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So PauloLOGOMARCAVARELA
3 edio2007
Neusely da SilvaValria Christina Amstalden JunqueiraNeliane
Ferraz de Arruda Silveira
Marta Hiromi TaniwakiRosana Franscisco Siqueira dos SantosRenato
Abeilar Romeiro GomesMargareteMidori Okazaki
MANUAL DE MTODOSDE ANLISE MICROBIOLGICA
DE ALIMENTOS
cap 01- cap 07.p65 1/7/2007, 23:501
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E24 Educao inclusiva e necessidades educacionais especiais
/Soraia Freitas, David Rodrigues, Ruy Krebs (orgs.).Santa Maria,
Ed. UFSM, 2005.p.
ISBN:
1. Educao 2. Educao especial 3. Incluso escolar4. Incluso social
5. Portadores de necessidades especiaisI. Freitas, Soraia Napoleo
II. Rodrigues, David III. Krebs,Ruy Jornada
CDU 376.1/.5
Direitos reservados Editora da Universidade Federal de Santa
Maria
Prdio da Reitoria 2 andar Campus UniversitrioCamobi 97105-900
Santa Maria RS
Fone/fax: (055)3220.8610e-mail: [email protected]
Ficha catalogrfica elaborada porMaristela Eckhardt
CRB-10/737Biblioteca Central - UFSM
Obra financiada pela CAPES, entidade do Governo Brasileiro
voltadapara a formao de Recursos Humanos.
Projeto grfico: Danclar Rossato - (55) 30284824 - e-mail:
[email protected]: Danclar RossatoReviso: autorFiguras:
autorImpresso: Pallotti - SMTiragem: ????????????????
cap 01- cap 07.p65 1/7/2007, 23:502
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3Captulo 1. Coleta, transporte e estocagem de amostras para
anlise
1.1.
Introduo.................................................................................................................................................Lote
...........................................................................................................................................................Amostra
de lote e unidade de amostra
.................................................................................................Planos
de amostragem de lotes
..............................................................................................................Unidade
analtica
....................................................................................................................................
1.2. Material necessrio
..................................................................................................................................1.3.
Coleta de amostras para anlise
.............................................................................................................
1.3.1. Seleo e preparao de frascos para coleta de
alimentosacondicionados em embalagens no individuais
.......................................................................
1.3.2. Procedimentos para a coleta de alimentos acondicionados
emembalagens no individuais
.........................................................................................................
1.3.3. Coleta de alimentos envolvidos em casos de doenas de
origem alimentar (DTAs) ............1.3.4. Coleta de amostras de
gua
.........................................................................................................
1.4. Transporte e estocagem de amostras at o momento da anlise
.......................................................1.4.1.
Transporte e estocagem de alimentos com baixa atividade de gua
......................................1.4.2. Transporte e estocagem
de alimentos congelados
....................................................................1.4.3.
Transporte e estocagem de alimentos refrigerados
..................................................................1.4.4.
Transporte e estocagem de alimentos comercialmente estreis
em embalagens hermticas
.........................................................................................................1.4.5.
Transporte e estocagem de amostras de gua
...........................................................................
1.5. Recepo de amostras para a anlise
.....................................................................................................1.6.
Referncias
...............................................................................................................................................
Captulo 2. Preparao de amostras para anlise2.1. Introduo
................................................................................................................................................2.2.
Material ncessrio
....................................................................................................................................2.3.
Homogeneizao da amostra e retirada da unidade analtica
...........................................................
2.3.1. Procedimento para a homogeneizao e retirada da unidade
analticade produtos lquidos
....................................................................................................................
2.3.2. Procedimento para a homogeneizao e retirada da unidade
analticade produtos slidos ou lquidos concentrados
..........................................................................
2.3.3. Procedimento para a retirada da unidade analtica pela
tcnicado esfregao de superfcie
..........................................................................................................2.3.3.1.
Amostragem com swabs
...............................................................................................2.3.3.2.
Amostragem com esponjas
.............................................................................................
Sumrio
cap 01- cap 07.p65 1/7/2007, 23:503
-
42.3.4. Procedimento para a retirada da unidade analtica pela
tcnica da lavagem superficial ....2.3.4.1. Procedimento para a
lavagem de carcaas de aves
.....................................................2.3.4.2.
Procedimento para a lavagem de outros alimentos
....................................................2.3.4.3.
Procedimento para a lavagem de embalagens
............................................................
2.3.5. Guarda de contra-amostras
..........................................................................................................2.4.
Preparo da 1 diluio da unidade analtica
........................................................................................
Diluentes para os ensaios de presena/ausncia
.................................................................................Diluentes
para os ensaios que requeiram tratamento diferenciado da amostra
..............................Diluentes para os ensaios gerais de
quantificao
................................................................................Como
obter uma diluio inicial 1:10 (10-1)
.........................................................................................Como
obter uma diluio inicial diferente de 1:10
.............................................................................Procedimento
para o preparo da primeira diluio de amostras lquidas
........................................Procedimento para o preparo
da primeira diluio de amostras slidasou lquidos concentrados
........................................................................................................................Procedimento
para o preparo da primeira diluio de amostras obtidaspor esfregao
de superfcie ou por lavagem superficial
.....................................................................
2.5. Diluio decimal seriada da amostra
.....................................................................................................Como
obter a 2 diluio (10-2)
..............................................................................................................Como
obter as diluies subsequentes
..................................................................................................
2.6. Referncias
...............................................................................................................................................
Captulo 3. Tcnicas bsicas de contagem demicrorganismos em
placas3.1. Introduo
................................................................................................................................................3.2.
Plaqueamento em profundidade (pour plate)
................................................................................3.3.
Plaqueamento em superfcie (spread plate)
....................................................................................3.4.
Plaqueamento em gotas (drop plate)
................................................................................................3.5.
Filtrao em membrana
..........................................................................................................................3.6.
Contagem das colnias e clculo dos resultados
..................................................................................3.7.
Referncias
...............................................................................................................................................
Captulo 4. Tcnicas bsicas de contagem demicrorganismos pelo
NmeroMais Provvel4.1. Introduo
................................................................................................................................................4.2.
Teste de diluio mltipla
......................................................................................................................4.3.
Teste de diluio nica
...........................................................................................................................4.4.
Clculo dos resultados
.............................................................................................................................4.5.
Referncias
...............................................................................................................................................
Captulo 5. Tcnicas bsicas de deteco da presena/ausncia
demicrorganismos5.1. Introduo
................................................................................................................................................5.2.
Material requerido nas anlises
..............................................................................................................5.3.
Procedimento
..........................................................................................................................................
a) Pr enriquecimento
..........................................................................................................................Composio
de amostras a seco
........................................................................................................
b) Enriquecimento seletivo
...................................................................................................................Composio
mida de amostras em ensaios com duas etapas de enriquecimento
....................
c) Plaqueamento diferencial
................................................................................................................c.1)
Tcnica de inoculao por estrias de esgotamento para obter culturas
puras ...................
d) Seleo de colnias e repique de culturas para
confirmao.......................................................
Manual deMtodos de AnliseMicrobiolgica de Alimentos
cap 01- cap 07.p65 1/7/2007, 23:504
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5Tcnica de repique de culturas puras a partir de colnias
isoladas em placas ...........................e) Testes de
confirmao.......................................................................................................................
e.1) Colorao de Gram (mtodo de Hucker)
..............................................................................e.2)
Colorao de esporos (mtodo de Schaeffer-Fulton)
...........................................................e.3)
Colorao de esporos (mtodo de Ashby)
..............................................................................e.4)
Montagens midas para observao microscpica a fresco
...................................................
5.4. Referncias
...............................................................................................................................................
Captulo 6. Contagem total demicrorganismos aerbiosmesfilos e
psicrotrficos em placas6.1. Introduo
................................................................................................................................................6.2.
Mtodo de contagem total de aerbios mesfilos em placas
..............................................................6.3.
Mtodo de contagem total de aerbios mesfilos em Petrifilm
...................................................6.4. Mtodo de
contagem total de aerbios psicrotrficos
.........................................................................6.5.
Referncias
...............................................................................................................................................
Captulo 7. Contagem de bolores e leveduras7.1. Introduo
................................................................................................................................................7.2.
Mtodo de contagem de bolores e leveduras em placas
.....................................................................7.3.
Mtodo de contagem de fungos psicrotrficos
....................................................................................7.4.
Mtodo de contagem de bolores termorresistentes
............................................................................7.5.
Referncias
...............................................................................................................................................
Captulo 8. Contagem de enterobactrias8.1. Introduo
................................................................................................................................................
Taxonomia
................................................................................................................................................Mtodos
de anlise
..................................................................................................................................
8.2. Mtodo de contagem em placas de VRBG
...........................................................................................8.3.
Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP)
...........................................................................................8.4.
Mtodo do
Petrifilm.......................................................................................................................8.5.
Referncias
...............................................................................................................................................
Captulo 9. Contagem de coliformes totais, coliformes
termotolerantes eEscherichia coli9.1. Introduo
................................................................................................................................................
Definio de coliformes totais
................................................................................................................Defnio
de coliformes termotolerantes
..............................................................................................E.
coli
...............................................................................................................................................Aplicao
como indicadores
...................................................................................................................Mtodos
de anlise
..................................................................................................................................
9.2. Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) (coliformes
totais/termotolerantes/E. coli) .................9.3. Mtodo de
plaqueamento em VRB (coliformes totais)
......................................................................9.4.
Mtodo do ColiComplete AOAC 992.30 (Coliformes totais/E. coli)
..............................................9.5 Mtodo do
Petrifilm (coliformes totais/E. coli)
................................................................................9.6.
Referncias
..............................................................................................................................................
Sumrio
cap 01- cap 07.p65 1/7/2007, 23:505
-
6Captulo 10. Staphylococcus aureus10.1. Introduo
..............................................................................................................................................
Principais caractersticas de S. aureus
............................................................................................Mtodos
de anlise
................................................................................................................................
10.2. Mtodo de contagem direta em placas
...............................................................................................10.3.
Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP)
.........................................................................................10.4.
Teste de presena/ausncia
.................................................................................................................10.5.
Referncias
.............................................................................................................................................
Captulo 11.Bacillus cereus11.1. Introduo
..............................................................................................................................................
Grupo B. cereus
...............................................................................................................................B.
anthracis
.....................................................................................................................................B.
thuringiensis
................................................................................................................................B.
mycoides
......................................................................................................................................B.
pseudomycoides
.............................................................................................................................B.
weihenstephanensis
.......................................................................................................................Principais
caractersticas de B. cereus
.............................................................................................Mtodos
de anlise
................................................................................................................................
11.2. Mtodo de contagem direta em placas
...............................................................................................11.3.
Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP)
.........................................................................................11.4.
Referncias
.............................................................................................................................................
Captulo 12. Clostrdios sulfito redutores eClostridium
perfringens12.1. Introduo
..............................................................................................................................................
Principais caractersticas de C. perfringens
......................................................................................Clostrdios
sulfito redutores a 46C
.....................................................................................................Mtodos
de anlise de C. perfringens
..............................................................................................Mtodos
de anlise de clostrdios sulfito redutores a 46C
...............................................................
12.2. Mtodo de plaqueamento direto (C. perfringens)
...............................................................................12.3.
Teste de presena/ausncia (C. perfringens)
.......................................................................................12.4.
Mtodo de contagem em placas (clostrdios sulfito redutores a
46C)...........................................12.5. Referncias
.............................................................................................................................................
Captulo 13. Contagem de enterococos13.1. Introduo
..............................................................................................................................................
Importncia em alimentos
....................................................................................................................Mtodos
de anlise
................................................................................................................................
13.2. Mtodo de contagem em placas
..........................................................................................................13.3.
Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP)
.........................................................................................13.4.
Referncias
.............................................................................................................................................
Captulo 14 Contagem de bactrias lticas14.1. Introduo
..............................................................................................................................................
Leuconostoc
......................................................................................................................................Pediococcus
....................................................................................................................
...................Streptocccus
.......................................................................................................................................
Manual deMtodos de AnliseMicrobiolgica de Alimentos
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7Lactobacillus
....................................................................................................................................Enterococcus
......................................................................................................................................Lactococcus
.......................................................................................................................................Carnobacterium
................................................................................................................................Vagococcus
.......................................................................................................................................Tetragenococcus
................................................................................................................................Weissella
..........................................................................................................................................Oenococcus
.......................................................................................................................................Mtodos
de anlise
................................................................................................................................
14.2. Mtodo de contagem em placas
..........................................................................................................14.3.
Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP)
.........................................................................................14.4.
Referncias
.............................................................................................................................................
Captulo 15.Campylobacter15.1. Introduo
..............................................................................................................................................
Taxonomia
..............................................................................................................................................Patogenicidade
......................................................................................................................................Mtodos
de anlise
................................................................................................................................
15.2. Mtodo de presena/ausncia ISO 10272-1 (2006)
.........................................................................15.3.
Referncias
.............................................................................................................................................
Captulo 16. Enterobacter sakazakii16.1. Introduo
..............................................................................................................................................
Taxonomia
..............................................................................................................................................Caractersticas
nutricionais e de crescimento
....................................................................................Epidemiologia
........................................................................................................................................Ecologia
...................................................................................................................................................Mtodos
de anlise
................................................................................................................................
16.2. Mtodo de presena/ausncia ISO/TS 22964 (2006)
.....................................................................16.3.
Referncias
.............................................................................................................................................
Captulo 17.Escherichia coliO157:H717.1. Introduo
..............................................................................................................................................
Sorotipagem
...........................................................................................................................................Patogenicidade
......................................................................................................................................Sorotipos
STEC mais envolvidos em surtos
.........................................................................................E.
coli O157:H7 em alimentos
...............................................................................................................Taxonomia
..............................................................................................................................................Mtodos
de deteco
............................................................................................................................
17.2. Mtodo BAM/FDA
................................................................................................................................17.3.
Referncias
.............................................................................................................................................
Captulo 18.Listeria monocytogenes18.1. Introduo
..............................................................................................................................................
Taxonomia
..............................................................................................................................................Patogenicidade
......................................................................................................................................Mtodos
de anlise
................................................................................................................................
Sumrio
cap 01- cap 07.p65 1/7/2007, 23:507
-
818.2. Mtodo BAM/FDA
................................................................................................................................18.3.
Mtodo MLG/FSIS/USDA
...................................................................................................................18.4.
Mtodo de plaqueamento direto
.........................................................................................................18.5
Referncias
.............................................................................................................................................
Captulo 19. Salmonella19.1. Introduo
..............................................................................................................................................
Classificao taxonmica de Salmonella
.........................................................................................Classificao
sorolgica de Salmonella
............................................................................................Caractersticas
bioqumicas de SalmonellaEpidemiologia
........................................................................................................................................Mtodos
tradicionais de anlise de Salmonella
...............................................................................Mtodos
alternativos de anlise de Salmonella
...............................................................................Composio
de amostras para a anlise
...............................................................................................
19.2. Mtodo ISO 6579
(2002)......................................................................................................................19.3
Mtodo BAM/FDA (2005)
...................................................................................................................19.4.
Mtodo MLG/FSIS/USDA
...................................................................................................................19.5.
Referncias
.............................................................................................................................................
Captulo 20. Vibrios patognicos20.1. Introduo
..............................................................................................................................................
Taxonomia
..............................................................................................................................................Epidemiologia
........................................................................................................................................V.
cholerae
.......................................................................................................................................V.
parahaemolyticus
..........................................................................................................................V.
vulnificus
.....................................................................................................................................Mtodos
de anlise
................................................................................................................................
20.2. Mtodo APHA/BAM/FDA (presena/ausncia de Vibrio cholerae)
.................................................20.3. Mtodo
APHA/BAM/FDA (NMP de Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus)
.............................20.4. Referncias
.............................................................................................................................................
Captulo 21. Yersinia enterocolitica21.1. Introduo
..............................................................................................................................................
Taxonomia
..............................................................................................................................................Epidemiologia
........................................................................................................................................Mtodos
de anlise
................................................................................................................................
21.2. Mtodo APHA de deteco
..................................................................................................................21.3.
Referncias
.............................................................................................................................................
Captulo 22. Contagem de esporos de bactrias22.1. Introduo
..............................................................................................................................................
22.1.1.Taxonomia das bactrias esporognicas importantes em
alimentos ....................................Bacillus
................................................................................................................................Clostridium
...........................................................................................................................Sporolactobacillus
...................................................................................................................Desulfotomaculum
.................................................................................................................Alicyclobacillus
......................................................................................................................
Manual deMtodos de AnliseMicrobiolgica de Alimentos
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9Thermoanaerobacterium
.........................................................................................................Paenibacillus
.........................................................................................................................Aneurinibacillus
....................................................................................................................Brevibacillus
..........................................................................................................................Virgibacillus
..........................................................................................................................Geobacillus
............................................................................................................................
22.2. Mtodos de contagem de esporos de termfilos aerbios totais
e flat sour .................................22.3. Mtodos de deteco
de esporos de termfilos anaerbios no-produtores de H
2S .....................
22.4. Mtodos de contagem de esporos de termfilos anaerbios
produtores de H2S ..........................
22.5. Mtodos de contagem de esporos de mesfilos aerbios
..................................................................22.6.
Mtodos de contagem de esporos de mesfilos anaerbios
.............................................................22.7.
Mtodos para deteco ou contagem de Alicyclobacillus
................................................................22.8.
Referncias
.............................................................................................................................................
Captulo 23. Esterilidade comercial ou causa da deteriorao23.1.
Introduo
..............................................................................................................................................
23.1.1.Parmetros de avaliao da resistncia trmica dos
microrganismos ...................................Curva de
sobrevivncia e tempo de reduo decimal (valor D)
..........................................Nmero de redues decimais
................................................................................................Curva
de destruio trmica e coeficiente de temperatura (valor z)
.................................
23.1.2.Valores D e z de microrganismos de importncia em
alimentos ..........................................Clulas
vegetativas
......................................................................................................................Esporos
de bolores termorresistentes
......................................................................................Esporos
de bactrias
...................................................................................................................
23.1.3.Dimensionamento de processos trmicos
...............................................................................23.1.4.Deteriorao
microbiana de alimentos enlatados
..................................................................
Subprocessamento
.....................................................................................................................Vazamento
..................................................................................................................................Deteriorao
por termfilos estritos
........................................................................................Multiplicao
microbiana antes do tratamento trmico
........................................................Causas no
microbianas de
deteriorao.................................................................................
23.2. Teste de esterilidade comercial e determinao da causa
dadeteriorao de alimentos de baixa acidez
.........................................................................................
23.3. Teste de esterilidade comercial e determinao da causa da
deterioraode alimentos cidos
................................................................................................................................
23.4. Referncias
.............................................................................................................................................
Captulo 24. Cuidados na preparao de meios de cultura e reagentes
para anlisesmicrobiolgicas24.1. Introduo
24.1.1. Ingredientes utilizados na formulao de meios de cultura
.................................................24.1.1.1. gua para
o preparo de meios e reagentes
............................................................24.1.1.2.
Fontes de nutrientes em meios de cultura
.............................................................24.1.1.3.
Agentes seletivos
.........................................................................................................24.1.1.4.
Agentes diferenciais
..................................................................................................24.1.1.5.
Agentes redutores
......................................................................................................24.1.1.6.
Agentes tamponantes
................................................................................................24.1.1.7.
Substratos cromognicos e fluorognicos
...............................................................24.1.1.8.
gar
.............................................................................................................................
Sumrio
cap 01- cap 07.p65 1/7/2007, 23:509
-
10
24.1.2.Classificao dos meios de cultura
...........................................................................................24.2.
Procedimento para a preparao de meios de cultura
.....................................................................
24.2.1.Armazenamento dos insumos para preparo de meios de
cultura........................................21.2.2.Pesagem e
rehidratao
............................................................................................................24.2.3.Dissoluo
e disperso
...............................................................................................................21.2.4.Verificao
e ajuste do pH antes da esterilizao
...................................................................24.2.5.Distribuio
.................................................................................................................................24.2.6.Esterilizao
pelo calor mido
..................................................................................................24.2.7.
Esterilizao por filtrao
.........................................................................................................24.2.8.
Verificao do pH depois da esterilizao
..............................................................................24.2.9.
Preparao dos suplementos para meios de cultura
.............................................................24.2.10.
Estocagem dos meios esterilizados at o momento do
uso.................................................24.2.11.
Preparao dos meios no momento do uso
.........................................................................
24.3. Referncias
Captulo 25. Preparao dematerial de laboratrio para anlises
microbiolgicas25.1. Descontaminao e descarte de resduos
contaminados
..................................................................25.2.
Lavagem
..................................................................................................................................................25.3.
Acondicionamento
................................................................................................................................25.4.
Esterilizao
............................................................................................................................................25.5.
Preparo de vidraria nova
.......................................................................................................................25.6.
Controle de qualidade do material
.....................................................................................................25.7.
Referncias
.............................................................................................................................................Anexo
1. Preparo de meios e reagentes para as anlises
............................................................................Anexo
2. Resoluo RDC No 12 de 02 de janeiro de 2001
.........................................................................Anexo
3. Fatores que afetam o crescimento de microrganismos em
alimentos.......................................
Manual deMtodos de AnliseMicrobiolgica de Alimentos
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-
11
Apresentao
Desde sua primeira edio, em 1997, este livro foi preparado para
fornecer um manual demtodos em portugus, com a metodologia
recomendada pela Agncia Nacional de VigilnciaSanitria (ANVISA), do
Ministrio da Sade. So mtodos oficiais da American Public
HealthAssociation (APHA), Food and Drug Adminstration (FDA), Food
Safety and Inspection Servicedo United States Department of
Agriculture (FSIS/USDA), Association of Official AnalyticalChemists
(AOAC) e International Organization for Standardization (ISO).
O texto foi preparado para atender tanto aos profissionais com
formao acadmica, quan-to aos tcnicos de laboratrio, sem formao de
nvel superior. Acreditamos que esse objetivo foiatingido: omanual
oferece ummaterial de contedo profundo, moderno e atualizado, mas
apre-sentado de forma didtica, com textos e esquemas que facilitam
a compreenso.
Nessa terceira edio, todos os mtodos foram revistos e
atualizados, de acordo com as no-vas edies do Compendium of Methods
for the Microbiological Examination of Foods (APHA, 4a Edio,2001),
StandardMethods for the Examination ofWater&Wastewater (APHA,
21a edio, 2005), StandardMethods for the Examination of Dairy
Products (APHA, 17a edio, 2004), Official Methods of Analysis
ofAOAC International (AOAC, 18a edio, 2005), Bacteriological
Analytical Manual (FDA, atualizadopor captulos, online),
Microbiology Laboratory Guidebook (FSIS/USDA, atualizado por
captulos,online) e ltimas edies das normas ISO.
Foram introduzidos novos captulos, com tcnicas bsicas de
microbiologia, que sero degrande valia para pessoal tcnico em
formao.
Foi introduzida, no incio de cada captulo, uma reviso extensiva
da literatura, apresentan-do o que h de mais recente sobre o
assunto tratado no captulo. Esse material oferece uma baseterica
slida, que ser de grande valia para a compreenso da metodologia e
interpretao dosresultados.
Finalmente, foram introduzidas as mudanas de nomenclatura das
bactrias relevantes emalimentos, ocorridas at dezembro de 2006.
Para bactrias Gram negativas, foi utilizada a classifi-cao e
nomenclatura do Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 2o Ed
(2005). Para bactrias Grampositivas, foi utilizada a classificao e
nomenclatura do International Journal of Systematic andEvolucionary
Microbiology (revista oficial do International Committee on
Systematic Bacteriology),porque ainda no foram publicados os
volumes do Bergeys Manual para Gram positivos.
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DOS AUTORES
Neusely da Silva Engenheira de Alimentos, com Doutorado em
Cincias de Alimentospela Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP). vice diretora do Laboratrio deMicrobiologia do Instituto
de Tecnologia de Alimentos de Campinas (ITAL), rgo de pesquisada
Secretaria de Agricultura do Estado de So Paulo. Exerce atividades
de pesquisa, desenvolvi-mento e inovao (P&D&I) para o setor
de alimentos, com vrios livros e artigos cientficos publi-cado no
Brasil e no exterior. Sua rea de concentrao o desenvolvimento,
adequao, avalia-o e validao de novos mtodos de anlise microbiolgica
de gua e alimentos. Endereo ele-trnico: [email protected].
Valria Christina Amstalden Junqueira biloga, com Doutorado em
Tecnologia de Ali-mentos pela Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP). Pesquisadora do Laboratrio deMicrobiologia do ITAL,
concentra suas atividades no estudo da deteriorao de alimentos
termo-processados e no estudo de bactrias anaerbias patognicas de
importncia em gua e alimen-tos, incluindo Clostridium perfringens e
Clostridium botulinum. Possui uma ampla experincia deconsultoria a
industrias privadas processadoras de alimentos principalmente em
produtos conta-minados por microrganismos anaerbios patognicos e
deteriorantes. Endereo eletrnico:[email protected].
Neliane Ferraz de Arruda Silveira biloga com Doutorado em
Tecnologia de Alimentospela Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP), na rea de higiene e legislao de alimen-tos. Pesquisadora
do Laboratrio deMicrobiologia do ITAL, concentra suas atividades no
contro-le da qualidademicrobiolgica de alimentos, com nfase em
pescadomarinhos de gua salgada edoce; frutas e hortalias
minimamente processadas, alimentos servidos em refeies coletivas
eprodutos crneos. Endereo eletrnico: [email protected].
Marta Hiromi Taniwaki biloga, com Doutorado na Universidade de
New South Wales,em Sydney-Australia. diretora do a Unidade
Laboratorial de Referncia em Microbiologia doITAL, onde exerce
atividades de pesquisa, desenvolvimento e inovao (P&D&I).
Expert emmicologia de alimentos, membro da International Commission
on FoodMycology (ICFM), pres-ta consultoria a empresas pblicas e
privadas, para o controle de fungos emicotoxinas em alimen-tos.
Endereo eletrnico: [email protected].
Rosana Francisco Siqueira dos Santos biloga, com mestrado em
Cincias de Alimentospela Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP). Gerente do Laboratrio deMicrobiologiado ITAL, exerce
atividades de pesquisa, desenvolvimento e inovao (P&D&I).
Concentra suasatividades no estudo de Enterobacter sakazakii e
mtodos para sua deteco. Endereo
eletrnico:[email protected].
Renato Abeilar RomeiroGomes Engenheiro Agrcola, commestrado
emEngenharia Agr-cola pela Universidade Federal de Viosa. Diretor
do Centro de Informao em Tecnologia deAlimentos (CIAL) do ITAL,
concentra suas atividades na divulgao de informaes tecnolgicaspara
o setor de alimentos. Endereo eletrnico: [email protected].
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Captulo1
Coleta, Transporte e Estocagemde Amostras para Anlises
1.1 INTRODUO
A maioria das recomendaes contidas nesse captulo so da American
Public HealthAssociation (APHA), descritas na 4 Edio do Compendium
ofMethods forMicrobiological Examinationof Foods (Downes & Ito,
2001). Quando diferentes ou complementares s do Compendium,
foramtambm includas recomendaes da 21 Edio do Standard Methods for
the Examination of Waterand Wastewater (Hunt & Rice, 2005),
especficas para a anlise de gua, da 17 Edio do StandardMethods for
the Examination of Dairy Products (Wehr & Frank, 2004),
especficas para a anlise deprodutos lcteos e de normas da
InternationalOrganization for Standardization (ISO 6887-4:2003,ISO
7218:1996), recomendadas para ensaios realizados commetodologia
ISO.
Alguns termos utilizados ao longo do texto so oriundos da
terminologia relacionada com aamostragem de lotes e devem ter seu
significado corretamente compreendido:
LoteLote definido como uma quantidade de alimento de mesma
composio e caractersticas
fsicas, qumicas e sensoriais, produzida e manuseada numa mesma
batelada, sob as mesmascondies. Na prtica, lote geralmente a
quantidade de alimento produzida dentro de um inter-valo de tempo
de funcionamento de uma linha de produo, sem interrupo.
Amostra de lote e unidade de amostraAmostra de lote uma frao do
total produzido, retirada ao acaso, para avaliar as condi-
es do lote. No caso de alimentos acondicionados em embalagens
individuais, composta de nembalagens individuais. No caso de
grandes massas de alimentos, no acondicionados em emba-lagens
individuais, composta de n alquotas do produto. As embalagens ou
alquotas individuaisso chamadas de unidades de amostra e, para a
avaliao do lote, so analisadas separadamente.A partir do conjunto
de resultados da anlise das n unidades de amostra, possvel inferir
ascaractersticas de todo o lote, mas o resultado da anlise de uma
nica unidade de amostra nopode ser tomado como representativo do
lote.
Nas anlises de Salmonella, cujo padro em alimentos ausncia em
qualquer das unidadesde amostra, comum a prtica de compor
(misturar) as unidades de amostra, para realizar umnico ensaio. A
presena na amostra composta inaceitvel, independente de quantas ou
quaisunidades de amostra estejam contaminadas. Maiores detalhes so
apresentados no captulo espe-cfico de Salmonella.Planos de
amostragem de lotes
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Sempre que se tratar da avaliao de lotes ou partidas, a tomada
das n unidades de amostradever seguir um plano de amostragem
estatstico adequado. Os mais utilizados so os planos deduas ou trs
classes estabelecidos pela International Commission
onMicrobiological Specificationsfor Foods (ICMSF, 2002), adotados
pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA).
Oplano de duas classes classifica os lotes emduas categorias,
aceitvel ou inaceitvel, depen-dendo dos resultados da anlise das n
unidades de amostra. So os mais aplicados no caso deensaios de
presena/ausncia, como Salmonella, por exemplo, em que ausncia
aceitvel e apresena em qualquer das n unidades de amostra
inaceitvel.
O plano de trs classes classifica os lotes em trs categorias,
aceitvel, qualidade interme-diria mas aceitvel e inaceitvel. So
recomendados para ensaios qualitativos, para os quais opadro no
ausncia, mas sim, valores dentro de uma faixa entrem eM. Os
parmetros utiliza-dos nesses planos, para a tomada de decises a
respeito dos lotes so:
n: o nmero de unidades de amostras a serem colhidas
aleatoriamente de um mesmo lote,para serem analisadas
individualmente. As n unidades de amostra constituem a amostra
re-presentativa do lote. Para ensaios de presena/ausncia, no
quantitativos (Salmonella ouListeriamonocytogenes, por exemplo) as
unidades de amostra podero ser compostas e realizada umanica
anlise, porm, na composio das amostras devem ser consultadas e
obedecidas asorientaes dos captulos relacionados aos ensaios
especficos em questo.
m: o padro microbiolgico estabelecido para um dado
microrganismo, num dado alimento.Em um plano de trs classes esse
valor separa um lote aceitvel de um lote com qualidadeintermediria
aceitvel.
M: um limite tolervel, acima do padro, que pode ser atingido por
algumas (c) unidades deamostra, mas no pode ser ultrapassado por
nenhuma. Em um plano de duas classes,M sepa-ra o lote aceitvel do
inaceitvel. Em um plano de trs classes, separa o lote com
qualidadeintermediria aceitvel do lote inaceitvel.
c: dentre as n unidades de amostra que constituem a amostra
representativa do lote, c o nme-ro mximo de unidades que podem ser
aceitas com contagens acima do padrom, desde queno acima do
limiteM. Nos casos em que o padro microbiolgico ausncia, c igual a
zeroe aplica-se o plano de duas classes.
Unidade analticaA unidade de amostra geralmente contm uma
quantidade de produto maior do que a
necessria para a anlise, porque, ao se coletar uma unidade de
amostra, h sempre o cuidado dese tomar quantidades suficientes para
estocagem de contra-amostras e preveno de perdas poracidente.
Unidade analtica a quantidade de alimento efetivamente utilizada na
realizao deum ou mais ensaios da unidade de amostra. O nmero de
unidades analticas necessrias para aanlise depende do nmero e tipos
de ensaios que sero realizados na mesma unidade de amos-tra, sendo
uma para os ensaios gerais de quantificao (contagem total de
aerbios mesfilos,contagem de bolores e leveduras, contagem de
coliformes totais/fecais/E. coli, contagem deS. aureus, contagem de
B. cereus, contagem de C. perfringens), uma para cada ensaio de
presena/ausncia (Salmonella, Listeria monocytogenes e todos os
outros que requeiram enriquecimento emcaldo especfico) e uma para
cada outro ensaio que requeira tratamento diferenciado da
amostra(contagem de esporos de bactrias, contagem de bolores
termorresistentes e outros).
Manual deMtodos de AnliseMicrobiolgica de Alimentos
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1.2 MATERIAL NECESSRIO
Frascos e utenslios para coleta Frascos ou bolsas plsticas
estreis de capacidade variada Esptulas Facas Colheres Tesouras
Pinas Caladores Amostradores verticais de tubo duplo Amostradores
tipo corer Furadeira eltrica e brocas esterilizadas Caixas de
isopor com gelo seco ou sachs de geloreutilizvel em gel
Reagentes e diluentes Etanol 70% Soluo de hipoclorito de sdio a
100mg/l Soluo 3% ou 10% de tiossulfato de sdio (Na2S2O3) Soluo 15%
de EDTA Soluo Tamponada Glicerol Sal
Equipamentos Freezer com temperatura abaixo de 20oC negativos
com termmetro calibrado Refrigerador com temperatura entre 0 e 4oC
com termmetro calibrado
1.3 COLETA DE AMOSTRAS PARA ANLISE
Sempre que possvel, amostras de alimentos acondicionados em
embalagens individuaisdevem ser coletadas e encaminhadas ao
laboratrio na sua embalagem comercial original, fecha-da e intacta.
Cada embalagem unitria do produto constitui uma unidade de amostra
e devem sercoletadas tantas unidades de amostra quantas forem
requeridas pelo plano de amostragem. Se aembalagem unitria contiver
uma quantidade de alimento insuficiente para as anlises e guardade
contra amostras, deve-se coletar vrias embalagens unitrias, como
parte de uma mesma uni-dade de amostra. No momento da anlise,
deve-se juntar o contedo dessas diversas embalagensem um nico
frasco estril, misturando-se bem e retirar a unidade analtica da
mistura. Se oproduto no permitir mistura, deve-se tomar, de cada
uma das embalagens unitrias, pores depeso aproximadamente igual,
para compor a unidade analtica daquela unidade de amostra.
No caso de alimentos contidos em tanques ou grandes embalagens,
impossveis de seremtransportadas ao laboratrio, deve-se transferir
pores representativas da massa total para fras-cos ou bolsas de
coleta estreis, sob condies asspticas.
Coleta, Transporte e Estocagem de Amostras para Anlises
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1.3.1 SELEO E PREPARAODE FRASCOS PARA COLETA DE
ALIMENTOSACONDICIONADOS EMEMBALAGENSNO INDIVIDUAIS
a) Utilizar frascos ou bolsas com tampas prova de vazamentos,
dematerial no txico, aprovadopara contato com alimentos e, de
preferncia, autoclavveis ou pr-esterilizados. No reco-mendvel o uso
de frascos de vidro devido ao risco de quebra, contaminao do
ambiente decoleta com cacos de vidro e perda do contedo.
b) Escolher frascos com tamanho adequado para a quantidade de
alimento que ser coletada.Para definir a quantidade de amostra a
ser coletada, considerar que cada unidade de amostradeve conter, no
mnimo, duas vezes o nmero de unidades analticas que sero utilizadas
nosensaios, de preferncia, trs a quatro vezes esse valor, para a
separao da contra-amostra epreveno de possveis perdas. Levar em
conta, ainda, o fato de que os frascos de coleta nodevem ser
completamente preenchidos pelo alimento, sendo recomendvel
utilizar, no mxi-mo, trs quartos de sua capacidade, para facilitar
a posterior homogeneizao da amostra,antes da retirada da(s)
unidade(s) analtica(s).
c) Os frascos e utenslios no pr-esterilizados que sero
utilizados na coleta (esptulas, colheres,tesouras, pinas,
caladores, etc.) devem, de preferncia, ser esterilizados
individualmente emautoclave (121oC/30 minutos) ou em estufa de
esterilizao (17010oC/2h). Alguns outrosmtodos que podem ser
utilizados como alternativa so a flambagem em chama, a imerso
emetanol e combusto do lcool (no elimina esporos) e o tratamento
com solues desinfetan-tes. Nesse ltimo caso devem ser usados
desinfetantes aprovados para superfcies de contatocom alimentos,
aplicados conforme a orientao dos fabricantes e seguidos de 12
enxgescom gua destilada estril, para a remoo dos resduos. Frascos
ou bolsas no estreis queapresentem, num teste de lavagem da
superfcie interna, contagem demicrorganismos viveismenor do que 1
UFC/ml de capacidade, podem ser utilizados sem esterilizao
prvia.
1.3.2 PROCEDIMENTOS PARA ACOLETADE ALIMENTOS ACONDICIONADOS
EMEMBALAGENSNO INDIVIDUAIS
a) Antes de iniciar a coleta da unidade de amostra, promover uma
mistura de toda a massa dealimento, para garantir que a distribuio
dos microrganismos seja homognea. Retirar en-to, com utenslios ou
instrumentos adequados, a quantidade de produto necessria
paracompor a unidade de amostra.
b) Se no for possvel promover amistura damassa de alimentos
antes do incio da amostragem,retirar pores de diferentes partes do
contedo, at obter a quantidade de produto adequa-da para compor a
unidade de amostra. Evitar a retirada de pores das regies prximas
superfcie ou abertura do tanque ou volume.b1) Para coletar amostras
de p, em diferentes partes de tanques ou grandes embalagens,
podem ser utilizados caladores ou amostradores verticais de tubo
duplo, com compri-mento suficiente para atingir o centro da massa
de alimento. Usar um amostrador est-ril diferente para cada unidade
de amostra coletada, ou desinfetar o instrumento entreuma
amostragem e outra.
b2) Para compor uma unidade de amostra com pores de diferentes
pontos de alimentosem grandes peas slidas, deve-se usar facas,
pinas e frceps estreis para cortar peda-os menores do alimento.
b3) No caso de grandes blocos de alimentos congelados, como
blocos de pescados e frutosdo mar, blocos de ovo lquido, etc., o
mais adequado utilizar uma furadeira eltrica
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(comabroca previamente esterilizada) combinada comum funil
estril. A broca inseridano funil (cujo dimetro de abertura inferior
deve ser apenas ligeiramente maior que odimetro da broca) e
encostada no ponto do bloco que se deseja amostrar. Liga-se
afuradeira e as raspas congeladas do alimento vo-se dirigindo para
a superfcie, sendocoletadas no funil, de onde podem ser
transferidas para um frasco de coleta adequado.
b4) Quando a coleta for feita atravs de torneiras ou tubulaes,
limpar a parte externa dasada com etanol 70%, flambar, se omaterial
for resistente ao fogo, e deixar escoar umacerta quantidade do
produto, antes de iniciar a coleta. Isso vai promover uma lavagemda
tubulao e remover os resduos acumulados.
b5) Para a amostragem de margarina e produtos similares
(spreads) a ISO 6887-4 (2003)recomenda remover a camada externa (3
a 5mm) e retirar as unidades de amostra comum amostrador tipo
corer, previamente esterilizado. Introduzir o instrumento
nadiagonal, sem atingir o fundo, rodar num crculo completo e
retirar, trazendo uma por-o cnica do produto.
c) Lembrar que a superfcie externa dos frascos e bolsas de
coleta no estril. Assim, no segu-rar os frascos ou bolsas
diretamente acima da massa de alimento, pois podem cair ou
introdu-zir contaminantes no produto. Da mesma forma, nunca
introduzir um frasco de coleta direta-mente no produto,mas sim,
utilizar umutenslio adequado para retirar as unidades de
amostra.
d) Ao retirar o instrumento de coleta cheio com o produto
coletado, no manuse-lo sobre osoutros instrumentos
pr-esterilizados, pois respingos do alimento podem contaminar os
quesero utilizados posteriormente.
e) Abrir os frascos ou bolsas de coleta apenas o necessrio para
introduzir o produto e fecharimediatamente.
f) No tocar a superfcie interna dos frascos ou bolsas de coleta
e suas tampas.g) Alimentos contaminados podem conter microrganismos
perigosos para a sade. Essas amos-tras devem ser coletadas por
pessoal bem treinado namanipulao demicrorganismos, cientedos
cuidados necessrios para sua prpria proteo. Na dvida, tratar cada
amostra como seestivesse contaminada.
1.3.3 COLETA DE ALIMENTOS ENVOLVIDOS EM CASOS DE DOENAS
DEORIGEMALIMENTAR (DTAS)Coletar e analisar amostras de todos os
alimentos suspeitos, o mais cedo possvel. Entretan-
to, no adianta coletar amostras de alimentos que tenham sofrido
abuso de temperatura ou quej se encontrem em estado de parcial
deteriorao. Os resultados dessas anlises sero de poucaou nenhuma
utilidade para as concluses da investigao. Se no houver sobras das
refeiessuspeitas, pode-se tentar uma das seguintes alternativas:
coletar amostras de refeies similares,preparadas posteriormente sob
as mesmas condies, coletar amostras dos ingredientes e
mat-ria-prima utilizados na preparao das refeies suspeitas e
coletar os vasilhames onde as refei-es suspeitas se encontravam
acondicionadas.
1.3.4 COLETADE AMOSTRASDE GUAO Captulo 60 da 4a Edio do
Compendium (Kim & Feng, 2001) trata da coleta de gua
engarrafada, considerada pelo Codex Alimentarius como alimento.
Essas amostras devem sercoletadas na embalagem original, lacrada.
Em havendo interesse ou necessidade de coletar volumes
Coleta, Transporte e Estocagem de Amostras para Anlises
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menores, a partir de embalagens de maior capacidade, deve-se
homogeneizar todo o contedo,invertendo a embalagem vrias vezes,
desinfetar o bocal cometanol 70%e, em condies asspticas,abrir o
lacre com uma faca ou tesoura estril ou flambada. Desprezar o
volume inicial e coletar aamostra em um frasco estril adequado.
Para a coleta de outros tipos de gua, a parte 9000 da 21a Edio
do Standard Methods for theExamination of Water and Wastewater
(Hunt & Rice, 2005) traz as seguintes orientaes:
Para coletar amostras de torneiras e tubulaes, limpar a rea
externa da sada comuma soluo de hipoclorito de sdio a 100mg/l ou
com etanol 70%, flambando, se o materialfor resistente ao fogo.
Abrir totalmente a torneira e deixar a gua fluir por 2 a 3 minutos,
paralimpar a tubulao. Reduzir o fluxo para coletar a amostra sem
respingos para fora do frasco decoleta.
Para coletar amostras de gua de poo ou cisterna com bomba,
bombear a gua por 5 a10min, para estabilizar a temperatura da gua
antes da coleta. Se no houver uma bomba, prepa-rar os frascos de
coleta com um peso na base e introduzir o frasco diretamente no
poo. neces-srio cuidado para no contaminar a amostra com material
acumulado na superfcie da gua.
Para coletar amostras de gua de rios, lagos ou reservatrios,
segurar o frasco de coleta pelabase e mergulhar abaixo da superfcie
da gua, com a boca para baixo. Direcionar a boca dofrasco para a
corrente de gua e elevar ligeiramente, para que a gua fique retida.
Se no houvercorrente de gua, empurrar o frasco para frente
horizontalmente, no sentido contrrio ao damo.
Amostras de gua clorada devem ter o cloro residual neutralizado
imediatamente aps acoleta, para impedir a continuao do seu efeito
bactericida sobre a microbiota presente. Paratanto, adicionar aos
frascos de coleta, antes da esterilizao, 0,1ml de uma soluo 3%de
tiossulfatode sdio (Na2S2O3), para cada 100ml de amostra que se
pretende coletar. Essa quantidade sufi-ciente para neutralizar 5mg
de cloro residual por litro de amostra. Nas situaes emque a
concen-trao de cloro residual seja superior a 5mg/l, utilizar 0,1ml
de uma soluo 10% de tiossulfato desdio, para cada 100ml de amostra
que se pretende coletar. Essa quantidade suficiente paraneutralizar
15mg de cloro residual por litro de amostra. Podem tambm ser
utilizadas bolsas pls-ticas ou frascos estreis, disponveis
comercialmente j contendo o tiossulfato de sdio. Se a amostrafor
coletada e enviada ao laboratrio pelo prprio interessado, sem a
prvia neutralizao docloro, adicionar a soluo de tiossulfato de sdio
estril imediatamente aps a chegada da amos-tra, sob condies
asspticas.
Amostrasdeguacomteor altodemetais (maiorque1,0mg/l), incluindo
cobre e zinco, devemser coletadas em frascos com EDTA (cido
etilenodiaminotetraactico), agente quelante parareduzir a toxidade
dos metais sobre os microrganismos. Isso particularmente importante
se ointervalo entre a coleta e a anlise formaior do que quatro
horas. Para tanto, adicionar aos frascosde coleta, antes da
esterilizao, 0,3ml de uma soluo 15% de EDTA, para cada 100ml de gua
aser coletada (372mg/l). Ajustar o pH da soluo em 6,5 antes do uso.
As solues de EDTA etiossulfato podem ser adicionadas ao mesmo
frasco.
1.4 TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE AMOSTRASAT O MOMENTO DA ANLISE
Como regra geral, deve-se transportar e estocar amostras de
alimentos da mesma formacomo o produto normalmente transportado e
estocado na sua comercializao. As orientaesabaixo devem ser
observadas para garantir a integridade do produto at o momento das
anlises:
Manual deMtodos de AnliseMicrobiolgica de Alimentos
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1.4.1 TRANSPORTE E ESTOCAGEMDE ALIMENTOS COM BAIXA ATIVIDADE DE
GUAAlimentos desidratados, secos ou concentrados so estveis
microbiologicamente, podendo
ser transportados e estocados temperatura ambiente. Devem,
entretanto, ser protegidos contraa umidade.
1.4.2 TRANSPORTE E ESTOCAGEMDEALIMENTOSCONGELADOSAmostras de
alimentos comercializados na forma congelada devem ser
transportadas e
mantidas congeladas at o momento da anlise, no podendo sofrer
descongelamento total ouparcial durante o transporte. O Compendium
(Midura & Bryant, 2001) recomenda que a tempera-tura de
estocagem dessas amostras no seja superior a 20C negativos. A ISO
7218 (1996) reco-menda temperatura abaixo de 18oC negativos, de
preferncia 242oC negativos.
O transporte deve ser feito em caixas de isopor com gelo seco,
porm, certos cuidados de-vem ser observados. O produto no deve
entrar em contato com o gelo seco porque a absorodo CO2 pode
alterar o pH. Se a tampa da embalagem no vedar a entrada de gases
e/ou seembalagem for permevel aos gases e/ou se tornar quebradia
com o frio, deve-se usar umaembalagem secundria. Geralmente um
embrulho em papel grosso suficiente para preveniresse problema.
Rtulos e etiquetas usados na identificao das amostras devem ser
prova dgua, paraprevenir a perda dos dados.
1.4.3 TRANSPORTE E ESTOCAGEMDEALIMENTOSREFRIGERADOSAmostras de
alimentos comercializados na forma refrigerada devem ser
transportados e
mantidos sob refrigerao desde a coleta at o momento da anlise. O
Compendium (Midura &Bryant, 2001) recomenda, como regra geral,
estocagem entre 0 e 4,4oC e intervalo mximo de 36horas entre a
coleta e a anlise. A ISO 7218 (1996) recomenda estocagem entre 0 e
4oC (0 a 2oCpara amostras altamente perecveis como pescados e
midos) e intervalo mximo de 24 horasentre a coleta e a anlise. Na
impossibilidade de se proceder anlise no intervalo de
tempopreconizado, as amostras devem ser congeladas e mantidas nas
mesmas condies descritas paraamostras congeladas.
O Compendium (Midura & Bryant, 2001) recomenda que o
transporte seja feito em caixas deisopor com gelo, sendo
recomendvel o uso de sachs de gelo reutilizvel em gel, para evitar
oacmulo de lquido nas caixas. Na indisponibilidade de gelo em gel,
pode ser utilizado gelo co-mum, desde que acondicionado em bolsas
plsticas. Caixas bem fechadas, com espao amplopara gelo, suficiente
para envolver todos os frascos de amostra, podem manter
temperaturas derefrigerao adequadas por at 48 horas, na maioria das
situaes. Como regra geral, essas amos-tras no devem ser congeladas,
por isso, no recomendvel o uso de gelo seco nas caixas deisopor. Se
o tempo de trnsito for prolongado e houver necessidade de usar gelo
seco, as embala-gens de amostras no devem entrar em contato direto
com as embalagens de gelo seco, paraevitar o congelamento. Rtulos e
etiquetas usados na identificao das amostras devem ser aprova dgua,
para prevenir a perda dos dados.
Excees. Para certos produtos ou microrganismos as recomendaes so
diferenciadas:a) No captulo especfico para bactrias lcticas o
congelamento no recomendado, devido grande susceptibilidade desses
microrganismos s injrias pelo congelamento.
Coleta, Transporte e Estocagem de Amostras para Anlises
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b)No captulo especfico para vibrios patognicos recmenda-se que
as amostras sejam estocadassob resfriamento moderado (7-10C) e
analisadas o mais rapidamente possvel, porque a tem-peratura tima
de manuteno de 15-18C e a maioria das cepas no sobrevive bem a 4C.
Ocongelamento das amostras desaconselhado e, em caso de absoluta
necessidade, deve serfeito a 80C negativos.
c) No caso de C. perfringens devem ser analisadas, se possvel,
imediatamente, pois a estocagempor poucos dias sob refrigerao ou
congelamento pode levar a uma reduo de 3 a 5 cicloslogartmicos na
contagem em placas. Na impossibilidade de se proceder anlise
imediata, oCompendium (Labbe, 2001) recomenda sejam refrigeradas
pelo menor tempo possvel, nodevendo ser congeladas ou mantidas sob
refrigerao prolongada. Havendo necessidade deestocagem por mais de
48 horas, tratar as amostras com Soluo Tamponada Glicerol Sal
(naquantidade requerida para atingir a concentrao final de 10% na
amostra) e estocar entre 55e 60oC negativos. O Bacteriological
Analytical Manual (Rhodehamel &Harmon, 2001) recomen-da que
sejam analisadas imediatamente ou refrigeradas por nomais de oito
horas, tempera-tura prxima de 10oC. Para transporte e estocagem por
perodo superior a oito horas, prepararassepticamente a amostra para
o congelamento, da seguinte forma: transferir pores de 25gbolsas
plsticas, adicionar 25ml da Soluo Tamponada Glicerol Sal, excluir o
ar das bolsas emisturar. Para amostras lquidas, misturar pores de
25ml com igual volume da SoluoTamponada Glicerol Sal, em concentrao
dupla. Congelar imediatamente, em freezera 20-30C negativos. Para o
transporte, transferir as amostras tratadas para frascos no
perme-veis ao CO2 (Nalgene ou equivalente) e transportar em caixa
de isopor com gelo seco. Manteras amostras congeladas at o momento
da anlise, de preferncia por poucos dias.
d)No captulo especfico para Campylobacter a ISO 10272-1 (2006)
destaca a sensibilidade deCampylobacter ao congelamento e secagem,
recomendando que as amostras no sejam con-geladas e que sejam
protegidas contra a perda de umidade. Indica estocagem 32oC e
anliseo mais rpido possvel. O Microbiological Laboratory Guidebook
(Ransom & Rose, 1998) destacaque Campylobacter sensvel ao
congelamento e morre temperatura ambiente. Durante aestocagem
refrigerada (indica 4oC) pode ser sobrepujado pela microbiota
psicrotrfica acom-panhante nas amostras, que devem ser analisadas o
mais rpido possvel. Se o congelamentofor inevitvel, devem ser
usados agentes criopotetores (glicerol ou dimetil sulfxido na
concen-trao de 10% em relao quantidade de amostra). Para a
estocagem congelada de swabs,indica Caldo Brucella suplementado
com10%de polivinil pirrolidina.OBacteriological AnalyticalManual
(Hunt et al., 2001) destaca que Campylobacter sensvel ao ar,
secagem, baixo pH, aque-cimento, congelamento e estocagem
prolongada, podendo sofrer injrias que dificultam adeteco. Clulas
velhas ou estressadas gradualmente adquirem forma cocoide e se
tornammais difceis de cultivar. Para estocagem prolongada,C. jejuni
subsp jejuni pode sobreviver duasa quatro semanas sob refrigerao
(4oC), se for garantida baixa tenso de oxignio e proteocontra perda
de umidade (exceto no caso de leite cru). Nas mesmas condies, tambm
podesobreviver dois a cincomeses a 20oC negativos. Outras espcies,
nas mesmas condies, podemsobreviver (mas no se multiplicar) uma a
trs semanas a 4oC (exceto no caso de leite cru). Apopulao diminui
dois ciclos logartmicos a 20oC negativos, mas os sobreviventes
podem serrecuperados aps mais de cinco meses. Uma vez abertos os
frascos ou embalagens, a anlisedeve ser feita o mais rpido possvel,
porque a introduo de oxignio particularmente dele-tria para as
clulas, j debilitadas pela estocagem prolongada.
Manual deMtodos de AnliseMicrobiolgica de Alimentos
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e) No captulo especfico para contagem de aerbios psicrotrficos,
recomenda-se que as amos-tras sejam analisadas no intervalo de seis
horas, a partir da coleta. A estocagem refrigeradapermite a
multiplicao dos psicrotrficos e o tempo de gerao de vrios desses
microrganis-mos encontra-se dentro desse intervalo. O congelamento
no indicado para essas amostras,porque pode provocar injria ou
morte de vrios microrganismos. Se o congelamento forindispensvel
considerar na avaliao dos resultados que parte da microbiota pode
ter sidoperdida.
f) Amostras demoluscos e crustceos (ostras, mexilhes, mariscos,
camares, etc. devem ser ana-lisadas dentro de no mximo 6 horas aps
a coleta, no devendo ser congeladas (Midura &Bryant, 2001).
g) Amostras de ovo lquido refrigerado devem ser analisadas, se
possvel, dentro de 4 horas apsa coleta, no devendo ser congeladas
(Ricke et al., 2001).
h)Amostras de produtos vegetais fermentados ou acidificados no
comercialmente estreis de-vem ser estocadas sob refrigerao por no
mais do que 24 horas, no devendo ser congeladas(Fleming et al.,
2001).
1.4.4 TRANSPORTE E ESTOCAGEMDE ALIMENTOS COMERCIALMENTEESTREIS
EM EMBALAGENS HERMTICASAlimentos comercialmente estreis
comembalagens em condies normais, podem ser trans-
portados e estocados temperatura ambiente, devendo ser
protegidos contra exposio a tempe-raturas superiores a 45oC.
Amostras de refrigerantes engarrafados, comercializados
temperatu-ra ambiente, tambm podem ser transportados e estocados
nessas condies.
Embalagens estufadas devem ser acondicionadas em bolsas plsticas
devido ao perigo devazamento de material de alto risco
microbiolgico. O transporte e a estocagem devem ser feitossob
refrigerao (0 a 4C) e o intervalo entre a coleta e a anlise deve
ser o menor possvel, nodevendo ultrapassar 48h (ISO 7218:1996). Por
outro lado, se a anlise destinar-se confirmaode suspeita de
deteriorao por bactrias termfilas, a refrigerao contra-indicada,
porque asclulas vegetativas desses microrganismos usualmente morrem
sob efeito do frio, no sendo co-mum a ocorrncia de esporulao nos
produtos enlatados (Denny & Parkinson, 2001).
1.4.5 TRANSPORTE E ESTOCAGEMDE AMOSTRAS DE GUAO Captulo 60 da 4a
Edio do Compendium (Kim & Feng, 2001) recomenda:
a) Para gua engarrafada na embalagem original, lacrada,
transporte e estocagem temperaturaambiente, sem necessidade de
refrigerao.
b) Para embalagens abertas ou amostras transferidas para outros
frascos, transporte e estocagemsob refrigerao (no especifica a
temperatura) e intervalo entre coleta e anlise preferencial-mente
de 8h, no devendo ultrapassar 24h.Para outros tipos de gua, a parte
9000 da 21a Edio do Standard Methods for the Examination ofWater
and Wastewater (Hunt & Rice, 2005) traz a seguinte
orientao:
a) Como regra geral, transporte e estocagem sob refrigerao
(menor que 10oC) e intervalo entrecoleta e anlise no superior a
24h.
b) Para avaliao da conformidade de gua potvel, transporte e
estocagem sob refrigerao (menorque10oC)e intervalo entre coleta e
anliseno superior a 30h, paraquantificaode coliformes, ou8h, para a
quantificao de heterotrficos (contagem total de aerbios mesfilos em
placas).
c) Para a avaliao da conformidade de gua no potvel, transporte e
estocagem sob refrigera-o (menor que 10oC) e intervalo entre coleta
e anlise no superior a 8h.
Coleta, Transporte e Estocagem de Amostras para Anlises
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1.5 RECEPO DE AMOSTRAS PARA ANLISE
Na recepo de amostras para anlise no laboratrio, devem ser
observadas as condies daembalagem e as condies em que foi feito o
transporte, antes da aceitao do pedido de anlise.Deve ser recusada
qualquer amostra com embalagem rasgada, furada, violada, com corpos
estra-nhos ou qualquer outro tipo de defeito, bem como amostras
transportadas sob condies inade-quadas. Se o interessado estiver
encaminhando amostra com embalagem j aberta ou com seloviolado
(comum no caso de amostras encaminhadas para responder a reclamaes
de consumi-dores, por exemplo), pode-se proceder anlise, dependendo
do tipo de embalagem, tipo deproduto e microrganismos investigados,
porm, as condies em que a amostra foi recebida de-vem constar da
identificao da amostra e do laudo final de anlise.
1.6 REFERNCIAS
AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA (ANVISA). Resoluo RDC 12
de 02 de janeiro de 2001 - Regula-mento Tcnico Sobre
PadresMicrobiolgicos para Alimentos. DirioOficial daUnio, 10
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DENNY, C.B. & PARKINSON, N.G. Canned foods Tests for cause
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Microbiological Examination of Foods, 4th ed.Washington:American
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FLEMING, H.P., McFEETERS, R.F. & BREIDT, F. Fermented and
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Environment Federation (WEF), 2005. Part 9000, p.9.1-9.169.
ICMSF (International Commission on Microbiological
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7.Microbiological Testing in Food SafetyManagement.Kluwer
Academic/PlenumPublishers, New York (ISBN0-306-47262-7).
ISO 6887-4. Microbiology of food and animal feeding stuffs
Preparation of test samples, initial suspension anddecimal
dilutions formicrobiological examination Part 4:Specific rules for
the preparation of products other thanmilk andmilk products, and
fish and fishery products, 1st ed. The International Organization
for Standardization, 2003.
ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs General
rules for microbiological examination, 2nd ed.
TheInternationalOrganization for Standardization, 1996.
ISO 10272-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs
Horizontal method for the detection and enumeration ofCampylobacter
Part 1: DetectionMethod, 1th ed. The International Organization for
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Coleta, Transporte e Estocagem de Amostras para Anlises
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Captulo 2
Preparao de Amostras para Anlise
2.1. INTRODUO
Amaioria das orientaes contidas nesse captulo so da American
PublicHealth Association(APHA), descritas na 4 Edio do Compendium
of Methods for Microbiological Examination of Foods(Downes &
Ito, 2001). Quando diferentes ou complementares s do Compendium,
foram tambmincludas recomendaes da 21 Ediodo StandardMethods for
the Examination ofWater andWastewater(Eaton et al., 2005),
especficas para a anlise de gua, da 17 Edio do Standard Methods for
theExamination of Dairy Products (Wehr & Frank, 2004),
especficas para a anlise de produtoslcteos e de vrias normas da
International Organization for Standardization (6887-1:1999,ISO
6887-2:2003, ISO 6887-3:2003, ISO 6887-4:2003, ISO 7218:1996, ISO
8261:2001, ISO17604:2003), recomendadas para ensaios realizados
commetodologia ISO.
A preparao das amostras para a anlise envolve trs etapas, que so
a homogeneizao docontedo e retirada da unidade analtica, a preparao
da primeira diluio da unidade analticae a preparao de diluies
decimais seriadas, para inoculao nos meios de cultura.
Antes de iniciar os procedimentos, a ISO 7218 (1996)
recomenda-se que sejam observadosos seguintes cuidados para
garantir que as atividades sejam conduzidas sob condies
asspticas:
Assegurar-se de que a rea de trabalho est limpa e as portas e
janelas fechadas, para evitarcorrentes de ar.
Desinfetar todas as superfcies de trabalho com um desinfetante
adequado (etanol 70%,cloreto de benzalcnio a 500ppm, hipoclorito de
sdio ou outro composto de cloro a 200ppm soadequados)
Assegurar-se de que todo o material necessrio esteja disponvel
nas bancadas.Lavar as mos e desinfetar com um desinfetante adequado
ao contato com a pele. Se reque-
rido, colocar luvas, verificando a necessidade ou no de luvas
nos captulos especficos de ensaioscom patgenos.
Trabalhar preferencialmente no interior de capelas de fluxo
laminar vertical, para prevenira contaminao da amostra pelo
ambiente e do analista pela amostra. Na indisponibilidade deuma
capela de fluxo laminar, trabalhar na regio prxima chama de um bico
de Bunsen que,em bom funcionamento, deve ter a chama azulada.
Evitar a formao de aerossis ao abrir tubos e/ou frascos depois
de agitar, liberar o conte-do de pipetas ou flambar alas de
inoculao.
Nunca pipetar com a boca, mas sim, usando pipetadores.Depois de
usados, acomodar as pipetas e outros utenslios em bandejas de
descarte, no
diretamente sobre as bancadas.
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Todos os instrumentos e utenslios utilizados na abertura das
embalagens e retirada dasunidades analticas (tesouras, pinas,
facas, esptulas, etc.) devem ser previamente esterilizados(em
autoclave ou estufa de esterilizao) ou mergulhados em etanol 70% e
flambados no mo-mento do uso.
Antes de abrir as embalagens, desinfetar a rea externa com
etanol 70%, para remover oscontaminantes presentes. No caso de
embalagens flexveis, cortar com uma tesoura estril. Nocaso de
embalagens rgidas com tampa rosquevel, desrosquear e remover a
tampa assepticamente.No caso de latas com sistema de abertura tipo
easy open, abrir assepticamente e remover atampa. No caso de latas
sem sistema easy open, usar um abridor de latas estril. No caso de
latas,vidros, caixinhas e outras embalagens destinados ao teste de
esterilidade comercial, devem serseguidos procedimentos
diferenciados, descritos no Captulo especfico. Esses
procedimentosobjetivam garantir a integridade da selagem, para
anlises posteriores da embalagem, se
necessrias.Observareanotarqualqueranormalidadenasembalagensounocontedo
interno, comoestufamento,vazamento, odor e/ou aparncia estranha,
presena de corpos estranhos, etc.
2.2.MATERIAL NECESSRIO
Reagentes e diluentes Etanol 70% Soluo de iodo Cloreto de
benzalcnio a 500ppm, hipoclorito de sdio ou outrocomposto de cloro
a 200ppm
gua Peptonada 0,1% (H2Op) Tampo Fosfato pH 7,2 (PB) gua Salina
Peptonada (H2Osp) gua Peptonada Tamponada (BPW) Soluo de Ringer de
concentrao Tampo Fosfato Cloreto de Magnsio Soluo de fosfato de
potssio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7,50,2 Soluo de fosfato de
potssio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 8,40,2 Soluo de fosfato de
potssio (K2HPO4) 2% com anti espumante e pH ajustado em7,50,2 Soluo
de fosfato de potssio (K2HPO4) 2% com anti espumante e pH ajustado
em8,40,2 Soluo de citrato de sdio (Na3C6H5O7.2H2O) 2% Leite em p
desnatado dissolvido em Tampo Fosfato (0,1g/100ml) Soluo de
tripolifosfato (Na3O10P3) 2% Tergitol-7 Aninico ou Tween 80 Sulfito
de potssio (K2SO3) Soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 1N estril Soluo
de cido clordrico (HCl) 1N estril Soluo alcolica de prpura de
bromocresol a 0,04%
Equipamentos Capela de fluxo laminar vertical Bico de Bunsen
Shaker
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Refrigerador com temperatura abaixo de 4oC com termmetro
calibrado Banho maria com temperatura regulvel na faixa de 30 a
45C,com termmetro calibrado
Furadeira eltrica e brocas esterilizadas Balana calibrada
Agitador magntico com barras magnticas esterilizadas Liquidificador
Homogeneizador peristltico (stomacher) Agitadores tipo vortex
Instrumentos e utenslios Tesouras Pinas Facas Martelos Esptulas
Bagetas de vidro Pipetas de capacidade variada Funis estreis de
capacidade variada Swabs e esponjas para amostragem de superfcies
Moldes para amostragem de superfcies Bandejas de descarte
2.3. HOMOGENEIZAO DA AMOSTRA E RETIRADA DAUNIDADE ANALTICA
Unidade analtica a quantidade de material retirado da amostra
para ser utilizado na rea-lizao de um ou mais ensaios. O nmero de
unidades analticas que devem ser retiradas e aquantidade de
material em cada unidade analtica depende do nmero e tipos de
ensaios quesero realizados na mesma amostra. De maneira geral so
necessrias:a) Unidades analticas para os ensaios de presena/ausncia
com enriquecimento em caldo espe-cfico. requerida uma unidade
analtica para cada ensaio (Salmonella, Listeria
monocytogenes,Yersinia enterocolitica,Campylobacter sp, Escherichia
coliO157:H7,Enterobacter sakazakii,Vibrio cholerae,Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio vulnificus). A quantidade de material em
cada uma dessas unida-des analticas definida nos captulos
especficos para esses ensaios.
b) Unidades analticas para os ensaios com tratamento
diferenciado da amostra. requerida umaunidade analtica para cada
ensaio (esterilidade comercial, contagem de esporos de
bactrias,contagem de bolores termorresistentes e outros). A
quantidade de material em cada umadessas unida