MAKALAH_ORGANOLOGAM

MAKALAH ORGANOLOGAMSYNTHESIS AND APPLICATION OF ORGANOMERCURY HAPTENS FOR ENZYME-LINKED IMMUNOASSAY OF INORGANIC AND ORGANIC MERCURYCaryn K. Prudente, Rebekah S. Sirios, Shaun Cote (2010)Sintesis dan Aplikasi dari Organomerkuri Hapten untuk Enzyme-linked Immunoassay pada Merkuri Anorganik dan Organik

Disusun oleh: Yuni Prasetiowati 103234023Tiva Umaroh 103234025Jepi Isnanto103234030Maulani Anies Shiami 103234035

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA 2013

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Merkuri adalah logam yang secara terus-menerus berada di lingkungan dan terakumulasi dalam rantai makanan. Merkuri ada dalam bentuk organik maupun anorganik. Bentuk organik dapat dibagi sebagai elemental merkuri dan garam merkuri. Organomerkuri mengandung senyawa alkil da aril didalamnya. Elemental merkuri menguap pada suhu ruang dan bereaksi dengan banyak unsur membentuk garam, amalgam, dan senyawa organomerkuri. Pada dasarnya semua bentuk merkuri adalah toksik. Misalnya senyawa organomerkuri, sangat beragam dari senyawa dengan toksisitas rendah (mercurochrome) sampai senyawa dengan toksisitas tinggi (dimetilmerkuri). Merkuri di alam, secara toksikologikal merupakan unsur yang penting. Dinyatakan oleh Environmental Protection Agency (EPA) bahwa merkuri merupakan unsur yang berbahaya akibat sifatnya yang tetap dan akumulatif di lingkungan dan biota. Meskipun merkuri bukan unsur kimia yang melimpah di alam, merkuri menjadi tersebar luas akibat hasil dari banyak industri dan agrikultural proses. Merkuri memiliki peran penting dalam lingkup kimia bioanalitik, seperti sejumlah aplikasi berbasis merkuri beragam ditemukan di seluruh literatur. Misalnya, merkuri yang memiliki sifat elektronik unik telah terbukti berguna dalam merancang metode pengujian tiol berbasis elektrokimia. Logam merkuri telah membantu karakterisasi mikroskop elektron dari protein dan telah dimasukkan ke dalam neon peptida dan kepingan protein. Baru-baru ini, sensor kimia dan fluorescent telah dibuat untuk mendeteksi merkuri dan spesies logam lainnya, dan berbagai metode nanoteknologi telah muncul. Telah ada minat dalam mengembangkan antibodi anti-merkuri monoklonal (mAb: monoclonal antibody) untuk digunakan sebagai alat diagnostik yang mampu memberikan spesifikasi tinggi, murah, mudah digunakan dalam tes deteksi merkuri. Logam merkuri, garam merkuri, dan senyawa organomerkuri adalah racun di lingkungan dan ada terus-menerus, dan bahaya bagi kesehatan manusia, mamalia, dan sistem perairan. Meskipun kemajuan di teknik instrumental canggih mampu mendeteksi logam berat pada konsentrasi sangat rendah, masih ada minat dalam pengembangan uji logam yang mudah digunakan yang menyediakan efisiensi, hemat biaya, dan deteksi merkuri yang sensitif. Pmbuatan biokonjugat yang mengandung logam dengan tujuan menghasilkan antibodi yang mampu mengikat logam dan ion logam, telah menjadi fokus dari banyak upaya penelitian selama lebih dari 20 tahun. Karena logam, seperti banyak hapten dengan berat molekul rendah, tidak imunogenik, salah satu pendekatan yang umum dilakukan untuk menghasilkan spesies imunogenik berbasis logam yang melekatkan secara kovalen EDTA atau agen pengkhelat logam lainnya pada permukaan protein. Bagian khelat memfasilitasi enkapsulasi logam dalam struktur kandang di permukaan karier melalui pembentukan ikatan koordinasi antara atom khelat kaya elektron dan atom logam yang kekurangan elektron. Contoh awal dari biokonjugat dibuat dari metodologi khelasi logam telah menghasilkan beberapa substrat berguna. Meskipun beberapa dari ini biokonjugat sebelumnya tidak menghasilkan antibodi dengan kekhususan mengikat memadai untuk tes analitis, biokonjugat khelat logam telah menemukan aplikasi praktis sebagai antibodi terapi logam berlabel, sebagai substrat pencitraan resonansi magnetik, dan teknik radioimaging. Salah satu ekstensi terbaru dari metodologi khelasi EDTA telah sintesis sensor optik neon yang dirancang untuk mendeteksi ion Hg2+. Dalam jurnal ini, ion Hg2+ terjebak dalam struktur kandang seperti yang timbul dari suatu dimer porfirin. Pekerjaan awal telah menunjukkan bahwa sensor kimia mampu mendeteksi Hg2+ pada konsentrasi 104-107 M dengan derajat spesifitas tinggi atas ion logam divalen lainnya. Saat ini, hanya ada beberapa contoh protokol yang telah menghasilkan antibodi yang mengikat logam dari metodologi selain kompleksasi khelat. Benkovic dan rekan kerja memodifikasi secara kimia situs pengikatan antibodi katalitik untuk mengakomodasi kompleksasi ion Zn2+. Laju hidrolisis katalitik yang dihasilkan oleh substrat AbZn2+ diamati untuk meningkatkan relatifitas terhadap antibodi asli. Mirip dengan enkapsulasi merkuri dalam khelat, yang lain telah mengeksploitasi afinitas ikatan yang tinggi dari sulfur untuk logam merkuri. Setelah secara kovalen mengikat glutathione, tripeptida dari asam glutamat, sistein, dan glisin, terhadap Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) melalui karbodiimida kimia, merkuri klorida (HgCl2) melekat pada karier glutathione termodifikasi oleh pertukaran ligan yang dimediasi sulfur. Imunogen yang dihasilkan menghasilkan antibodi yang mampu mendeteksi konsentrasi rendah garam merkuri (II) dalam air. Rancangan dan persiapan sintesis hapten organomerkuri dilakukan dengan metode konjugasi protein, dengan tujuan menghasilkan antibodi yang mampu mengikat baik logam Hg(II) maupun bentuk organologam merkuri di berbagai media sampel. Strategi secara keseluruhan adalah dengan melakukan reaksi oxymerkurasi intramolekul untuk mensintesis struktur sederhana, tapi kuat secara kimia, hapten organomerkuri yang mudah terikat kovalen pada protein karier melalui amina yang ada, strategi yang cukup unik dibandingkan dengan yang sebelumnya dijelaskan dalam metode khelasi. Dalam studi ini, antibodi anti-merkuri tikus yang sangat serbaguna diberikan dengan menerapkan strategi yang dievaluasi secara mendalam melalui berbagai format immunoassay. Hasil dari penelitian ini memberikan dorongan untuk mengejar produksi mAb. Berdasarkan hasil yang dijelaskan di bawah ini, bahwa mAb yang berasal dari hapten organomerkuri akan sangat kuat, sehingga sistem deteksi merkuri serbaguna dan sangat sensitif.

B. Rumusan Masalah 1. Bagaimana proses sintesis dan karakterisasi hapten organomerkuri?2. Bagaimana penerapan hapten organomerkuri sebagai antibodi yang mampu mengikat baik logam Hg(II) maupun bentuk organologam merkuri diberbagai media sampel?

C. Tujuan 1. Mengetahui peroses sintesis dan karakterisasi hapten organomerkuri.2. Mengetahui penerapan hapten organomerkuri sebagai antibodi yang mampu mengikat baik logam Hg(II) maupun bentuk organologam merkuri diberbagai media sampel.

BAB II KAJIAN PUSTAKA

A. Organomerkuri Organomerkuri mengacu pada kelompok senyawa organologam yang mengandung merkuri. Biasanya ikatan Hg-C stabil terhadap udara dan kelembaban, tetapi sensitif terhadap cahaya. Senyawa organomerkuri yang penting adalah kation metilmerkuri (CH3Hg+), kation etilmerkuri (C2H5Hg+), dimetil merkuri (CH3)2Hg, dan dietilmerkuri. Merkuri organik (RHg, R2Hg, ArHg) seperti metilmerkuri dan etilmerkuri yang keduanya termasuk bentuk alkil rantai pendek dijumpai sebagai kontaminan logam dilingkungan. Merkuri organik merupakan bentuk senyawa merkuri yang paling berbahaya. Sebagian besar peristiwa keracunan merkuri disebabkan oleh senyawa ini. Merkuri organik digunakan secara luas pada industri pertanian, industri pulp dan kertas, dan dalam bidang kedokteran. Senyawa ini juga dapat terbentuk dari metabolisme merkuri metalik atau dari merkuri anorganik dengan bantuan mikroorganime tertentu baik dalam lingkungan perairan ataupun dalam tubuh manusia.

B. Reaksi Oksimerkurasi Reaksi oksimerkurasi merupakan reaksi adisi elektrofilik yang mengubah suatu alkena menjadi alkohol netral. Dalam oksimerkurasi, akena bereaksi dengan Hg(II) asetat dalam larutan aquos membentuk adisi gugus asetoksimerkuri (HgOAc) dan gugus hidroksi (OH).Contoh reaksi Oksimerkurasi:

Mekanisme reaksi oksimerkurasi secara umum dijelaskan oleh gambar berikut:

Seperti reaksi adisi pereaksi lain terhadap alkena, oksimerkurasi merupakan reaksi dua tahap. Adisi dimulai dari serangan nukleofilik (HgOAc)+ yang diikuti oleh serangan nukleofilik H2O.

C. Immunoassay Immunoassay adalah deteksi dan uji zat dengan metode serologis (imunologi), pada sebagian besar aplikasi zat tersebut berfungsi sebagai antigen, baik dalam produksi antibodi dan dalam pengukuran antibodi oleh zat uji. Metode deteksi secara Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) yang berdasarkan reaksi spesifik antara antigen dengan antibodi memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi karena menggunakan enzim sebagai indikatornya. ELISA juga memiliki keunggulan sebagai metode yang sederhana, cepat, murah, dapat mendeteksi sampel dalam jumlah banyak. ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifisitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah yang tidak diketahui dari antigen yang bergerak pada dukungan solid baik non-spesifik (melalui adsorps ke permukaan) atau khusus melalui penangkapan oleh antibodi lain spesifik terhadap antigen yang sama. Setelah antigen tersebut bergerak, antibodi deteksi yang ditambahkan membentuk kompleks dengan antigen. Deteksi antibodi kovalen dihubungkan dengan enzim atau dapat dideteksi sendiri oleh antibodi sekunder yang terkait dengan enzim melalui biokonjugat. Pada tahapannya, setiap langkah plate biasanya dicuci dengan larutan deterjen ringan untuk menghilangkan protein atau antibodi yang tidak terikat secara khusus. Setelah langkah akhir, plate dikembangkan dengan menambahkan substrat enzimatik untuk menghaslkan sinyal yang terlihat dan menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Antigen adalah suatu substansi kimia yang mampu merangsang sistem imun untuk menimbulkan respon spesifik. Contoh antigen tidak lengkap adalah hapten. Hapten adalah molekul organik kecil yang dapatmengikat bagian reseptor antigen. Meskipun molekul inikecil tetapi dapat menginduksi responimun sendiri. Selain itu juga dapat menginduksi antibodi dengan titer yang tinggi jikadiikatkan dengan pembawa carrier berupa protein yang mempunyai berat molekul tinggi atau polimersintetik contohnya adalah logam berat non-mulia. Antibodi merupakan biomolekul yang tersusun atas protein dan dibentuk sebagai respons terhadap keberadaan benda-benda asing yang tidak dikehendaki di dalam tubuh kita. Benda-benda asing itu disebut antigen. Tiap kali ada benda-benda asing yang masuk ke dalam tubuh diperlukan 10-14 hari untuk membentuk antibodi. Antibodi dihasilkan oleh limfosit B atau sel-sel B. Antibodi digunakan untuk menetralkan atau menghancurkan antigen yang masuk ke dalam tubuh. Setiap detik sekitar 2.000 molekul antibodi diproduksi oleh sel-sel B. Salah satu contoh peristiwa yang melibatkan antibodi adalah ketika kulit kita terkena infeksi karena luka maka akan timbul nanah. Nanah itu merupakan limfosit atau sel-sel B yang mati setelah berperang melawan antigen. Antibodi tidak dapat menghancurkan antigen. Antibodi tidak bisa secara langsung menghancurkan antigen. Fungsi utama antibodi adalah menonaktifkan dan menandai antigen untuk pengancuran lebih lanjut. Umumnya, jika antibodi bertemu dengan antigen akan terbentuk kompleks antigen-antibodi. Antibodi dapat ditemukan pada aliran darah dan cairan nonseluler. Antibodi memilik struktur molekul yang bersesuaian dengan antigen secara sempurna, seperti anak kunci dengan lubangnya. Tiap jenis antibodi spesifik terhadap antigen jenis tertentu.

Jenis-jenis AntibodiAntibodi disebut juga immunoglobulin (Ig) atau serum protein globulin, karena berfungsi untuk melindungi tubuh lewat proses kekebalan (immune).Ada lima macam immunoglobulin, yaitu IgG, IgM, IgA, IgE, dan IgD. ImmunoglobulinG (IgG)IgG terbentuk 2-3 bulan setelah infeksi, kemudian kadarnya meninggi dalam satu bulan, menurun perlahan-lahan, dan terdapat selama bertahun-tahun dengan kadar yang rendah. IgG beredar dalam tubuh dan banyak terdapat pada darah, sistem getah bening, dan usus. Senyawa ini akan terbawa aliran darah langsung menuju tempat antigen berada dan menghambatnya begitu terdeteksi. Senyawa ini memiliki efek kuat antibakteri maupun virus, serta menetralkan racun. IgG juga mampu menyelinap diantara sel-sel dan menyingkirkan mikroorganisme yang masuk ke dalam sel-sel dan kulit. Karena kemampuan serta ukurannya yang kecil, IgG merupakan satu-satunya antibodi yang dapat dipindahkan melalui plasenta dari ibu hamil ke janin dalam kandungannya untuk melindungi janin dari kemungkinannya infeksi yang menyebabkan kematian bayi sebelum lahir. Selanjutnya immunoglobulin dalam kolostrum (air susu ibu atau ASI yang pertama kali keluar), memberikan perlindungan kepada bayi terhadap infeksi sampai sistem kekebalan bayi dapat menghasilkan antibodi sendiri. Immunoglobulin A (IgA)Immunoglobulin A atau IgA ditemukan pada bagian-bagian tubuh yang dilapisi oleh selaput lendir, misalnya hidung, mata, paru-paru, dan usus. IgA juga ditemukan di dalam darah dan cairan tubuh lainnya, seperti air mata, air liur, ASI, getah lambung, dan sekresi usus.Antibodi ini melindungi janin dalam kandungan dari berbagai penyakit. IgA yang terdapat dalam ASI akan melindungi sistem pencernaan bayi terhadap mikroba karena tidak terdapat dalam tubuh bayi yang baru lahir Immunoglobulin M (IgM)Antibodi ini terdapat pada darah, getah bening, dan pada permukaan sel-sel B. Pada saat antigen masuk ke dalam tubuh, Immunoglobulin M (IgM) merupakan antibodi pertama yang dihasilkan tubuh untuk melawan antigen tersebut. IgM terbentuk segera setelah terjadi infeksi dan menetap selama 1-3 bulan, kemudian menghilang.Janin dalam rahim mampu memproduksi IgM pada umur kehamilan enam bulan. Jika janin terinfeksi kuman penyakit, produksi IgM janin akan meningkat. IgM banyak terdapat di dalam darah, tetapi dalam keadaan normal tidak ditemukan dalam organ maupun jaringan. Untuk mengetahui apakah janin telah terinfeksi atau tidak, dapat diketahui dari kadar IgM dalam darah. Immunoglobulin D (IgD)Immunoglobulin D atau IgD juga terdapat dalam darah, getah bening, dan pada permukaan sel-sel B, tetapi dalam jumlah yang sangat sedikit. IgD ini bertindak dengan menempelkan dirinya pada permukaan sel-sel T, mereka membantu sel-sel T menangkap antigen. Immunoglobulin E (IgE)Immunglobulin E atau IgE merupakan antibodi yang beredar dalam aliran darah. Antibodi ini kadang juga menimbulkan reaksi alergi akut pada tubuh. Oleh karena itu, tubuh seorang yang sedang mengalami alergi memiliki kadar IgE yang tinggi. IgE penting melawan infeksi parasit, misalnya skistosomiasis, yang banayk ditemukan di negara-negara berkembang.

BAB III METODE PENELITIAN

1. Sintesis hapten dan prosedur biokonjugasiTert-butil alil karbamat (2)

4,87ml alilamin (65 mmol) dalam 80 ml H2OTert-butil alil karbamatDitambah 40ml Na2CO3 1,5 MDitambah 13,9 ml di-tert-butilkarbonat (63,7mmol) Distirer semalam dalam suhu kamar

Tert-butil N-[2-(kloromerkurio)-3-[(1-hidroksipentana-2-il)oksi] propil karbamat (3)

Merkuri nitrat (162mg, 0.5 mmol)Larutan kuning cerahDilarutkan dalam 1 ml CH3CNTert-butil alil karbamatDilarutkan dalam 3 ml CH3CNDimasukkan dalam labu Padatan kuningCampuran kuningDistirer selama 15 menit di suhu ruangDitambah 1,2-pentanadiol (105l, 0.98mmol) yang dilarutkan dalam 2ml CH3CNDistirer dalam N2 di suhu ruang semalam Tert-butil N-{3-[(1-hidroksipentana-2-il)oksi] propil} karbamat (4)

Hasil (3) dalam 2 ml CH2Cl2Direduksi dengan 37 mg (1mol) NaBH4 yang terlarut dalam 1ml NaOH 0,2M Distirer dalam suhu ruangCampuran menjadi suspensi abu-abuMinyak kuning pucatSetelah distirer 15 menit, produk mentah difiltrasi melalui CeliteFiltrat diekstrak dengan CH2Cl2 Fraksi organik dicuci dengan air asin da dikeringkan dengan Na2SO4

2-[3-amino-2-(kloromerkurio)propoksi] pentana-1-ol (5)

Hasil (3) (248mg 0,5mmol) dalam 2 ml CH2Cl2Minyak pekat berwarna kuningDideproteksi dengan 114 mg (1mmol) TFA yang terlarut dalam 2 ml CH2Cl2 Distirer di suhu ruang selama 1 jamDiekstraksi dengan air, kemudian fasa aquos dibasakan dengan NaOH sampai pH 8-9Difiltrasi

2. Persiapan fase padat konjugat Persiapan biokonjugat BS3

1,0 ml larutan BSADiencerkan dalam 20 mM fosfat buffer dengan 150 mM saline pada pH 7,2 (PBS)Ditambahkan 0,023 mmol hapten 1 (8,0 mg)Ditambahkan 0,023 mmol hapten 5 (9,0 mg)DistirerDitambahkan 0,6 ml (0,031 mmol) BS3 pada 30 mg/ml dalam PBSDistirer selama 2 jam.Fase padat BS3 biokonjugatDimurnikan dengan kromatografi (Sephadex G-25) dengan menggunakan PBS sebagai eluenHasil

Persiapan biokonjugat SMCC

Minyak mentah hapten 1 (5,0 mg, 0,014 mmol)Ditempatkan dalam vialDitempatkan di botol keduaDiencerkan dengan 200 l dari PBS (masing-masing sampel)Ditambah 200 l dari 30 mg/ml (0,018 mmol) SMCC (masing-masing sampel)Keduanya dicampurDistrirer selama 1 jam dalam botol terpisahDitambah 20 mg BSA (10 mg ml dalam PBS) dan 1,0 ml dari 4,0-mg/ml (0,030 mmol) larutan stok dari 2 IMT pada PBS dicampur bersama-samaDiinkubasi selama 1 jam pada RTlarutan BSA/2-IMT dilewatkan melalui kolom Sephadex G-25 menggunakan PBS sebagai eluen.HasilMinyak mentah hapten 5 (6,0 mg, 0,015 mmol)

3. Persiapan immunogen dan antiseraPenelitian bermaksud menggunakan BSA sebagai pembawa untuk pengujian fase padat tersebut, IgG ayam terpilih sebagai pembawa imunogen untuk meminimalkan ikatan spesifik.

500 l larutan 20 mg/ml IgG ayam pada PBSDitambahkan 10 mg (0,028 mmol) dari (5-metilmerkuri klorida tetrahidrofuran-2-il) - metilamin (organomerkuri hapten 1)DiadukDitambahkan 170 l dari 30 mg/ml BS3 (8,9x10-3 mmol) Distirer selama 90 menitImmunogenDimurnikan dengan kromatografi (Sephadex G-25) dengan menggunakan PBS sebagai eluenLarutan immunogenDiencerkan menjadi 3,0 mg/ml dalam PBSDisaringDisimpan pada -20 oC sampai digunakanHasil

MencitDiimmunisasi setiap minggu dengan 100 g antigen dengan 100 g antigen dicampur dengan volume yang sama dengan Imject tawas.Darah dikumpulkan melalui pendarahan retro-orbital sebelum immunisasi awal dan setiap minggu selama proses imunisasiDarah dibiarkan membeku pada suhu kamar dan kemudian diinkubasi pada 4 oC semalamDisentrifugasi pada 3000 rpm dalam pendingin microfuge termoIEC.Serum dipindahkan dan disimpan pada -20 oC tanpa pemurnian lebih lanjutHasil

4. Pelapisan plat dan prosedur ELISA

Plat mikrotiter skriningDilapisi dengan 100 l dari BSA BS3 hapten 1 yang diencerkan sampai 10 g/ml dalam PBS dan diinkubasi semalam pada 4 oC atau selama 2 jam pada 37 CKonsentrasi lapisan optimal ditentukan dengan titrasi fase padat dengan menggunakan konsentrasi 7-20 10 g/mlPlat dicuci tiga kali dengan 20 mmol PBS yang mengandung 0,05 % Tween 20 Plat diblok paling sedikit 1 jam pada RT dengan 250 ml dari 1% baik BSA dalam PBS atau susu kering 3% dalam PBSPlat disimpan pada suhu 4 oC sampai digunakanHasil

Antisera yang serialDiencerkan dalam PBS yang mengandung 0,05% Tween 20Ditambahakan HRP-label anti-tikus IgG (GAM-HRP) yang diencerkan menjadi 10,0 ng/ml dalam 0,1 M buffer sitrat (pH 5,0)Ditambahkan 75 l antibodi deteksi HRP label, Gam-HRP Ditambahkan plat yang telah dilapisiDitambahkan 50 l dari 1,0 mg/ml OPD pada penyangga peroksida stabilSetelah berdiri selama 15-30 menit pada RT, reaksi diakhiri dengan menambahkan 50 l dari 2,5 M H2SO4 Absorbansi diukur pada 490 nm dan direkam dengan menggunakan Bio-Tek Instrumen plate readerHasilSemua analisa diukur setidaknya diduplikat dan umumnya dalam rangkap tiga.

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

A. Sintesis Hapten Organomerkuri Yang pertama dilakukan dalam jurnal ini adalah melakukan sintesis hapten berbasis organomerkuri. Hapten adalah molekul kecil yang bersifat antigenik tapi tidak imunogenik, yang bisa berikatan dengan produk respon imun tapi tidak bisa membangkitkan respon imun. Antibodi atau limfosit teraktivasi yang terbentuk untuk melawan ikatan tersebut kemudian seringkali akan bereaksi secara terpisah terhadap protein atau hapten. Hapten yang menimbulkan tipe respon imun seperti obat-obatan dengan berat molekul rendah, unsur kimiawi dalam debu, produk pemecahan ketombe dari hewan, bahan kimiawi industri , toksin dari racun tumbuh-tumbuhan yang menjalar, dll. Hapten + Protein Karier imunogenik.Keterangan : Hapten yang berikatan dengan protein karier bersifat imunogenik yang disebut hapten carriers conjugate. Hapten 1 disintesis dari material awal 2-propen-1-amina 1. Berikut adalah gambaran reaksinya:

Gambar 1. Sintesis 1: pembentukan hapten 1.Sintesis hapten organomerkuri 1 dimulai dengan melindungi alil amina (dalam hal ini 2-propen-1-amina) dengan t-butil karbamat. Rekristalisasi dari reaksi campuran t-BOC-alilamina membentuk epoksida 2 akibat adanya reaksi dengan mCPBA dalam CH2Cl2. Kemudian dibentuk senyawa hidroksi alkena 3 dengan reaksi menggunakan reagen Grignard dan dioxane. Tujuan penggunaan dioxane, yang merupakan eter, adalah untuk membuka cincin nukleofilik dari epoksida. Ketika magnesium bromida berada dalam larutan, epoksida 2 mudah bereaksi terhadap ion bromida yang membantu terbukanya cincin nukleofilik membentuk bromohidrin sebagai produk samping. Pada saat larutan yang kaya dialilmagnesium, yang dihasilkan dari reaksi Reagen Grignard dan dioxane, akan terjadi reaksi dengan epoksida 2 menghasilkan hidroksi alkena 3 tanpa ada gangguan dari bromohidrin. Dengan terbentuknya senyawa hidroksi alkena 3, sintesis dengan metode intramolekular oxymerkurasi dapat dilakukan. Senyawa 3 merupakan prekursor organomerkuri yang dapat digunakan dalam membuaat hapten organomerkuri.Reaksi oxymerkurasi dilakukan dengan menambahkan merkuri (II) asetat terhadap larutan hidroksi alkena 3 dalam asetonitril. Kemudian dalam campuran diberi NaCl untuk memfasilitasi pertukaran ligan menghasilkan siklis merkuri klorida 4. Tahap akhir dari sintesis hapten 1, senyawa 5, deproteksi terhadap t-BOC senyawa 4 dilakukan oleh pemberian TFA (trifluoroacetic acid/asam trifluoroasetat) yang berlebih, yang hasilnya dilepaskan oleh pemberian NaOH dan diperoleh hasil utama yaitu amina bebas hapten organomerkuri 5. Dalam jurnal ini tidak hanya dilakukan satu jenis sintesis hapten organomerkuri saja melainkan juga dilakukan sintesis hapten 5 yang juga berbasis organomerkuri. Berikut adalah gambaran reaksinya:

Gambar 2. Sintesis 2: pembentukan hapten 5Prinsip sintesisnya mirip dengan sintesis hapten 1, yaitu proteksi alilamin 1 (2-propen-1-amina) menggunakan t-BOC untuk menghasilkan senyawa 2. Namun, reaksi oxymerkurasi yang dilakukan dalam pembentukan hapten 5 adalah reaksi oksimerkurasi intermolekular, dimana t-BOC-alilamin direaksika dengan merkuri (II) nitrat, diikuti adisi in situ 1,2-pentanadiol yang menghasilkan intermediet merkurinium. Jika dalam sintesis hapten 1 merkuri (II) asetat memfasilitasi reaksi oksimerkurasi, dalam sintesis hapten 5 t-BOC-alilamin 2 membutuhkan merkuri (II) nitrat yang lebih elektrofil untuk mempercepat reaksi adisi yang menghasilkan senyawa 3. Sedikit dari senyawa 3 direduksi menjadi senyawa 4 dengan pemberian NaBH4 untuk meminimalisasi pembongkaran terhadap merkuri selama karakterisasi. Tahap akhir dari sintesis hapten 5, senyawa 5, dilakukan deproteksi terhadap t-BOC senyawa 4 dilakukan oleh pemberian TFA yang berlebih, yang hasilnya dilepaskan oleh pemberian NaOH dan diperoleh hasil utama yaitu amina bebas hapten 5.

B. Karakterisasi Hapten OrganomerkuriDalam jurnal ini tidak dipaparkan secara pasti bagaimana hasil dari karakterisasi hapten organomerkuri yang dihasilkan. Hanya pada proses sintesis organomerkuri hapten 5, dikatakan bahwa analisis NMR dari senyawa 4 pada sintesis hapten 5 menunjukkan adanya regioisomer pentanadiol yang dihasilkan dalam campuran produk. Namun dalam jurnal pendukung yang kami gunakan, dikatakan bahwa pada sintesis hapten 1, melalui data GC menunjukkan bahwa epoksida yang dihasilkan merupakan produk yang murni.

C. Aplikasi Hapten Organomerkuri Hapten organomerkuri yang telah dihasilkan, diaplikasikan dalam immunoassay enzime-linked terhadap merkuri organik dan anorganik. Immunoassay adalah suatu metode analisis yang menggunakan antibodi atau antigen sebagai pereaksi untuk mengukur bahan kimia tertentu, atau analit. Immunoassay sangat akurat dan sensitif terhadap tingkat konsentrasi yang sangat rendah dari analit.Dalam jurnal ini, hapten 1 dikonjugasikan terhadap BSA (Bovine Serum Albumin) melalui BS3 (bis[sulfosuccinimidyl]suberate) dan SMCC (Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexan-1-carboxylate) sebagai reagen cross-linkingnya. Berikut adalah prosesnya:

Gambar 3. Biokonjugasi hapten organomerkuri terhadap BSA melalui BS3 dan SMCC sebagai reagen cross-linkingDalam penelitian ini juga dibuat konjugat imonugen ayam IgG-hapten1 sebagai kontrol dalam analisis.Setelah diketahui bahwa hapten organomerkuri itu terikat kovalen dengan karier, empat tikus diimunisasi dengan IgG ayamhapten1 dicampur dengan Imject Alum. Antisera tikus discreening tanpa purifikasi setiap 2 minggu dimulai 12 minggu setelah imunisasi awal. BSA diencerkan pada 10 mg/ml dalam PBS dan BSABS3 ditutup dengan allylamine sebagai kontrol negatif dalam percobaan ini. Berdasarkan uji dengan ELISA, dapat dikatakan bahwa karakter nonpeptida hidrofilik hapten, dikopling dalam bentuk kaku dengan backbone siklopentana, menghasilkan antibodi menunjukkan derajat sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi. Hapten 1 dianggap sebagai pilihan yang logis untuk imunisasi karena ketersediaan merkuri tampaknya lebih menguntungkan untuk memunculkan respon imun daripada hapten dengan struktur yang kurang kaku. Ini adalah contoh pertama dari antibodi anti-merkuri yang diturunkan dari imunogen yang dibuat secara kovalen dari hapten berbasis organomerkuri terhadap protein karier. Beberapa modifikasi sintesis fase padat dieksplorasi untuk mengevaluasi spesifisitas antibodi terhadap bentuk-bentuk organik dan anorganik merkuri dan untuk menentukan korelasi antara struktur konjugat fasa padat dan sensitivitas uji logam. Sebuah fase padat kedua konjugat disiapkan dengan kopling hapten 1 terhadap BSA via SMCC. Kondisi pengkoplingan tidak dioptimalkan untuk memberi kerja awal dengan BS3, melainkan menyarankan protokol kopling (Gambar 3). Enam pengenceran antiserum ditambahkan ke plate dengan tiga replikasi, dan dua konsentrasi antibodi HRP-label (80 dan 40ng/ml) digunakan untuk mengevaluasi ikatan antibodi pada setiap fase padat (Gambar 4). Pada konsentrasi deteksi antibodi yang lebih tinggi (80 ng/ml), dua kurva yang dihasilkan sangat mirip. Namun, konjugat SMCC menunjukkan peningkatan jarak dinamis (25%) dibandingkan dengan konjugat BS3 ketika konsentrasi antibodi deteksi HRP-label dikurangi menjadi 40ng/ml. Hasil ini jelas menunjukkan bahwa antibodi secara spesifik terikat pada struktur hapten daripada arm linker atau beberapa bagian dari hapten dan arm linker. Kiranya mudah untuk memprediksi bahwa sensitivitas uji kemungkinan akan meningkat secara signifikan pada optimalisasi kimia cross-coupling dan atau pemilihan agen cross-linking. SMCC dapat memberi kesempatan yang lebih baik untuk ikatan antibodi dikarenakan jarak relatif linker arm yang lebih panjang terhadap BS3 (1,97 vs 1,14 nm) dan/atau karena kekakuan relatif SMCC yang lebih besar untuk BS3, akhirnya mengarah ke uji yang lebih peka. Selain itu, kinerja immunoassay umumnya meningkat ketika linker arm di imunogen yang secara struktural berbeda dari linker arm yang digunakan untuk menyiapkan komponen uji. Karena struktur hapten sintetik meliputi amina, maka dapat segera dikoplingkan ke berbagai pilihan reagen cross-linking untuk menghasilkan amida linkage yang stabil antara hapten dan kariernya, memberi ikatan yang lebih tahan lama dibandingkan dengan ikatan sulfur-merkuri yang digunakan dalam konjugat dengan dasar Hg2+ sebelumnya.

Gambar 4. Respon ikatan antibodi anti-merkuri tikus pada konjugat fasa padat yang dibuat dari kopling hapten 1 ke BSA melalui dua reagen cross-linking (BS3 vs SMCC). Kedua konjugat fasa padat dilapisi 10g/ml. respon antibodi terhadap kedua konjugat fasa padat diukur menggunakan 80 dan 40ng/ml peroksidase anti-mouse IgG.Kemudian untuk hapten 5, dikonjugasikan terhadap BSA melalui SMCC untuk mengevaluasi lebih lanjut selektivitas antibodi anti-merkuri. Berikut adalah prosesnya:

Gambar 5. Kopling hapten 5 terhadap BSA via SMCCAntibodi anti-merkuri menunjukkan derajat ikatan tinggi pada kedua konjugat fase padat (Gambar 6). Secara keseluruhan, ikatan antibodi dengan hapten 5 lebih tinggi daripada dengan hapten 1. Rentang dinamis yang ditampilkan oleh kedua konjugat fase padat meningkat ketika menggunakan konsentrasi antibodi deteksi rendah HRP label (20 ng/ml) dibandingkan dengan 40 ng/ml. Sensitivitas tinggi antibodi terhadap hapten 5 relatif terhadap hapten 1 tampaknya sedikit mengejutkan, namun biokonjugat BSASMCC tidak dianalisis dengan MALDI, yang mengungkapkan rasio hapten/protein. Mungkin hapten 5 lebih efisien untuk BSA karena merupakan hapten yang lebih polar dari hapten 1, memberi rasio hapten/protein yang lebih tinggi dari 8:1 dan permukaan fase padat yang lebih kompak dengan hapten.

Gambar 6. Respon antibodi terhadap hapten 1 dan 5. Kedua hapten dikoplingkan ke BSA melalui SMCC dan dilapisi pada plate microtiter 10g/ml. Respon antibodi terhadap kedua hapten diukur dengan 40 dan 20 ng/ml peroksidase anti-mouse IgG.Linker lengan panjang dan kepadatan epitop telah terbukti berdampak pada sensitivitas antibodi. Hasil ini mendorong karena antibodi anti-merkuri yang dihasilkan menampilkan kemampuan unik untuk mengikat berbagai konfigurasi fase padat, memberikan tingkat fleksibilitas yang tinggi dalam format desain assay.

Gambar 7. Hasil uji persaingan inhibisi menggunakan plate yang dilapisi dengan BSABS3hapten1 dan Hg(Oac)2, Hg(NO3)2, dan hapten 1 sebagai inhibitor.Sebuah studi pendahuluan inhibisi kompetitif dilakukan menggunakan coated plate dari BSABS3hapten 1. Antisera tikus diencerkan 1:10.000, 1:15.000, 1:20.000, dan 1:30.000 di PBS. Setiap pengenceran dipreinkubasi dengan merkuri asetat (Hg(OAc)2) pada 20 ppm, merkuri nitrat (Hg(NO3)2) pada 20 ppm , dan 10 ppm hapten 1 tak terkonjugasi selama 1 jam pada suhu kamar sebelum menambahkan 50l masing-masing sampel ke plate dalam dua replikasi. Setiap pengenceran serum juga diinkubasi pada kondisi yang sama dengan tidak adanya inhibitor apapun. Ketika antibodi anti-merkuri fase padat berikatan dihambat dengan Hg(OAc)2 dan Hg(NO3)2, sinyal rata-rata untuk semua sampel yang diinhibisi setara dengan tingkat kontrol negatif (Gambar 5). Hapten 1 tidak memblokir kemampuan ikatan fase padat antibodi seefisien garam merkuri. Mungkin hapten 1 tak terkonjugasi kurang tersedia untuk ikatan antibodi karena ada fleksibilitas konformasi yang lebih besar dan impedansi kurang sterik ketika larut dibandingkan dengan konformasi kaku yang terjadi ketika konjugat haptenBSA diserap ke permukaan plate.Immunoassays sangat kuat, tapi mudah digunakan, alat-alat analisis untuk mendeteksi kontaminan lingkungan hadir dalam konsentrasi rendah. Penelitian ini memvalidasi strategi untuk sintetis hapten berbasis organomerkuri unik dan dapat digunakan untuk mengembangkan immunoassay yang sangat sensitif yang mampu mendeteksi kontaminasi merkuri dalam berbagai kondisi lingkungan. Pendekatan dalam penelitian ini memanfaatkan reaksi oxymerkurasi untuk mensintesis hapten organomerkuri yang stabil dan larut dalam air. Fungsi hapten mudah membentuk ikatan kovalen dari bagian organomerkuri terhadap protein karier. Penelitian ini telah membuat immunogen berbasis merkuri dengan metode dasar yang sama, yaitu, koordinasi garam Hg2+ untuk kelat atau sulfur. Disini, antibodi yang dihasilkan menunjukkan tingkat ikatan terhadap merkuri yang tinggi dalam berbagai format uji dan mampu mengikat bentuk merkuri anorganik (Hg2+) dan organik.

BAB V PENUTUP

A. Kesimpulan 1. Sintesis hapten organomerkuri dilakukan dengan reaksi oxymerkurasi yang hasilnya dikonjugasikan ke protein, dengan tujuan menghasilkan antibodi yang mampu mengikat baik logam Hg(II) maupun bentuk organologam merkuri di berbagai media sampel. Strategi secara keseluruhan adalah dengan melakukan reaksi oxymerkurasi intramolekul untuk mensintesis struktur sederhana, tapi kuat secara kimia, hapten organomerkuri yang mudah terikat kovalen pada protein karier melalui amina yang ada, strategi yang cukup unik dibandingkan dengan yang sebelumnya dijelaskan dalam metode khelasi.2. Sintesis hapten berbasis organomerkuri dapat digunakan untuk mengembangkan immunoassay yang sangat sensitif yang mampu mendeteksi kontaminasi merkuri dalam berbagai kondisi lingkungan

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2011. Mengenal Antibodi dan Antigen. http://sistempertahanantubuh.blogspot.com/2011/04/mengenal-anti-bodi-dan-antigen. html. (Diakses pada 16 Desember 2013). Anonim. 2013. What is ELISA? Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). http://www.elisa-antibody.com/ELISA-Introduction. (Diakses pada 16 Desember 2013). Fesenden, R.J. dan J. S. Fessenden. 1992. Kimia Organik Jilid 1 Edisi ke-3. Terjemahan Aloysius Hadyana Pudjaatmaka. Jakarta: Penerbit Erlangga.Prudente, Carry K. dan Margaret C. H.. 2003. Organomercury Bioconjugate Synthesis and Characterization by Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Bioconjugates Chemistry 14: 1270-1278. Sriwahyuni, Reni. 2012. Organomerkuri. http://kimia-reni.blogspot.com/2012/11/ organomerkuri.html. (Diakses pada 16 Desember 2013).Yan, Li dan Zhe Ming Ni. 2002. Determination of Trace Mercury in Environmental and Food Samples by Online Coupling of Flow Injection Displacement Sorption Preconcentration to Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry. Environmental Science & Technology, Vol. 36 (22): 4886-4891.

Anonim.2010.Antibodi dan Jenis Jenis Antibodi.Immune system.wordpress.com/.../antibodi-dan-jenis-jenis-antibodi/ diakses 16 Desember 2013