-Potential Assesment Tool (CPAT) ................................................................ 60
5.18.2 Análise do potencial codificador pelo software Coding Potential Calculator (CPC) ....................................................................................................................... 61
5.19 Avaliação da presença da cauda poli A ......................................................... 61
6.1 Silenciamento de Aire na linhagem mTEC 3.10 .............................................. 63
6.2 Western Blot da proteína AIRE ....................................................................... 63
6.3 Normalização dos dados de microarray .......................................................... 64
6.4 Correlação de Pearson ................................................................................... 65
6.5 Transcritos diferencialmente expressos após silenciamento de Aire em células mTEC 3.10 ............................................................................................................ 66
6.6 LncRNAs diferencialmente expressos após silenciamento de Aire em células mTEC 3.10 ............................................................................................................ 68
6.7 Caracterização dos lncRNAs modulados por Aire ........................................... 69
6.7.1 Classificação dos lncRNAs .............................................................................. 69
6.7.2 Localização cromossômica dos lncRNAs modulados por Aire......................... 70
6.7.3 Identificação e posicionamento dos genes codificadores mais próximos ......... 71
6.7.4 Avaliação do potencial codificador dos lncRNAs ............................................. 73
6.7.5 Contagem de lncRNAs poliadenilados (lncRNAs poli A+) ................................ 76
Figura 1 Composição celular do timo ...................................................................... 23
Figura 2 Diversos tecidos são representados em células tímicas epiteliais medulares (mTECs) através da expressão gênica promíscua...................................................27
Figura 3 Representação esquemática da proteína AIRE humana............................31
Figura 4 Mecanismo proposto para a ativação gênica mediada por AIRE...............32
Figura 5 Classificação dos RNAs longos não codificadores.....................................35
Figura 6 Sequência do RNA interferente para o transcrito do gene Aire.....................48
Figura 7 Eletroforese microfluídica das preparações de RNA total..........................51
Figura 8 Densitometria da eletrofese microfluídica das preparações de RNA total........................................................................................................................... .51
Figura 9 Histograma mostrando a expressão transcricional relativa do gene Aire determinada por qRT-PCR em células mTEC 3.10 controles (Ctrl) ou transfectadas com RNA interferente siRNA anti-Aire (Aire-siRNA)..................................................63
Figura 10 Westen blot da proteína AIRE em células mTECs 3.10 controles (Ctrl) e transfectadas com RNA interferente siRNA anti-Aire (Aire-siRNA)........................................................................................................................64
Figura 11 Gráfico boxplot das amostras controle (em verde) e tratadas com siRNA-anti Aire (em rosa) após a normalização pelo método quantile .................................. 65
Figura 12 Agrupamento hierárquico da expressão transcricional global de mRNAs e de lncRNAs resultante da aplicação do coeficiente de correlação de Pearson......................................................................................................................66
Figura 13 Heat map dos transcritos modulados (mRNA e lincRNAs) entre as amostras de mTEC3.10 controle (CTL) versus mTEC3.10 Aire silenciadas (siAIRE).................................................................................................... ..................67
Figura 14 Heat map dos lncRNAs modulados por Aire entre as amostras de mTEC3.10 controle (CTL) versus mTEC3.10 Aire silenciadas (siAIRE)......................................................................................................................68
Figura 15 Distribuição dos lncRNAs modulados por Aire segundo o tipo.................69
Figura 16 Distribuição dos lncRNAs de acordo à sua distância em relação ao gene codificador de proteína mais próximo no genoma.......................................................72
Figura 17 Diagrama de Venn resultante da análise do potencial codificador de lncRNAs modulados por Aire pelos softwares Coding Potential Calculator (CPC) e Coding Potential Assesment Tool (CPAT).................................................................74
Figura 18 Porcentagem de lncRNAs poli A+ e lncRNAs poli A-.................................76
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Localização cromossômica dos lncRNAs modulados por Aire em células mTEC 3.10 e sua respectiva modulação, em log de fold change....................................................................................................................... 70
Tabela 2 Distância entre os genes codificadores de proteínas mais próximos e os lncRNAs modulados por Aire.....................................................................................72
Tabela 3 Potencial codificador dos lncRNAs modulados por Aire, segundo análise por Coding Potential Calculator (CPC) e Coding Potential Assesment Tool (CPAT), e seus respectivos escores...........................................................................................75
LISTA DE ABREVIATURAS
AChR: receptor de acetilcolina
AIRE: Autoimmune regulator
APC: célula apresentadora de antígeno
APECED: síndrome de distrofia ectodérmica com poliendocrinopatia e candidíase
autoimune
APS1: síndrome autoimune poliglandular do tipo 1
ATTGGTTA: sítio G-box
CARD: domínio recrutar de caspase
Cauda poli A: poli adenilação da porção 3’
CBP: proteína ligadora de CREB
CCL19: Chemokine (C-C motif) ligand 19
CCL25: Chemokine (C-C motif) ligand 25
CCL21: Chemokine (C-C motif) ligand 21
cDNA: DNA complementar
CPAT: ferramenta de acesso ao potencial codificador
CPC: calculador de potencial codificador
CpG: sítios CG
CREB: AMPcíclico reponsivo a elementos ligadores de proteína.
cRNA: RNA complementar
CRP: proteína C reativa
cTEC: célula tímica epitelial cortical
Cy3: cianina 3 verde
DM1: Diabetes Mellitus tipo 1
DNA: ácido desoxirribonucléico
DNA-PK: proteína quinase DNA-dependente
EAE: encefalomielite autoimune experimental
FDR: razão de falsa descoberta
GAD1: glutamato descarboxilase 1
GAD67: glutamato descarboxilase 67
H3K4me3: trimetilação da lisina 4 da histona H3
Ins: insulina
Ins1: insulina I
Ins2: insulina II
kb: kilobase
KO: knockout
lncRNA: RNA longo não codificador
MBP: proteína básica da mielina
MeV: Visualizador experimental múltiplo
MHC: complexo maior de histocompatibilidade
miRNA: microRNA
MOG: glicoproteína associada a oligodendrócitos e mielina
mRNA: RNA mensageiro
mTEC 3.10: linhagem de células tímicas epiteliais medulares imortalizada
mTEC: célula tímica epitelial medular
MYC: oncoproteína mielocitomatose-homóloga
Nanog: nanog homeobox
NF-kB: fator nuclear kappa B
N-TEF: fator alongador negativo da transcrição
Oct4: fator de transcrição 4 ligador de octâmero
ORF: matriz aberta de leitura
p53: supressor tumoral
PCR: reação em cadeia de polimerase
PGE: expressão gênica promíscua
PHD1: domínio tipo dedo de zinco primeiro
PHD2: domínio tipo dedo de zinco segundo
PLP: lipoproteína da mielina
PTA: antígenos de tecidos periféricos
P-TEFb: fator b alongador positivo da transcrição
qRT-PCR: reação de polimerização em cadeia quantitativa e em tempo real
RIN: número de integridade do RNA
RNA pol II: RNA polimerase II
RNA pol III: RNA polimerase III
RNA: ácido ribonucleico
rRNA: RNA ribossômico
SAND: domínio denominado SP100, AIRE1, nucP41/P75 and DEAF1
SFB: soro fetal bovino
siRNA: pequeno RNA interferente
Sox2: box 2 da região Y determinante do sexo
STAT3: sinal transdutor e ativador da transcrição 3
SVM: máquina de suporte de vetores
TCR: receptor de célula T
TEC: célula tímica epitelial
TRA: antígeno tecido-específico
Treg: célula T reguladora
tRNA: RNA transportador
TTATTA: sítio TATA-box
UCSC: Universidade da Califórnia, Santa Cruz
V(D)J: v=variável, d=diversidade, j=junção.
RESUMO
O timo é um órgão linfoide primário envolvido na discriminação entre o próprio e não-próprio durante o processo de tolerância central. Neste órgão, células tímicas epiteliais medulares (mTECs) facilitam a eliminação de células T auto-reativas por expressarem e apresentarem um repertório diverso de antígenos dos tecidos periféricos (PTAs), um processo que depende, em grande parte, da expressão do gene regulador autoimune, do inglês, Autoimmune regulator (Aire). O gene Aire é um regulador transcricional que pode atuar de maneira dual, ou seja, ora ativando a transcrição, ora reprimindo-a. A proteína AIRE, modula a expressão ectópica de muitos PTAs e a transcrição de muitos miRNAs em células mTECs por influir no desencadeamento da liberação da RNA Pol II ancorada nas regiões promotoras ao longo da cromatina. No entanto, a associação entre o gene/proteína Aire e a expressão de RNAs longos não codificadores (lncRNAs) ainda permanece desconhecida. Por isto, investigamos se Aire exerce função moduladora sobre a expressão desta espécie de RNA em células mTECs. Através do silenciamento de Aire nestas células por meio de RNA interferente e posterior análise do transcriptoma murino por microarrays, nossos resultados demonstram que Aire exerce, de fato, uma função moduladora sobre a expressão de lncRNAs reprimindo a maioria deles. Além disso, a maioria consiste de lncRNAs intergênicos, sem cauda poli A sendo que no genoma estão situados até 10 kb do gene codificador mais próximo. Esta é a primeira evidência de que células mTECs expressam lncRNAs e que o gene Aire pode controlar a expressão dos mesmos.
Os progenitores linfoides de células T entram no timo no dia embrionário
11.5 em camundongos Mus musculus e na sétima semana de gestação na
espécie humana (FARLEY et al., 2013; HAYNES; HEINLY, 1995; PEARSE,
2006) e passam por grande expansão inicial, mediada por IL-7, produzida pelas
células epiteliais tímicas (BOUDIL et al., 2015; HARA et al., 2012; SEDDON,
2015). Neste estágio, as células T imaturas são duplo negativas (CD4-, CD8-) e
começam a rearranjar os loci das cadeias formadoras do receptor de antígenos
de células T (T cell receptor ou simplesmente TCR), por meio do processo
denominado de recombinação V(D)J (MORRIS; ALLEN, 2012). Após a correta
formação do TCR, os timócitos passam ao estágio de duplos positivos (CD4+,
CD8+) e são atraídos, por meio das quimiocinas CCL21 e CCL25, para contato
com as cTECs (MISSLITZ et al., 2004; PETRIE; ZÚÑIGA-PFLÜCKER, 2007;
ZLOTOFF et al., 2010). É através desse contato com cTECs que expressam
autoantígenos que os timócitos são selecionados favorecendo aqueles clones
que expressam TCRs úteis, ou seja, capazes de reconhecer o complexo
peptídeo-MHC (Major Histocompatibility Complex) próprio com baixa afinidade,
recebendo sinais de sobrevivência. Esse fenômeno é conhecido como “seleção
positiva” (MOUCHESS; ANDERSON, 2014; TAKADA et al., 2014).
Aqueles timócitos selecionados positivamente no córtex passam a ser
simples positivos (TCD4+CD8- ou TCD8+CD4-), se comprometendo com a
linhagem de células T auxiliares ou as T citotóxicas, respectivamente. São
atraídos à medula do timo pelas quimiocinas CCL25, CCL19 e CCL21
(MISSLITZ et al., 2004; PETRIE; ZÚÑIGA-PFLÜCKER, 2007; ZLOTOFF et al.,
25
2010), onde interagem com as mTECs que, juntamente com as demais células
apresentadoras de antígenos (APCs), lhes apresentam uma vasta gama de
autoantígenos. Aqueles que se ligarem ao complexo peptídeo-MHC com alta
afinidade serão deletados por apoptose ou convertidos em células Tregs,
processo esse denominado “seleção negativa” (ANDERSON et al., 2014;
MOUCHESS; ANDERSON, 2014).
Somente 5% dos timócitos resultam em linfócitos T maduros que, ao final
de sua jornada pelo timo, reconhecem o MHC próprio mas são tolerantes aos
autoantígenos (PALMER, 2003). O impedimento da deleção clonal ou da
indução de Tregs pode levar à quebra da tolerância central e o desenvolvimento
de doenças autoimunes (AKIYAMA et al., 2013).
Na seleção negativa participam os diversos tipos de células dendríticas
presentes no timo. As células dentríticas migratórias transportam antígenos
próprios adquiridos na periferia e provenientes do sangue e os apresentam para
os timócitos (JOFFRE et al., 2012; OH; SHIN, 2015). Estudos indicam que as
células B também são capazes de apresentar antígenos, contribuindo com o
processo de tolerância central (PERERA et al., 2013; YAMANO; STEINERT;
KLEIN, 2015; YAMANO et al., 2015).
Na seleção negativa, porém, um fator de grande relevância é a
colaboração entre as células epiteliais medulares tímicas e as células dentríticas.
Estudos demonstram que as células mTECs produzem linfopoietina, quimiocina
responsável por atrair e manter as células dendríticas residente próximas a elas.
Tal proximidade seria coerente com o fato de que as células mTECs
compartilham diversos autoantígenos periféricos expressos por elas com as
células dentríticas, promovendo uma apresentação indireta, que amplia o
alcance e eficácia da apresentação deles aos timócitos, para promoção da
seleção negativa (GALLEGOS; BEVAN, 2004; HUBERT et al., 2011; KLEIN et
al., 2011; KOBLE; KYEWSKI, 2009; OH; SHIN, 2015)
1.3 Expressão gênica promíscua (PGE) em células epiteliais medulares
tímicas
A primeira evidência de que autoantígenos periféricos podiam ser
expressos de maneira ectópica no timo foi a descoberta da expressão do
26
receptor de acetilcolina (AChR) e de componentes da mielina em timo humano
(KIRCHNER et al., 1988; LEVINSON et al., 2003; SMITH et al., 1997).
Posteriormente encontraram insulina (Ins), além da proteína C-reativa (CRP) do
fígado sendo expressos no timo humano e de camundongos (DERBINSKI et al.,
2001; JOLICOEUR; HANAHAN; SMITH, 1994; KLEIN et al., 1998; SOSPEDRA
et al., 1998).
Além de antígenos de tecidos periféricos (PTAs do inglês peripheral tissue
antigens) ou antígenos tecido-específicos (TRA do inglês tissue restricted
antigens) antígenos tumorais também foram encontrados no timo normal
(CLOOSEN et al., 2007). Essa expressão foi atribuída às células mTEC e foi
denominada expressão gênica promíscua (PGE) (DERBINSKI et al., 2001, 2005;
MAGALHÃES et al., ) A PGE é definida, operacionalmente, como a expressão
no timo de genes ectópicos, ou seja, que não fazem parte do programa de
expressão gênica fisiológica destas células. O conceito de antígenos TRAs por
sua vez, engloba antígenos que são expressos em menos de cinco tecidos
diferentes (DERBINSKI et al., 2005)
As células mTEC expressam enorme diversidade de genes (chegando a
mais de 19.000 genes) e isto faz com que elas façam a representação
imunológica de virtualmente todos os antígenos de todos os tecidos do corpo
(Figura 2)(SANSOM et al., 2014). Esta característica é diretamente relacionada
com o seu processo de maturação, isto é, com a maior expressão de MHC
classe II e a molécula co-estimulatória CD80 em sua membrana além da
expressão do gene regulador autoimune, do inglês Autoimmune regulator (Aire)
(MHCII+, CD80hi , Aire+), estágio em que se tornam competentes na
apresentação de antígenos (DERBINSKI et al., 2005).
Desbinski e colaboradores (2005), descreveram uma maior gama de
antígenos tecido-específicos expressos nas células mTECs, em modelos
murinos autoimune e não autoimune. Os antígenos tecido-específicos se
apresentaram fracamente expressos quanto a sua transcrição (RNAs
mensageiros ou mRNAs), porém capazes de ser detectados por meio das
respectivas proteínas.
Entretanto, somente cerca de 1-5% das células mTEC se mostraram com
esta capacidade transcricional as quais estiveram presentes durante a ontogenia
27
tímica, se mantendo no período pós-natal e coincidindo com o processo de
maturação dos linfócitos T (DERBINSKI et al., 2001).
Figura 2 Diversos tecidos são representados em células tímicas epiteliais medulares (mTECs) através da expressão gênica promíscua. Extraído e adaptado de(KYEWSKI; DERBINSKI, 2004).
Muitos desses antígenos estão associados com doenças autoimunes
como o diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) (Ins1, Ins2, Gad1) esclerose múltipla
(MBP, MOG, PLP) e miastenia gravis (AchR). Logo os pesquisadores
correlacionaram a PGE com a tolerância central mediada pelo timo e
especificamente com a seleção negativa, na qual a medula tímica tem papel
fundamental (SMITH et al., 1997; SOSPEDRA et al., 1998).
Os timócitos permanecem na medula tímica cerca de quatro a cinco dias,
tempo necessário e suficiente para serem expostos às células do estroma e
serem apresentados aos autoantígenos (KLEIN, 2009), sendo que essa
apresentação é otimizada com o auxílio das células dendríticas (HUBERT et al.,
2011; KLEIN et al., 2011; KYEWSKI; FEUERER, 2014; MA; BAJIC; ZHANG,
2013; OH; SHIN, 2015).
28
1.4 Regulação da expressão gênica promíscua no timo
A PGE parece ser controlada em múltiplos níveis. Ela tem início nas
mTECs imaturas e progride juntamente com sua maturação. Nas mTECs
maduras que expressam Aire (mTECs Aire+), uma vasta gama de autoantígenos
periféricos controlados por Aire passam a ser expressos e são denominados
Aire-dependentes como por exemplo insulina 2 (Ins2) e caseína α. Estes
autoantígenos são expressos concomitantemente com outros antígenos Aire-
independentes (como CRP e GAD67), o que indica a presença de outros
controladores da PGE, ainda desconhecidos (ANDERSON et al., 2002). Até o
momento o gene Aire é considerado o principal controlador transcricional da
PGE apesar de atuar em conjunto com outras moléculas (proteínas) acessórias
chamadas de parceiras de Aire (ABRAMSON et al., 2010; KYEWSKI;
PETERSON, 2010; LAAN; PETERSON, 2013b; MEREDITH et al., 2015;
PETERSON; ORG; REBANE, 2008; ST-PIERRE et al., 2015).
Variações alélicas também refletem em variações na expressão
intratímica de certos PTAS e são correlacionadas com a suscetibilidade a
doenças autoimunes. Este é o caso da DM1 na qual uma variação alélica no
gene da insulina promove sua maior expressão no timo, resultando em um efeito
protetor (PUGLIESE et al., 1997; VAFIADIS et al., 1997). O background genético
em modelos murinos de esclerose múltipla, a encefalomielite autoimune
experimental (EAE), também obedece ao mesmo princípio, uma vez que a maior
expressão da proteína básica da mielina (MBP), no timo, está associada com a
resistência à doença (LIU et al., 2001).
.Um estudo focado no lócus da caseína, cujos genes são expressos
durante a PGE demonstrou ainda o controle epigenético sobre a expressão
promíscua. A demetilação do promotor do gene da caseína β no estágio imaturo
da mTEC foi seguida da acetilação da histona H4 e trimetilação da lisina 4 da
histona H3 (H3K4me3), um marcador de ativação transcricional, resultando em
descontração do lócus e consequente expressão de outros membros da família
gênica da caseína. Os mesmos marcadores epigenéticos permissivos foram
encontrados no promotor de um outro antígeno-tecido específico tipicamente
expresso durante a PGE, como é o GAD67 (TYKOCINSKI et al., 2010).
29
O controle pós transcricional da PGE também tem sido evidenciado.
Quando animais deficientes de Dicer – uma enzima essencial na maturação dos
microRNAs (miRNAs) – foram analisados quanto a expressão de autoantígenos,
observou-se que sua expressão era diminuída na ausência dos miRNAs
maduros. A ausência do miR-29a, em especial, afetou a expressão dos
ectodermal-dystrophy (APECED)(AALTONEN et al., 1997; NAGAMINE et al.,
1997).
Dentre diversos tecidos endócrinos humanos analisados, o gene que foi
chamado de Aire, apareceu expresso principalmente no timo, pâncreas e córtex
da adrenal e por predição postulou-se que codificava uma proteína de 545
aminoácidos, cujo peso molecular era 57.7 kDa. Por sequenciamento,
determinou-se que o novo gene apresentava duas regiões ricas em cisteína que
formavam motivos PHD tipo dedos de zinco, e que, pelo alto conteúdo de prolina
deveria ter uma estrutural espiral, com pequena probabilidade de formar
estruturas alfa hélice ou folha B pregueada. Sem porção transmembrana,
30
apresentava um sinal de localização nuclear. A mutação neste gene
provavelmente levaria a formação de uma proteína truncada, com perda de pelo
menos um dos motivos tipo dedos de zinco. Tais motivos dedos de zinco seriam
importantes para interação com outras macromoléculas, como ácidos nucléicos
e proteínas e estavam presentes em proteínas nucleares que regulavam ou
mediavam a transcrição. Os indícios apontavam para a descoberta de um novo e
importante fator de transcrição (AALTONEN et al., 1997; NAGAMINE et al.,
1997).
Dois anos depois, Heino e colaboradores (HEINO et al., 1999)
investigaram a expressão de Aire por hibridação in situ de mRNA,
imunohistoquímica e imunofluorescência em diversos tecidos humanos. O que
chamou a atenção foi a sua expressão acentuada em células epiteliais da
medula tímica e também em células dendríticas (tanto no timo quanto nos
linfonodos); isto é, em duas populações de células APCs. Tal fato trouxe à luz a
possibilidade do gene Aire atuar na seleção negativa uma vez que ambas as
APCs participam desses eventos. Se isto fosse confirmado, esse gene teria um
papel primordial no estabelecimento da tolerância central e quando mutado,
como no caso da APECED, provocaria a quebra da tolerância órgão específica.
Além disso, já era sabido que vários autoantígenos relacionados com o DM1
eram expressos no timo e poderiam participar da indução da tolerância central,
corroborando novamente com a ideia de que a proteína Aire poderia estar
regulando a expressão e/ou apresentação de autoantígenos específicos
(FORNARI et al., 2010; SMITH et al., 1997; SOSPEDRA et al., 1998)
1.6 Mecanismo de ação de Aire
O gene Aire codifica uma proteína que compreende uma combinação de
domínios típicos de reguladores transcricionais e de proteínas ligadoras da
cromatina. Além disso, apresenta um sinal de importação e um de exportação
nuclear. Sua porção N-terminal apresenta um domínio de recrutamento de
caspase, do inglês, caspase recruitment domain (CARD), ao qual sua
oligomerização tem sido atribuída. Um domínio SAND (SP100, AIRE1,
31
nucP41/P75 and DEAF1), envolvido com sua ligação ao DNA e domínios tipo
dedos de zinco (PHD1 e PHD2). PHD 1 é responsável por sua ligação à histona
H3 e à subunidade catalítica das proteínas quinases DNA-dependentes (DNA-
PKs) e o domínio PHD2 característico de proteínas ligadoras de cromatina
(Figura 3 )(CHAKRAVARTY; ZENG; ZHOU, 2009; KOH et al., 2010).
Figura 3 Representação esquemática da proteína AIRE humana. Os domínios e elementos
funcionais da proteína reguladora autoimune (AIRE) são mostradas em diferentes cores. CARD= domínio recrutador de caspase; NLS= sinal de localização nuclear; SAND=(SP100, AIRE1, nucP41/P75 and DEAF1); PHD= domínios tipo dedos de zinco. Extraído de (PETERSON; ORG; REBANE, 2008).
Observou-se que a proteína AIRE se liga ao DNA em regiões TATA-box
(TTATTA) e repetições de ATTGGTTA (G-box) (KUMAR et al., 2001), mas mais
do que um fator de transcrição clássico, AIRE atualmente é tida como uma
proteína moduladora da transcrição (KEANE; CEREDIG; SEOIGHE, 2015;
KYEWSKI; PETERSON, 2010; MEREDITH et al., 2015; PETERSON; ORG;
REBANE, 2008; SATO et al., 2004; ST-PIERRE et al., 2015).
Ela é capaz de promover, através da interação com outras proteínas
consideradas “parceiros transcricionais”, um maior acesso da maquinaria de
transcrição em determinados loci gênicos, culminando em sua ativação
transcricional, exemplo; os PTAs nas mTECs. Para tanto, AIRE se liga, através
de seus domínios PHD a promotores hipometilados ou não metilados na lisina 4
da histona 3 (H3K4) e é fosforilado por DNA-PKs em dois resíduos N-terminais
(treonina -68 e serina – 156), tornando-se ativado. Ativo, recruta a proteína
ligadora de CREB (CBP) um importante co-ativador transcricional. CBP atua na
iniciação da transcrição, promovendo a acetilação das histonas e recrutando
remodeladores da cromatina (PETERSON; ORG; REBANE, 2008; PITKÄNEN et
al., 2000). A seguir, é recrutado o fator alongador positivo da transcrição (P-
TEFb, do inglês, positive transcription elongation factor b), que remove o fator
alongador negativo da transcrição (N-TEF, negative elongation factor), fosforila a
RNA polimerase II (RNA Pol II), permitindo assim a progressão da transcrição
32
para a fase de alongamento (OVEN et al., 2007; PETERSON; ORG; REBANE,
2008). Sua função consiste, em suma, em promover a liberação de moléculas de
RNA pol II travadas nas regiões promotoras de genes ao longo da cromatina,
contribuindo assim com a promoção da transcrição (Figura 4) (GIRAUD et al.,
2012).
E foi considerando a interação de AIRE com RNA Pol II que nosso grupo
de pesquisa em um trabalho recente demonstrou, pela primeira vez, que este
gene também pode controlar a transcrição de miRNAs em células mTECs
(MACEDO et al., 2013).
AIRE, no entanto, pode apresentar um papel duplo na regulação da
expressão gênica, funcionando como um ativador transcricional e também como
um repressor de vários genes, por meio do fenômeno de transrepressão
(ILMARINEN et al., 2008; JOHNNIDIS et al., 2005; SATO et al., 2004; TAO et al.,
2006).
Figura 4 Mecanismo proposto para a ativação gênica mediada por AIRE. O autoimune regulator (AIRE) é preferencialmente recrutado para promotores com baixos níveis de trimetilação da lisina 4 da histona H3. Em adição a ligação às histonas, uma interação direta com o DNA é necessária para guiar AIRE a regiões específicas. Nas regiões regulatórias alvo, AIRE recruta o fator alongador positivo da transcrição (P_TEFb), responsável por fosforilar a RNA pol II, o que a converte de uma forma pausada para uma forma de alongamento. AIRE também interage com a proteína ligadora de CREB (CBP), a qual acetila histonas, permitindo maior acesso da maquinaria de transcrição ao DNA. A interação de AIRE com proteínas quinases DNA-dependentes (DNA-PKs) e com a proteína inibidora de STAT1 (PIAS1) também aumentam a ativação transcricional. DNA-PKs fosforilam AIRE e, através de interação com a matrix nuclear colaboram com AIRE para a formação de loops na cromatina. Extraído e modificado de (PETERSON; ORG; REBANE, 2008)
33
1.7 Aire e autoimunidade
Humanos deficientes em Aire, isto é, aqueles indivíduos portadores de
mutações que ocasionam perda de função deste gene, desenvolvem APECED
também conhecida como Síndrome Autoimune Poliglandular Tipo 1 (APS 1) uma
doença autoimune hereditária autossômica recessiva. Essa doença é debilitante
e é caracterizada por insuficiência da glândula adrenal, hipoparatireoidismo e
candidíase mucocutânea (NAGAMINE et al., 1997; PERHEENTUPA, 2002);
sendo que a ocorrência de duas das três manifestações já é suficiente para
diagnóstico clínico da doença (BUZI et al., 2003).
Além dessas características clínicas, os pacientes de APECED
apresentam anticorpos séricos anti-citocinas, principalmente anti-interferon (IFN)
e anti-IL-17 (KISAND et al., 2010; MEAGER et al., 2006) e anticorpos anti-
enzimas estereidogênicas (UIBO et al., 1994). Pacientes com APECED também
apresentaram menor quantidade de células Tregs (RYAN et al., 2005).
Existem mais 60 mutações associadas à APS1 já identificadas, que
variam entre mutações sem sentido, onde a troca de bases origina um stop
codon, mutações de sentido trocado, deleções que mudam a matriz de leitura;
substituições e mutações de ponto não sinônimas (AKIRAV; RUDDLE;
HEROLD, 2011). Tais mutações originam proteínas truncadas com domínios
comprometidos (ISHII et al., 2000).
Assim como pacientes com APS1, camundongos Aire knockout (Aire KO)
também desenvolvem quadro de doença autoimune e nestes animais observou-
se diminuição da expressão de PTAs no timo (ANDERSON et al., 2002;
DERBINSKI et al., 2005). Isso pode influir na seleção negativa permitindo que
células T auto reativas escapem para a periferia (RAMSEY et al., 2002).
Resultados recentes de nosso laboratório demonstram que não apenas as
mutações de Aire, mas também alterações na sua expressão transcricional
podem ocasionar alterações na expressão downstream de genes que codificam
PTAs (OLIVEIRA et al., 2013).
34
Até o momento, não houve relato na literatura associando Aire com a
expressão de outros tipos de RNAs diferentes de mRNAs e de miRNAs, como
por exemplo os lncRNAs.
1.8 A descoberta dos RNAs longos não codificadores
Análises aprofundadas do transcriptoma de mamíferos demonstraram que
90% de toda a transcrição realizada pela RNA Pol II não corresponde a “genes-
padrão”. A hipótese levantada para explicar tal fato era que a RNA Pol II iniciaria
uma transcrição inespecífica a partir de sítios “incorretos”, gerando um ruído
transcricional sem relevância biológica (STRUHL, 2007).
Rastreamentos genômicos demonstraram que a RNA Pol II se associa
com a maior parte do genoma, incluindo regiões que eram consideradas
transcricionalmente inertes. Observou-se que grande parte dessa transcrição
tinha início em regiões intergênicas e que encontravam-se preferencialmente
acessíveis à maquinaria transcricional e originavam transcritos antisense e
RNAs não codificadores em eucariotos (STRUHL, 2007; WILLINGHAM;
GINGERAS, 2006). Muitos dos RNAs não codificadores foram justificados, mais
tarde, como componentes da maquinaria de splicing de mRNAs e RNAs da
maquinaria de tradução e sua regulação, ou seja, o RNA ribossômico (rRNA), o
RNA transportador (tRNA), RNAse P. Porém, muitos permaneciam como
transcritos longos com pouco ou nenhum potencial codificador cuja função não
era conhecida. A esta nova espécie RNAs denominou-se “RNAs longos não
codificadores” ou lncRNA (MATTICK; RINN, 2015a; RINN; CHANG, 2012).
1.9 Definição e classificação dos RNAs longos não codificadores
Os lncRNAs são definidos como RNAs maiores que 200 bases, sem
poder codificador (RINN; CHANG, 2012). São classificados de acordo com a
localização de seu lócus em relação a genes codificadores de proteínas), ou
35
seja, são classificados da seguinte forma (HARROW et al., 2012; MA; BAJIC;
ZHANG, 2013) (Figura 5):
Figura 5 Classificação dos RNAs longos não codificadores. Genes codificadores de proteína e seus exons são representados em azul; em vermelho estão os lncRNAs e seus exons. Extraído e adaptado de (MA; BAJIC; ZHANG, 2013).
LincRNAs: são RNAs não codificadores intergênicos, isto é, têm sua unidade
transcricional separada da unidade transcricional de genes codificadores de
proteínas. Uma definição de lincRNAs determina, ainda, que estejam a 5
kilobases (kb) de distância a partir de genes codificadores de proteínas
(GUTTMAN et al., 2009).
36
LncRNAs intrônicos: sua unidade transcricional se encontra inserida no íntron de
um gene codificador, mas não intersecta com nenhum éxon do mesmo.
LncRNAs antisense: apresentam em seus lócus pelo menos um produto de
transcrição que intersecta qualquer éxon de um lócus codificador e que sejam
transcritos no sentido oposto ou, ainda, que tenham evidência publicada de
regulação antisense de um gene codificador.
LncRNAs sense: aqueles RNAs cujas unidades transcricionais contém éxons de
um gene codificador, transcritos na mesma fita sense.
1.10 Características dos RNAs longos não codificadores
Apesar de pertencerem a uma classe distinta, os lncRNAs compartilham
semelhanças com os mRNAs: alguns deles também têm sua regulação
transcricional mediada por fatores de transcrição-chave como p53, NF-kB, Sox2,
Oct4 e Nanog (cujos genes se situam próximos a eles) e muitos deles
apresentam domínios K4-K36 (trimetilação da lisina 4 da histona H3 - H3K4me3
no seu promotor e trimetilação da lisina 36 da histona H3 – H3K36me3- ao longo
da unidade transcrita), marcadores de genes ativamente transcritos pela RNA
Pol II (GUTTMAN et al., 2009; KHALIL et al., 2009). Seus promotores, assim
como o de genes codificadores, possuem forte enriquecimento na ligação à RNA
Pol II (GUTTMAN et al., 2009; STRUHL, 2007) e sua expressão pode também
ser regulada por miRNAs, assim como a expressão de mRNAs (LEUCCI et al.,
2013; YOON; ABDELMOHSEN; GOROSPE, 2014).
Alguns lncRNAs compartilham como os mRNAs o processamento com 5’
cap, o splicing alternativo, a poli adenilação na sua porção 3’ (cauda poli A)
(GUTTMAN et al., 2009; HARROW et al., 2012; STRUHL, 2007; WU et al.,
2008). Diferentemente dos mRNAs, são pouco conservados e, como
demonstrado por Cabili e colaboradores, que investigaram a expressão dos
mesmos em 24 tecidos humanos, são altamente tecido específicos, fato
confirmado também em murinos (CABILI et al., 2011; RAVASI et al., 2006).
37
Função biológica importante não significa apresentar altos níveis de
expressão transcricional. Os lncRNAs são pouco expressos, podendo ser até
dez vezes menos expressos que os genes codificadores de proteínas
(GUTTMAN et al., 2009; RAVASI et al., 2006; ULITSKY; BARTEL, 2013). Eles
são regulados nas células pelo estado da cromatina, ou seja, padrões de
metilação e acetilação das histonas, sendo que muitos são transcritos a partir de
promotores com poucas ilhas CpG e promotores bidirecionais, cujo início da
transcrição se dá a menos de 1000 bases do sítio de início da transcrição de um
gene codificador (WU et al., 2014).
1.11 Função dos RNAs longos não codificadores
Os lncRNAs consistem em uma classe altamente heterogênea de RNAs,
têm papel crucial no controle da expressão gênica e seu número (diversidade)
aumenta acompanhando o nível de complexidade dos organismos (FATICA;
BOZZONI, 2014). Tem sido associados com diversos processos celulares como
a pluripotência, resposta imune e regulação do ciclo celular (GUTTMAN et al.,
2009; HU et al., 2011; HUARTE et al., 2010; LOEWER et al., 2010).
Podem atuar de diversas maneiras na célula. Existem aqueles que podem
mediar modificações epigenéticas por recrutar e guiar remodeladores da
cromatina a determinados loci gênicos, definindo assim os domínios de
metilação diferencial de histonas e interferindo na acessibilidade da RNA Pol II a
estes loci (FATICA; BOZZONI, 2014; MERCER; DINGER; MATTICK, 2009).
Sabe-se que o imprinting genômico também é um fenômeno controlado
por lncRNAs, sendo que um complexo remodelador da cromatina pode ser
convocado para silenciar um dos cromossomos X na espécie humana, ou ainda,
proporcionar a origem a um pequeno RNA interferente na célula, no momento de
seu processamento (OGAWA; SUN; LEE, 2008; ZHAO et al., 2008).
Alguns servem de “iscas moleculares” a proteínas ligadoras de RNA que
atuam como repressores transcricionais e agem como mediadores de sua ação
em promotores gênicos, causando a repressão de determinados genes (WANG
38
et al., 2008). Podem, ainda, se ligar do DNA, em regiões promotoras, formando
uma tripla hélice, o que impede a ligação de co-fatores transcricionais nestes
sítios (MARTIANOV et al., 2007; VANCE; PONTING, 2014).
Eles não são, no entanto, somente repressores da transcrição, pois
podem atuar como enhancers, sendo neste caso, co-ativadores da transcrição
(FENG, 2006; VANCE; PONTING, 2014).
lncRNAs podem também podem afetar a transcrição de modo mais global
por interagir com componentes básicos da maquinaria de transcrição da qual
depende a RNA Pol II. Neste caso são transcritos pela RNA polimerase III (RNA
realizada a busca e posicionamento ao longo do genoma dos genes
codificadores mais próximos aos lncRNAs (somente daqueles diferencialmente
expressos e modulados por Aire) (Figura 16 e Tabela 2).
5.18 Análise do potencial codificador dos RNA longos não codificadores
A análise do potencial codificador dos lncRNAs diferencialmente
expressos foi realizada através de dois softwares (Tabela 3) que utilizam
abordagens diferentes. Como controle e comparação foram utilizados além dos
lncRNAs, 50 genes codificadores randomicamente escolhidos e cujas
sequências dos respectivos mRNAs foram obtidas no UCSC Genome Browser.
Os resultados obtidos por cada software foram comparados e são mostrados na
forma de Diagrama de Venn (Figura 17).
5.18.1 Análise do potencial codificador dos RNAs longos não codificadores
por Coding-Potential Assesment Tool (CPAT)
Utilizamos a ferramenta Coding-Potential Assesment Toll (CPAT)
(disponível em: code.google.com/p/cpat/) que permite a detecção do potencial
codificador de transcritos por meio de uma técnica livre de alinhamentos. Este
software utiliza um modelo de regressão logística baseado em quatro
características: 1) O tamanho da Open Reading Frame (ORF, ou matriz aberta
de leitura), uma vez que ORFs longas dificilmente são observadas em
sequências não codificadoras; 2) A cobertura da ORF, isto é, a razão entre os
comprimentos da ORF e do transcrito; 3) O Fickett TESTCODE score, que
reflete o efeito combinatório possível da composição de nucleotídeos e a
tendenciosidade ao uso de determinado códon; e por fim o 4) hexâmero score,
que determina o grau relativo de viés no uso de um hexâmero em determinada
sequência (WANG et al., 2013a).
Cada uma dessas características são mostradas ao final da análise, e
resultam em um score que indica a probabilidade de codificação daquela
sequência. Os valores desse score variam de 0 a 1. Valores próximos a 0
61
indicam menor potencial codificador, sendo que à medida que se aproximam de
1 indicam maior potencial codificador. O cutoff, portanto, fica em 0.5 (WANG et
al., 2013a).
A vantagem desta técnica consiste na independência de alinhamentos,
uma vez os RNAs longos não codificadores não são, em sua maioria,
conservados entre as espécies(WANG et al., 2013a).
5.18.2 Análise do potencial codificador pelo software Coding Potential
Calculator (CPC)
A análise do potencial codificador de um transcrito realizada pelo software
CPC (disponível em: cpc.cbi.pku.edu.cn/) se baseia em dois conceitos: 1) ORFs
– seu tamanho, sua qualidade, sua cobertura e sua integridade (se ela começa
com um códon de início e termina com um stop códon). 2) Alinhamento do tipo
BLASTX, ou seja, é realizada a “tradução” do lncRNA o e o resultado é
comparado com os dados dos bancos de dados de proteínas. Dessa forma,
transcritos não codificadores tendem a ter ORFs menores, com baixa cobertura
e integridade, além de não alinhar com proteínas. Em caso de alinhamento com
sequencias codificadoras de proteínas, pode se dispersar por qualquer uma das
três frames. Cada uma dessas classes fornece um score, que são incorporados
por uma máquina de vetores de suporte (SVM – support vector machine), um
classificador linear binário não probabilístico, que fornece um score final.
Escores negativos indicam transcritos não codificadores e positivos indicam os
codificadores. O SVM padrão toma como entrada um conjunto de dados e
prediz, para cada entrada dada, qual de duas possíveis classes a entrada faz
parte (KONG et al., 2007).
5.19 Avaliação da presença da cauda poli A
A presença da cauda poli A foi realizada avalindo-se as sequências
obtidas através do UCSC Genome Browser após identificação das mesmas.
62
Resultados
63
6. RESULTADOS
6.1 Silenciamento de Aire na linhagem mTEC 3.10
Visando avaliar o nível de sileciamento do gene Aire em células mTECs
transfectadas in vitro com RNA interferente anti-Aire após período de 24 horas
da transfecção, nós avaliamos a expressão relativa deste gene por qRT-PCR. O
histograma (Figura 9) demonstra que a transfecção com RNA interferente foi
eficaz em diminuir os níveis transcricionais de Aire, promovendo o silenciamento
parcial (70%) deste gene.
Figura 9 Histograma mostrando a expressão transcricional relativa do gene Aire determinada por
qRT-PCR em células mTEC 3.10 controles (Ctrl) ou transfectadas com RNA interferente siRNA anti-Aire (Aire-siRNA). Teste t de Student *p ≤ 0,0193.
6.2 Western Blot da proteína AIRE
Com o objetivo de verificar o efeito do silenciamento de Aire a nível
proteico foi realizado o western blot das proteínas totais das amostras controles
e tratadas com RNAi anti-Aire, após 24 horas da transfecção. Pode-se observar
que o silenciamento de Aire foi capaz de promover uma redução nos níveis da
proteína AIRE nas células mTECs 3.10. (Figura 10).
64
Figura 10 Westen blot da proteína AIRE em células mTECs 3.10 controles (Ctrl) e transfectadas
com RNA interferente siRNA anti-Aire (Aire-siRNA). (a) membrana de nitrocelulose. (b)
histograma da intensidade das bandas convertidas em valores numéricos, teste t de Student *p ≤
0,0215. Dados representativos de três experimentos .
6.3 Normalização dos dados de microarray
O primeiro passo no tratamento dos dados obtidos nas as hibridizações
com os microarrays foi a retirada dos controles positivos e negativos existentes
nas lâminas e a correção do backgroud, além da conversão dos dados
numéricos em escala logaritmica.
Depois dessa etapa procedemos a normalização dos dados, com o intuito
de remover aqueles valores oriundos de variações não biológicas que poderiam
afetar as medições dos níveis de expressão gênica entre as condições
experimentais. Os métodos de normalização visam compensar as variações
técnicas sistemáticas entre as lâminas de microarrays afim de aprimorar a
análise das diferenças biológicas entre as amostras. A normalização utilizada foi
a do tipo quantile a qual tornou as amostras comparáveis, reduzindo ao máximo
os artefatos experimentais (BOLSTAD et al., 2003). O resultado da normalização
pode ser visto na Figura 11, por meio do gráfico boxplot, onde cada um dos
boxes representa uma amostra. É possível observar que todos possuem o
mesmo comprimento e estão dispostos de maneira uniforme, indicando que os
valores foram normalizados.
a b
Ctrl Aire-siRNA
65
Figura 11 Gráfico boxplot das amostras controle (em verde) e tratadas com siRNA-anti Aire (em
rosa) após a normalização pelo método quantile.
6.4 Correlação de Pearson
A primeira abordagem utilizada após a normalização dos dados foi a
comparação do padrão de expressão global entre as células controle e Aire
silenciadas dos dois tipos de transcritos cujas sondas estavam presentes nos
microarrays (mRNA e lncRNAs). Para tanto, utilizou-se a coeficiente de
correlação de Pearson como medida da correlação entre a expressão gênica de
ambas as condições e o agrupamento hierárquico dos dados de expressão pré-
processados, para melhor visualização do resultado (Figura 12).
No agrupamento hierárquico resultante da aplicação do coeficiente de
correlação de Pearson é possível observar, segundo a escala de cor e seu
respectivo valor numérico, que houve baixa correlação entre as amostras
controle e silenciadas para o gene Aire, indicando baixa similaridade entre elas.
O dendrograma, que apresenta a relação hierárquica entre as amostras, também
permite notar a distinção entre os dois grupos (Figura 12).
66
Figura 12 Agrupamento hierárquico da expressão transcricional global de mRNAs e de lncRNAs
resultante da aplicação do coeficiente de correlação de Pearson. Neste tipo de análise foram comparadas as expressões transcricionais de células mTEC 3.10 (controle) com as de células mTEC 3.10 Aire silenciadas (Aire si-RNA).
6.5 Transcritos diferencialmente expressos após silenciamento de Aire em
células mTEC 3.10
Após normalização e análise da similaridade transcricional entre as
amostras procedeu-se com a análise estatística dos perfis transcricionais nas
duas condições (mTECs controle e mTEC 3.10 Aire silenciadas) através da
definição da expressão gênica diferencial por meio dos recursos de modelagem
linear do pacote limma.
Foram identificados 480 transcritos modulados após o silenciamento de
Aire, dentre os quais 65 são lncRNAs. Para isto, utilizamos como cuttoff um valor
de p ajustado ≤ 0.05 (Benjamini-Hochberg FDR) e fold change ≥ 1.5, conforme
mostrado nos heat map da Figura 13. Pode-se observar a diferença
transcricional entre as duas condições.
67
Figura 13 Heat map dos transcritos modulados (mRNAs e lncRNAs) comparando as amostras de mTEC3.10 controle (CTL) versus mTEC3.10 Aire silenciadas (siAIRE) (fold change ≥. 1.5, p value ≤ 0.05).
68
6.6 LncRNAs diferencialmente expressos após silenciamento de Aire em
células mTEC 3.10
O heat map e agrupamento hierárquico não supervisionado dos lncRNAs
diferencialmente expressos após silenciamento de Aire em células mTEC 3.10 é
mostrado na Figura 14. Este tipo de análise permitiu a identificação dos lncRNAs
modulados, ou seja, aqueles induzidos e os reprimidos indicando o papel
modulador de Aire sobre esta espécie de RNAs. Dentre os lncRNAs
significativamente modulados por Aire, a maioria teve sua expressão aumentada
após o silenciamento de Aire.
Figura 14 Heat map dos lncRNAs modulados por Aire comparando as amostras de mTEC 3.10
controle (CTL) versus mTEC3.10 Aire silenciadas (siAIRE) (fold change ≥. 1.5, p value ≤ 0.05).
69
6.7 Caracterização dos lncRNAs modulados por Aire
6.7.1 Classificação dos lncRNAs
Os lncRNAs modulados por Aire também foram distribuídos segundo seus
tipos (lincRNAs, intronicos, sense RNAs ou antisense RNAs) (HARROW et al.,
2012; MA; BAJIC; ZHANG, 2013) (Figura 15), segundo suas posições
genômicas em relação aos genes codificadores de proteína mais próximos.
O primeiro passo para realizar essa distribuição foi a identificação das
sequências dos lncRNAs utilizando o UCSC Genome Browser A busca foi
baseada no identificador (ID) de cada lncRNA presente nos microarrays
fornecido pela Agilent. Para alguns lncRNAs esse ID correspondia a designação
da própria posição genômica dos mesmos e para aqueles já anotados já havia a
atribuição de um “símbolo”. A maioria dos lncRNAs foi do tipo intergênica e os
outros do tipo sense ou antisense. Alguns não puderam ser classificados por
serem expressed sequence tags (ESTs) ou por ainda não terem sido anotados.
Figura 15 Distribuição dos lncRNAs modulados por Aire segundo o tipo.
70
6.7.2 Localização cromossômica dos lncRNAs modulados por Aire
Os 56 lncRNAs modulados por Aire apresentaram ampla distribuição
genômica, pois dos 19 cromossomos do camundongo 16 abrigam genes que
codificam esses RNAs. Os únicos cromossomos que, segundo nossas análises,
não abrigam genes de lncRNAs modulados são o 7, 11 e 14.
A localização cromossômica e a respectiva modulação dos lncRNAs
modulados está disponível na Tabela 1.
Tabela 1 Localização cromossômica dos lncRNAs modulados por Aire em células mTEC 3.10 e sua respectiva modulação, em log de fold change.
Mas estudos posteriores ainda são necessários para elucidar efeito
repressor de Aire sobre a maioria dos lncRNAs em células mTECs e a
consequência disto sobre a PGE e seu significado sobre a seleção negativa e a
indução da tolerância central.
De qualquer forma, os resultados obtidos neste trabalho evidenciaram, pela
primeira vez, a ação moduladora de Aire sobre a expressão de lncRNAs em
células mTECs além de promover o primeiro relato da expressão desta espécie
de RNAs nestas células, lembrando que eles são altamente tecido específicos e
foram pouco explorados no timo.
87
Conclusões
88
8. CONCLUSÕES
Este é o primeiro relato sobre a expressão de lncRNAs em células mTECs
de camundongos Mus musculus.
Neste trabalho foi possível colher evidências que Aire pode exercer efeito
modulador sobre a expressão de lncRNAs em células mTEC.
A maioria dos lncRNAs modulados por Aire têm disposição genômica do
tipo intergênica, não apresentaram cauda poli A e se localizaram a até 10kb do
gene codificador mais próximo.
89
Referências bibliográficas
90
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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