UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA A SAÚDE MARIANA MARTINELLI JUNQUEIRA RIBEIRO ESTUDOS QUÍMICOS E BIOLÓGICOS DE Clusia grandiflora Splitg. (Clusiaceae). NITERÓI, RJ 2016
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MARIANA MARTINELLI JUNQUEIRA RIBEIRO · Pedro Ramos, Thaíz Mattos, Juliana Araújo, Ana Amélia Ribeiro, Esthefanie Ribeiro, Rafaela Bahia, Amanda Cecília, Ana Carolina Cavalini,
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A
PRODUTOS PARA A SAÚDE
MARIANA MARTINELLI JUNQUEIRA RIBEIRO
ESTUDOS QUÍMICOS E BIOLÓGICOS DE Clusia grandiflora Splitg.
(Clusiaceae).
NITERÓI, RJ
2016
MARIANA MARTINELLI JUNQUEIRA RIBEIRO
ESTUDOS QUÍMICOS E BIOLÓGICOS DE Clusia grandiflora Splitg.
(Clusiaceae).
Dissertação apresentada ao Curso
de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a
Produtos para Saúde da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal
Fluminense, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre.
Campo de Confluência: Pesquisa e
Desenvolvimento de Produtos para a Saúde.
Orientação:
PROFª DRª SELMA RIBEIRO DE PAIVA
PROFª DRª ALESSANDRA LEDA VALVERDE
Niterói, RJ
2016
R 484 Ribeiro, Mariana Martinelli Junqueira.
Estudos químicos e biológicos de Clusia grandiflora Splitg. / Mariana
Martinelli Junqueira Ribeiro; Orientadora: Selma Ribeiro de Paiva;
Primeiramente, à Deus, por ter concedido a força de sempre continuar,
independente do que aconteça.
Às minhas orientadoras, Selma Ribeiro de Paiva e Alessandra Leda Valverde,
pela oportunidade deste trabalho, pela orientação, pela paciência e carinho durante
os anos em que estivemos juntas.
A todos alunos que estão ou passaram pelo Laboratório de Botânica
Funcional e Estrutural e Laboratório de Produtos Naturais Marinhos. Principalmente,
à Maria Carolina Anholeti e Arthur Macedo por sempre me ajudarem com seus
conhecimentos, as alunas, Tatiana Godoi, Luana Sodré e Fernanda Moreira pela
ajuda cotidiana no laboratório e a Karen Dutra pela ajuda e amizade.
À professora Adriana Lobão pela identificação da espécie. E à professora Ana
Joffily por sempre me ajudar durante esses anos.
Ao Jardim Botânico do Rio de Janeiro, principalmente à Profª Drª Claudia
Barros e a aluna Karla Marins, e à Plataforma de Metodologia Analítica de
Farmanguinhos - Fiocruz pelo suporte na pesquisa.
Ao Laboratório de Produtos Naturais (PN3) em Farmanguinhos-Fiocruz,
principalmente ao funcionário Alan Heringer, e ao Laboratório de RMN da UFF pelas
análises realizadas.
Ao Laboratório de Citogenética Humana do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Pará, principalmente Profª. Drª. Raquel Carvalho
Montenegro e a aluna Laine Celestino, ao Laboratório de Antibióticos, Bioquímica,
Ensino e Modelagem Molecular do Instituto de Biologia da Universidade Federal
Fluminense, principalmente a Profª. Drª. Helena Carla Castro e a aluna Louise
Azulay Palavecino, que se dispôs sempre para as análises, e ao Laboratório de
II
Metabolismo de Parasitos do Instituto de Biologia da Universidade Federal
Fluminense, principalmente a Profª. Drª. Evelize Folly das Chagas, pela colaboração
para realização das atividades biológicas.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para
Saúde pela oportunidade de continuar meus estudos.
À Fundação Comissão de Aperfeiçoamento de Pessoal do Nível Superior pelo
fomento concedido.
Aos demais professores e alunos, que estão ou já passaram, pelo Setor de
Botânica pela convivência durante esses quase 7 anos.
Aos meus colegas da pós-graduação pelos dias de estudos e conversas
durante esses dois anos, principalmente a Glauce Duarte a Aline Fleck.
A todos os amigos que fiz na graduação, principalmente aqueles que
permanecem com o convívio diário, Lucas Fajardo, Mariana Dupim, Thamires Conti,
Pedro Ramos, Thaíz Mattos, Juliana Araújo, Ana Amélia Ribeiro, Esthefanie Ribeiro,
Rafaela Bahia, Amanda Cecília, Ana Carolina Cavalini, João Paladino, Renato
Pereira, Júlia Hauaji, Luciana Cardoso e Raísa Reis.
Aos meus pais, Luciene Pereira e Marcos Martinelli, meus avós, Paulo Ferraz,
Tereza Mota e Aldaíza Ribeiro, ao meu tio Carlos Ribeiro e demais familiares que
sempre acreditaram e incentivaram meus estudos.
Ao meu namorado Vitor Balestro, não só por entender meus estudos, mas por
sempre me incentivar a continuar, por me ensinar tantas outras coisas e me
proporcionar muita felicidade. E sua família, pois foi onde sempre encontrei um “vai
dar tudo certo”.
III
Aos demais amigos, que entenderam e conviveram com meus estudos,
Mariah Conti, Aline Mota, Ana Paula Carneiro, Daniele Lima, Nathália Jardim, Maísa
Cavalcanti, Gercia Maria, Rubia Monteiro e a todos os outros.
E a todos que direta ou indiretamente fizeram parte de tudo isso.
IV
“ Por isso, os frutos servirão
de alimento e as folhas de remédio. ”
(Ezequiel 47:12).
V
RESUMO
Clusia grandiflora Splitg. é uma espécie distribuída, principalmente, na floresta Amazônica. Pertence à família Clusiaceae Lindl., que merece destaque pela sua representatividade e potencial biológico. Há poucos trabalhos com C. grandiflora, apresentando, assim, grande relevância seu estudo para sua melhor caracterização morfológica, química e biológica. Partes vegetativas e reprodutivas de C. grandiflora foram coletadas no bairro Jardim Botânico, Rio de Janeiro, RJ. Folhas e ramos foram caracterizados morfologicamente por técnicas tradicionais em anatomia vegetal. A folha apresentou epiderme unisseriada, presença de hipoderme, estômatos restritos à face abaxial e cilindro vascular com feixes acessórios, que também foram identificados no pecíolo. O ramo apresentou tecidos primários ainda instalados, assim como início de crescimento secundário. Os testes histoquímicos localizaram substâncias fenólicas, amido e lipídeos. O material coletado foi processado e, posteriormente, submetido à extração por maceração estática com hexano, seguido de etanol. Os extratos brutos obtidos tiveram seus perfis analisados por CCD, CLAE-DAD e RMN de H1, tendo sido identificados principalmente substâncias fenólicas simples, flavonoides, benzofenonas e terpenos. O perfil dos extratos brutos hexânicos também foram analisados por CG/EM e observaram a presença de hidrocarbonetos alifáticos, triterpenos e esteroides. Os extratos brutos etanólicos foram avaliados quanto a atividade antioxidante e o extrato bruto das raízes adventícias apresentou o melhor CE50 (1,8±0,4 g extrato/g DPPH) com menor concentração de DPPH remanescente nas concentrações de 125 e 250 µg/mL (aproximadamente 5 % em ambas). A análise do doseamento de flavonoides totais nos extratos brutos etanólicos indicou maior presença de flavonas e flavonóis no extrato bruto das flores (1,6 ± 0,0 %). Os extratos brutos foram avaliados quanto a citotoxidade e tiveram resultados promissores para o extrato etanólico dos ramos e folhas. Os extratos também foram avaliados quanto atividade antimicrobiana, sendo os extratos etanólicos dos ramos, folhas e raízes adventícias os mais ativos. Foi feita a atividade acaricida para os extratos brutos hexânicos e o melhor resultado foi para o extrato dos ramos. O extrato bruto etanólico dos ramos foi fracionado por CLV, e submetidos a testes de atividade antimicrobiana, com o melhor resultado para fração em diclorometano. Esta fração foi, então, novamente fracionada por cromatografia em coluna com sílica gel, resultando em frações enriquecidas com 3-oxo-friedelina. Esta foi testada quanto a atividade antimicrobiana e o resultado indicou que esta atividade não está relacionada a 3-oxo-friedelina ou que esta não age sozinha.
Clusia grandiflora is a distribuited species mainly in the Amazon forest. Belongs to the family Clusiaceae Lindl., which worth mentioning for its representativeness and biological potential. There are few studies with C. grandiflora, and thus its study shows relevant for best morphological, chemical and biological description. Vegetative and reproductive parts of C. grandiflora were collected in the Botanical Garden neighborhood, Rio de Janeiro, RJ. Leaves and stems were morphologically characterized by traditional techniques in plant anatomy. The leaves presented uniseriate epidermis, presence of hypodermis, stomata restricted to abaxial face and vascular cylinder with accessory bundles, which were also identified in the petiole. The stems presented primary tissues already installed and early secondary growth. The histochemical tests located phenolic substances, starch and lipids. The collected material processed and after subjected to static maceration by extraction with hexane, followed by ethanol. The obtained extracts had their profiles analyzed by TLC, HPLC-DAD and 1H-NMR, being mainly identified simple phenolic substances, flavonoids, benzophenone and terpenes. The profile of the hexane crude extracts were also analyzed by GC/MS and presence of aliphatic hydrocarbons, triterpenes and steroids were observed. The ethanol crude extracts were evaluated for antioxidant activity and the adventitious roots crude extract showed the best EC50 (1,8 ± 0,4 g extract / g DPPH) with lower concentrations of remaining DPPH at concentrations of 125 and 250 mg/mL (approximately 5 % in both). The analysis of total flavonoids content in ethanol crude extracts showed greater presence of flavones and flavonols in the flowers crude extract (1.6 ± 0.0 %). The extracts were evaluated for cytotoxicity and had promising results for the stems and leaves ethanol extract. The extracts were also evaluated for antimicrobial activity and the stems, leaves and adventitious roots ethanol extracts the most active. It was made acaricide activity for hexane extracts and the best result was for the stems extract. The stems crude ethanol extract was fractionated by CLV and subjected to antimicrobial activity test, with the best result for dichloromethane fraction. This fraction was again fractionated by column chromatography with silica gel, resulting in fractions enriched with 3-oxo-friedelin. This was tested for antimicrobial activity and the results indicated that this activity is not related to 3-oxo-friedelin or that it does not act alone. Keywords: Clusiaceae Lindl, Clusia grandiflora Splitg, chromatography, terpenes,
A histoquímica tem como objectivo localizar in situ, os principais grupos
químicos que ocorrem nos tecidos. Os testes histoquímicos são aplicados em
estudos de caracterização de plantas que apresentem metabólitos primários e/ou
secundários. Além destes estudos, os testes podem ser incorporados em futuro
controle de qualidade (LEITE, 2009).
Para identificar a possível presença de determinadas classes de substâncias
na folha e ramo de C. grandiflora, essas partes vegetativas foram submetidos à
diferentes reagentes.
Os alcalóides podem se acumular em células epidérmicas e a reação positiva
para o reagente de Wagner se deu devido a precipitação do metabólito em presença
de halogênios, corando em vermelho a castanho-avermelhado (Figura 12A)
(FIGUEIREDO et al., 2007). Em C. grandiflora a presença da substância se deu na
epiderme e no feixe vascular de toda lâmina foliar e no pecíolo, porém não foram
encontrados na literatura tal metabólito secundário para o gênero.
A presença de carboidratos, metabólito primário essencial para sobrevivência
da planta, se deu devido a presença de dois tipos de polissacarídeos, o estrutural
(celulose) e de reserva (amido) (FIGUEIREDO et al., 2007). Para detecção de amido
foi utilizado o lugol, ao qual é constituído por iodeto de potássio que se acumula na
molécula de amido gerando coloração marrom, roxo ou negro (Figura 12B)
(FIGUEIREDO et al., 2007). Este metabólito foi encontrado em todas as partes da
folha, pecíolo e ramo, principalmente no parênquima cortical e medular do pecíolo e
da nervura principal, próximo ao cilindro vascular; no parênquima lacunoso da região
intercostal e parênquima cortical do ramo. Essa substância que está bastante
presente na espécie (ESAU, 1974). Para detecção de celulose foi utilizado o
calcoflúor, um fluoróforo que quando irradiado com luz UV o complexo formado
fluoresce intensamente de azul (FIGUEIREDO et al., 2007), sua presença foi
sugerida apenas na epiderme do mesofilo (FIGURA 12C).
Substâncias lipídicas e seus derivados são corados por um processo
puramente físico, isto é, afinidade do reagente pelo metabólito primário
(FIGUEIREDO et al., 2007). Para tal detecção foram utilizados sudan III, sudan IV e
auramina. Os sudans coraram em alaranjado (Figura 12D e 12E) (FIGUEIREDO et
al., 2007) e, em C. gradiflora, foram evidenciados, principalmente, nas cutículas
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presente em toda lâmina foliar e ramo e em idioblastos presentes nos parênquimas
corticais e medulares da nervura principal, no parênquima cortical do pecíolo, no
parênquima fundamental do bordo e no parênquima cortical do ramo. Já o fluoróforo
auramina quando irradiado com luz UV o complexo formado fluoresce em
esverdeado (Figura 12F) e, em C. gradiflora foi onservado, principalmente, na
cutícula presente em toda lâmina foliar.
Substâncias fenólicas foram detectadas pela reação com cloreto férrico que
se complexaram formando precipitados cuja coloração puderam variar do verde
intenso, púrpura, azul a negro (Figura 12G) (FIGUEIREDO et al., 2007). Este tipo de
substância está amplamente distribuído no reino vegetal e compreende cumarinas,
xantonas, flavonoides, entre outras (CARVALHO et al., 1999), sendo muitas delas
encontradas em Clusiaceae e Clusia. Em C. gradiflora foram encontrados no
parênquima paliçádico da região intercostal, no parênquima fundamental do bordo,
sistema vascular do pecíolo e a região cortical do ramo.
Uma das classes de subtâncias fenólicas são os taninos. Para detecção
dessas substâncias utilizou-se vanilina clorídrica que formam um produto de
condensação resultante da reação dos grupos aldeídicos da vanilina com os fenóis,
resultando em uma coloração vermelho alaranjado (Figura 12H) (FIGUEIREDO et
al., 2007). Em C. gradiflora foram idenficados em tecidos parenquimáticos da
nervura principal e epiderme do ramo. Esta classe de substância tem atuação na
defesa contra insetos, fungos e bactérias (SANTOS & MELLO, 1999) e já foram
descritos por Fernandes (2007) em Clusia criuva.
Por fim, para detecção de outra classe de substâncias fenólicas, foi utilizado
cloreto de alumínio que se complexa com flavonóides (flavonas) com grupos
hidroxilo livres em 3' ou 5', corando em amarelo sob luz UV (Figura 12I).
(FIGUEIREDO et al., 2007). Em C. grandiflora, esta metodologia não foi a mais
promissora, sendo detectado com pouca clareza apenas no sistema vascular do
pecíolo, porém, já foram identificados flavonoides em espécies de Clusia.
A Tabela 5 evidencia as classes químicas encontradas em diferentes partes
da planta.
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Figura 12. Testes histoquímicos da lâmina foliar e ramos de C. grandiflora. A)
Epiderme e feixe vascular corados com ragente de Wagner no bordo foliar sugerindo
presença de alcaloides. B) Parênquima medular da nervura principal, próximo ao
cilindro vascular, corado com lugol (seta) indicando a presença de amido. C)
Mesofilo envidenciando a presença de celulose na epiderme corado com calcofluor.
D) Cutícula do pecíolo corada com Sudam IV indicando a presença de lipídios. E)
Idioblastos no parênquima cortical do ramo corado com Sudam III indicando a
presença de liídeos F) Bordo foliar evidenciando a presença de lipídeos quando
corados com auramina. G) Parênquima paliçádico da região intercostal corado com
cloreto férrico, evidencia a presença de substâncias fenólicas, comum ao gênero. H)
Idioblasto presentes na nervura corado com vanilina clorídrica evidenciando a
presença de taninos, já descrito em outras espécies de Clusia. I) Possível resultado
positivo para flavonoides, classe descrita em outras espécies de Clusia, devido a
coloração amarelada quando em presença de cloreto de alumínio nas células
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presente no pecíolo. ep: epiderme, cu: cutícula, fv: feixe vascular, pf: parênquima
fundamental, pp: parênquima paliçádico.
Tabela 5. Localização das classes químicas detectadas na lâmina foliar e no ramo
de C. grandiflora utilizando teste histoquímico.
Classe
química
Reagente Pecíolo Bordo Mesofilo Nervura Ramo
Substâncias
lipofílicas
Sudam III + + + + +
Sudam IV + + + + +
Auramina + + + + n
Flavonoides Cloreto de
alumínio
+ - - - -
Alcaloides Reagente de
Wagner
+ + + + -
Taninos Vanilina
Clorídrica
- - - + +
Substâncias
fenólicas
Cloreto
férrico
+ + + - +
Carboidratos:
Amido
Calulose
Lugol
+
+
+
+
+
Calcofluor - - + - n
Legenda: + presença, - ausência, n: não realizado teste para parte vegetatitva
5.3. Processamento e extração do material botânico
As raízes adventícias, os ramos, as folhas e as flores de C. grandiflora foram
coletadas, adequadamente processadas e submetidas à extração sucessivas com
hexano e etanol. A Tabela 6 apresenta os rendimentos extrativos obtidos.
Tabela 6. Rendimentos extrativos obtidos de C. grandiflora.
Parte da
planta
Peso
seco (g)
Solvente (mL) Peso do
extrato (g)
Rendimento
(%)
Código
Flores 31,60 Hexano (100) 0,41 1,30 CGFH
40
Etanol (100) 2,49 7,88 CGFEt
Raízes
adventícias
45,58 Hexano (100) 1,34 2,93 CGRAH
Etanol (100) 2,16 4,74 CGRAEt
Ramos 887,10 Hexano (1000) 7,41 0,84 CGRH
Etanol (1000) 26,69 3,00 CGREt
Folhas 1126,95 Hexano (1500) 25,15 2,23 CGFoH
Etanol (1500) 51,28 4,55 CGFoEt
Os melhores rendimentos foram obtidos nas partes vegetativas e reprodutivas
extraídos com etanol, tendo o extrato etanólico das flores (CGFEt) o melhor
rendimento, 7,88%.
5.4. Atividade antioxidante
Nas últimas décadas vem sendo observado um aumento importante no
conhecimento acerca de substâncias antioxidantes, particularmente aquelas
capazes de prevenir efeitos deletérios dos radicais livres no corpo humano e
prevenir a deterioração de alimentos. Nos dois casos, há uma preferência por
antioxidantes de origem natural àqueles oriundos de fontes sintéticas, já que estes
últimos são bastante voláteis e decompõem-se facilmente em temperaturas
elevadas, além de apresentarem problemas relacionados à toxidez (ABDALLA,
1999).
Para determinar o potencial antioxidante da espécie, os extratos foram
avaliados quanto a sua capacidade de sequestro radical livre DPPH (2,2-difenil-1-
picrilhidrazila), um método colorimétrico que, apesar de não representar condições
semelhantes aos processos que ocorrem in vivo, representa uma forma rápida e
simples para caracterizar a presença de substâncias com propriedades
antioxidantes em extratos vegetais brutos, afim de que estes se tornem alvo de
ensaios bioguiados com a finalidade de isolamento de tais substâncias (SILVA &
PAIVA, 2012).
O DPPH é um radical livre estável que, em solução, apresenta coloração
violeta, e quando inserido em um meio onde existem substâncias com propriedades
antioxidantes é reduzido, refletindo em uma mudança na sua coloração, que passa a
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amarelo, com consequente diminuição da absorvância na faixa de 518 nm,
absorvância máxima da cor violeta (Figura 13) (DA SILVA, 2015).
Figura 13. Estrutura do DPPH antes e depois da reação com um agente
antioxidante (A-H) (RUFINO et al., 2009).
Inicialmente, a curva analítica do DPPH e dos padrões BHT e rutina foram
obtidas por regressão linear e resultaram em um bom coeficiente angular (r2 > 0,90).
As curvas para avaliação da atividade dos extratos foram obtidas por regressão
linear dos ensaios e mostraram um bom coeficiente de determinação (r2 > 0,80). A
Tabela 7 mostra os valores de CE50, concentração de extrato necessária para reduzir
em 50% a concentração inicial de DPPH, encontrados. O tratamento estatístico dos
dados realizados por ANOVA não mostrou diferença significativa entre os três
ensaios independentes para mesma amostra (p ≥ 0,05), exceto para o extrato bruto
dos ramos (p = 0.0139).
Tabela 7. Valores do CE50 dos padrões e dos extratos etanólicos de C. grandiflora.
Padrões/ Código das amostras CE50 (g amostra/g DPPH)
Rutina 0,58±0,03
BHT 0,75±0,12a
Raízes Adventícias 1,79±0,36a
Folhas 2,49±0,25b
Flores 2,64±0,52b
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Ramos 3,46±0,30c
Legenda: a sem diferença significativa entre as amostras por Tukey-Kramer b um dos ensaios independente foi feito em duplicata c diferença significativa entre os três ensaios independentes por ANOVA
A avaliação do grau de significância das diferenças entre os valores de CE50
obtidos para cada extrato também foi efetuada por ANOVA, que considerou a
diferença significativa. Como o resultado da análise de variância levou à rejeição da
hipótese nula, ou seja, a afirmação de que todos os valores de CE50 são iguais, foi
realizado testes de comparações múltiplas que permitem identificar essas
diferenças. Para esta análise, foi escolhido o teste de Tukey-Kramer, que compara
contrastes de variância e discrimina de forma mais clara as comparações, dando
maior embasamento estatístico às análises (DA SILVA, 2015).
A Tabela 7 mostra que todos os extratos apresentaram valores de CE50
maiores que o encontrado para os padrões. No entanto, o teste de estatístico de
Tukey-Kramer sugere que há diferença significativa entre os valores de CE50 dos
padrões e dos extratos analisados, exceto quando o BHT é comparado com o
extrato das raízes adventícias.
Os extratos quando comparados aos padrões apresentaram maior CE50,
entretanto, cabe lembrar que tratam-se de extratos brutos constituídos de diversas
substâncias em menores quantidades, enquanto os padrões são substâncias puras
(SILVA & PAIVA, 2012).
Os extratos etanólicos brutos apresentam desde substâncias ligeiramente
apolares até polares, como as substâncias fenólicas. Essas substâncias podem ser
encontradas em todas as partes da planta e estão disponíveis como ácidos
fenólicos, flavonoides, lignanas, estilbenos, cumarinas e taninos (POMPILHO et al.,
2014). Os baixos valores de CE50 dos extratos analisados podem estar relacionados
com a presença dessas substâncias, tendo o extrato das raízes adventícias o menor
valor de CE50 (1,79±0,36 g amostra/ g DPPH), conferindo-lhe melhor atividade e
maior proximidade com o padrão BHT, enquanto o extrato dos ramos apresentou o
maior CE50 (3,46±0,30 g amostra/ g DPPH).
O valor de CE50 isolado nem sempre é o melhor parâmetro para avaliar a
atividade antioxidante de uma amostra, pois não leva em consideração o fato de que
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a amostra em questão pode apresentar perfis reacionais diferentes em
concentrações diferentes (DA SILVA, 2015).
Do ponto de vista cinético, os extratos obtiveram, na maior parte das
concentrações analisadas, cinética rápida, ou seja, foi atingido o estado de equilíbrio
em menos de 5 minutos, já nas concentrações de 50 e 125 μg/mL a cinética foi
considerada intermediária, uma vez que o equilíbrio foi atingido no intervalo de 5 a
30 minutos (BRAND-WILLIAMS et al., 1995). A cinética reacional da rutina se
assemelha ao observado com os extratos, porém, a cinética foi intermediária na
concentração de 25 μg/mL. Já o BHT apresentou cinética intermediária em todas
concentrações. As Figuras 14-19 apresentam as cinéticas reacionais observadas
para os extratos e padrões, em cada concentração ao longo de 30 minutos.
Figura 14. Cinética reacional do BHT com DPPH.
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Figura 15. Cinética reacional da rutina com DPPH.
Figura 16. Cinética reacional das raízes adventícias com DPPH.
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Figura 17. Cinética reacional dos ramos com DPPH.
Figura 18. Cinética reacional das folhas com DPPH.
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Figura 19. Cinética reacional das flores com DPPH.
Todos os extratos apresentaram atividade antioxidante máxima após 30
minutos de reação, nas maiores concentrações analisadas, com aproximadamente 5
% de DPPH remanescente, ou seja, com aproximadamente 95 % de atividade, o
mesmo é observado com os padrões. Tal similaridade aos padrões demonstra o
potencial antioxidante de substâncias presentes em C. grandiflora.
Quando comparada com outras espécies do gênero, C. grandiflora
demonstrou melhor atividade para os extratos das folhas, das flores e das raízes
adventícias que os extratos metanólicos e acetônicos das folhas, frutos e caules de
Clusia fluminensis (SILVA & PAIVA, 2012). Comparando o extrato das raízes
adventícias desta espécie com os extratos metanólicos das folhas de Clusia
lanceolata (FERREIRA et al., 2014), C grandiflora apresentou também melhor
atividade.
A atividade antioxidante pode estar relacionada à presença de substâncias
fenólicas, como os flavonoides, como observado nos testes histoquímicos. Esta
classe de metabólitos já foi identificada anteriormente no gênero Clusia, podendo ser
essas substâncias as responsáveis pela atividade na espécie C. grandiflora
(FERREIRA et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2012; BITTAR et al., 2000).
5.5. Doseamento de flavonoides
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Para identificar as possíveis substâncias responsáveis pelo efeito antioxidante
foi feito o doseamento de flavonoides expressos por flavonas e flavonóis. O princípio
desse método consiste na formação de complexos ácidos estáveis entre o cloreto de
alumínio e a carbonila em C-4 e a hidroxila em C-5 do anel A e entre as hidroxilas
em C-3 e C-4 do anel B em flavonóis e flavonas (Figura 20) (CHANG et al., 2002). A
presença de insaturação entre o C-2 e C-3 no anel C de flavonoides fornece um
máximo de absorção do complexo na faixa de 415-440 nm (CHANG et al., 2002).
Figura 20. Esquema da complexação do cloreto de alumínio com flavonoides
(MABRY et al. 1970).
A curva padrão obtida por regressão linear da rutina para a análise da dos
extratos brutos etanólicos resultou em um coeficiente angular r2 > 0,90. O tratamento
estatístico dos dados mostrou que as diferenças entre os três experimentos
independentes realizados para cada extrato não foram estatisticamente significativas
(p ≥ 0,05). Os resultados obtidos no doseamento de flavonoides podem ser
visualizados na Tabela 8.
Tabela 8. Teor de flavonoides, expressos em flavonas e flavonóis, obtidos para os
extratos etanólicos de C. grandiflora.
Código das amostras Teor de flavonoides (%)
Flores 1,57±0,00ª
Ramos 1,56±0,00ª
48
Raízes adventícias 1,56±0,00b
Folhas 1,56±0,00b
Legenda: a, b sem diferença significativa entre os extratos por Tukey-Kramer
A avaliação do grau de significância das diferenças entre os valores do teor
de flavonoides obtidos para cada extrato também foi efetuada por ANOVA que
considerou a diferença significativa. O teste de Tukey-Kramer também sugere essa
diferença, exceto quando comparado o extrato das flores com dos ramos e extrato
das raízes adventícias com das folhas.
Todos os extratos avaliados apresentaram baixos teores de flavonas e
flavonóis quando comparados a dados de outras espécies como, C. fluminensis
(SILVA & PAIVA, 2012) e C. lanceolata (FERREIRA et al., 2014). O maior teor foi
observado na amostra das flores (1,57±0,00%) e o menor valor foi obtido para a
amostra das folhas (1,56±0,00%), sugerindo que o potencial antioxidante pode não
estar relacionado a essas substâncias ou que estas não são as únicas responsáveis,
uma vez que estudos mostram que a formação de complexos do cloreto de alumínio
com flavonoides que não possuem essa insaturação resulta em uma absorvância
muito baixa na faixa de comprimento de onda utilizado (CHANG et al., 2002). Além
disso em Clusia identificou-se maior presença de flavonas e bisflavonoides que de
flavonóis (VIRGINIO, 2015). A presença de outros esqueletos flavonoídicos
diferentes pode justificar a alta atividade antioxidante observada ao lado do baixo
teor de flavonoides expressos como flavonas e flavonóis.
Para se saber se o teor de flavona e flavonol possui ou não correlação com a
atividade antioxidante, foi realizado o teste de Correlação de Pearson. Este teste é
uma ferramenta estatística que fornece um coeficiente definido pela medida de
associação linear entre variáveis. Os valores de Correlação de Pearson podem estar
situados entre -1 e +1, onde o número 1 indicaria uma correlação linear perfeita e o
sinal indicaria se essa correlação é negativa ou positiva, respectivamente (FILHO &
JÚNIOR, 2009). São classificados ainda como relação fraca quando os valores
estão entre 0,10 e 0,29; correlação moderada quando os valores estão entre 0,30 e
0,49 e correlação forte quando os valores estão 0,50 e 1 (COHEN, 1988).
Os resultados obtidos forneceram uma correlação positiva moderada (+0,48)
entre os valores de CE50 dos extratos e o percentual de flavonoides. Isto indica uma
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tendência moderada de que o valor de CE50 aumenta conforme o aumento do teor
de flavonoides. A Figura 21 apresenta os resultados de Correlação de Pearson entre
o percentual de flavonoides e os valores de CE50, o que sugere a participação de
outras substâncias corroborando o efeito observado.
Figura 21. Correlação de Pearson (r2 = 0,2276) entre os valores de CE50 dos
extratos de C. grandiflora e o percentual de flavonoides.
5.6. Atividade citotóxica
Para desenvolvimento de um fármaco a toxidez pode fazer de moléculas
promissoras uma molécula descartada, já que sua segurança é um dos parâmetros
mais importantes (FLINT et al., 2000). O equilíbrio entre o efeito farmacológico e
toxicológico é sempre verificado quando se busca aplicabilidade como agente
terapêutico (MELO et al., 2000). Entretanto, para células neoplásicas o ideal é que o
fármaco seja tóxico apenas para células tumorais e não para as sadias. Por isso, o
estudo da toxidez se faz importante.
Um avanço na pesquisa de produtos naturais no campo da oncologia vem
ocorrendo desde o início do século XX. A maioria dos fármacos antitumoral, 60 %,
tem sua origem nos produtos naturais, dentre eles a vimblastina, vincristina,
Por fim, as frações da CLV foram comparadas com frações enriquecidas das
substâncias 13, 16 e 17 (Figura 50) e indicam a presença de 13 na fração CGREtD
(2) e de 16 na fração CGREtH (1).
Figura 50. CCD das frações obtidas na CLV e frações enriquecidas com as
substâncias 13, 16 e 17 eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético (80:19:1)
91
e revelados em vanilina sulfúrica. 1: fração CGREtH, 2: fração CGREtD, 3: fração
CGREtAc, 4: fração CGREtM, 5: fração CGREtMA, lan: fração enriquecida com a
substância 17, clu: fração enriquecida com a substância 16, fri: fração enriquecida
com a substância 13, setas: substâncias majoritárias.
5.10.1. Atividade antimicrobiana das frações da CLV
As frações obtidas por CLV tiveram o CIM frente às cepas que foram inibidas
no CGREt (P. aeruginosa e. coli) e seus resultados encontram-se na Tabela 14.
Tabela 14. Concentrações mínimas necessárias de cada fração para inibir o
crescimento das cepas P. aeruginosa e E. coli.
Código das amostras P. aeruginosa E. coli
CGREtH >256 μg/mL 128 μg/mL
CGREtD 128 μg/mL 8 μg/mL
CGREtAc >256 μg/mL 8 μg/mL
CGREtM >256 μg/mL >256 μg/mL
CGREtMA >256 μg/mL >256 μg/mL
A fração CGREtD foi a mais eficaz frente ambas às cepas. CGREtH e
CGREtAc obtiveram atividade frente à E. coli, tendo a CGREtAc um bom resultado.
Apesar dos altas CIM, as frações ainda mostraram valores dentro da faixa de
concentração aceita pelo CLSI (512 μg/mL> CIM> 0,25 μg/mL).
5.10.2. Isolamento e purificação de substâncias obtidas em CGREtD e
suas elucidações estruturais
Como a fração CGREtD (1,0573g) obteve o melhor resultado frente à
atividade antimicrobiana e presença de um número maior de substâncias
majoritárias nas CCDs, esta foi separada por cromatografia em coluna com gel de
sílica utilizando eluentes hexano, acetato de etila e metanol, em gradiente de
92
polaridade fornecendo um total de 34 frações que após a análise por CCD foram
reagrupadas em 9 frações.
As frações 3 e 4 exibiram cristais após a evaporação do solvente. Essas
foram, então, recristalizadas utilizando etanol e analisada com as demais frações por
CCD (Figura 51) e reveladas sob a lâmpada de luz UV em 365 nm. As frações de 5
a 9 foram analisadas separadamente em outro eluente (Figura 52).
Figura 51. CCD do extrato bruto etanólico dos ramos, da fração CGCEtD, das
frações 1 a 4 e frações 3 e 4 recristalizadas eluídas em hexano: acetato de etila:
ácido acético (85:14:1) e revelados sob lâmpada de luz UV em 365 nm. B: extrato
bruto etanólico dos ramos; C: fração CGCEtD obtida da CLV; 1 a 4: frações obtidas
da coluna em gel de sílica, 3rec e 4rec: frações obtidas após recristalização.
93
Figura 52. CCD do extrato bruto etanólico dos ramos, da fração CGCEtD e
das frações 5 a 9 eluidos em hexano: acetato de etila: ácido acético (50:49:1) e
revelados sob lâmpada de luz UV em 256 nm. B: extrato bruto etanólico dos ramos;
C: fração CGCEtD obtida da CLV; 5 a 9: frações obtidas da coluna em gel de sílica.
Por fim, as frações da coluna em gel de sílica foram comparadas com frações
enriquecidas das substâncias 13, 16 e 17 e indicam a presença de 13 na fração 3rec
e 4rec (Figura 53A) e da substância 17 nas frações de 5 a 9 (Figura 53B).
Figura 53. CCD das frações 1 a 9, frações recristalizadas e frações
enriquecidas com as substâncias 13, 15 e 16 eluídas em hexano: acetato de etila:
ácido acético (75:24:1) e revelados em vanilina sulfúrica. A) Frações de 1 a 4 obtidas
da coluna em gel de sílica, frações 3rec e 4rec recristalizadas e frações enriquecidas
com 13, 16 e 17. B) Frações de 5 a 9 obtidas da coluna em gel de sílica e frações
94
enriquecidas com 13, 16 e 17. lan: fração enriquecida com a substância 17, ben:
fração enriquecida com a substância 16, fri: fração enriquecida com a substância 13,
setas: substâncias majoritárias.
Após a análise por CCD as frações 8 e 9 foram cromatografadas em CCD
preparativa, porém, a quantidade de amostra resultante não foi o suficiente para
elucidação estrutural.
Já as amostras 3rec e 4rec, quando reveladas em vanilina com a fração
enriquecida da substância 13 apresentou mesmo Rf e mesma coloração como
proposta na literatura (NOUFOU et al., 2012). Essas amostras foram, então,
enviadas para CG/EM e tiveram suas substâncias majoritárias identificadas em
comparação com banco de dados do aparelho e dados da literatura (Tabela 15 e
Figuras 54 e 55).
Tabela 15. Substância majoritária identificada nas frações cromatogradas em coluna
com gel de sílica de C. gradiflora por CG/EM.
Fração Tempo de
retenção
(min)
Substância Correlação
banco de
dados (%)
Abundância
(%)
CGREtD 3rec 22.83 3-oxo-friedelina
(Triterpeno)
96* 92,28
CGREtD 4rec 22.85 3-oxo-friedelina
(Triterpeno)
96* 90,80
Legenda: *literatura (ALMEIDA et al., 2011)
CGREtD 3rec: fração 3rec da coluna obtida da fração em diclorometano da CLV do
extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora; CGREtD 4rec: fração 4rec da coluna
obtida da fração em diclorometano da CLV do extrato etanólico dos ramos de C.
grandiflora.
95
Figura 54. Cromatograma e fragmentação das substâncias obtidas na fração
CGREtD 3rec. A) Cromatograma da fração CGCEtD 3rec. B) Espectro de massas da
substância 3-oxo-friedelina obtida da fração CGCEtD 3rec.
96
Figura 55. Cromatograma e fragmentação das substâncias obtidas na fração
CGREtD 4rec. A) Cromatograma da fração CGCEtD 4rec. B) Espectro de massas da
substância 3-oxo-friedelina obtida da fração CGCEtD 4rec.
Como as frações obtidas são ricas em 3-oxo-friedelina (C30H50O) o processo
de fragmentação originou íon molecular m/z 426 e íons fragmentos de m/z 273, m/z
205 e m/z 69, conforme encontrado em Almeida (2011). O processo de
97
fragmentação foi proposto por Fernandes (2010) e Carvalho (2013) como é
mostrado na Figura 56.
Figura 56. Proposta de fragmentação da 3-oxo-friedelina.
A substância majoritária da fração 3rec, como estava em maior abundância
no CG/EM, também foi analisada por RMN de H1 e resultaram na presença de todos
os sinais característicos para um triterpeno friedelano: sete simpletos referentes às
metilas (δH 1,18; 1,05;1,01; 1,00; 0,95; 0,87 e 0,73) e um dupleto em δH 0,88
referente aos prótons metila ligados ao carbono C-23. Os demais sinais de
hidrogênio metilênicos e metílicos se acoplaram formando multipletos difíceis de
serem visualizados na região entre δH 1,18-1,59 e multipletos entre δH 2,20-2,39
referentes a prótons α-carbonílicos. Estes sinais estão de acordo com os dados da
literatura (ALMEIDA et al., 2011; CARVALHO, 2013), conforme mostra a Figura 57 e
Tabela 16. Confirmando mais uma vez que essa substância majoritária é a 3-oxo-
friedelina (13) (Figura 58).
98
Figura 57. Espectro de RMN de H1 da 3-oxo-friedelina e expansões do campo alto.
99
Tabela 16. Dados do RMN de H1 da 3-oxo-friedelina comparados a literatura*.
H δH fração δH literatura
1 a 1,96 (m) 1,96 (m)
1 b 1,69 (ddd, J = 26,1; 13,1;
5,1 Hz) - sobreposto
1,68 (dq; J = 13,0; 5,1 Hz)
2 a 2.39 (ddd, J = 13,7; 5,1,
2.0 Hz)
2,39 (ddd; J = 13,7; 5,1;
1,9 Hz)
2 b 2.30 (m) -sobreposto 2,29 (m; J = 13,8; 13,6;
6,5 Hz)
4 2.25 (dd, J = 14,1; 6,9 Hz)
- sobreposto
2,24 (q; J = 6,5 Hz)
6 a 1,75 (dd, J= 15,4; 2,7 Hz)
- sobreposto
1,75 (m)
23 0.88 (d, J = 6,7 Hz) -
sobreposto
0,87 (d; J = 6,5 Hz)
24 0,73 (s) 0,73 (s)
25 0,87 (s) - sobreposto 0,88 (s)
26 1.01 (s) 1,01 (s)
27 1,05 (s) 1,05 (s)
28 1,18 (s) 1,18 (s)
29 1,00 (s) 1,00 (s)
30 0,95 (s) 0,95 (s)
Legenda: *ALMEIDA et al., 2011
Figura 58. Estrutura química da 3-oxo-friedelina (13).
100
Como o CG/EM e o RMN de H1 mostraram que as frações ainda não estavam
puras e se trataram da mesma substância elas foram reunidas e novamente
recristalizadas com acetato de etila e lavadas com etanol, conforme proposto por
Pires e colaboradores (2009). Após cristalização observou-se a formação de um
sólido branco em forma de agulhas (CGREtF – 3,1mg), como descrito no trabalho de
Almeida e colaboradores (2011) e seu ponto de fusão (PF) resultou numa faixa de
260-265ºC próximo ao encontrado na literatura (260-261ºC) (SEUPEL et al., 2015).
5.10.3. Atividade antimicrobiana da 3-oxo-friedelina
Como a fração CGREtD (2) da CLV foi a mais ativa frente à P. aeruginosa e
E. coli decidiu-se avaliar a atividade antimicrobiana de CGREtF frente às mesmas
cepas.
O CIM para esta fração em ambas às cepas foi maior que 256 μg/mL,
indicando que, na concentração utilizada, possivelmente a 3-oxo-friedelina (13) não
foi a responsável ou não sozinha pela atividade antimicrobiana encontrada na fração
CGREtD (2), apesar de ser encontrados relatos na literatura quanto ao seu potencial
(SINGH & DUBEY, 2001).
6. CONCLUSÕES
As características anatômicas encontradas em C. grandiflora foram epiderme
unisseriada com estômatos restritos a face abaxial, cutícula espesssa com flages,
presença de hipoderme, diversas estruturas secretoras e idioblastos com drusas.
Essas características contribuíram com os dados da literatura descritos para a
família Clusiaceae e para similaridade com outras espécies.
Os testes histoquímicos demonstraram a presença de grãos de amido,
lipídeos, taninos e flavonoides em localização esperada e descrita na literatura.
A caracterização anatômica e histoquímica da espécie permitiu o
estabelecimento de parâmetros para futura verificação de autenticidade de
amostras.
101
A análise dos valores de CE50 e da atividade antioxidante máxima mostraram
que os extratos apresentaram potencial antioxidante, destacando-se o extrato
etanólico das raízes adventícias.
O teor de flavonoides expressos como flavonas e flavonóis obtiveram baixos
valores para estas substâncias. Porém, quando foram analisados estatisticamente
obtiveram uma correlação positiva entre o CE50 e a presença de flavonoides.
A atividade citotóxica foi promissora para os extratos etanólicos dos ramos e
folhas frente às linhagens de cólon humano e ascite gástrica, respectivamente.
Para a atividade antimicrobiana os extratos apresentaram atividade apenas
frente às cepas P. aeruginosa e E. coli, destacando-se todos os extratos etanólicos e
o extrato hexânico dos ramos. As frações obtidas do extrato etanólico dos ramos
também foram avaliadas e obtiveram bons resultados para as frações em
diclorometano, principalmente, e acetato de etila. A substância majoritária presente
na fração em diclorometano, a 3-oxo-friedelina, teve seu potencial avaliado e como
resultado pode-se sugerir que esta não foi a responsável ou não sozinha pela
atividade antimicrobiana na concentração utilizada. Sugerindo a utilização de uma
concentração maior para estudos futuros.
O potencial acaricida para os extratos hexânicos não apresentaram um bom
resultado, tendo uma melhor atividade apenas o extrato dos ramos.
A prospecção química sugeriu a presença de substâncias fenólicas,
benzofenonas e terpenoídicas. O perfil obtido por CCD foi bastante amplo, podendo
ser corroborado após a realização das demais técnicas. Por CLAE-DAD foi possível
sugerir a presença, principalmente, de substâncias fenólicas nos extratos etanólicos.
Por RMN de H1 foi sugerido a presença das substâncias terpenoidicas, flavonoides e
benzofenonas, mencionadas anteriormente, mas como se trata de uma matriz
complexa os sinais estavam sobrepostos dificultando a identificação. A análise por
CG/EM dos extratos hexânicos demonstrou, principalmente, a presença de
triterpenos do esqueleto friedelano.
Os resultados obtidos neste trabalho indicam que C. grandilora pode ser alvo
para estudos futuros visando o isolamento de outras classes de substâncias,
avaliação de outras atividades biológicas e busca por metabólitos que possam se
102
tornar alvo para indústria farmacêutica. Além disso, contribuiu para ampliação do
conhecimento da família e, assim, da flora brasileira.
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