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5/24/2018 Manual Del Laboratorio de Biotecnologia Molecular
Instituto Politcnico NacionalUnidad Profesional
Interdisciplinaria de Biotecnologa
Laboratorio de Biotecnologa Molecular
Manual elaborado por Paola Berenice Zrate Segura, Csar Agustn
Jimnez Sierra, Jess Agustn Badillo Corona y ClaudioGaribay
Orijel
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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA
DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
ACADEMIA DE BIOTECNOLOGA
MANUAL DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA MOLECULAR
ELABORADO POR:
M. en C. Paola Berenice Zrate Segura
I. Bt. Csar A. Jimnez Sierra
Dr. Jess Agustn Badillo Corona
Dr. Claudio Garibay Orijel
Dra. Mara del Carmen Oliver Salvador
Mxico D. F. Agosto 2009
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Relacin de prcticas
PRCTICA 1. Bioseguridad
PRCTICA 2. Cuantificacin de ADN
PRCTICA 3. Extraccin de ADN
PRCTICA 4. Cuantificacin de ADN en gel de agarosa
PRCTICA 5. Extraccin de ARN
PRCTICA 6. Extraccin de ADN plasmdico por lisis alcalina
PRCTICA 7. Insercin de material gentico en un plsmido
bacteriano.
PRCTICA 8. Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR).
PRCTICA 9. Mtodo para preparar clulas competentes deEscherichia
colicon CaCl2
PRCTICA 10. Transformacin de clulas competentes
PRCTICA 11. Inmunodeteccin en estado slido
PRCTICA 12. Inmuno ensayo Ligado a enzimas (ELISA)
PRCTICA 13. Transformacin gentica de plantas de tabaco
(Nicotiana tabacum)utilizandoAgrobacterium tumefaciens
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PRCTICA 1. Bioseguridad
Segn la Ley de Bioseguridad de organismos genticamente
modificados publicada en elDiario Oficial de la Federacin el 18 de
marzo del 2005 (1), bioseguridad se define como:
Las acciones y medidas de evaluacin, monitoreo, control y
prevencin que se debenasumir en la realizacin de actividades con
agentes biolgicos, con el objeto de prevenir,evitar o reducir los
posibles riesgos que dichas actividades pudieran ocasionar a la
saludhumana o al medio ambiente y la diversidad biolgica,
incluyendo los aspectos deinocuidad de dichos organismos que se
destinen para uso o consumo humano.
Por otra parte, como Biotecnologa moderna se entiende:
la aplicacin de tcnicas in vitro de cidos nucleicos, incluidos
el cidodesoxirribonucleico (ADN) y el cido ribonucleico (ARN)
recombinante y la inyeccindirecta de cido nucleico en clulas u
organelos, o la fusin de clulas ms all de la familiataxonmica, que
supera las barreras fisiolgicas naturales de la reproduccin o de
larecombinacin y que no son tcnicas utilizadas en la reproduccin y
seleccin tradicional,que se aplican para dar origen a organismos
genticamente modificados, que se determinenen las normas oficiales
mexicanas que deriven de esta Ley (1)
Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:
A) Universalidad: Todo el personal debe seguir las precauciones
estandarizadas de manera
rutinaria para prevenir la exposicin de la piel y de las
membranas mucosas, en todas lassituaciones que puedan dar origen a
accidentes. Estas precauciones, deben ser aplicadas pory para TODAS
las personas.
B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposicin
directa a agentesbiolgicos infecciosos o sustancias potencialmente
contaminantes, mediante la utilizacinde materiales adecuados que se
interpongan para evitar el contacto con estos agentes ysustancias.
La utilizacin de barreras (ej. bata de laboratorio, guantes, lentes
de proteccin,mascarillas, etc.) no evitan los accidentes de
exposicin a estos fluidos, pero disminuyen lasconsecuencias de
dicho accidente.
C) Medios de eliminacin de material contaminado: Comprende el
conjunto de dispositivosy procedimientos adecuados a travs de los
cuales los materiales biolgicos y qumicosutilizados en los
laboratorios son depositados para su almacenamiento y
posterioreliminacin sin que se presente ningn riesgo.
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Algunos aspectos importantes en Bioseguridad incluyen (2):
Contencin
El trmino contencin se utiliza para describir mtodos seguros
para manejar materialesbiolgico-infecciosos en el medio ambiente
del laboratorio donde son manipulados oconservados. El objetivo de
la contencin es reducir o eliminar la exposicin de quienestrabajan
en laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a
agentespotencialmente peligrosos.
La contencin primaria se refiere a la proteccin del personal y
del medio ambienteinmediato del laboratorio a la exposicin a
agentes infecciosos, es provista tanto mediantebuenas tcnicas
microbiolgicas como a travs del uso de equipos de seguridad
adecuados.
La contencin secundaria, se refiere a la proteccin del medio
ambiente externo al
laboratorio a la exposicin a materiales infecciosos. Esta
contencin se logra utilizando unacombinacin del diseo de la
instalacin y de las prcticas operativas. Por lo tanto, los
treselementos de contencin incluyen prcticas y tcnicas de
laboratorio, equipos de seguridady el diseo de la instalacin. La
evaluacin del riesgo del trabajo a realizar con un agenteespecfico
determinar la combinacin apropiada de estos elementos.
Equipos de Seguridad (Barreras Primarias)
Los equipos de seguridad incluyen gabinetes de seguridad
biolgica (BSCs), recipientescerrados, y otros controles de
ingeniera destinados a eliminar o minimizar las exposicionesa
materiales biolgicos peligrosos.
Un ejemplo de otra barrera primaria es la cubeta centrfuga de
seguridad, un recipientecerrado destinado a prevenir la liberacin
de aerosoles durante el centrifugado.
Diseo y Construccin de Instalaciones (Barreras Secundarias)
El diseo y la construccin de la instalacin contribuyen a la
proteccin de quienes trabajanen el laboratorio, proporcionan una
barrera para proteger a las personas que se encuentranfuera del
laboratorio, y protegen a las personas o animales de la comunidad
de agentesinfecciosos que pueden ser liberados accidentalmente del
laboratorio.
Niveles de Bioseguridad. Existen cuatro niveles de bioseguridad
(BSLs), que constan decombinaciones de prcticas y tcnicas de
laboratorio, equipos de seguridad e instalacionesde laboratorio.
Cada combinacin es especficamente apropiada para las
operacionesllevadas a cabo, las vas de transmisin documentadas o
sospechosas de los agentesinfecciosos, y la funcin o la actividad
del laboratorio (tabla 1).
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Tabla 1. Niveles de bioseguridad recomendados para el trabajo
con agentes infecciosos (2)
NIVELGrupo deRiesgo
Agentes PrcticasBarrera Primaria
(Equipos)Barrera Secundaria
(Instalaciones)Tipo de
Laboratorio
I
Bajo riesgoindividualBajo,
RiesgoComunitario
Que no causen
enfermedad enindividuosadultos
saludables(Cepas
silvestres)
Prcticasmicrobiolgicas
comunes
Campana deflujo laminar
Mesa de Laboratorio
con servicio de agua ydrenaje. Enseanza
Bsica
II
Moderadoriesgo
individual,Riesgo
comunitario
limitado
Asociados conenfermedad enhumanos, endonde hayariesgo de
infeccin porheridas
percutneas,ingestin y
exposicin de
membranamucosa
(Shigella,Staphylococcus,
Sporotrix)
NBS 1. AccesoLimitado. Deben
utilizarsesealamientos, se
deben tomar medidasde precaucin enmaterial punzo
cortante. Debe contarcon manual deBioseguridad
definiendo
procedimientos ypolticas de
confinamiento,desinfeccin de zonas
y materiales yatencin mdica.
Gabinetes deBioseguridadClase I o II,equipo paraprevenir
derrames odifusin de
aerosoles. Elpersonal debe
utilizar Bata,guantes y cubrebocas o careta,de ser
necesario.
NBS 1. Adems, debeexistir autoclave.
Servicios desalud, Hospital
de nivelprimario,
laboratorios dediagnstico y
Laboratorios de
nivelUniversitario
III
Alto riesgoindividual,Bajo riesgocomunitario
Agentesautctonos oexticos con
riesgo detransmisin poraerosoles y que
causenenfermedadesserias o letales
(Brucilla,
Hystoplasma)
NBS 2. Accesocontrolado.
Procedimientosrutinarios de
desinfeccin de ropa,desechos y materialprevio al lavado.
Todas lasanteriores,incluyendo
proteccin delsistema
respiratorio.
NBS 2, Separacin delos corredores de
acceso, puertas dobles(sistema de exclusa).
Debe evitarse larecirculacin del aire.
Presin de airenegativa en el rea de
trabajo
Laboratorios deDiagnstico
Especializado.
IV
Alto riesgoIndividual,Alto riesgo
Comunitario
Agentespeligrosos o
exticos con altoriesgo de causar
enfermedadmortal por
transmisin poraerosoles o
agentes similarescon forma detransmisindesconocida
(EBOLA, SARS,B. Antracis)
NBS 3. Ropa (trajes)individuales,
equipados en cuartosprevios al rea de
trabajo. Regadera a lasalida del Laboratorio.
Mecanismo dedescontaminacin del
rea de trabajo.
Gabinetes deBioseguridadTipo 3. Trajesindividualessellados
consistema derespiracinautnomo y
presin de airepositiva
NBS 3. Debe ser unazona aislada, con
sistemas individualesde obtencin y
liberacin de vaco,sistema de suministroy descontaminacin de
aire, generador deenerga auxiliar.
Laboratoriosque trabajan con
agentespatgenospeligrosos
NBS = Nivel de Bioseguridad
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OBJETIVO
Informar y motivar a los alumnos sobre principios y normas de
bioseguridad para suaplicacin activa en el trabajo de
laboratorio
ACTIVIDADES
Actividad dinmica por los alumnos para identificar los posibles
riesgos en el laboratorio ylas medidas necesarias que se pueden
llevar a cabo para minimizarlos.
Identificar y describir los equipoa en el laboratorio. Entender
los procedimientos adecuadospara la utilizacin de estos
equipos.
REFERENCIAS
1. LEY DE BIOSEGURIDAD DE ORGANISMOS
GENTICAMENTEMODIFICADOSNueva Ley DOF 18-03-2005
2. http://www.cdc.gov/od/ohs/pdffiles/bmbl4_spanish.pdf
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(
PRCTICA 2. Cuantificacin de ADNINTRODUCCIN
En la mayora de los casos cuando se trabaja con ADN es
importante realizar una
cuantificacin de la cantidad con la que se dispone. La
cuantificacin del ADN se puedellevar a cabo por estimacin de la
intensidad de una banda en geles de agarosa en el que elADN es
teido por algn colorante como Bromuro de Etidio, Syber Green o Gel
Red, obien mediante tcnicas de espectrofotometra de luz
ultravioleta.
Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen
que los cidosnucleicos absorban luz ultravioleta (UV). El espectro
de absorcin caracterstico de ANpresenta un mximo a !~ 260 nm. Si
bien el coeficiente de extincin de un cido nucleicoen particular
depende de la secuencia de nucletidos, algunas reglas empricas
permitenestimar la concentracin a partir del valor de A260 nm. As,
una unidad de absorbancia a 260nm corresponde aproximadamente a una
concentracin de 50 g/mL de ADN doble hebra,
40 g/mL de ARN o 33 g/mL de fragmentos cortos de ADN
monohebra.
En las preparaciones de cidos nucleicos, son frecuentes las
impurezas de naturalezaproteca. Dado que los aminocidos aromticos
(Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, lapresencia de protenas lleva a
sobrestimaciones de la concentracin de cidos nucleicos.Dado que el
mximo de absorbancia de las protenas se encuentra en !~ 280 nm, es
posibleestimar el grado de impurezas de origen proteico a partir
del cociente A260/A280. Lapresencia de protenas en la muestra har
que el cociente A260 nm/A280 sea menor que elesperado para cidos
nucleicos puros. Para el ADN doble hebra en soluciones de
altapureza se espera A260/A280"1.8, y para ARN, A260/A280 "2.0.
Para que la cuantificacin de cidos nucleicos sea adecuada se
requiere la habilidadde medir de manera exacta y reproducible. El
transferir volmenes pequeos de lquidos escrtico para obtener
resultados confiables es por ello que en los laboratorios de
biologamolecular para medir volmenes pequeos, se utiliza un
dispositivo conocido comomicropipeta (Fig 1). Las micropipetas
tienes diferentes capacidades de medida, 0.1-1 #L,0.5-10 #L,
10-100#L, 20-200 #L, 100-1000 #L, 1000-5000 #L. .
OBJETIVOS
Objetivo General
Llevar a cabo al cuantificacin de ADN por mtodos
espectrofotomtricosObjetivos especficos
Conocer las partes y el funcionamiento de las micropipetas,
Adquirir destreza en la utilizacin de pipetas para la medicin de
volmenespequeos.
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)
Figura 1. Micropipeta. Se muestran las diferentes partes de la
pipeta as como puntas dediferente tamao para la medicin de
diferentes volumenes.
MATERIALES
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipoAgua
desionizadaBalanza analtica con lmite de 0,0001 gTapas de cajas de
petri de plsticoPuntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000
#L)Muestra de ADN en solucin de concentracin desconocida
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*
METODOLOGA EXPERIMENTAL
MANEJO DE LA MICROPIPETA
Importante: Para el uso adecuado de la micropipeta asegrese que
est usando lamicropipeta correcta para el volumen que necesita
medir. Tambin, asegrese que lamicropipeta est realmente lista para
el volumen que necesita revisando la ventana devolumen. Si es
necesario, cambiar el volumen mediante el dispositivo del control
omando del volumen hasta que la micropipeta corrija el volumen (la
micropipeta no lee sumente; varias personas usarn las pipetas, no
siempre se encontrar como usted la necesita).
NO trate de colocar la micropipeta para volmenes mayores que el
mximo, o para
volmenes menores del cero, esto descalibrar y daar la
micropipeta.
1) Partes de la micropipetaa) Identificar las partes de la
micropipeta ayudndose de la imagen en la Figura 1.b) Observar las
diferencias entre la micropipeta a usar y la mostrada en al
Figura
2) Llenado de la pipeta
a) Colocar una punta segn corresponda.b) Colocar el pulgar sobre
el mando o mbolo de pipeteado.
c) Oprimir el mbolo hasta el primer un punto de resistencia alto
o "tope". Sicontina presionando encontrar un punto donde el mbolo
ya no se mueve haciaabajo, este corresponde al segundo punto de
resistencia alto o "tope".
d) Oprimir el mbolo hasta el primer tope y colocar la punta
dentro del lquido hastauna profundidad menor a 1 mm. De una manera
lenta y controlada, disminuya lapresin del mbolo para permitir que
se desplace hacia arriba. No suelte el mboloabruptamente, al
permitirlo causar que el lquido pueda salpicar dentro de la
puntaproduciendo volmenes inexactos y generando contaminacin de la
pipeta. Una vezel mbolo se haya desplazado hasta arriba mantenga la
micropipeta en el lquidodurante un segundo, esto evita que se
aspire aire en la parte final.
3) Expulsin de la muestra
a) Llevar la micropipeta al tubo de polipropileno de 1.5 mL.b)
Se apoya la punta en la pared inferior del tubo.c) Oprimir el mbolo
hasta el primer tope y luego hasta el segundo tope. Haga este
procedimiento a una velocidad moderada, hacerlo muy rpido har
que quedengotas de muestra en la punta. Si observa cuidadosamente,
entonces notar que aloprimir hasta el segundo alto se expele todo
el lquido de la punta.
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"+
d) Lo anterior es cierto para la mayora de soluciones acuosas,
excepto para lassoluciones de alta viscosidad como el Glicerol. Si
es usada inadecuadamente, lamicropipeta transferir volmenes
inexactos.
4) Calibracin de Micropipeta
La micropipeta puede perder su calibracin. Comprobar la
calibracin de la pipeta es unprocedimiento simple que puede ahorrar
tiempo considerable, energa, y reactivos. En estaprctica aprender a
usar la micropipeta de tamaos diversos medir su exactitud,
precisiny calibracin.Para cada micropipeta revisar el porcentaje de
exactitud (E%) y el coeficiente de variacin(CV%) en todo el rango
usando al menos dos volmenes diferentes; por ejemplo: Para
lamicropipeta P1000 revisar los volmenes de 300 L y 1000 L. Para
P200 revisar losvolmenes de 60 y 200 L. Para P10 revisar 3 y 10
L.
a) Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas.b) Colocar
la tapa de la caja de petri en la balanza y tarar a cero.c) Tomar
el volumen de agua destilada con la micropipeta y dispnselo en la
tapa de la
caja de petri. Registre el peso del agua aadido. La densidad del
agua es 1 g/mL a25C, por lo tanto un volumen de 1 mL corresponde
aproximadamente a una masade 1 g, 300 L a 0.3 g, 200 L a 0.2 g, 60
L a 0.06 g, 10 L a 0.01 g y 3 L a0.003 g.
d) Repita el procedimiento cinco veces para cada volumen.e)
Repetir todo el procedimiento para glicerol. La densidad del
glicerol es de 1,2656
g/mL a 25 C.f) Calcular la masa esperada para cada volumen
5) Clculo de la exactitud (E%) y del coeficiente de variacin
(CV%)
Valor medioX = $Xi /n
donde Xi= pesadas, n= numero de pesadas
Volumen medioV=X.Z donde X= valor medio y Z= factor z
(1/densidad)
Valore del control a 21,5 C (Z = 1,0032)
Exactitud E(%)= ((V-Vnominal)/Vnominal) *100
Desviacin estndarS = Z . ! $(Xi X)2
n 1
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Coeficiente de Variacin
CV= (S*100)/V
Lmites de tolerancia para micropipetas
Volumen (L) E% nominal CV% nominal
5-101 0.8
20-50 0.7 0.4100-1000 0.5 0.2
Una vez determinadas la exactitud y el coeficiente de variacin
de las micropipetasproporcionadas, realice la cuantificacin de las
muestras proporcionadas.
6) Cuantificacin de ADN
Preparacin de las muestras.
a) Realice diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000 de las muestras
proporcionadas portriplicado con agua Milli Q estril, en tubos de
polipropileno estriles.
b)c) Encienda el espectrofotmetro al menos 15 minutos antes de
iniciar las lecturas.d) Mantenga las muestras en hielo o en
refrigeracin hasta ser cuantificadase) Cuantifique las muestras a
260 y 280mnf) Realice los clculos correspondientes
Muestra Dilucin Lectura260 nm
Lectura280 nm
Relacin260/280
ADN(ng/#L)
ADN(fg/#L)
ADN(mg/#L)
ADN1ADN2
REFERENCIAS
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 3 ed. EdCold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA
2001. 2344 pgs.
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PRCTICA 3. Extraccin de ADN
INTRODUCCIN
Hay diferentes tcnicas que permiten obtener cidos nucleicos con
alto grado de pureza.Las ms utilizadas suelen incluir una etapa de
ultracentrifugacin en gradientes de CsCl ouna cromatografa de
intercambio inico. Sin embargo, muchas aplicaciones de
laboratoriono necesitan un grado de pureza tal que justifique
incluir estas tcnicas (laboriosas y/ocaras) en los protocolos de
purificacin.
Las etapas del procedimiento que se realizan son las
siguientes:
Desintegracin del tejido y solubilizacin y homogenizacin de los
componentes celulares Precipitacin de los cidos nucleicos y
disolucin en un buffer adecuado
Homogenizacin de la muestraEl mtodo para desintegrar el tejido
debe estar adaptado a las caractersticas de ste. Paragrandes
volmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente
iguales a laslicuadoras domsticas. Para volmenes menores, en
general es suficiente unhomogeneizador, el cual consiste en un tubo
de vidrio de paredes gruesas y un pistn (devidrio o de tefln). La
rotacin del pistn dentro del tubo (propulsin manual o por unmotor),
disgrega la muestra. Tejidos ms resistentes, como por ejemplo hueso
o diente,necesitan tratamientos mecnicos especiales. Aquellos
tejidos con clulas cuya paredcelular es resistente, como por
ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren tambincondiciones
drsticas. Uno de los mtodos ms utilizados consiste en congelar la
muestra
en nitrgeno lquido y, mantenindola congelada, pulverizarla con
un mortero. As, ademsde desintegrar la muestra, se logra que sta se
mantenga a muy baja temperatura durante eltratamiento, con lo cual
se evita la accin de nucleasas endgenas que pudieran degradar
elmaterial de inters.
Como puede deducirse de los prrafos anteriores, se han descrito
diversos mtodosparticulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en
el caso particular de clulasbacterianas, se emplea tpicamente la
enzima lisozima, que cataliza la degradacin de lapared celular.
Para facilitar a la solubilizacin de los componentes celulares, y a
la rupturade membranas y complejos proteicos, la solucin de lisis
contendr un detergente inico(dodecil sulfato de sodio, SDS). Este
detergente dispersa los componentes de las
membranas y desnaturaliza las protenas. La solucin de lisis
contiene adems el agentequelante de cationes divalentes EDTA. Esto
impide la accin de las ADNasas(dependientes de Mg++), aunque no
tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas
Es importante comprender que durante la homogenizacin de la
muestra, as como en otrospasos siguientes de la purificacin de
cidos nucleicos, las molculas de gran tamao(como por ejemplo las
molculas de ADN genmico presentes en los cromosomas, cuyotamao es
del orden de millones de pares de bases) es fragmentado
mecnicamente en
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forma parcial, por lo que se obtienen fragmentos de tamao mucho
menor (tpicamenteentre 20 y 200 kb). El grado de fragmentacin
depender, obviamente, de los mtodosutilizados para la
homogeneizacin y purificacin. Los mtodos ms vigorosos por logeneral
permiten mayores rendimientos, al maximizar el nmero de clulas
lisadas, pero
por la misma razn llevan a una mayor fragmentacin del ADN.
Extraccin de protenas y lpidosLos cidos nucleicos son muy
solubles en agua debido al fuerte carcter hidroflico de susgrupos
fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno acuoso
y otro orgnicono polar, los cidos nucleicos tendern a permanecer en
la fase acuosa, en tanto que loslpidos y gran parte de las protenas
desnaturalizadas se encontrarn en la fase orgnica.En la preparacin
de cidos nucleicos, los solventes que se usan ms frecuentemente
para laextraccin de protenas y lpidos son el fenol y el
cloroformo.
Precipitacin de cidos nucleicos
La precipitacin de los cidos nucleicos permite su purificacin y
concentracin. Se basa enla simultnea neutralizacin de las cargas
negativas (mediante el aadido de sales), ydeshidratacin de la
molcula (mediada por el agregado de alcoholes, tpicamente etanol
oisopropanol), lo cual lleva a su precipitacin. La precipitacin es
un fenmeno reversible(mediante la disolucin en soluciones acuosas)
y no debe ser confundido ni con ladesnaturalizacin (potencialmente
reversible) ni con la degradacin (irreversible) de losmismos.
OBJETIVOS
Objetivo General
Extraer ADN de diferentes muestras por mtodos fsico-qumicos
Objetivos especficos
Conocer la metodologa bsica para la extraccin de ADN Adquirir
destreza en la manipulacin de diversas muestras biolgicas para
la
extraccin de ADN Determinar la integridad del ADN por
electroforesis en gel de agarosa
MATERIALES Reactivos y Materiales Acetato de Sodio (3 M) Etanol
absoluto Etanol 70% Fenol Cloroformo
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Agua desionizada TE (pH 8.0) 1 juego de micropipetas P1000, P200
y P10 por equipo Gradillas Medio LB lquido Termobloques Tubos de
polipropileno 1.5 mL Centrifuga Vortex
Muestras biolgicas
Una alcuota de 3 mL de un cultivo lquido de E. coli incubado por
14-16 h a 37C conagitacin constante de >200 rpm.
Una muestra de suelo.
METODOLOGA EXPERIMENTAL
IMPORTANTE:Adems de los aspectos bsicos de bioseguridad (bata
obligatoria, zapatos cerrados) sedeber usar en todo momento guantes
de ltex o vinilo.
Primera Sesin. Extraccin de DNA
Extraccin de ADN deE. coli
1. Propagar un cultivo de E. colien medio LB (3 mL) durante toda
la noche (14-16 h) a37C con agitacin constante de >200 rpm.
2. Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5
mL.3. Centrifugar el tubo a 7000 g durante 2 min.4. Decantar el
sobrenadante.5. Agregar 250 L de agua desionizada estril al paquete
celular.6. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr
la resuspensin de las clulas
(aproximadamente 30 s).7. Agregar 250 L de fenol (equilibrado
con Tris 1M pH 8.0).8. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando
un vortex.9. Agregar 250 L de cloroformo.10.Agitar vigorosamente
utilizando un vortex durante 30 s.11.Centrifugar a 19000 g durante
5 min.12.Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 L) y
colocarla en otro tubo de 1.5
mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un
precipitado blanco, este
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precipitado no debe de ser recuperado, ya que son protenas que
pueden contaminar lamuestra e inhibir reacciones posteriores.
13.Agregar 225 L de cloroformo.14.Agitar vigorosamente durante
30 s utilizando un vortex.
15.Centrifugar a 19000 g durante 5 min.16.Recuperar la fase
acuosa (fase superior, aprox. 200 L) y colocarla en otro tubo de
1.5
mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso
12.17.Agregar 20 L de Acetato de Sodio (3M) a la fase
acuosa.18.Agitar en vortex 20 s.19.Agregar 440 L de etanol Absoluto
fro a la fase acuosa.20.Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es
importante colocar los tubos un la misma
orientacin siempre, para saber en qu lado del tubo est el ADN
precipitado. Mientrasse est llevando a cabo la centrifugacin, se
debe hacer el gel de agarosa.
21.Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en
hielo durante el resto delexperimento.
22.Agregar 500 L de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado,
evitando resuspender lapastilla.
23.Centrifugar a 19000 g durante 5 min.24.Decantar el
sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto
del
experimento.25.Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una
servilleta de papel y boca abajo,
hasta que todo el etanol haya sido evaporado.26.Resuspender el
ADN en 50 L de TE pH 7.8 o agua desionizada.
Guardar a -20C.
Extraccin de ADN de Suelo1. Pesar 0.1 mg de suelo en un tubo de
polipropileno de 1.5 mL.2. Agregar 250 L de agua desionizada
estril.3. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la
resuspensin de las clulas
(aproximadamente 30 s).4. Agregar 250 L de fenol (equilibrado
con Tris 1M pH 8.0).5. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando
un vortex.6. Agregar 250 L de cloroformo.7. Agitar vigorosamente
utilizando un vortex durante 30 s.8. Centrifugar a 19000 G durante
5 min.9. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 L) y
colocarla en otro tubo de 1.5
mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un
precipitado blanco, esteprecipitado no debe de ser recuperado, ya
que son protenas que pueden contaminar lamuestra e inhibir
reacciones posteriores.
10.Agregar 225 L de cloroformo.11.Agitar vigorosamente durante
30 s utilizando un vortex.12.Centrifugar a 19000 G durante 5
min.13.Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 L) y
colocarla en otro tubo de 1.5
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"'
mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso
12.14.Agregar 20 L de Acetato de Sodio (3M) a la fase
acuosa.15.Agitar en vortex 20 s.16.Agregar 440 L de etanol Absoluto
fro a la fase acuosa.
17.Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar
los tubos un la mismaorientacin siempre, para saber en qu lado del
tubo est el ADN precipitado. Mientrasse est llevando a cabo la
centrifugacin, se debe hacer el gel de agarosa.
18.Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en
hielo durante el resto delexperimento.
19.Agregar 500 L de etanol al 70% al tubo que ha sido
vaciado.20.Centrifugar a 19000 g durante 5 min.21.Decantar el
sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto
del
experimento.22.Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una
servilleta de papel y boca abajo,
hasta que todo el etanol haya sido evaporado.23.Resuspender el
ADN en 50 L de TE pH 7.8 o agua desionizada.
Guardar -20C DEPENDIENDO DEL AVANCE CONTINUAR24.Realizar una
electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN (prctica
4).25.Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotmetro a una
longitud de onda de 260 nm.26.Cuantificar el ADN utilizando un
espectrofotmetro a una longitud de onda de 260 nm.27.Realizar una
electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN (prctica
4).
REFERENCIAS
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 3 ed. EdCold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA
2001. 2344 pgs.
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"(
PRCTICA 4. Cuantificacin de ADN en gel de agarosa
INTRODUCCIN
Una vez que se ha realizado la extraccin de ADN es necesario
revisar la integridad y lacantidad del mismo, esto se efecta
mediante la separacin por electroforesis en geles deagarosa o de
poliacrilamida. La agarosa es ms comnmente utilizada puesto que no
estxica. A los valores de pH en los cuales usualmente se trabaja
con cidos nucleicos, losgrupos fosfato confieren carga neta
negativa a estas molculas. En la electroforesis en gelesde agarosa,
las molculas de ADN lineales migran segn su tamao y se pueden
visualizarmediante tincin. Los geles son teidos con diferentes
colorantes para visualizar el ADN.Los ms comunes son: el bromuro de
etidio, el nitrato de plata, y recientemente el SYBERSAFE, Gel Red,
Syber Green, Syber Gold, etc.
Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia
del buffer adecuado hastaque se logre una solucin transparente. La
solucin fundida es puesta en un molde dondegelifica. El gel forma
una matriz cuya densidad est determinada por la concentracin
deagarosa. Cuando se aplica un campo elctrico a travs del gel, el
ADN migra hacia elnodo. La velocidad de migracin est determinada
por varios parmetros, algunos de loscuales son detallados a
continuacin.
(a) Tamao del ADN:
Las molculas de ADN lineal de doble hebra migran a travs del gel
a velocidades que soninversamente proporcionales al log del nmero
de pares de bases.
Dado que la carga del ADN est dada por los grupos fosfato y que
por cada par de baseshay dos grupos fosfato, la relacin carga/masa
es la misma para molculas de ADN dediferente tamao. Pero, debido a
la friccin que impone la malla del gel de agarosa, lasmolculas de
mayor tamao sern retardadas respecto a las de menor tamao.
(b) Concentracin de la agarosa:
Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro
de geles con diferentesconcentraciones de agarosa. La tabla
siguiente muestra concentraciones de agarosa usadaspara resolver
fragmentos de ADN en los intervalos indicados.
Concentracin del gel de agarosa(% w/v)
Intervalo de pesomolecular (kpb)
0.3 5-600.6 1-200.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0
0.1-2
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")
(c) Conformacin del ADN
El ADN circular cerrado de doble hebra superenrollado (forma I),
el circular relajado conun corte en una de las hebras (forma II) y
la forma lineal (forma III) que tengan idnticopeso molecular y
misma secuencia van a migrar a distinta velocidad en los geles
deagarosa. Las movilidades relativas de las tres formas dependen
primariamente de laconcentracin de agarosa, pero tambin estn
influidas por otros factores como la corrienteelctrica aplicada, la
fuerza inica del buffer y de la cantidad del colorante
presente(fundamentalmente en el caso de la forma I).
(d) Corriente aplicada
A bajo voltaje, la velocidad de migracin de los fragmentos
lineales es proporcional alvoltaje aplicado. Sin embargo a medida
que la fuerza del campo elctrico aumenta, la
movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se
incrementa menos. Por lotanto el intervalo efectivo de separacin en
los geles de agarosa disminuye a medida que elvoltaje es
incrementado.
(e) Otros factores
Otros factores que influyen (y que no se discutirn en esta
INTRODUCCIN) son: ladireccin del campo elctrico, la composicin de
bases de los fragmentos a analizar, latemperatura y la composicin
del buffer de electroforesis.
OBJETIVOSObjetivo General
Determinar la cantidad de ADN por densitometra de las bandas en
un gel deagarosa
Objetivos especficos
Adquirir destreza en el corrimiento de muestras de ADN en geles
de agarosa
Cuantificar el ADN en geles de agarosa por densitometra
MATERIALES
Materiales y Reactivos Solucin de Agarosa 0.5% w/v Solucin para
teir ADN Regulador para electroforesis TBE 1X
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"*
Regulador de carga 6x 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10
por equipo Agua desionizada Puntas de diferentes capacidades (10,
200 y 1000 #L) Muestras de ADN Cmara de Electroforesis Fuente de
Poder Marcador de Peso Molecular (100pb)
METODOLOGA EXPERIMENTAL
1. Colocar 20 mL de TBE en un vaso de precipitado de 100 mL
(para un volumen degel de 20 mL, si es mayor hacer los clculos
conservando la proporcin de laconcentracin del gel)
2. Agregar 100 mg de agarosa
3. Calentar en parrilla de calentamiento hasta fundir
completamente4. Adicionar 0.5L de reactivo para teir ADN (Rojo
Texas, Syber green, etc.)5. Mezclar6. Verter la solucin en una
canastilla para electroforesis7. Colocar el formador de pozos
(peine) en la canastilla8. Dejar gelificar (cubrir el gel con papel
aluminio)9. Colocar la canastilla adentro de la cmara de
electroforesis10. Agregar buffer de corrimiento (TBE)11. Preparar
las muestras a analizar (con buffer de carga, no ms de 10 L en
total)12. Colocar las muestras adentro de los pozos13. Llevar a
cabo la electroforesis a 100 V durante 30 a 45 min
14. Visualizar el gel en el transiluminador y cuantificar segn
instrucciones.
REFERENCIAS
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 3 ed. EdCold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA
2001. 2344 pgs.
COMPOSICIN DE SOLUCIONES
6x Amortiguador de carga
Azul de bomofenol 0.25% (w/v)Glicerina en agua 30% (v/v)
TBEPrepare una solucin madre 5x en 1 litro de H2OTris base 54 g,
cido Brico 27.5 g , EDTA 0.5 M (pH 8.0) 20 mL
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#+
PRCTICA 5. Extraccin de ARN
En una tcnica sencilla de extraccin de ARN, las clulas son
homogenizadas entiocianato de guanidina y posteriormente purificado
por fenol-cloroformo a pH reducido. Elrendimiento del ARN total
extrado depende del tipo de muestra y generalmente esta en
unintervalo de 4-7 g/mL iniciando de 5-10 mg de tejido o
106clulas.
OBJETIVOS
Objetivo General
Extraer ARN de diferentes muestras por mtodos fsico-qumicos
Objetivos especficos
Conocer la metodologa bsica para extraccin de ARN,
Adquirir destreza en la manipulacin de diversas muestras
biolgicas para laextraccin de ARN.
Determinar la integridad del ARN por electroforesis en gel de
Agarosa
MATERIALES
Cloroformo: alcohol isoamlico (49:1, v/v)
EtanolIsopropanolNitrgeno liquidoFenolAcetato de sodio(2 M, pH
4.0)Solucin D (solucin desnaturalizante)Agua desionizada1 juego de
micropipetas P1000, P200 y P10 por equipoGradillasTermobloquesTubos
de polipropileno 1.5 mL
CentrifugaVortex
Material biolgico
Una alcuota de 3 mL de un cultivo lquido de E. coli incubado por
14-16 h a 37C conagitacin constante de >200 rpm.Una planta de
tabaco o de lechuga fresca.
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#"
METODOLOGA EXPERIMENTAL
IMPORTANTE:
Adems de los aspectos bsicos de bioseguridad (bata obligatoria,
zapatos cerrados) sedeber usar en todo momento guantes de ltex o
vinilo.
Sesin 1. Preparacin de los cultivos de
1. Crecer E. colien medio LB (3 mL) durante toda la noche,
incubado por 14-16 h a37C con agitacin constante de >200
rpm.
2. Asegurarse que la planta de tabaco y lechuga estn en
condiciones sanas y frescas.
Sesin 2. Extraccin de ARN
Preparacin del cultivo deE. coli
1. Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5
mL.2. Centrifugar el tubo a 12 000 rpm. durante 2 min.3. Decantar
el sobrenadante.4. Mantener la pastilla celular en hielo
Preparacin del tejido vegetal
5. Cortar cuidadosamente 1-2 g de tejido foliar.6. Colocar el
tejido en un mortero estril libre de RNAsas y adicionar
nitrgeno
lquido.7. Usando el pistilo macerar el tejido hasta obtener un
polvo fino.8. Transferir el macerado a un tubo nuevo estril.
Extraccin de RNA de clulas bacterianas y vegetalesEl tratamiento
siguiente es el mismo tanto para las clulas bacterianas como para
eltejido vegetal a menos que se indique lo contrario.
9. Adicionar 3 mL de la solucin D.10.Homogenizar 15-30 segundos
a temperatura ambiente en un homogenizador para el
caso del tejido vegetal (en caso de no tener pasar el macerado
en una jeringa de
1mL 3 veces). Para el caso de bacterias es suficiente con
macerar con un pistilo deplstico pequeo.11.Transferir el
homogenizado a un tubo nuevo y adicionar 0.1 mL de Acetato de
sodio
2 M, 1 mL de fenol y 0.2 mL de cloroformo-alcohol isoamlico por
cada mililitro desolucin D.
12.Mezclar con un vortex vigorosamente por 10 s e incubar en
hielo por 15 min.13.Centrifugar a 9000 rpm. por 20 min a
4C.14.Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.
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15.Adicionar un volumen de isopropanol e invertir el tubo 5
veces para mezclar eincubar a -20C mnimo 1 hr.
16.Centrifugar a 10,000g (9000 rpm.) por 30 min a
4C.17.Cuidadosamente decantar y disolver el ARN en 0.3 mL de la
solucin D.
18.Adicionar un volumen de isopropanol e incubar 1 h a
-20C.19.Centrifugar 10 min a 4C.20.Decantar y adicionar un volumen
de etanol al 70%.21.Centrifugar a mxima velocidad durante 3
min.22.Adicionar 50-100 l de H2O. Almacenar la solucin de ARN a
-70C.23.Estimar la concentracin de ARN midiendo la absorbancia de
una dilucin 1:200 de
la muestra a 260 nm24. Separar 5 #L de la muestra de ARN por
electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Solucin D
4 M Tiocianato de guanidina25 mM citrato de sodio0.5% (w/v)
Lauril sarcosianato de sodio0.1 M -mercaptoetanol
Disolver 250 g de tiocianato de guanidina en 293 mL de H2O, 17.6
mL de 0.75 M decitrato de sodio (pH 7.0), y 26.4 mL de 10% (w/v)
lauril sarcocianato de sodio. En unaparrilla a 65C mezclar los
ingredientes con ayuda de agitacin magntica, guardar atemperatura
ambiente y adicionar 0.36 mL de 14.4 M mercaptoetanol por cada 50
mL de la
solucin D justo antes de usar.
REFERENCIAS
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory
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PRCTICA 6. Extraccin de ADN plasmdico por lisis alcalina
Cuando se desea introducir un gen para expresin en bacterias, es
necesario que este gen seencuentre en el vector adecuado para que
se obtengan los niveles de expresin deseados. Elvector que se va a
utilizar es generalmente amplificado en un cepa de E. coli a partr
de lacual se purifica. La extraccin por lisis alcalina consiste en
la lisis de las clulas utilizandouna solucin con NaOH y SDS.
Posteriormente la separacin entre los restos celulares y elADN se
logra por precipitacin mediante la adicin de una solucin de acetato
de potasio.Para purificaciones ms exhaustivas se utiliza una
solucin de fenol:cloroformo. Los cidosnucleicos se separan en la
fase acuosa y las protenas en la fase orgnica.
OBJETIVOS
Objetivo General
Extraer ADN plasmdico deE. coli.
Objetivos especficos
Conocer la metodologa bsica para extraccin de ADN plasmdico de
bacterias.Determinar la integridad del ADN plasmdico por
electroforesis en gel de agarosa.
MATERIALES
Soluciones
Solucin de lisis alcalina ISolucin de lisis alcalina IISolucin
de lisis alcalina IIIAmpicilinaEtanolFenol: cloroformoTE (pH
8.0)
Medios de cultivo
Cajas con medio LB con ampicilina 100 #g/mLCajas con medio
LB
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METODOLOGA EXPERIMENTAL
IMPORTANTE:Adems de los aspectos bsicos de bioseguridad (bata
obligatoria, zapatos cerrados) se
deber usar en todo momento guantes de ltex o vinilo.
Sesin 1. Preparacin de los cultivos de
1. Crecer E. colien medio LB (3 mL) durante toda la noche,
incubado por 14-16 h a37C con agitacin constante de >200
rpm.
Sesin 2. Extraccin de ADN plasmdico
Centrifugar a velocidad mxima por 30 segundos 2 mL del cultivo a
temperatura ambiente.
7) Remover el sobrenadante dejando la pastilla libre del
medio.8) Resuspender la pastilla en 100 L de solucin Alcalina I
fra, mezclar
vigorosamente con ayuda del vortex.9) Adicionar 200 L de solucin
de lisis II recin preparada, cerrar el tubo y mezclar
invirtiendo el tubo cinco veces, No usar vortex. Poner el tubo
en hielo10)Adicionar 150 L de solucin alcalina III fra, cerrar el
tubo e invertir el tubo cinco
veces para mezclar. Guardar el tubo en hielo 3-5 minutos (NO
CONGELAR).11)Centrifugar a mxima velocidad por cinco minutos a
4C.12)Transferir el sobrenadante a un tubo limpio.13)Adicionar un
volumen de fenol: cloroformo (1:1 v/v), mezclar en vortex y
centrifugar a velocidad mxima por 2 min a 4C.14)Transferir el
sobrenadante a un tubo nuevo.15)Precipitar el ADN plasmdico
adicionando 2 volmenes de etanol absoluto, incubar
a -20C durante 20 minutos.16)Centrifugar a mxima velocidad 5
minutos a 4C.17)Remover el sobrenadante.18)Adicionar 1 mL de etanol
al 70% (tener cuidado de no resuspender la pastilla),19)Centrifugar
a mxima velocidad por 2 minutos a 4C.20)Remover el sobrenadante e
invertir el tubo sobre una superficie limpia para permitir
que la pastilla quede lo ms seca posible.21)Resuspender la
pastilla en 50 L de agua desionizada estril y guardar a -20C.
Soluciones
Solucin de lisis alcalina I
50 mM glucosa25 mM Tris-Cl (pH 8.0)10 mM EDTA (pH 8.0)Guardar a
4C
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Solucin de lisis alcalina II
0.2 N NaOH
1% (w/v) SDSPreparar la solucin al momento.
Solucin de lisis alcalina III
5 M acetato de potasio, 60.0 mLcido actico glacial, 11.5 mLH2O,
28.5 mlGuardar a 4C
REFERENCIAS
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PRCTICA 7. Insercin de material gentico en un plsmido
bacteriano.
La ligacin de fragmentes de inters en plsmidos ha sido una
metodologa presente en casi
todos los estudios que tienen que ver con tcnicas de Biologa
Molecular. Se han utilizadodiferente sistemas que utilizan
diferente vectores, entre los que se encuentran el pUC 19,pBR322,
pBlueScript KS II, pTOPO, etc. Para la insercin de un gen o de un
fragmento delgen en un vector, generalmente se lineariza el vector
con enzimas de restriccin y al mismotiempo se digiere el gen con
las misma enzimas de restriccin. Despus de la linearizacindel
vector y de la restriccin del gen, ambos fragmentos se incuban con
una ligasa enpresencia de ATP para que la enzima catalize la
reaccin de ligacin.
Objetivo General
Realizar la insercin de material gentico dentro de un vector
plasmdico.
Objetivos especficos
Conocer la metodologa bsica para cortar un vector utilizando
enzimas derestriccin.
Conocer la metodologa bsica para insertar material gentico de
intersdentro de un plsmido previamente tratado con enzimas de
restriccin.
MATERIALES
Plsmido (cuales Enzimas de restriccin Material gentico de
inters. T4 ADN Ligasa Buffer de restriccin. Buffer de Ligacin.
Termo-Bloque
MTODOLOGASesin 1. Reaccin de restriccin
1. En un tubo estril, adicionar 2 #l de buffer de restriccin.2.
Adicionar 200-500 ng de plsmido.3. Adiciona 1 U de la enzima de
restriccin.4. Adicionar suficiente cantidad de agua para alcanzar
un volumen final de 20 #L
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#(
5. Incubar a la temperatura indicada para la enzima durante 30
min en el termobloque.
Sesin 2. Reaccin de ligacin
6. Colocar 2 L de buffer de ligacin en un tubo estril.7.
Adicionar 1 #L de T4 ADN ligasa.8. Aadir (100-300 ng) de plsmido
previamente tratado con enzima de restriccin.9. Agregar (500-900
ng) del fragmento a insertar deseado.10. Adicionar suficiente
cantidad de agua para alcanzar un volumen final de 20 #L11. Incubar
a 22C durante 2 horas en el termobloque.12. Almacenar a -20C hasta
el momento de su uso.
REFERENCIAS
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PRCTICA 8. Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR).
La Reaccin en Cadena de la polimerasa (PCR) permite obtener ms
de 10 millonesde copias de una cadena de ADN de inters a partir de
pocas molculas de sta. Lasensibilidad de sta tcnica requiere de
cuidados para que la muestra no est contaminadapreviamente con
otras cadenas de ADN que pudieran generar amplificados.
Existen numerosas tcnicas que emplean la PCR (RAPD, RFLP, RTPCR)
condiferentes aplicaciones en campos de diagnstico, criminologa, e
investigacin.
Objetivo General
Obtener un producto amplificado por la tcnica de Reaccin en
Cadena de laPolimerasa (PCR).
Objetivos especficos
Conocer la metodologa bsica para amplificar una cadena de inters
por medio dela reaccin en cadena de la polimerasa.
Identificar la correcta o incorrecta insercin de una cadena de
inters en un vectoren base al tamao del amplificado por medio de
PCR.
MATERIALES
Termociclador. ADN molde Tubos de polipropileno de 200 #L.
Oligonucletidos iniciadores (primers): sentido y anti sentido Taq
DNA polimerasa Micro pipetas de diferentes capacidades (1000-100,
200-20 y 10-0.5 #L 10X PCR buffer MgCl2 dNTPs: 1 mM dATP, 1 mM
dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP.
MTODOLOGA EXPERIMENTAL
1. En condiciones de esterilidad colocar dos tubos de
polipropileno de 200#L decapacidad en hielo.
2. Adicionar los reactivos que se indican en la tabla 1.
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#*
Tabla 1. Composicin de la Reaccin en cadena de la
PolimerasaConcentracin final Muestra (#L) Control negativo(#L)
AND molde 10 pg-1 #g 1 #L* -----
Iniciador Sentido 10 #M 0.1-1 #M 2.5 #L 2.5 #L
Iniciador Antisentido10 #M 0.1-1 #M 2.5 #L 2.5 #L
Buffer PCR 10X 1X 5 #L 5 #L
25 mM MgCl2 1-4 mM 6 #L* 6 #L*
dNTPs 0.2 mM de cada uno 5 #L 5 #L
Agua MilliQ estril 27.6 #L * 28.6 #L *
Taq polimerasa (5U/ #L) 1.25 U / 50 #L 0.2 #L** 0.2 #L**
*El volumen depende de la concentracin final requerida.
** Se coloca al final en la reaccin en fro.
3. Mezclar perfectamente la reaccin por y centrifugar unos
segundos en caso de sernecesario.
4. Colocar en el termociclador con el siguiente programa:a) 95C
2 minb) 95C 30s (desnaturalizacin),c) 55C 30 s (alineamiento),d)
72C 1 min (elongacin)e) Repetir los pasos b a d 30 vecesf) 72C 4
min.g) 4C (refrigerar hasta el momento de uso)5. Separar el
fragmento amplificado por electroforesis en un gel de agarosa.6.
Verificar que el tamao amplificado por PCR sea el esperado.
REFERENCIAS
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 3 ed. EdCold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA
2001. 2344 pgs.
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$+
PRCTICA 9. Mtodo para preparar clulas competentes deEscherichia
colicon CaCl2
Uno de las metodologas rutinarias en los laboratorios de Biologa
Molecular es lapreparacin de clulas competentes. Las clulas
competentes pueden ser almacenadas yusarse para la propagacin de
vectores de inters. Hay varios mtodos para preparar
clulascompetentes pero quiz el ms utilizado sea el que se realiza
con cloruro de calcio ya quees eficiente, barato y generalemente se
obtienen clulas con altos niveles de transformacin.
OBJETIVOS
Objetivo General
Aprender a preparar clulas competentes deEscherichia colicon
CaCl2.
Objetivos especficos
Conocer la metodologa bsica para hacer clulas competentes de
Escherichia colicon CaCl2.
Determinar la viabilidad de las clulas competentes deEscherichia
colicon CaCl2.
MATERIALES
- CaCl2 (0.1 M)- Espectrofotmetro- Gradillas para tubos- Hielo-
Medio LB lquido- Micropipetas de 200 L y 1000 L- Puntas para
micropipetas de 200 L y 1000 L- Termo-bloques- Tubos de
polipropileno 1.5 mL estriles- Ultracentrfuga
MTODOLOGA EXPERIMENTAL
1. IncubarE. coli a 37C por 16 h en placas de agar LB
2. Transferir una colonia de E. coli a 5 mL de mdio LB e incubar
a 37C conagitacin a >200 rpm durante toda la noche (12-16
h).
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$"
3. Transferir 0.5 mL del cultivo a 50 mL de medio LB e incubar a
37C con agitacin,hasta que la densidad ptica a 590 nm sea de 0.3 a
0.4 (aproximadamente 3-4 horas)
4. Transferir 50 mL de clulas a un tubo de propileno fro y
estril y mantenerlo por
10 min a 4C.5. Centrifugar a 6000 rpm. por 10 min
6. Decantar el sobrenadante
7. Resuspender el paquete celular en 25 mL de CaCl20.1 M esteril
y fro)
8. Colocar el tubo en hielo durante 10 min a 4C.
9. Centrifugar a 6000 rpm. por 10 min a 4C.
10.Decantar el sobrenadante
11.Con la ayuda de una pipeta pero con extremo cuidado,
resuspender el paquetecelular en 1-2 mL de CaCl20.1 M esteril y
fro.
12.Las clulas competentes pueden ser usadas inmediatamente o
almacenadas por 24-48 h a 4C.
13. Para periodos de almacenamiento ms largos, guardar en
alcuotas de 100 L entubos estriles de 1.5 mL.
14.Guardar la clulas competentes a -70C. Las clulas se mantienen
viables poraproximadamente 3 meses.
REFERENCIAS
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory
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$#
PRCTICA 10. Transformacin de clulas competentes
La ligacin de fragmentos de ADN inters en plsmidos ha sido una
metodologafundamental en casi todos los estudios de transformacin
de organismos. Se han utilizadoeste tipo de plsmidos como el pUC 19
linearizado con enzimas de restriccin especficas,una vez hecho esto
se realiza una reaccin de ligacin plsmido-inserto con la
enzimaligasa.
El vector obtenido puede entonces ser introducido en una cepa
bacteriana para serpropagado. Los metodos ms utilizados para la
INTRODUCCIN de DNA en clulascompetentes es la electroporacin y la
que involucra choque trmico. Las clulas
preparadas con cloruro de calcio son faciles de preparar y son
las que se utilizanmayormente. El proceso consiste en preparar la
clulas (Prctica 9) y despus incubarlascon el vector a introducir,
seguido de un choque trmico. Este mtodo es eficiente ygeneralmente
da rendimientos aceptables para la insercin de vectores despus de
unareaccin de ligacin.
Objetivo General
Realizar la transformacin de clulas competentes con un plsmido
extradopor lisis alcalina.
Objetivos especficos
Conocer la metodologa bsica para transformar clulas competentes
con unplsmido bacteriano
Determinar la eficiencia de transformacin de clulas competentes
deEscherichia colipreparadas con CaCl2.
MATERIALES
Clulas competentes Incubadora Placas de agar LB-Ampicilina
Reaccin de PCR (Prctica 8) Termo-Bloque (Prctica 7) Plsmido
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MTODOLOGA EXPERIMENTAL
A. Muestra de inters
1. Adicionar 4 L de reaccin de PCR a un tubo de polipropileno.2.
Adicionar 1 L del buffer de ligacin.3. Adicionar 1 L del Plsmido.4.
Mezclar la reaccin suavemente.5. Incubar por 16 h a 4C.6. Adicionar
todo el contenido del tubo a un tubo que contiene clulas
competentes.7. Mezclar el tubo suavemente.8. Incubar a -20C durante
20 min.9. Colocar el tubo en un bao o Termo-bloque a 42C durante 1
min.10. Colocar el tubo a -20C durante 2 min.11. Adicionar 800 L de
medio LB.12. Colocar el tubo en un bao o un Termo-bloque a 37C
durante 1 hora.13. Agregar 200 L en una placa con medio LB
Ampicilina14. Sembrar por extensin con varilla.15. Incubar la caja
durante 16 h a 37C
B. Control de viabilidad y control negativo
16. Colocar 200 L de clulas competentes.17. Mezclar el tubo
suavemente.18. Incubar a -20C durante 20 min.19. Colocar el tubo en
un bao o Termo-bloque a 42C durante 1 min.20. Colocar el tubo a
-20C durante 2 min.21. Adicionar 800 L de medio LB.22. Colocar el
tubo en un bao o un Termo-bloque a 37C durante 1 hora.23. Agregar
200 L en una placa con medio LB Ampicilina y 200 L a una caja
con
medio LB24. Sembrar por extensin con varilla.25. Incubar la caja
durante 16 horas a 37C
REFERENCIAS
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PRCTICA 11. Inmunodeteccin en estado slido
El western blot es una tcnica inmuno enzimtica utilizada en
biologa molecular para ladeteccin de protenas en muestras crudas o
extractos celulares. Esta tcnica tiene mltiplesaplicaciones, tanto
en el rea de investigacin como en la de diagnstico clnico, en
dondees utilizada ya sea independiente o conjuntamente con
ELISA.
La tcnica consiste en realizar la separacin de las protenas de
la muestra por electroforesisen gel de poli acrilamida (PAGE) y
posteriormente transferirlas a una membrana (e.initrocelulosa), ya
sea por gravedad, difusin o un campo elctrico.
Una vez en la membrana, la protena es identificada mediante un
inmunoensayo, en dondese liga a la protena de inters un anticuerpo
especfico contra ella ligado a una enzima, lacual permite la
deteccin.
OBJETIVOS
Objetivo General
Conocer y realizar la tcnica de westtern blot para deteccin de
protenamediante la reaccin antgeno-anticuerpo.
Objetivos especficos
Conocer la metodologa bsica para realizar electroforesis en gel
depoliacrilamida.
Conocer la metodologa bsica para realizar una
electrotransferencia. Conocer la metodologa bsica para detectar
protenas por medio de un
inmunoensayo.
MTODOLOGA EXPERIMENTAL
A. Tratamiento de la muestra.
1. A una muestra de concentracin conocida de protena (ya sea
antgeno o anticuerpo)se le adiciona amortiguador de muestra hasta
un volumen final de 85 #l.
2. Aadir 10 #l de solucin de azul de bromofenol y 5 #l de
-mercaptoetanol.3. Incubar en bao mara a ebullicin durante 5
minutos.
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$&
B. Preparacin del Gel.
4. Se limpia con etanol al 70% las placas de vidrio para remover
contaminantes.
5. Colocar las placas de vidrio y los separadores en la base
para preparar el gel.6. Preparar el gel separador de acuerdo a lo
indicado en la tabla 1 del anexo, adicionando
el persulfato de amonio y el temed al final.7. Vaciar el gel
separador en los vidrios evitando la formacin de burbujas, y
alcanzando un nivel 3cm por debajo del borde superior. Dejar
polimerizar por 20 a30 minutos.
8. Preparar el gel concentrador de acuerdo a la tabla 2 del
anexo.9. Vaciar en la parte superior y colocar el peine, evitando
la formacin de burbujas.
Dejar polimerizar por 20 a 30 minutos.
C. Montaje de la cmara de electroforesis y corrimiento del
gel.
10. Montar las placas de vidrio conteniendo el gel en su base, y
esta en la cmara.11. Preparar amortiguador decorrida 1x.12. Llenar
con amortiguador de corrida la cmara interna hasta el lmite y la
externa hasta
cubrir los electrodos.13. Retirar con cuidado el peine. Cargar
aproximadamente 20 #l de muestra y marcador
de peso molecular en los pozos.14. Colocar la tapa de la cmara y
conectar a la fuente de poder.15. Correr a 50 V mientras las
muestras se encuentren en el gel concentrador.16. Correr a 100 V
una vez alcanzado el gel separador y hasta que el frente de
corrida
alcance el final del gel.
17. Detener la fuente de poder, recuperar el amortiguador de
corrida y desmontar lacmara.
18. Cuidadosamente recuperar el gel de los vidrios y colocar en
amortiguador detransferencia.NOTA: En caso de existir un duplicado
del gel, este puede ser teido para observarel corrimiento del gel
antes de proseguir con la siguiente etapa.
D. Montaje de la cmara de electro transferencia y electro
transferencia.
19. Incubar fibras scotch y papel whatmann (0.16 mm de espesor)
en amortiguador detransferencia 30 min. antes de iniciar el montaje
de los cartuchos.
20. Cortar la membrana de nitrocelulosa a un tamao ligeramente
mayor al de los geles.Este procedimiento debe ser llevado a cabo
con guantes. Colocar en un recipientecon amortiguador de
transferencia.
21. Colocar el gel sobre la membrana de nitrocelulosa, y
cuidadosamente, marcar sobre lamembrana, con lpiz, el frente
decorrida y el nmero de carril del gel.
22. Para el armado de los cartuchos se colocan dos fibras
scotch, dos papeles filtro, el gel,la membrana de nitrocelulosa,
dos papeles filtro ms y dos fibras scotch ms. Hayque eliminar
cualquier burbuja que se forme al ir adicionando las diferentes
capas.
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23. Colocar el cartucho en la cmara de electrotransferencia de
manera que el gel quedehacia el nodo (-) y la membrana hacia el
ctodo (+).
24. Llenar la cmara con amortiguador de transferencia hasta el
nivel indicado.25. Cerrar la cmara, conectar a la fuente de poder y
transferir a 100 V por una hora,
cuidando que la temperatura del amortiguador no sobrepase los
60C.26. Al terminar la transferencia, recuperar, con guantes, la
membrana del cartucho.
NOTA: En caso de tener duplicado de la membrana, teir una de
ellas paraobservar la transferencia de las protenas antes de
proseguir con el siguiente paso.
E. Reaccin inmunoenzimtica
27. Colocar la membrana de nitrocelulosa en un recipiente, y
agregar l solucin debloqueo, de manera que cubra completamente la
membrana. Incubar 2 horas atemperatura ambiente con agitacin
continua.
28. Retirar la solucin de bloqueo y realizar 3 lavados con
PBS-Twen de 5 min. cada uno,
con agitacin contina.29. Incubar la membrana con la solucin de
protena complementaria a la que se
encuentre unida en la membrana (si se tiene antgeno en la
membrana, incubar consolucin e anticuerpo, y viceversa) durante 2
horas.
30. Retirar la solucin de protenas y repetir el paso 28.31. Se
adiciona a la membrana la solucin de avidina HRP (peroxidasa de
rbano) y se
incuba por 2 horas con agitacin continua.32. Retirar la solucin
de conjugado y repetir el paso 28.33. Se incuba la membrana en la
solucin de cromgeno / sustrato en agitacin continua
hasta que aparezcan las bandas.34. Se enjuaga la membrana con
agua desionizada y se deja secar.
REFERENCIAS
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ANEXO I
Tabla 1. Gel separador (para un volumen de 15 mL)
Sol. stock (mL) / Conc. gel (%) 5 6 7 8 9 10 12 13 15
Sol. Acrilamida bisacrilamida 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 6.0 6.5
7.5
Amortiguador pH 8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
3.75
Agua desionizada 8.75 8.25 7.75 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75
3.75
Persulfato de amonio 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
0.05
TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
Tabla 2. Gel concentrador (para un volumen de 2 mL)
Sol. Acrilamida bisacrilamida 0.26 mL
Amortiguador pH 6.8 0.5 mL
Agua desionizada 1.22 mL
Persulfato de amonio 0.01 mL
TEMED 0.02
PREPARACIN DE SOLUCIONES
Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%
Pesar 29.2 g de acrilamida (99.9% pureza) ms 0.8 g de
bis-acrilamida. Disolver en aguabidestilada y aforar a 100 mL.
Filtrar con papel Whatman 1. Guardar en frasco mbar a 4C. Usar
guantes al pesar ya que la acrilamida es un compuesto
neurotxico.
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$)
Amortiguador del gel separador pH 8.8
Pesar 9.081 g de Tris-base, y 0.2 g de SDS, disolver en poca
agua desionizada y ajustar elpH con HCl (aprox. 1 mL). Aforar a 50
mL y almacenar a temperatura ambiente.
Amortiguador del gel separador pH 6.8
Pesar 3.027 g de Tris-base y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua
desionizada y ajustar elpH con HCl (aprox. 1.5 mL). Aforar a 50 mL
y almacenar a temperatura ambiente.
Amortiguador de corrida 5X / SDS
Pesar 7.55 g de Tris-base, 36 g de glicina y 2.5 g de SDS,
disolver con agua desionizada yaforar a 500 mL. Al usar ajustar a
1X.
Amortiguador de muestra pH 6.8
Pesar 1.52 g de Tris-base y 2.0 g de SDS. Disolver en 40 mL de
agua desionizada y ajustar
el pH a 6.8 con HCl (aprox. 2.0 mL). Adicionar 20 mL de glicerol
y ajustar el volumen a100 mL.
Persulfato de amonio al 10%
Se prepara al momento de usarlo. Preparar el volumen mnimo
necesario.
Solucin de azul de bromofenol 10 mg/mL
Pesar 100 mg de azul de bromofenol y disolverlo en 10 mL de agua
desionizada. Guardaren refrigeracin.
Solucin teidora
Para preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de cido
actico y 40 mL de aguadesionizada y 0.05 g de azul de Coomassie.
Disolver el azul de Coomassie en el metanol yadicionar el cido
actico. Aforar con el agua desionizada.
Solucin desteidora
Para preparar 500 mL se usan 25 mL de cido actico, 82.5 mL de
metanol y 392.5 mL deagua desionizada.
Amortiguador de transferencia
(Tris 0.025M, glicina 0.192M, pH 8.3, metanol 20% v/v). Medir
125 mL de Trizma-base 2
M y agregar 14.49 g de glicina, aadir 200 mL de metanol, aforar
a 1000 mL con aguabidestilada. Guardar a 4 C. Nota: No ajustar pH
oscila entre 8.1 y 8.4 dependiendo de lacalidad del tris, el
metanol debe ser grado analtico, este amortiguador se puede usar
hasta 3veces, despus de cada uso filtrar con papel Whatman n 1.
Solucin salina de fosfatos 0.01 M, NaCl 0.15 M, pH 7.2 (PBS)
Medir 800 mL de agua desionizada y agregar 100 mL de PB 10X y
8.75 g de NaCl.Disolver las sales y ajustar el pH. Aforar a 1 L con
agua desionizada. La solucin de PB se
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$*
prepara con 2.62 g de fosfato de sodio monobsico monohidratado y
11.5 g de fosfato desodio dibsico anhidro. Disolver en 200 mL de
agua desionizada y aforar a 1 L con aguadesionizada.
Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20, 0.05%)A un litro de PBS pH
7.2 aadir 500 #L de Tween 20.
Solucin de bloqueo.
Pesar 5 g de leche descremada en polvo y disolverlo en 100 mL de
PBS-Tween 20. Guardara 20 C.
Rojo de Ponceau 0.2% en cido tricloroactico 3%
Pesar 200 mg de rojo de Ponceau y aadir 3 g de cido
tricloroactico. Aforar a 100 ml conagua desionizada. Mantener a 4 C
en frasco color mbar.
Solucin cromgeno / sustrato
Pesar 25 mg de 4-cloro-1-naftol, aadir 5 mL de metanol absoluto
y 25 mL de PBS, agregar25 l de perxido de hidrgeno al 3%. Nota:
esta solucin se prepara inmediatamente antesde usarla.
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ANEXO II
PURIFICACIN DE GAMMA GLOBULINA POR PRECIPITACIN CON SULFATODE
AMONIO.
INTRODUCCIN.
Tiselius y Kabat demostraron que la actividad de anticuerpos est
principalmente presenteen la fraccin gamma de las protenas del
suero. Desde entonces se han diseado diferentesmtodos para la
obtencin de esta fraccin srica.Los anticuerpos pueden purificarse
por mtodos especficos e inespecficos. Los mtodos
especficos se basan en la propiedad que tienen los anticuerpos
para reaccionar con susantgenos. As, los anticuerpos pueden ser
precipitados por la adicin del antgeno enestado soluble, o ser
adsorbidos al antgeno previamente insolubilizado. En ambos casos,
elcomplejo resultante puede disociarse por modificacin del pH a
valores entre 2.5 y 4.0 9.5 y 11.0, o bien por aumento en la
concentracin de sales o la concentracin del antgenosoluble. Despus,
los anticuerpos se recuperan por alguno de los mtodos de
separacininespecfica.Las separaciones inespecficas estn basadas en
las propiedades fisicoqumicas de losanticuerpos. Entre estos
mtodos, los ms utilizados son la precipitacin con etanol,
consulfato de amonio o sulfato de sodio, electroforesis en diversos
soportes (papel, acetato decelulosa, gel de almidn, etc.),
cromatografa de intercambio inico y filtracin en tamices
moleculares.Uno de los mtodos inespecficos ms empleados de
purificacin de gamma globulina es laprecipitacin con sulfato de
amonio a una concentracin final de 33%. Generalmente, seconsidera
que con tres precipitaciones se obtiene una gamma globulina con un
alto grado depureza.La precipitacin de la gamma globulina por este
mtodo se debe al fenmeno conocidocomo salting out, el cual consiste
en que las molculas de agua que solvatan a lamolcula de anticuerpo
son desplazadas por los iones sulfato y amonio, que
ademsneutralizan los grupos cargados de la protena, con lo que se
insolubiliza y precipita.
OBJETIVO.
Purificar gamma globulinas de conejo y de humano por
precipitacin con sulfato de amonioa una saturacin final del 33% y
deteccin por medio de un gel de electroforesis congradiente
desnaturalizante.
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MATERIALES.
Material por grupo:
1 centrfuga clnica.6 agitadores magnticos5.0 mL de BaCI2 al
10%.1 parrilla con agitacin.
Material por equipo:
10 mL de suero de conejo10 mL de suero de humano.
20 mL de solucin sobresaturada de sulfato de amonio.5.0 mL de
NaOH 2N.50 mL de solucin de salina al 0.85% (SS), pH 7.8.20 mL de
salina-regulador de boratos (SSRB) 0.1 M, pH 7.8.Papel indicador de
pH.Tubo para dilisis.10 cm de hilo grueso.2 tubos falcn de 15 mL,
graduados.2 vasos de p.p. de 100 mL2 pipetas serolgicas de 5.0 mL.1
pipeta serolgicas de 1.0 mL.
2 pipetas Pasteur y bulbo de hule.1 matraz Erlenmeyer de 25
mL.
METODOLOGA EXPERIMENTAL
1. Ajustar a 7.8 el pH de la solucin saturada de sulfato de
amonio, con NaOH 2N.2. Adicionar a un volumen de suero, contenido
en un vaso de p.p., medio volumen de lasolucin sobresaturada de
sulfato de amonio, LENTAMENTE Y CON AGITACINCONSTANTE. De esta
forma, el sulfato de amonio queda a una saturacin final del 33%.3.
Continuar con la agitacin durante 10-15 min despus de terminar la
adicin del sulfatode amonio.
4. Traspasar el contenido del vaso de p.p. a un tubo falcn y
centrifugar los tubos atemperatura ambiente a 3500 rpm. durante 15
min.5. Decantar y disolver el sedimento en SS pH 7.8, hasta
alcanzar el volumen original delsuero.6. Repetir los pasos 2, 3, 4
y 5.7. Repetir nuevamente los pasos 2, 3 y 4.8. Disolver en SSRB el
sedimento despus de la ltima centrifugacin hasta alcanzar lamitad o
un tercio del volumen original del suero.
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Jimnez Sierra, Jess Agustn Badillo Corona y ClaudioGaribay
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9. Dializar contra SSRB en fro (4 C) y con agitacin, durante 2
das, realizando 2 cambiosdiarios de solucin de dilisis hasta
eliminar completamente al sulfato de amonio. Parasaber si
efectivamente se elimin el sulfato de amonio, a 5.0 mL de la
solucin de dilisisse le agregan unas gotas de cloruro de bario al
10%. La dilisis se considera completa si ya
no se observa la formacin de un precipitado blanco de sulfato de
bario.10. Transferir la gamma globulina dializada a un tubo y
centrifugar en fro a 2500 rpm.durante 10 min para eliminar el
precipitado que se hubiera formado.11. Guardar las gamma globulinas
para la separacin de isotipos.12. Determinar la concentracin de
protenas por el mtodo de Bradford.13. Correr un gel de SDS-PAGE
para observar las gamma globulinas.
REFERENCIAS.
Campbell, D.H.; Garvey, LS.; Cremer, N.E.; Sussdorf, D.H. 1970.
Methods inImmunology. 2. ed. W.A. Benjamin. Editor.Kabat, E.A.;
Mayer, M.M. 1968. Inmunoqumica Experimental. 1a. ed. Editorial La
Prensa
Mdica Mexicana.
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PRCTICA 12. Inmuno ensayo ligado a enzimas (ELISA)
El inmunoensayo enzimtico, conocido como ELISA por sus siglas en
ingls (enzymelinked immunosorbant assay) fue descrito en 1971 por
Engvall y Perlman.En este mtodose utilizan anticuerpos conjugados a
una enzima. El anticuerpo conserva su capacidad deunin especfica al
antgeno, mientras la enzima es capaz de catalizar una reaccin
deoxido-reduccin, en la cual el sustrato se transforma en un
producto colorido. En estesistema el antgeno o el anticuerpo se
adsorbe a una fase slida insoluble (micro pozos,tubos o perlas de
polivinilo o estireno). El mtodo de ELISA tiene aplicaciones
muyvariadas, lo cual lo hace muy verstil: diagnstico de
enfermedades infecciosas, virales oparasitarias, cuantificacin de
hormonas, cuantificacin de haptenos, titulacin deanticuerpos en
bajas concentraciones, determinacin de anticuerpos no
precipitantes
Existen diversas variantes del mtodo de ELISA, como son los
mtodos directo, indirecto yen sndwich, y el mtodo de ELISA
competitivo. Estos permiten la determinacin deantgenos en fluidos
biolgicos, a excepcin del mtodo indirecto con que se
detectananticuerpos.
En los mtodos directos, el anticuerpo dirigido especficamente
contra el antgeno es el quelleva unida la enzima. En cambio en los
mtodos indirectos, el conjugado enzima-anticuerpo reacciona con el
primer anticuerpo, el cual ya reaccion con el antgeno. En elmtodo
de sndwich, el conjugado antgeno anticuerpo reacciona con el
antgeno que se haunido antes a un primer anticuerpo, adsorbido a la
fase slida. El o los componentes que no
reaccionaron se eliminaron por lavados; por ltimo se adiciona el
sustrato de la enzima y semide la intensidad del color
desarrollado, el cual es proporcional a la magnitud de lareaccin
antgeno-anticuerpo.
OBJETIVOS
Objetivo General
El alumno conocer y realizar la tcnica de ELISA para deteccin de
antgeno oanticuerpo.
Objetivos especficos
Conocer la metodologa bsica para adsorber antgenos en micro
placas de ELISA.Ligar antgenos o anti anticuerpos conjugados a
antgenos adsorbidos en placas de
ELISA.Determinar la presencia del antgeno deseado por la reaccin
de una enzima
conjugada a anticuerpo.
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MATERIALES
Estufa regulada a 37 C.Placas de ELISA de poliestireno (fase
slida)Antgeno H u O, solucin al 5% en solucin salina 0.85%.Pipetas
automticas de 20-200 mlAnticuerpo anti-IgG purificado y conjugado
con HRPSuero humano control positivo y suero humano control
negativoSustrato: 4 mg de orto-fenilen diamina, 4 ml de H2O2al 30%
(v/v) en 10 ml de regulador decitratos 0. XM pH 5.0Regulador de
bloqueo: 0.25 % de gelatina 2% de albmina srica bovina (BSA),
enregulador de fosfato borato sal (PBS) 0.1M pH 9.6Regulador de
lavado: regulador de salina-fosfatos 0.01M pH 7.2 adicionado de
0.05%
Tween 20.Diluyente del suero (PBSG): regulador de
salina-fosfatos 0.01M, pH 7.2 adicionado de0.25% de gelatina.
MTODOLOGA EXPERIMENTAL
Mtodo de ELISA indirecto.
1. Adicionar 0.2 mL de antgeno en los pozos de poliestireno.
Incubar la placa a 4Cdurante 24 horas para permitir la adsorcin del
antgeno a la fase slida.
2. Eliminar las soluciones por inversin de la tira de pozos, y
desechar el lquido
remanente sacudiendo fuertemente la tira sobre papel
absorbente.3. Lavar los pozos con 0.1 mL de solucin de lavado.
Dejar los pozos llenos con esta
solucin durante 3 minutos. Al cabo de este tiempo, eliminar la
solucin de la maneradescrita en el paso 2. Repetir dos veces ms con
el fin de eliminar todo el antgeno noadsorbido.
4. Bloquear con 0.1 mL de una solucin de 0.25% de BSA en PBS e
incubar los pozos a37C durante 30 min para permitir el bloqueo de
los sitios a los que no se adsorbi elantgeno.
5. Repetir el paso 2.6. Adicionar 0.1mL de los sueros control
negativo, positivo y problema uno en cada pozo.
Si lo requiere puede hacer diluciones del suero. Incubar a 37C
durante 30 minutos para
permitir la reaccin antgeno-anticuerpo.7. Repetir los pasos 2 y
3 para eliminar el exceso de suero que no reaccion.8. Adicionar
0.1mL de conjugado diluido en PBSG, a todos los pozos. Incubar a
37C
durante 30 min. Para permitir que el conjugado reaccione con los
anticuerpos humanosque se hayan unido al antgeno en la fase
slida.
9. Repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exceso de conjugado
que no haya reaccionado.10.Adicionar 0.1 mL de una solucin recin
preparada del sustrato de la enzima: H2O2al
0.04% en regulador de salina-fosfatos pH 5.0 y adicionado de
ortofenilendiamina al
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0.04% (como cromgeno). Incubar en oscuridad para permitir la
reaccin enzimtica yel consecuente desarrollo de color (Nota: el
cromgeno es fotosensible)
11.Detener la reaccin enzimtica adicionando 12 mL de H2SO48N en
cada pozo.12.Determinar la presencia o ausencia del antgeno de
inters contra los controles de
manera visual, o de contarse, con un lector de placas de
ELISA.
REFERENCIAS
1. Avrameas S. (1971) Immunochemistry 6:432. Kemeny D. M. (1991)
A practical Guide to ELISA. Pergamon Press. Oxford. Pp 21-
215.3. Voller A., Bidwell D.E. y Bartlett A. (1979) The enzyme
linked immunosorbet assay
(ELISA). A guide with abstracts of microplate application.
Dynatech Laboratories, Inc.
4. Profesores del Departamento de Inmunologa (1992) Manual de
Prcticas deInmunologa. ENCB, IPN pp.47-51.
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Prctica 13. Transformacin gentica de plantas de tabaco
(Nicotiana tabacum) utilizandoAgrobacterium tumefaciens
INTRODUCCION
La modificacin gentica de plantas tiene varios objetivos, entre
los que se encuentran: lageneracin de especies resistentes a
condiciones de estrs (sequa, estrs osmtico, etc), lamejora
nutricional de la especies (aumento en el contenido de aminocidos o
precursores devitaminas, etc), obtencin de plantas para
fitoremediacin (remocin de metales pesados),la obtencin de
variedades con flores de color no convencional, la produccin de
algunaprotena o metabolito con propiedades teraputicas (vacunas,
anticuerpos, alcaloides, etc).Esta ltima es de gran inters para los
Ingenieros Biotecnlogos ya que la produccin demetabolitos y
protenas en plantas presenta varias ventajas en comparacin con el
resto delos sistemas de produccin. Algunas de estas ventajas son:
el costo de produccin es en
muchos casos menor, hay una mayor facilidad de escalamiento,
protenas ms complejas(anticuerpos, protenas con varios enlaces
disulfuro, protena que requieren unprocesamiento postraduccional,
etc) pueden ser producidas. Adicionalmente, las semillas ygranos
pueden ser utilizados como sitio de almacenamiento.La modificacin
gentica de plantas puede llevarse a cabo utilizando diferentes
mtodo