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EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES
ASOCIADAS A
YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGÍONES DE LA AMAZONÍA
COLOMBIANA.
DANIELA LEÓN VELANDIA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA
BOGOTA D.C DICIEMBRE DE 2006
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EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES
ASOCIADAS A
YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGIONES DE LA AMAZONÍA
COLOMBIANA.
DANIELA LEÓN VELANDIA
TRABAJO DE GRADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TITULO
DE
MICROBIÓLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIA
JOSE SALVADOR MONTAÑA DIRECTOR
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA
BOGOTA D.C DICIEMBRE DE 2006
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NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la resolución No 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos
emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica
y porque las tesis no contengan ataques personales contra
persona alguna, antes bien se vea en
ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
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EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES
ASOCIADAS A
YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGIONES DE LA AMAZONÍA
COLOMBIANA.
DANIELA LEÓN VELANDIA
APROBADO
_______________________________
______________________________
José Salvador Montaña MSc Clara Patricia Peña MSc.
Director Co-Director Instituto SINCHI
_______________________________
Gladys Ines Cardona MSc.
Asesor Instituto SINCHI
______________________________
______________________________
Adriana Arcos Ingeniero Agronomo MSc Maria Ximena Rodríguez
PhD
Jurado 1 Jurado 2
Bogota D.C. Diciembre 2006
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EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES
ASOCIADAS A
YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGÍONES DE LA AMAZONÍA
COLOMBIANA.
DANIELA LEÓN VELANDIA
APROBADO
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Angela Umaña MPhil, David Gómez MSc.
Decana Académico Director de Carrera
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DEDICATORIA
Dedicada a mis padres por su amor incondicional, constante
esfuerzo y dedicación durante todos
estos años.
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AGRADECIMIENTOS
A mis directores de tesis José, Gladys y Clarita por su
cordinación, dirección, apoyo y por
compartir sus invaluables conocimientos conmigo.
Al Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas – SINCHI
por haber permitido el desarrollo
del presente trabajo de investigación.
A las comunidades Indígenas del Sur del Trapecio Amazónico y a
los propietarios de los arreglos
agroforestales del municipio de San José de Guaviare por
permitir el muestreo.
A todo el personal vinculado con el laboratorio de Biotecnología
del Instituto Sinchi por compartir
recursos y conocimientos.
A la Dra. María Mercedes Zambrano, Directora Científica de
Corpogen por su asesoría científica.
A los eminentes científicos Dirk Redecker y Francisco de Souza
por su interés, asesoría científica,
y por compartir su experiencia e información.
A Adriana Arcos por facilitarme documentación relacionada con
esta investigación.
A mis hermanos Pacho, David y Lucha, y a mi Abuelita por su
compañía y su apoyo durante todo
este proceso.
A mi prima Paula por su colaboración e interés.
A mi Danny por estar siempre conmigo apoyándome en todo y por su
valiosa colaboración y
compañía en la realización de este proyecto.
A Fiona, Figo, Ramona y Galileo por estar siempre ahí.
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TABLA DE CONTENIDO
37 Introducción
....................................................................................................................
3 38 Marco Teórico y revisión de literatura
............................................................................
8
38.1 Micorrizas
................................................................................................................
8 38.2 Importancia de las micorrizas
................................................................................
11 38.3 Clasificación de HMA
...........................................................................................
12 38.4 Ciclo de vida de HMA
..........................................................................................
14 38.5 Etapas del desarrollo de Hongos de Micorriza Arbuscular en
sistemas suelo/planta 15
38.5.1 Germinación de las esporas
............................................................................
16 38.5.2 Colonización
...................................................................................................
18
38.6 Poblaciones de HMA en ecosistemas naturales
..................................................... 19 38.7
Planta hospedera y producción de esporas
............................................................ 21
38.7.1 Manihoto esculenta (YUCA) y su relación con los HMA
.............................. 24 38.8 Aproximaciones moleculares
al estudio de HMA .................................................
25
38.8.1 Detección de HMA en raíces
........................................................................
27 38.8.2 Espaciadores internos de trascripción (ITS)
................................................... 28
38.9 Métodos de estudio de diversidad de HMA
........................................................... 30
38.9.1 Métodos de cultivo de raíces y órganos de micorriza
..................................... 30 38.9.2 Análisis
moleculares del genoma fungal
........................................................ 32
38.10 Área de Estudio
....................................................................................................
35 38.10.1 Sur del Trapecio Amazónico
........................................................................
35 38.10.2 San José del Guaviare La región Colombiana
............................................. 40 38.10.4 La región
amazónica de Colombia, comprende las cuencas de los ríos que
tributan al Amazonas y de algunos que lo hacen al Alto Orinoco.
Limita al norte con el río Guaviare y hacia el occidente no
sobrepasa la cota de los 500 m. en la vertiente de la Cordillera
Oriental (Herrera, 1989).
.........................................................................................................
40 38.10.5 La Amazonía colombiana comparte con la cuenca
hidrográfica del río Amazonas ciertos rasgos de clima y morfología.
El 70% de esta inmensa región, está cubierta de bosques tropicales
húmedos tipo hylea, para cuyo desarrollo se requiere de una
temperatura media superior a los 22ºC y una precipitación anual
superior a los 2.000 mm., con lluvias constantes, repartidas a lo
largo del año y un período seco, corto y marcado (Herrera, 1989).
.. 40 38.10.6 En Colombia se encuentran algunas de las áreas con
mayor precipitación de la cuenca amazónica: en los altos ríos
Putumayo, Caquetá, Napo, en la región fronteriza con Venezuela y
Brasil, en el Guainía y Vaupés esta alcanza los 3.500 - 4.500 mm
anuales. Estas áreas habrían conservado la vegetación selvática
durante varios períodos largos en el pleistoceno y holoceno cuando,
al bajar la temperatura y disminuir la pluviosidad por efectos de
episodios glaciales, grandes extensiones de bosque fueron
transformados en sabanas. En estas áreas con mayor pluviosidad se
habrían refugiado especies de animales y de flora de adaptación
selvática. El aislamiento prolongado de estos refugios, habría
permitido que sus habitantes evolucionaran en formas distintas. Se
explicaría así la amplia variación de especies de la Amazonía,
donde no hay barreras geográficas que la justifiquen. Esta
hipótesis se podría aplicar, durante los últimos episodios secos, a
poblaciones humanas, para explicar la gran variación lingüística y
la distribución de algunas características culturales dentro del
área; sin embargo no ha sido puesta a prueba todavía por los
arqueólogos (Herrera, 1989).
.............................................. 40 38.10.7
Morfológicamente la planicie amazónica es una inmensa región
sedimentaria. Los sedimentos más antiguos, depositados durante el
terciario, en un mar o lago salobre, sufrieron posteriormente
procesos erosivos, de manera que el relieve es de lomeríos.
Intercaladas en este paisaje hay elevaciones mayores, superficies
aún más antiguas, reductos de formaciones montañosas del
precámbrico, que forman mesetas y colinas rocosas y son parte del
Escudo de las Guayanas. También sobresale en el relieve la región
de pie de monte andino, formada por terrazas, serranías y terrenos
levemente ondulados que se alinean en un cinturón al pie de la
-
Cordillera Oriental. Los materiales que la constituyen provienen
en su mayor parte de erosión y lavado de la cordillera, por lo
tanto, allí pueden encontrarse los mejores suelos (Herrera, 1989).
.........................................................................................................................
40 38.10.8 Las superficies más recientes están formadas por los
sedimentos fluviales, que forman auténticas planicies a lo largo de
los ríos más caudalosos. Se pueden distinguir en ellas tres
niveles: terrazas antiguas del plioceno-pleistoceno , que hoy se
encuentran sobre el nivel actual de los ríos, y las llanuras
aluviales de inundación (várzea), con dos niveles, el más alto de
los cuales se inunda cada 5 ó 10 años cuando vienen las grandes
crecientes ("conejeras") y el más bajo, lo hace en un lapso corto
de tiempo todos los años, y recibe periódicamente sedimentos
rejuvenecedores, óptimos para la agricultura (Herrera, 1989).
.................................. 41 38.10.9 Los ríos que forman
llanuras de inundación extensas, son frecuentemente, aquellos que
nacen en las vertientes orientales de los Andes. Desde allí,
arrastran sedimentos en suspensión que les dan una apariencia
barrosa; de ahí su apelativo de "ríos de aguas blancas". Los
sedimentos que cargan, propician el desarrollo de vida orgánica
numerosa y variada. Otros ríos nacen dentro del Escudo de las
Guayanas o en las superficies de denudación, atraviesan suelos
empobrecidos y sus aguas cristalinas o ambarinas adquieren en gran
volumen, una coloración oscura, debida a la presencia de minúsculas
porciones de ácidos húmicos; de ahí su apelativo de "ríos de aguas
negras" (Herrera, 1989).Estos se caracterizan por su extrema
acidez, pobreza de nutrientes y escasez de la fauna acuática
(Herrera, 1989). ................................. 41 38.10.10
Considerados en general los suelos de la Amazonía son pobres, tanto
en materia orgánica como en minerales. Aún los del pie de monte y
las vegas inundables son inferiores a los suelos andinos fértiles.
Los nutrientes para la frondosa vegetación, no se encuentran en el
delgado suelo, sino en la capa de hojarasca y detritus que lo
cubre, de donde las plantas los obtienen directamente a través de
raíces "alimentadoras" y hongos micorriza (Herrera, 1989).
....................................................................................................................................
41 38.10.11 Con respecto a los solidos en suspensión que
transportan los rios Cotuhe, Putumayo y Amazonas, la mayor parte
esta representada por arcillas, limos y arenas finas, ademas de
algunas fracciones de plancton procedente de los lagos de sus
llanuras de inundación. 41 38.10.12 Por su parte, el rio amazonas
supera ampliamente el Putumayo en el transporte de solidos en
suspensión y alcanza una concentración de 116 mg/l. En contraste,
los afluentes del amazonas encontrados en la orilla colombiana
presenta una concentración promedio de solidos disueltos de 29 mg/l
que corresponde a 4 veces menos que lo encontrado en el amazonas.
....................................................................................................................................
41
38.11 Antecedentes del estudio
.....................................................................................
44 39 FORMULACIÓN del problema y justificación
........................................................... 47
39.1 Formulación del problema
.....................................................................................
47 39.2 Justificación
...........................................................................................................
47
40 Objetivos
.......................................................................................................................
49 40.1 Objetivo General
....................................................................................................
49 40.2 Objetivos Específicos
.............................................................................................
49
44 Materiales y Métodos
....................................................................................................
50 44.1 Muestreo
...............................................................................................................
50
44.1.1 Muestreo de raíces
..........................................................................................
52 44.1.2 Muestreo de suelo
..........................................................................................
52
44.2 Material Biológico
................................................................................................
53 44.3 Iniciadores para PCR
.............................................................................................
53 44.4 Métodos
..................................................................................................................
54
44.7.1 Tinción de raíces (Philips & Hayman 1970)
.................................................. 54 44.7.2
Determinación del porcentaje de colonización
............................................... 55 44.7.3
Extracción de esporas
.....................................................................................
57 44.7.4 Evaluación morfológica de las esporas
........................................................... 59
44.8 ExtraccionExtracción de DNA
.............................................................................
59
-
44.8.1 Amplificación de la región ITS
.......................................................................
61 44.8.2 Purificación de los productos PCR
.................................................................
63 44.8.3 5.4.5 Clonación
...............................................................................................
63 44.8.4 5.4.3 Análisis de restricción de DNA ribosomal
(ARDRA)Digestión de los productos PCR
............................................................................................................................
63 44.8.6 La digestión de los productos de PCR se realizo de
acuerdo a lo reportado por Redecker et al, 1997. utilizando las
enzimas de digestión Hinf I y Taq I. La digestión con Hinf I se
realizo a 37ºC durante 1 hora y la digestión con Taq I se realizo a
65ºC por 1 hora. Los productos de las digestiones fueron
visualizados por electroforesis en geles de agarosa ultrapura al 3%
con buffer TAE. Se utilizo dos marcadores de peso molecular (50 pb
y 100 pb).
............................................................................................................................
64 44.8.7
........................................................................................................................
64 44.8.8 5.4.4 Visualización de los productos y lectura de
patrones de restricción. ... 64 44.8.9 La comparación de los
patrones de bandas obtenidas después de la digestión con las
respectivas enzimas (RFLP) se realizará utilizando el software
Quantity one de Bio-Rad
....................................................................................................................................
65 44.8.10 5.4.6 Secuenciación
......................................................................................
65
45 Resultados
....................................................................................................................
67 45.1 Porcentaje de colonización
....................................................................................
67 45.4 Recuento de esporas
...............................................................................................
69 45.5 Análisis Fisicoquímicos
.........................................................................................
70 45.6 Análisis morfológico
..............................................................................................
74 45.7 Extracción de DNA
...............................................................................................
79 45.8 Amplificación.
.......................................................................................................
80 45.11 Clonación
.............................................................................................................
83 45.12 Análisis de patrones ARDRA
..............................................................................
86 45.13 Secuenciación
.....................................................................................................
94
46 Discusión de resultados
.................................................................................................
97 46.1 Porcentaje de colonización de HMA y su relación con
recuentos de esporas y el contenido de fósforo (ppm) en el suelo.
........................................................................................
97 46.2 Recuento de esporas de HMA
.............................................................................
100 46.3 Porcentaje de colonización de HMA y su relación con los
valores del pH, el contenido de materia orgánica, acidez
intercambiable y % de saturación de Aluminio. ..................
102 46.4 Evaluación Morfológica de Esporas
....................................................................
104 46.5 Extracción de DNA
..............................................................................................
106 46.6 Amplificaciones con primers generales y género-
específicos, clonación y secuenciación
......................................................................................................................................
108
47 Conclusiones
...............................................................................................................
113 48 RECOMENDACIONES
...........................................................................................
114 49
...................................................................................................................................
116 62 Referencias
..................................................................................................................
116 11 Anexos…………………………………………………………………………………..117
-
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura No 1 Clasificación de los HMA del orden
Glomales…………………………………7
Figura No 2 Ciclo de vida de HMA…………………………………………………………...11
Figura No 3 Estructura morfológica de las micorrizas vesiculo
arbuscular……………...12
Figura No 4 Chagra del Sur del Trapecio
Amazónico……..……………………………....36
Figura No 5 Arreglo Agroforestal de San José del
Guaviare……………………………...38
Figura No 6 Área de muestreo Sur del Trapecio
Amazónico……………………………...43
Figura No 7 Área de muestreo San José del
Guaviare…………………………………....44
Figura No 8 Tipos de muestreos empleados en
campo……………………………………45
Figura No 9 Proceso de tinción de
raíces……………………………………………………47
Figura No 10 Determinación del porcentaje de
colonización……………………….……..48
Figura No 11 Aislamiento de esporas………………………………………………………..49
Figura No 12 Recuento de esporas…………………………………………………………..49
Figura No 13 Representaciones esquemáticas de los genes rRNA con
sitios de anillamiento de los
primers……………………………………………………………………52
Figura No 14 Porcentaje de colonización total de HMA en Manihot
esculenta en el Sur del
Trapecio Amazónico y San José del Guaviare…………………………………………57
Figura No 15 Porcentaje de colonización de HMA por arbúsculos y
vesículas en Manihot
esculenta en el Sur del Trapecio Amazónico y San José del
Guaviare………………….57
Figura No 16 Recuentos de esporas de HMA en suelos rizosféricos
de Manihot esculenta en el
Sur del Trapecio Amazónico y San José del Guaviare………………….59
Figura No 17 Relación entre porcentaje de colonización y
concentración de fósforo en suelos
rizosféricos de Manihot esculenta en dos regiones de la Amazonía
Colombiana……………………
………………………………………………………………..61
Figura No 18 Porcentaje de colonización y su relación con acidez
intercambiable y porcentaje de
saturación de aluminio………………………………………………………..62
Figura No 19 Esporas encontradas en suelos rizosféricos de las
muestras del sur del Trapecio
Amazónico……………………………………………………………………………65
Figura No 20 Esporas encontradas en suelos rizosféricos de las
muestras de San José del
Guaviare…………………………………………………………………………………….65
Figura No 21 Primera y segunda PCR anidada
……………………………………………69
Figura No 22 Clones positivos muestras Sur del Trapecio
Amazónico…………………..71
Figura No 23 Clones positivos de los arreglos agroforestales 2,
7,10 y 13 del muestreo de San
José del Guaviare……………………………………………………………………..71
Figura No 24 Clones positivos para
GIGA5.8R……………………………………………..72
Figura No 25 Análisis ARDRA CHTR1………………………………………………………73
Figura No 26 Análisis ARDRA CHTR3………………………………………………………73
-
Figura No 27 Análisis ARDRA Arreglo Agroforestal
2……………………………………...74
Figura No 28 Análisis ARDRA Arreglo Agroforestal
7……………………………………...74
Figura No 29 Análisis ARDRA Arreglo Agroforestal
10…………………………………….75
Figura No 30 Análisis ARDRA Arreglo Agroforestal
13……………………………………75
Figura No 31 Análisis ARDRA (GIGA5.8R) Arreglo Agroforestal
7………………………76
Figura No 32 Análisis ARDRA (GIGA 5.8 R) Arreglo Agroforestal
10…..………………..77
Figura No 33 Secuenciación del clon 12 del arreglo agroforestal
13…………………….78
Figura No 34 Secuencia del clon 6 del arreglo agroforestal
10…………………………...78
-
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla No 1 Características de los lugares de
muestreo……..…………………………….44
Tabla No 2 Secuencias de iniciadores……………………………………………………….46
Tabla No 3 Enzimas de restricción usadas en los ensayos de ARDRA
de los amplificados de
HMA…………………………………………………………………………..54
Tabla No 4 Porcentaje de colonización de HMA en raíces de
Manihot esculenta……...56
Tabla No 5 Recuento de esporas a partir de 100g de suelo
rizosférico………………….58
Tabla No 6 Análisis fisicoquímicos de las muestras de suelo
rizosférico del Sur del Trapecio
Amazónico y San José del Guaviare……………………………………………...59
Tabla No 7 Características fenotipicas de las esporas
encontradas en los suelos rizosféricos de
Manihot esculenta en las muestras del sur del Trapecio Amazónico
y San José del Guaviare……
……………………………………………………………………64
Tabla No 8 Morfotipos encontrados por
muestra…………………………………………...66
Tabla No 9 Datos clonación…………………………………………………………………...70
-
RESUMEN
Se caracterizó la población micorrítica asociada a raíces de
yuca (Manihot esculenta) colectadas
en 2 regiones de la Amazonía Colombiana (Chagras del Sur del
trapecio Amazónico y arreglos
agroforestales (A.AF) en San José de Guaviare). Se evaluaron
diferentes variables como fueron:
porcentaje de colonización, recuento de esporas, identificación
taxonómica por características
macro y microscópicas, características fisicoquímicas del suelo
y caracterización molecular.
Respecto al porcentaje de colonización se observó que en todas
las muestras analizadas se
encontró colonización por MA evidenciándose un valor mayor en
las muestras colectadas en San
José de Guaviare. De igual forma el número de esporas por gramo
de suelo fue mayor en estas
muestras con respecto a las colectadas en chagras del sur del
trapecio amazónico. Los
recuentosmásbajos se encontraron en las rizósferas de yuca
colectadas en chagras bajo el
paisaje de llanura aluvial en el sur del trapecio amazónico.
En la identificación taxonómica se encontraron 12 morfotipos en
las muestras del sur del trapecio
amazónico y 10 morfotipos en las muestras de San José de
Guaviare. Hubo predominancia de
especies del género Glomus, y en menor porcentaje especies de
los géneros Acaulospora y
Gigaspora.
Para la caracterización molecular, se extrajo DNA a partir de
raíces de yuca colonizadas por
diferentes géneros de hongos MA. A partir de este se realizó una
PCR general utilizando primers
universales (ITS4-NS5), obteniéndose un fragmento de
aproximadamente 1200 pb. Del producto
obtenido de la PCR general se realizaron PCRs anidadas con
primers género específicos (GLOM
5.8 R, GIGA 5.8 R, ACAU 1660, ARCH 1311, LETC 1670), reportados
por (Redecker et al, (2000)
para la identificación molecular de hongos MA.
En las muestras evaluadas se observó solamente amplificación con
los primers GIGA 5.8 R y
GLOM 5.8 R, específicos para amplificar secuencias de Glomus y
Gigaspora respectivamente.
Dos de las seis muestras colectadas en chagras del sur del
trapecio amazónico (CHTR1 y
CHTR3) amplificaron con el primer GLOM 5.8 R, evidenciándose un
fragmento de
aproximadamente 200 pb, sin embargo no se observó amplificación
en ninguna de las muestras
con el primer GIGA 5.8 R. De las muestras colectadas en A.AF en
San José de Guaviare, 4 de las
6 amplificaron con el primer específico GLOM 5.8 R (Arreglos
agroforestales 2, 7, 10 y 13)
obteniendo un fragmento de aproximadamente 200 pb y 2 con el
primer específico para Gigaspora
GIGA 5.8 R (A.AF 7 y 10), obteniéndose un fragmento de
aproximadamente 300 pb.
Los productos PCR con el fragmento de interés fueron clonados
dentro del vector TOPO pCR2.1
-
de Invitrogen y transformados en células de E. coli DH5-α
químicamente competentes. De cada
muestra evaluada se obtuvo un promedio entre 3 y 17 clones con
el inserto de interés, 10 clones
para las muestras del sur del trapecio amazónico y 68 clones
para las de San José de guaviare.
De cada clon se extrajo el DNA plasmídico, se purificó y se
realizaron los análisis de ARDRA
con las enzimas de restricción Hinf I y Taq I de Invitrogen. Se
construyó una matriz de presencia y
ausencia con los resultados de las 2 enzimas, agrupando los
clones según su semejanza genética
por medio del coeficiente de Dice y el método de agrupamiento de
UPGMA.
En las muestras del sur del trapecio amazónico se encontró en
general una alta similaridad entre
los clones evaluados, a diferencia de lo encontrado en las
muestras de San José de Guaviare,
donde los clones fueronmásdisímiles, encontrándose con esto una
mayor diversidad. De acuerdo
a estos agrupamientos se escogieron los clones para la
secuenciación. Hasta la fecha solamente
se tienen datos de 2 secuencias. La primera corresponde al clon
número 3 del A.AF 10, el cuál
reportó un 94% de similitud en el alineamiento con el clon Giga
3538.1 aislado de raíces de Inga
parteno en Costa Rica. La otra secuencia corresponde al clon 12
del A.AF 13 la cual fue alineada
con el clon de Glomus Pa106 con una similitud del 92%, clon
aislado de raíces colonizadas por
HMA de Prunus africana.
El mayor porcentaje de colonización y diversidad de hongos MA en
las muestras colectadas en
A.AF en San José de Guaviare se relacionó con: niveles bajos de
fósforo (0.61-5.51 ppm),
porcentaje de carbono orgánico con niveles medios y bajos (1.14
– 2.62 %) y valores de pH
extremadamente ácidos (4.05-5.0). Igualmente se observó que la
cobertura de los A.AF
proporciona mayor oferta de recursos y por lo tanto mejores
beneficios para el establecimiento de
esta simbiosis.
-
ABSTRACT
A mycorrhizal population associated to yucca roots was
characterized. There were collected in 2
regions of the Colombian Amazon (chagras from the South of the
Amazonic trapezium and
agroforestal arrangements AF.A in San José del Guaviare). There
were evaluated different
variables which were: colonization percentage, spores recount,
taxonomic identification by
macroscopic and microscopic characteristics as well,
physicochemical characteristics of the soil,
and molecular characterization. In reference to the colonization
percentage, in all the samples
analyzed it was found that AMF colonization showed a greater
value in the sample collected in San
José del Guaviare. Also, the number of spores per gram of soil
was bigger in these samples than
in the samples collected in the chagras of the South of the
Amazonic trapezium. The lowest spore
recounts were found in the yucca rhizospheres collected in
chagras under the landscape of llanura
aluvial in the South of the Amazonic trapezium.
In the taxonomic identification there were found 12 morphotypes
in the samples collected from the
South of the Amazonic trapezium and 10 morphotypes in the
samples collected in San José del
Guaviare. Species of the genera Glomus were the ones which
prevailed although there were also
found species from Acaulospora and Gigaspora in a lower
percentage.
For the molecular characterization, DNA was extracted from yucca
roots colonized by different
genera of AMF. With this DNA a general PCR was performed using
ITS4-NS5 universal primers
obtaining a fragment of ca. 1200bp. From the product obtained
from the general PCR there were
performed nested PCRs with genera-specific primers (GLOM 5.8 R,
GIGA 5.8 R, ACAU 1660,
ARCH 1311, LETC 1670) reported by (Redecker et al., 2000) for
the molecular identification of
AMF.
In the samples evaluated there was only observed amplification
with the specific primers GIGA 5.8
R and GLOM 5.8 R to amplify Glomus and Gigaspora sequences
respectively. 2 of the 6 samples
collected in chagras of the South of the Amazonic trapezium
(CHTR1 and CHTR3) amplified with
the GLOM 5.8 R primer showing a fragment of ca. 200bp. However
it was not observed any
amplification in none of the samples tested with the GIGA 5.8 R
primer. From the samples
collected from AF.A in San José del Guaviare, 4 of the 6 samples
amplified with the GLOM 5.8 R
primer (AF.A 2, 7, 10, and 13) obtaining a fragment of ca. 200bp
and 2 with the Gigaspora-specific
primer GIGA 5.8 R (AF.A 7 and 10), obtaining a fragment of ca.
300bp.
The PCR products with the intended fragment were cloned inside
the TOPO pCR2.1 vector from
Invitrogen and transformed in chemical competent E. coli
DH5-alpha cells. From each sample
tested it was obtained an average between 3 and 17 clones with
the intended fragment, 10 clones
-
for the samples from the South of the Amazonic trapezium, and 68
clones for the ones from San
José del Guaviare. From each clone plasmidic DNA was extracted,
purified and ARDRA analysis
were performed with the restriction enzymes Hinf I and Taq I
from Invitrogen. It was built up a
presence-absence matrix simultaneously considering the results
for the 2 enzymes, grouping the
clones according to their genetic resemblance by means of the
Dice coefficient and the UPGMA
grouping method.
In the samples from the south of the amazonic trapezium it was
found, in general, a high similarity
between the tested clones in contrast to the findings in the
samples from San José del Guaviare,
where the clones were more different thus finding a greater
diversity. According to these groupings
the clones to be sequenced were chosen. Until now, there only
exist data from 2 sequences. The
first, corresponds to clone number 3 of the AF.A 10 which
reported 94% of similarity in the
alignment with clone Giga 3538.1 isolated from roots of Inga
parteno in Costa Rica. The other
sequence corresponds to clon 12 of AF.A 13 which was aligned
with Glomus Pa106 clone with
92% of similarity, the clon isolated from roots colonized by
Prunus aficana AMF.
The greater colonization percentage and AMF diversity in the
samples collected in AF.A in San
José de Guaviare were related to: low phosphorus levels (0.61 -
5.51 ppm), low and medium levels
of organic carbon percentage (1.14 – 2.62 %) and extremely acid
pH values (4.05 – 5.0). Likewise,
it was observed that the covering of the AF.A gives a higher
resource offering, thus giving better
benefits for the symbiosis establishment.
-
INTRODUCCIÓN
En la Amazonía Colombiana los suelos son pobres, tanto en
materia orgánica como nutrientes,
estos últimos se encuentran en la capa de hojarasca y detritus
de donde las plantas los obtienen a
partir de raíces alimentadoras y hongos de micorriza (Peña et
al., 2006).
Los agroecosistemas de la amazonía colombiana presentan como
rasgo característico la no
utilización de agroquímicos, a pesar de establecerse en suelos
muy poco fértiles. La fertilidad de
los suelos en tales agroecosistemas es altamente dependiente de
la participación de la microbiota
del suelo en procesos de descomposición, mineralización,
solubilización y fijación simbiótica de
nutrientes. Por esta razón se afirma que las comunidades
vegetales de la Amazonía se establecen
bajo un potencial de microorganismos transformadores y
enriquecedores del suelo. De ahí la
importancia de conocer la riqueza microbiana presente (www.
geocities.com/RainForest/Jungla/1143/Micorrizas.htm, septiembre
2006).
En los suelos amazónicos, las micorrizas arbusculares, son casi
una relación obligada para el
establecimiento de las especies vegetales tanto en condiciones
naturales como en
agroecosistemas. El conocimiento de la diversidad de estos
microorganismos, el estudio de la
simbiosis que establecen con la vegetación, su relación con
factores fisicoquímicos del suelo y
otras poblaciones biológicas, el aporte en el establecimiento de
especies vegetales, su uso en la
recuperación de zonas degradadas y en el desarrollo potencial de
biofertilizantes, son algunas de
las razones que han llevado al Instituto Amazónico de
Investigaciones Científicas (Sinchi) a
abordar esta comunidad como tema de investigación.
La fase inicial de investigación sobre HMA consiste en
identificar las condiciones naturales de la
simbiosis, con el fin de conocer la ocurrencia y distribución
nativa de los hongos de micorriza
arbuscular. Por esto se evaluó el porcentaje de colonización,
número de esporas presentes en
suelo rizosférico, morfotipos encontrados e identificación
molecular a partir de raíces de plantas
micorrizadas.
Uno de los puntos más difíciles de abordar sobre este grupo de
microorganismos es su
caracterización taxonómica, lo cual limita el conocimiento de su
diversidad y su aplicación. La
razón básica es que estos organismos son simbiontes obligados,
por lo que no pueden ser
aislados y mantenidos in vitro; además la única estructura que
permite diferenciaciones
morfológicas entre géneros y especies son las esporas que
producen y que pueden ser fácilmente
aisladas en el suelo (Dodd et al., 1996 citado en Antoniolli,
1999).
-
A pesar de que las características morfológicas de las esporas
han sido usadas por años para su
determinación, no existen claves taxonómicas suficientes y
actualizadas que lleven a una fácil y
correcta determinación, por lo que en muchos casos se necesita
de expertos dedicados a esta
labor para la correcta determinación de un morfotipo, y aún
entre ellos existen discrepancias sobre
género y especies reportadas (Peña et al., 2006).
El entendimiento de la importancia de la diversidad de HMA en
los ecosistemas naturales ha sido
un gran reto. El hecho de que muchas plantas puedan ser
colonizadas por la mayoría de HMA
indica una ausencia de especificidad de los hospederos, lo que
puede contribuir al mantenimiento
de la diversidad fungal en los suelos. Los estudios de la
diversidad de los HMA y la ecología de la
simbiosis se han soportado en datos de la ocurrencia y
frecuencia de diferentes tipos de esporas y
métodos de clasificación morfológicos los cuales están limitados
por la pequeña cantidad relativa
de diversidad morfológica entre especies. Los hongos se
clasifican bajo una base de morfología
de las esporas y su desarrollo. Es frecuentemente difícil
identificar los taxones en material de
campo de los aislamientos por la condición y preservación
variables de las esporas (Antoniolli,
1999).
La sola utilización de datos de esporas puede dar origen a
conclusiones erróneas sobre la
diversidad de las poblaciones de hongos ya que el número de
esporas no refleja la presencia de
hongos no esporulantes ni el grado o nivel de colonización por
especies particulares en las raíces
vegetales. Más aún, aunque las esporas muestran una baja
diversidad morfológica estas son
altamente diversas a nivel genético. Las técnicas de biología
molecular ofrecen la posibilidad de
tener métodos rápidos, sensibles y confiables para la
identificación de aislamientos fungales tanto
como componentes de las poblaciones de esporas como estructuras
vegetativas en raíces y
suelo. También tienen el potencial de proveer información
cuantitativa en cuanto al desarrollo
vegetativo del HMA (Antoniolli, 1999).
El número de esporas presentes en el suelo no siempre está
relacionado con presencia de HMA
en raíz, ya que en algunas especies la producción de esporas
ocurre después de que es
alcanzado el umbral de la colonización. Además, la producción de
esporas esta influenciada y
puede ser afectada por diversos factores. El porcentaje de
colonización varía en diferentes
especies (Abbot y Robson, 1984 b; Ebbers et al., 1987; McGee,
1989; Gazey et al., 1992;
Tomeroup, 1983 y Gemma et al., 1989). Esto es importante en los
estudios de HMA ya que un
número alto de esporas en el suelo no es criterio suficiente
para decir que hay una colonización
eficiente dentro de la raíz. Por esto, con las técnicas
moleculares, amplificando directamente DNA
de la raíz se puede aclarar si hay o no una colonización
efectiva y conocer el genero de HMA que
esta colonizando la raíz.
-
En años recientes, el desarrollo de técnicas moleculares basadas
en PCR ha dado una
aproximación alternativa y valiosa a la identificación
morfológica. Estas técnicas moleculares
incluyen: Amplificación de regiones variables tales como los
genes ribosomales espaciadores
internos de trascripción (ITS) o espaciadores intergénicos
(IGS), polimorfismos en la longitud de
los fragmentos de restricción (RFLP´s) , amplificación de
secuencias cortas repetidas
(microsatélites) y amplificación al azar de DNA polimorfito
(RAPD). Aunque estos métodos han
sido aplicados exitosamente a estudios de HMA el uso potencial
de la región ITS para diseñar
primers a ser usados para identificación de especies y
cuantificación no ha sido bien explorado. La
utilización de la región ITS tiene ventajas porque los genes
pueden ocurrir en copias múltiples y
las regiones son lo suficiente variables para permitir una clara
discriminación entre especies
cercanamente relacionadas (Antoniolli, 1999).
En cuanto al área de estudio los inventarios de micorrizas
arbusculares de la región amazónica
son escasos y en muchos casos los morfotipos aislados no han
sido descritos o incluidos en las
guías taxonómicas publicadas, por lo que el conocimiento de la
diversidad de estos hongos en la
región es limitada. De allí la necesidad de usar otras técnicas
que apoyen estos estudios. En el
año 2001 Schüßler et al revolucionó la taxonomía de Glomales a
partir del análisis molecular de
las secuencias SSU del rRNA, lo cual permitió reconocer las
técnicas moleculares como una
alternativa válida para su estudio.
Con base en lo anterior, y teniendo en cuenta que no existe
información detallada acerca de la
heterogeneidad de especies presentes en la región amazónica
colombiana, se planteó la
realización de un trabajo de investigación, cuyo objetivo
general fue: Caracterizar la población
micorrítica presente en raíces de plantas de yuca (Manihot
esculenta) aisladas de dos regiones
de la Amazonía Colombiana. El análisis de la región ITS del rDNA
se constituye una herramienta
molecular valiosa para la identificación de estos hongos de
manera rápida y confiable,
complementando la metodología tradicional.
La yuca (Manihot esculenta) ha sido uno de los principales
cultivos agrícolas de las comunidades
amazónicas, además de ser, su base alimenticia. Es empleada como
ritual de intercambio cultural
y comercial. Es por esto que fue seleccionada como modelo de
estudio (Arias, J et al., 2005). La
yuca es también una especie vegetal que tiene gran afinidad con
la simbiosis de HMA debido a
sus necesidades nutricionales en suelos tan pobres como los de
la región amazónica.
-
MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA
Micorrizas
Las asociaciones simbióticas entre raíces vegetales y hongos
fueron denominadas en 1885 por el
patólogo forestal alemán A. B. Fran como micorriza, derivado de
la palabra en griego que traduce
raíz fungal (Aristón, 1999).
Las micorrizas, de las que hace muchos años se sabe son comunes
en árboles forestales, hoy en
día se consideran como las raíces nutricias normales de la
mayoría de las plantas, incluyendo
cereales, hortalizas, plantas de ornato y, por supuesto, los
árboles (Agrios, 2002).
Hay tres tipos de micorrizas que se distinguen por la forma en
que las hifas del hongo se
encuentran dispuestas dentro de los tejidos corticales de la
raíz:
Las ectomicorrizas. Se caracterizan por formar en las células
corticales una red de micelio
característica denominada red de Hartig. Estas raíces comúnmente
son hinchadas y en algunas
combinaciones que se establecen dentro el hongo y su hospedante
se encuentran
considerablemente más bifurcadas que las raíces no micorrizales.
Las ectomicorrizas se forman
principalmente en árboles forestales debido a los basidiomicetes
que forman setas y bejines y a
varios ascomicetes. Las esporas de los hongos ectomicorreicos se
forman sobre el suelo y son
diseminadas por el viento. Las hifas de estos hongos
frecuentemente producen un “manto
fungoso” estrechamente entretejido en torno a las raíces
nutricias y dicho manto tiene un grosor
que varia desde el diámetro de una a dos hifas hasta como de
treinta a cuarenta. Dichos hongos
penetran también en las raíces, pero solo crecen alrededor de
las células corticales,
reemplazando a parte de la lámina media entre las células y
formando la denominada red de
Hartig (Agrios, 2002).
Los árboles con asociaciones ectomicorríticas son dominantes en
bosques de confieras, en
regiones boreales frías o alpinas, y muchos bosques de hoja
ancha en regiones templadas o
mediterráneas, pero también se presentan en sabanas tropicales o
subtropicales o en bosques
lluviosos. La mayoría de los hospederos de ectomicorrizas son
los árboles o arbustos, pero
existen asociaciones formadas por unas pocas plantas herbáceas.
Los hongos ectomicorriticos
contribuyen significativamente con la biomasa de los ecosistemas
de bosque. Las hifas de los
hongos ectomicorriticos tienen capacidad saprofitita, pueden
absorber fósforo y nitrógeno de
fuentes inorgánicas y orgánicas (Bledsoe 1992).
-
En las endomicorrizas el hongo crece dentro de las células
corticales de la raíz y forma
estructuras características (Currah 1991). Existen dos tipos de
endomicorrizas, el grupo más
común se distingue por presentar hifas aseptadas, vesículas y
estructuras ramificadas que le
confieren el nombre de micorrizas vesículo-arbusculares. El
segundo grupo está constituido por
hongos con hifas septadas que invaden las células de la raíz sin
romper la membrana plasmática
y crecen dentro de la célula formando estructuras globosas
(Richardson et al., 1993).
Las micorrizas arbusculares se originan a partir de hifas que
proceden de los propágulos
existentes en el suelo (esporas maduras, fragmentos de raíz
micorrizados, o plantas micorrizadas
que crecen en vecindad). Cuando una hifa contacta con la
superficie de una célula epidérmica de
la raíz, forma un apresorio que originara seguidamente la hifa
colonizadora que penetrara en
dicha célula o atravesara el espacio intercelular. En la zona
externa del cortex de la raíz forma
unas estructuras intracelulares típicas que son los ovillos; en
la zona media las hifas crecen
normalmente en forma longitudinal en los espacios
intercelulares; Mientras que en la zona interna
las hifas penetran intracelularmente y forman los arbusculos por
ramificación dicotómica repetida,
a nivel de los cuales se produce el intercambio de
nutrientes.
También habría que destacar la formación de vesículas en el
cortex cuya función es el
almacenamiento de reservas lipidicas. Tras la colonización
interna se produce la ramificación y
desarrollo del micelio externo, que es clave en la captación de
nutrientes y da lugar a nuevos
puntos de colonización en la propia raíz o en otras próximas.
Sobre la red tridimensional de hifas
que constituye se forman las esporas, estructuras de resistencia
que, al madurar, completan el
ciclo del hongo (Bledsoe 1992). Estas micorrizas no se
encuentran rodeadas por un manto
fungoso denso, sino por una masa micelial laxa que se forma
sobre la superficie de la raíz a partir
de la cual se forman subterráneamente hifas y grandes zigosporas
de color perla o bien
clamidosporas. Las endomicorrizas tienen una distribución
mundial, encontrándose desde los
ecosistemas árticos hasta los ecosistemas desérticos (Bledsoe,
1992).
Las endomicorrizas son la simbiosis predominante tanto en
coberturas naturales como en
coberturas antrópicas. Igualmente se ha observado que el
fenómeno de dominancia de algunas
especies es más evidente en zonas con climas fríos que en zonas
de climas templados (Bhatia et
al., 1996)
Los hongos micorriticos arbusculares son todos miembros de la
división Glomeromycota del
orden de los Glomales; la clasificación actual contiene 2
subórdenes que son Glomineae y
Gigasporineae; dentro de los Glomineae se encuentras las
familias Glomaceae (Glomus),
Acaulosporaceae (Acaulospora y Entrophospora), Archaeosporaceae
(Archaeospora) y
Paraglomaceae (Paraglomus) y dentro del suborden Gigasporineae
se encuentra la familia
Gigasporineae (Gigaspora y Scutellospora (INVAM, 2006) (Figura
1). El número de especies
http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S0034-77441998000200004&script=sci_arttext#Richardson#Richardsonhttp://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S0034-77441998000200004&script=sci_arttext#Currah91#Currah91
-
dentro de los glomales actualmente es de 154 (INVAM, 2006).
Figura 1: Clasificación de los HMA del orden Glomales (INVAM,
2006)
Importancia de las micorrizas
Las micorrizas al parecer mejoran el crecimiento de la planta al
aumentar la superficie de
absorción del sistema radial; al absorber selectivamente y al
acumular ciertos nutrientes,
especialmente el fósforo; al solubilizar y hacer disponibles
para la planta algunos minerales
normalmente insolubles; al permitir que las raíces alimentadoras
funcionen durante más tiempo; y
al hacer que las raíces alimentadoras sean más resistentes a la
infección que ocasionan algunos
hongos del suelo tales como Phytophthora, Pythium y Fusarium
(Agrios, 2002).
Sin embargo, debe tenerse en cuenta que hay muchas asociaciones
distintas que se establecen
entre el hongo y su hospedante y que cada combinación puede
tener efectos distintos sobre el
crecimiento de la planta. Algunos hongos micorriticos tienen un
amplio rango de hospederos,
mientras que otros son más específicos. Así mismo, algunos de
ellos benefician el mayor grado a
un determinado hospedante que otros hongos, y algunos hospederos
sacan un mejor provecho al
asociarse con ciertos hongos micorriticos que con otros
hospedantes. Los hongos micorrizales
necesitan también a un hospedante para poder crecer y
reproducirse; en ausencia de
hospedantes, el hongo se mantiene en reposo en forma de esporas
(Agrios, 2002).
Las micorrizas arbusculares estimulan el crecimiento, desarrollo
y nutrición de las plantas,
-
especialmente en suelos de baja y moderada fertilidad los
estudios llevados a cabo han puesto de
manifiesto que dichos efectos se deben a que la micorriza mejora
sustancialmente la absorción de
nutrientes y agua por la planta y que el principal nutriente
implicado es el fósforo (Barea et al.,
2002).
Se sabe que la mayor parte de los suelos naturales tienen un
bajo contenido en fosfato asimilable,
e incluso la mayoría de los suelos arables productivos necesitan
un aporte considerable de
fertilizante fosforado para mantener su fertilidad. En efecto,
el 95-99% del fósforo de un suelo esta
integrado en compuestos orgánicos o inorgánicos insolubles. De
otro lado, se conoce que el ritmo
de absorción de los iones fosfato por la planta es superior al
del desplazamiento de dichos iones
desde el suelo no rizosférico hacia la raíz. Ello condiciona que
se forme una zona de agotamiento
del elemento en la rizósfera. Esta zona de agotamiento, que ha
podido ser puesta de manifiesto
por autorradiografía, es la base que justifica que el PO4-3 sea
el factor limitante del crecimiento de
las plantas en gran número de suelos. Efectivamente, el
desplazamiento del ión fosfato hacia la
raíz tiene lugar por difusión; en su camino hacia la planta se
fija fácilmente a arcillas y coloides del
suelo por medio de combinaciones insolubles con calcio, hierro o
aluminio (Barea et al., 2002).
Los mecanismos propuestos para explicar la mayor capacidad de
absorción de fósforo por las
plantas están basados en lo siguiente: (a) que la micorrización
induzca cambios morfológicos en la
planta; (b) que la micorrización induzca cambios fisiológicos,
lo que provocaría un incremento de
la capacidad de la superficie de la raíz de la planta para
absorber fósforo; (c que la micorrización
proporcione una superficie de absorción adicional (hifas del
hongo), o más eficaz; (d) que las hifas
o las raíces micorrizadas tengan capacidad para solubilizar
fuentes de fósforo no disponibles para
raíces no infectadas y (e) que la raíz micorrizada tenga más
longevidad que la que no lo esta
(Barea et al., 2002).
Clasificación de HMA
La clasificación puede estar basada tanto en la identificación
de una población como en la
estructura para entender las relaciones filogenéticas entre
unidades taxonómicas (Bentivenga y
Morton, 1994). Todas las clasificaciones están basadas en las
mismas categorías taxonómicas
lineanas (por ejemplo especie, genero). Sin embargo las clases y
las causas de diversidad son
menos universales y pueden existir grandes diferencias dentro de
cada uno de los organismos.
Las esporas fueron el único foco de atención en el que se
centraron los primeros estudios de
taxonomía de los HMA. Los cuales no fueron formalizados
utilizando la nomenclatura tradicional
hasta 1974 (Gerdemann y Trappe, 1974). Pocas áreas del mundo han
sido extensivamente
muestreadas para especies silvestres de HMA y las
investigaciones taxonómicas todavía
incluyen unos componentes de exploración y descripción
significativo (Morton, 1993).
-
Hasta ahora la espora ha sido la estructura más importante usada
para la identificación. El
diámetro de las esporas de HMA en el suelo se encuentra en un
rango de 50-600 µm (Mosse et
al., 1981).
La primera aproximación a la clasificación de HMA fue hecha en
los años 1960’s todas las
especies fueron puestas dentro del genero Endogone de los
zigomicetos basándose en la
producción de esporas muy grandes multinucleadas. Después fueron
agrupados los géneros
Acaulospora, Gigaspora, Glaziella, Modicella y Sclerocystis con
Endogone en Endogonaceae,
Zygomycetes en ese tiempo se conocían unas pocas
características, pero a medida que fueron
descritas nuevas especies, se descubrieron nuevos caracteres y
la información base fue
ampliada. Glaziella y Modicella fueron transferidos a los
Ascomycetes. Ames y Schneider (1979)
eligieron un nuevo genero, Entrophospora, y Walker y Sanders
(1986) situaron a la especie
Gigaspora sensu lato (con paredes internas y un escudo de
germinación) a un nuevo genero
Scutellospora.
Entre 1982 y 1990, el número de HMA descrito se incremento
marcadamente Trappe (1982), en
su clave sinóptica para la familia Endogonaceae, describió 77
especies excluyendo Endogone, y
Hall (1984) en su clave dicotómica para Endogonaceae listo 67
especies, otra vez excluyendo a
Endogone. Luego, Schenck y Pérez catalogaron 120 especies
descritas (1987) y
subsecuentemente 147 especies (1990) en el género de hongos que
producen asociaciones
micorríticas. Walker (1986) y otros (Berch y Koske, 1986;
Morton, 1986; Spain et al, 1989)
definieron tipos de paredes fenotípicamente diferentes y
separables, representados por
murogramas (Representación grafica de tipos de paredes y sus
posiciones relativas). Esta
clasificación de HMA se basa en características morfológicas de
esporas (incluyendo murógrafos),
ya que los caracteres vegetativos de los hongos no varían mucho
entre taxones y están también
influenciadas por especies de hospederos vegetales.
Ciclo de vida de HMA
Las micorrizas arbusculares se originan a partir de hifas que
proceden de los propágulos
existentes en el suelo (esporas maduras, fragmentos de raíz
micorrizados, o plantas micorrizadas
que crecen en vecindad). Cuando una hifa contacta con la
superficie de una célula epidérmica de
la raíz, forma un apresorio que originara seguidamente la hifa
colonizadora que penetrara en
dicha célula o atravesara el espacio intercelular. En la zona
externa del cortex de la raíz forma
unas estructuras intracelulares típicas que son los “ovilllos”;
en la zona media las hifas crecen
normalmente de forma longitudinal en los espacios
intercelulares; mientras que en la zona interna
-
las hifas penetran intercelularmente y forman los arbusculos por
ramificación dicotómica repetida,
a nivel de los cuales se produce el intercambio de nutrientes
(Figura 2).
Figura 2. Ciclo de Vida de HMA (INVAM, 2006).
También habría que destacar la formación de vesículas en el
cortex cuya función es el
almacenamiento de reservas lipidicas. Tras la colonización
interna se produce la ramificación y
desarrollo del micelio externo, que es clave en la captación de
nutrientes y da lugar a nuevos
puntos de colonización en la propia raíz o en otras próximas.
Sobre la red tridimensional de hifas
que constituye se forman las esporas, estructuras de resistencia
que, al madurar completan el
ciclo del hongo (Figura 3).
Figura 3.
Estructura morfológica de las micorrizas vesículo arbuscular
(http://www.turipana.org.co/micorrizas.htm
corredor Gloria)
http://www.turipana.org.co/micorrizas.htmhttp://www.turipana.org.co/micorrizas.htm
-
Etapas del desarrollo de Hongos de Micorriza Arbuscular en
sistemas suelo/planta
Los Hongos de Micorriza Arbuscular (HMA) son simbiontes
biotróficos obligados con un ciclo de
vida dividido en dos etapas distintas. Por un lado, los estadios
de reposo y reproductivo (esporas,
esporocarpos, y posiblemente también vesículas) son
independientes de la planta. Por otra parte,
los estadios vegetativos están involucrados en interacciones
complejas con las plantas entre las
cuales se incluyen el reconocimiento, la colonización y el
intercambio de nutrientes. Estas etapas
son representadas por el desarrollo de hifas externas en el
suelo e hifas y espirales, arbusculos y
vesículas dentro de la raíz.
Esporas de HMA
Las esporas son producidas rápidamente en presencia de una
planta hospedera, de manera que
a los 4 a 6 meses son producidas miles de nuevas esporas del
mismo tipo. Las esporas son
formadas en el micelio extraradical o agregadas en estructuras
más o menos bien definidas
llamadas esporocarpos. Aunque en algunas especies las
características de los esporocarpos son
importantes, las características individuales de las esporas son
las que principalmente se utilizan
para la identificación. Las esporas difieren en forma,
estructura, contenido citoplasmático, color,
tamaño, número de paredes vía de germinación, morfología de
esporas secundarias y presencia o
ausencia de esporocarpos (Mosse et al., 1981; Gerdemann y
Trappe, 1974; Morton, 1990).
El fenotipo de la espora es el resultado de procesos de
desarrollo completamente diferentes de
aquellos del talo, por lo que la espora es considerada ser
autónoma en forma y función por
algunos investigadores. Sin embargo, el tubo germinal de la
espora puede originarse a partir de
una red hifal filamentosa, arbusculos, vesículas o células
accesorias (Morton et al., 1995b). El
compromiso de la hifa arbuscular altamente modificada en la
colonización no es muy posible.
Morton (1993) considera que un individuo fungal es representado
por una sola espora identificable
la cual consiste de una sola célula multinucleada. Esta célula
puede dar origen a una nueva
colonia fungal con componentes del micelio dentro de una raíz y
en el suelo. Esta colonia
vegetativa eventualmente dará origen a nuevos individuos en
forma de nuevas esporas.
Las esporas son células morfológicamente especializadas las
cuales no contribuyen directamente
ni soportan actividades del desarrollo de la micorriza e
interacciones hospedero-hongo. La función
de la espora es llevar la información genética a nuevos hábitats
e iniciar nuevos individuos
espacialmente separados del organismo parental. En ausencia de
información sobre el ciclo
nuclear o existencia de etapas sexuales no es posible determinar
si las esporas representan
realmente nuevas generaciones de nuevos individuos. Sin embargo,
existe una gran variabilidad
genética entre las esporas dentro de una sola especie e incluso
entre las que se originan de un
cultivo que parte de una sola espora (Lloyd-McGilp et al., 1996;
Rosendahl y Taylor, 1997;
-
Sanders et al., 1995; Wyss y Bonfante, 1993; Zézé et al., 1997).
Esto complica los factores y
resalta la necesidad de investigaciones en el ciclo de vida y la
genética del hongo.
Germinación de las esporas
La germinación de esporas es una parte integral del ciclo de
vida de los hongos de micorriza
arbuscular ya que representa la iniciación de la etapa
vegetativa del crecimiento. Los caracteres
de germinación son importantes para la taxonomía ya que son
utilizados para distinguir entre los
dos géneros de Gigasporinae, Gigaspora y Scutellospora. En
Gigaspora la germinación ocurre
directamente a través de la pared celular mientras que en
Scutellospora ésta ocurre a partir de un
escudo de germinación formado sobre o dentro de una capa de
pared interna (Walter y Sanders,
1986).
La dormancia de esporas puede variar desde dos semanas hasta
muchos meses en especies de
Acaulospora, G. intraradices y Gigaspora gigantea (Gazey et al.,
1992; Tommerup. 1983). La
germinación de esporas puede también estar influenciada por el
pH, la humedad, los exudados de
la raíz hospedera y otros factores (Tommerup, 1983; Hetrick,
1984; Hepper, 1984; Siquiera et al.,
1985). Por ejemplo, las esporas de Glomus mosseae germinan más
rápidamente cuando son
almacenadas a bajas temperaturas (Hepper y Smith, 1976). Muchas
bacterias del suelo pueden
afectar la germinación de esporas. Algunas pueden ser
inhibidoras mientras otras promueven la
germinación y formación micorrizales (Fitter y Garbaye,
1994).
En presencia de factores de la raíz hospedera, el crecimiento
hifal a partir de esporas no es
todavía bien comprendido. Originalmente se propuso que la falta
de síntesis de DNA y
proliferación nuclear podrían ser la causa (Burggraaf y
Beringer, 1989), pero las observaciones de
migración nuclear y replicación de DNA nuclear en la hifas
creciendo a partir de esporas
(Bianciotto y Bonfante, 1993); Bécard y Pfeffer, 1993), han
llevado al rechazo de ésta hipótesis, y
otros mecanismos deben ser los responsables de la falta de
crecimiento. Estos podrían incluir
sistemas de transporte de membrana no efectivos tal que la
habilidad de absorber nutrientes es
limitada (Smith y Smith, 1986).
Las esporas transportadas por el suelo de HMA son consideradas
las estructuras reproductivas
más importantes, pero sus números en suelo están a menudo poco
relacionadas con la formación
de micorrizas en raíz (Abbott y Robson, 1984b; Ebbers et.al,
1987; McGee, 1989). Para algunas
especies, la producción de esporas solo ocurre después de que un
nivel umbral de colonización
es alcanzado (Gazey et al., 1992). Además la producción de
esporas es influenciada por muchos
factores incluyendo la planta hospedera y el tipo de suelo.
-
Solo se pueden hacer pocas generalizaciones útiles acerca de las
condiciones que llevan a la
formación de esporas a parte de la necesidad dejar pasar algunos
meses desde la colonización
inicial del hospedero. En relación a otros propágalos
micorríticos de MA, las esporas son
consideradas generalmente como más resistentes a condiciones
adversas (Abbott y robson,
1982b) que otros fragmentos colonizados de raíz o hifas y pueden
actuar como estructuras de
supervivencia a largo plazo, con alguna capacidad para la
dispersión por agua y por viento (Koske
y Gemma, 1990; Friese y Allen, 1991).
Colonización
El proceso y la taza de colonización determinan la efectividad
de un HMA o una asociación
micorrizal. La colonización puede originarse a partir de
esporas, fragmentos de raíz infectados o
hifas (Smith y read, 1997). La red hifal y los fragmentos de
raíz son dados a ser la fuente principal
por la cual las plantas son colonizadas (Smith y Walter, 1981;
Jasper et al., 1992; Hepper, 1981).
Al mismo tiempo que la infección de esparce dentro de las
células corticales de la raíz hospedera,
un micelio de hifas extraradicales crece afuera, hacia el suelo.
Las hifas extraradicales tienen un
papel importante en la adquisición de nutrientes y forman una
fuente de colonización secundaria a
lo largo de y entre las raíces (Harley y Smith, 1983; Smith y
Gianiazzi-Pearson, 1988; Smith et al.,
1992).
Dentro de la corteza, las hifas crecen longitudinalmente entre
las células e intracelularmente para
formar arbusculos. Utilizando a G. mosseae como modelo,
Giovannetti et al., (1993) demostraron
que los primeros apresorios fueron formados dentro de las 36
horas siguientes al principio de la
interacción con Ocimum basilicum y Helianthus annuus y los
primeros arbusculos fueron formados
entre las 42 y las 48 horas después de la inoculación de H.
annuus. Estas observaciones
concuerdan con observaciones anteriores (Cox y Sanders, 1974;
Brundrett et al., 1985). Utilizando
un sistema de materas nodriza con Glomus intraradices y
Lycopersicon esculentum, Rosewarne
et al., (1997) mostraron que después de solo 4 días
aproximadamente el 60% de la raíz estaba
asociada con hifas y el pico de número de arbusculos ocurrió 4
días después de que el
crecimiento hifal lograra su máximo. Es asumido por parte de
muchos investigadores que los
arbusculos son la interfase principal para la toma de azúcares
por parte del hongo y la
transferencia de iones desde el hongo a las células corticales
de las raíces de las plantas
hospederas, aunque existen evidencias de la separación espacial
de las funciones de
transferencia de Carbono y Fósforo y esta disponible una
interfase hifal y arbuscular. (Gianiazzi-
Pearson, 1991; Smith y Read, 1997).
Las vesículas, que son órganos de almacenamiento que contienen
gran cantidad de lípidos y
-
muchos núcleos, son formadas por miembros de Glominaceae después
de que la unidad de
infección ha madurado. Las vesículas producidas por muchos HMA
se considera que funcionan
como órganos de almacenamiento temporal. Sin embargo éstas
tienen a menudo paredes con
múltiples capas, como las esporas, y pueden funcionar como
propágalos cuando están aisladas
de la raíz (Biermann y Linderman, 1983).
Poblaciones de HMA en ecosistemas naturales
Existe muy poca información acerca de HMA en ecosistemas
naturales, sin embargo han surgido
evidencias de que la diversidad es mayor que la que se ha
inferido a partir de estudios
morfológicos de esporas. Las poblaciones en diferentes
ecosistemas, sobre la base de conteo de
esporas, varían entre 5 y 25 especies diferentes. Este número
depende de las especies
hospederas involucradas (tabla 2.1). El número de esporas no
siempre esta bien correlacionado
con el grado de formación micorrizal (Brundrett, 1991) y su
porcentaje de germinación varía en
diferentes tiempos del año (Tommerup, 1983; Gemma et al.,
1989)
La composición de una especie de HMA puede ser explicada como
una respuesta a los cambios
en la comunidad de plantas, ya que la naturaleza obligada de los
simbiontes de HMA une el
crecimiento y la reproducción tanto de la planta hospedera como
del hongo a las condiciones del
suelo (Adelman y Morton, 1986; Hendrix et al., 1995; Sanders y
Fitter, 1992a). En estudios de
campo, se ha mostrado que la secuencia de cosechas modifica la
comunidad de HMA y la
composición de especies. La predominancia de una sola especie de
HMA para cada cosecha se
desarrolló en secuencias continuas de maíz y soya (Johnson et
al., 1991), favoreciendo la
especies benéficas para la cosecha y reduciendo la población de
especies de HMA menos
benéficas (Johnson et al., 1992a).
Las prácticas de manejo tales como la labranza (Evans y Miller,
1988), tasa y método de
aplicación de fósforo, aplicación de pesticidas o abonar con cal
se ha demostrado que también
influencian la esporulación y la colonización por HMA (Duke et
al., 1994; Medeiros et al., 1994;
Ryan et al., 1994; Wang et al., 1993). En algunos casos la
diversidad de la comunidad de HMA ha
sido incrementada en el manejo de sistemas que utilizan la
rotación de cultivos y entradas
reducidas de herbicidas (Douds et al., 1993).
Para estudiar la contribución micorrizal a una comunidad de
plantas de sucesión temprana en el
campo, Gange et al., (1990) utilizó un fungicida para reducir la
colonización durante el primer año
de establecimiento de las plantas en suelo raso. Una menor
cantidad de especies de plantas se
establecieron en comunidades tratadas con fungicidas, soportando
la idea de que los HMA
promueven la diversidad de especies de plantas (Helgason et al.,
1998; Van der Heijden et al.,
1998). Los hongos micorrizales deben también afectar el patrón
de diversidad de especies y la
-
abundancia relativa, una vez el estatus micorrizal de la
comunidad de plantas ha sido restaurado
en un ecosistema previamente perturbado (Barea y Jeffries,
1995). El HMA puede reducir la
diversidad de plantas si la simbiosis representa un beneficio
relativamente más grande para la
especie dominante dentro de la comunidad Hetrick et al.,
1994).
Cuando los ecosistemas son perturbados, por ejemplo por
monocultivos o por utilización de
pesticidas, la dinámica de la comunidad es perturbada y se puede
desarrollar un sesgo hacia
pocos e incluso un solo hongo dominante (Johnson et al., 1992a).
Por ejemplo, en algunos
ambientes la labranza y el uso de fertilizantes ha llevado a que
se encuentren menos especies de
HMA en el suelo (Hetrick y Bloom, 1983; Schenck y Kinloch, 1980)
mientras que en otros el uso
agricultural debe promover una mayor diversidad (Abbott y
Robson, 1977).
Aunque los estudios poblacionales de hongos micorrizales de MA
están basados en caracteres
morfológicos de los cuerpos fructificantes, esporas, micelios
vegetativos o estructuras simbióticas,
la aproximación es todavía limitada dado que los factores que
influencian la esporulación de una
especie individual son poco entendidos y no pueden ser
extrapolados hasta la extensión de
colonización vegetativa de diferentes especies de plantas. Las
poblaciones de esporas proveen
solo una indicación relativa de la abundancia y la composición
de especies de poblaciones
fungales de MA. Sin embargo, los estudios moleculares de la
diversidad de los hongos (Van
Tuinen et al., 1994) en ecosistemas naturales pueden ofrecer un
mejor medio de identificación
para información sobre poblaciones, especialmente cuando es
difícil acumular un número
suficiente de características morfológicas.
La ocurrencia de muchas especies de HMA en suelos o dentro de
raíces sugiere, que la
competencia interespecífica es posible. La variación en la
producción de esporas entre endófitos
coexistentes ha sido observada (Gemma et al., 1989) y una
abundante producción de esporas por
un HMA era usualmente correlacionada con niveles más bajos de
producción de esporas por
otros. Esto puede deberse al antagonismo entre las especies. En
experimentos de cultivo con
materas, donde muchos aislamientos de HMA son inoculados
conjuntamente, se ha probado que
algunos son mejores competidores que otros (Wilson, 1984;
López-Aguillon y Mosse, 1987).
Planta hospedera y producción de esporas
Casi el 90% de las especies de plantas vasculares hasta ahora
examinadas pueden ser
colonizadas por HMA (Harley y Smith, 1983) y son normalmente
micorrizales en el campo. La
especificidad del hospedero es aparentemente muy baja. Bajo
condiciones experimentales un solo
aislamiento del hongo puede formar asociaciones con plantas
hospederas taxonómicamente
-
diversas (Gerdemann, 1975; Smith y Read, 1997) y solo una
especie de planta hospedera se
asocia con muchos aislamientos fungales, llevando a la visión
ampliamente aceptada de que las
asociaciones micorríticas carecen de especificidad. Sin embargo
hay algunas evidencias de que
existe un cierto grado de especificidad entre HMA y plantas,
particularmente en ecosistemas
naturales (Rosendahl et al., 1994; Sanders y Fitter, 1992b;
Smith y Read, 1997).
No hay duda de que las asociaciones incluyendo diferentes
especies de plantas y hongos exhiben
una variabilidad funcional. Algunas plantas hospederas dan un
mayor beneficio al HMA que otras,
lo cual es reflejado en las diferencias de cantidad de
producción de esporas. En la mayoría de los
casos la formación de esporas esta estrechamente relacionada con
la longitud total de las raíces
micorrizales producidas por determinado hospedero (Giovannetti
et al., 1988; Hetrick y Bloom,
1988; Howeler et al., 1987; Simpson y Daft, 1990; Gazey et al.,
1992). De este modo, la
proporción de diferentes especies en determinado lugar dependerá
de la extensión a la cual
colonicen los sistemas radiculares de las plantas. Cualquier
grado de especificidad o diferencia en
la efectividad será entonces reflejado en las poblaciones de
esporas.
Hay evidencias que soportan esta idea. En una investigación de
plantas perennes de 19 familias,
en un desierto del Sur de California, la mayoría de las plantas
eran hospederos potenciales para
hongos endomicorriticos y fue mostrado que la diversidad de
estos hongos esta directamente
relacionada con la diversidad de plantas (Bethlenfalvay et al.,
1984). De nuevo la situación es
compleja ya que en algunos estudios de comunidades de plantas
los datos han sido presentados
mostrando que toda la diversidad de hongos puede ser soportada
por un gran número de
especies relacionadas (ie. en el mismo género o familia)
mientras que especies de solo una planta
solo soportaban algunos de los hongos (Brundrett y Kendrick,
1988; Trappe et al., 1984). Más
aún, en un estudio de los hongos presentes en el bosque
bluebell, Scutellospora, Acaulospora y
Glomus solo ocurrían cuando la planta Hyacinthoides non-scripta
estaba presente (Clapp et al.,
1995), otra vez, implicando algún nivel de especificidad del
hospedero.
Este resultado confirma los estudios realizados por Molina et
al. (1978), los cuales mostraban que
dos o más especies pueden colonizar una planta individual. Los
datos en esta área no son
extensivos y por esto los métodos que nos permiten comparar el
grado de colonización de raíces
por especies individuales con producción de esporas son
esenciales para comprender a cabalidad
la competencia entre especies de hongos y las especificidad de
las plantas hospederas.
Las asociaciones micorrizales son normalmente benéficas,
(mutualísticas) para las plantas
(Johnson et al., 1997; Smith y Read, 1977). Las micorrizas
incrementan la tasa de crecimiento de
las plantas a través de un incremento en la toma de nutrientes,
especialmente Fósforo bajo
condiciones controladas (Fitter, 1989; Smith et al., 1994;
Jackson et al., 1972), sin embargo, bajo
-
condiciones naturales, no hay suficiente evidencia que muestre
los incrementos en el crecimiento
de las plantas debido a micorrizas (Fitter, 1989; Newsham et
al., 1995a; West et al., 1993).
Las respuestas de bajo crecimiento podrían estar asociadas con
las diferencias en la efectividad
de las especies micorrizales (eg. Abbott y Robson, 1981a; Abbott
y Robson, 1981b; Bevege y
bowen, 1975; Jakobsen et al., 1992).Por ejemplo, el pequeño
endófito Glomus tenue no produce
una respuesta de crecimiento, aún en suelo con baja fertilidad
(Powell, 1979), G. intraradices y G.
City Beach WUM 16 incrementaron el crecimiento de la planta y la
toma de fósforo, pero G.
etunicatum y G. mosseae no tuvieron efectos en el crecimiento de
la planta ni en la toma de
Fósforo en diferentes niveles de compactación del suelo (Nadian
et al., 1998). La contribución
relativa de las raíces en la toma total de fósforo vario
ampliamente entre plantas colonizadas por
S. calospora, Glomus sp. y G. caledonium en cohombro (Pearson y
Jakobsen, 1993). Entonces,
las diferencias entre los HMA de sus requerimientos aparentes de
eficiencia de toma de carbono o
nutrientes deberían ser evaluados para HMA de especies
colectadas en campo. Mas aún, en esta
situación, las sondas moleculares harán más fácil la distinción
de diferentes especies de hongos
que están actualmente presentes en las raíces.
Los efectos de los HMA en plantas son dependientes de la planta
hospedera y las condiciones
ambientales (Sieverding o Howeler, 1985; Smith y Read, 1997;
Smith, 1993; Newsham et al.,
1995b). Los números de esporas de HMA individuales en un
ecosistema natural de sabana en
Colombia cambiaron como resultado de diferentes prácticas de
manejo (Dodd et al., 1990). En los
suelos originales, doce tipos de esporas fueron identificadas y
se observó que las poblaciones de
diferentes tipos de esporas cambiaron rápidamente bajo
diferentes regimenes de cosecha. Por
ejemplo, las esporas de Glomus occultum y Acaulospora myriocarpa
incrementaron en
subtransectos de sorgo, mientras que aquellos de Entrophospora
colombiana, A. melleae y A.
morrowiae dominaron subtransectos donde cowpea (Vigna unguilata)
crecía tras un cultivo de
kudzu (Pueraria phaseoloides) (Dodd et al., 1990b). Este estudio
soporta la idea de que