Makalah kapsel

MAKALAH

KAPITA SELEKTA HEWAN

Pengaruh Deksametason pada Gen Moesin Ekspresi dalam Sel-sel Stroma Sumsum Tulang Kelinci

DESIANA IKA LISTIANI

0402514017

PROGRAM PASCASARJANA UNNES

PENDIDIKAN IPA KONSENTRASI BIOLOGI

SEMARANG2014

BAB 1

Pendahuluan

Kortikosteroid pada saat ini dianggap sebagai obat yang sangat penting dalam

dunia pengobatan, sehingga sering digunakan dalam mengobati berbagai macam

penyakit. Obat dari golongan kortikosteroid umumnya digunakan untuk mengurangi

mengatasi radang, apapun penyebab radangnya dan di manapun lokasinya. Beberapa

penyakit peradangan yang kerap diobati dengan kortikosteroid adalah asma, radang

rematik, radang usus, radang ginjal, radang mata, dll. Selain itu, obat ini juga

digunakan pada penyakit gangguan sistem kekebalan tubuh, seperti berbagai jenis

alergi, dan lupus. Dengan sifatnya yang menurunkan sistem kekebalan, kortikosteroid

juga dapat digunakan untuk pasien yang baru menjalani transplantasi organ untuk

mencegah reaksi penolakan tubuh terhadap organ yang dicangkokkan.   Obat ini

bahkan digunakan juga pada pasien kanker, yaitu untuk mencegah mual dan muntah

akibat kemoterapi, juga pada terapi kanker itu sendiri sebagai terapi pendukung

kemoterapi. Kortikosteroid juga digunakan untuk ibu hamil yang memiliki resiko

melahirkan prematur, yaitu untuk mematangkan paru-paru janin, sehingga jika harus

lahir prematur paru-paru bayi sudah cukup kuat dan bekerja dengan baik.

Salah satu kortikosteroid yang banyak dikonsumsi yaitu dari jenis

deksametason. Deksametason memiliki efek anti inflamasi dan anti alergi.

Penggunaan deksametason di masyarakat sering kali kita jumpai, antara lain: pada

terapi arthritis rheumatoid, systemic lupus erithematosus, rhinitis alergika, asma,

leukemia, lymphoma, anemia hemolitik atau auto immune, selain itu deksametason

dapat digunakan untuk menegakkan diagnosis sindroma cushing. Efek samping

pemberian deksametason antara lain terjadinya insomnia, osteoporosis, retensi cairan

tubuh, glaukoma dan lain-lain ( Suherman, 2007). Banyaknya penggunaan

deksametason dalam berbagai macam kasus, sehingga deksametason merupakan satu-

satunya pilihan obat terbaik, sehingga mau tidak mau harus digunakan. Namun,

penggunaan deksametason memiliki efek samping yang cukup luas, antara lain :

meningkatkan resiko diabetes, menghambat pertumbuhan anak-anak, menyebabkan

gemuk pada bagian tubuh tertentu (wajah, bahu, perut), menurunkan daya tahan

tubuh sehingga mudah terkena infeksi, meningkatkan resiko hipertensi karena

menahan garam di dalam tubuh, menyebabkan gangguan lambung (perdarahan

lambung) dan penggunaan deksametason dalam jangka panjang dapat mengakibatkan

osteoporosis atau pengeroposan pada tulang.

BAB II

PEMBAHASAN

Penelitian yang dilakukan untuk mengetahui pengaruh deksametason terhadap

sumsum tulang sel stroma diferensiasi dipelajari dengan skrining aksi deksametason

dan ekspresi gen pada kelinci. Sebuah penelitian pada perubahan matriks protein

ekstraseluler menggunakan pengobatan deksametason. Pada sebagian besar penelitian

yang dilakukan dengan memodifikasi perlakuan pemberian deksametason. Untuk

mengidentifikasi suatu gen responsive terhadap deksametason, dipelajari sebuah

tampilan pola ekspresi gen diferensial pada sel stroma sumsum tulang pada kelinci

yang dikultur dengan pemberian deksametason dan tanpa pemberian deksametason.

Bahan dan metode

Sel dan kondisi kultur sel stroma sumsum tulang pada femur tiga ekor kelinci putih

betina New Zealand. Sel-sel berlapis 75 cm2 dalam botol pada kepadatan 3x105

sel/cm2 dan dikultur dalam α MEM ditambah dengan 10% v/v (FCS) serum fetal calf

dan diberi perlakuan dengan pemberian deksametason 10 Nm (Dex) dan tanpa

pemberian deksametason selama kurun waktu 28 hari. Pada akhir pengkulturan,

aktivitas alkaline phosphate dan kapasitas in vitro.

Ekstraksi mRNA

Total ektraksi RNA dilakukan pada 1 ml semua ekstrak untuk 7x106 cells

(Eurobio, Les Ulis, France). Total RNA diukur dengan menggunakan

spektrofotometer pada 260 nm. Total RNA diberi perlakuan dengan DNase I

(Clontech, Palo Alto, USA). Dua microgram dari masing-masing RNA sampel

digunakan untuk melangsungkan trnskripsi balik dalam kondisi standar dengan

Superscript II transcriptase balik (Gibco BRL, Grand Island, USA) dalam 20 µl

volume akhir. Reaksi dilakukan pada 420C selama 1 jam dan 700C selama 10 menit

dan berhenti pada 40C. produk dari reaksi RT diencerkan dalam 1/40 (cairan A) dan

1/10 (cairan B) dalam air.

Tampilan diferensial

Differential reaksi display PCR dilakukan dengan menggunakan DeltaTM Diferensial

Tampilan kit dari Clontech (Palo Alto, USA). Lima mikroliter cDNA cairan A dan B

digunakan dalam reaksi PCR selanjutnya dilakukan pada 20 µl campuran reaksi yang

mengandung 50 µM setiap dNTPs, 1 µM primer hulu (T) dan primer hilir (P) dan 1

µU Taq polymerase (Roche, Prancis) mengikuti rekomendasi aturan dunia.

Amplificasi dilakukan pada 940C selama 5 menit, 40 0C selama 5 menit dan 68 0C

selama 5 menit untuk satu siklus, 94 0C selama 20 detik, 60 0C selama 30 detik dan 68 0C selama 2 menit selama 30 siklus dan siklus akhirnya 68 0C selama 7 menit. Produk

dari amplifikasi divisualisasikan pada gel akrilamida (urea 8 M dan TBE 6%) setelah

pewarnaan perak nitrat. fragmen ditentukan untuk diungkapkan secara berbeda

dielusi dan cDNA adalah diperkuat menggunakan primer yang sama T dan P dan

PCR yang sama kondisi dimana mereka dihasilkan. Produk amplifikasi diklon

menggunakan keuntungan PCR Cloning kit dari Clontech (Palo Alto, USA) dan

sequencing menggunakan Big DyeTM Terminator v 3.3 siklus kit sequencing siap

untuk direaksikan (Applied Biosystems, Les Ulis, Prancis) dalam PRISM ABI 310

sequencer DNA otomatis (Applied Biosystems, Les Ulis, Prancis). Urutan DNA

dibandingkan dengan Database Gene Bank menggunakan ledakan algoritma.

mRNA kuantifikasi oleh kuantitas PCR secara real-time

Kuantitatif PCR dilakukan dengan menggunakan sebuah sistem Cahaya Cycler

(Roche Diagnostics, Meylan, Prancis) sesuai dengan instruksi pabrik. Reaksi

dilakukan pada 10 Volume µl dengan 1 µl cDNA, 0,5 µM primer, 4 mM MgCl2

dan 1 µl Cahaya Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green I campuran (Roche

Diagnostics, Meylan, Prancis). Tipikal protokol terdiri dari langkah mulai panas (8

mn pada 950C) diikuti oleh 40 siklus termasuk 10 detik denaturasi langkah (95 0C),

10 detik annealing langkah (58 ◦C) dan perpanjangan langkah pada 72 0C bervariasi

dari 15 detik sampai 40 detik. untuk mengkonfirmasi amplifikasi spesifisitas, produk

PCR menjadi sasaran analisis kurva leleh. Data kuantifikasi diwakili rata-rata dari

tiga percobaan independen. Primer untuk moesin dipilih dalam urutan yang diperoleh

sebelumnya. Urutan primer hulu dan hilir primer masing-masing:

5’-CGATAATCAGAACCCCGTCC-3’?? dan 5’GGGGAGAAGGCAAATAGGAA-

3’. Gen 36B4 digunakan sebagai gen referensi. Urutan primer hulu dan primer hilir

masing-masing: 5’ CGACCTGGAAGTCCAACTAC-3’ dan 5’ -AGCAACATG

TCCCTGATCTC-’

Hasil

Analisis tampilan diferensial

Analisis tampilan diferensial dilakukan pada RNA sampel yang diisolasi dari

sel-sel stroma pada sumsum tulang kelinci dikultur dalam FCS baik dengan

pemberian deksametason maupun yang tidak diberi deksametason selama 28 hari.

Tiga belas perbedaan kombinasi primer yang digunakan untuk memperkuat

pemberian DNase Total RNA. Lima dari mereka diperbolehkan untuk mendapatkan

pita diferensial.

Tampilan diferensial menggunakan P1 downstream primer dan T1 upstream

primer diidentifikasisebuah cDNA fragment mengelilingi 300bp yang turun setelah

pemberian deksametason (Pada gambar 1).

Gambar 1. Analisis tampilan diferensial.

Analisis tampilan diferensial untuk ekstraksi mRNA dari sel stroma sumsum

tulang kelinciyang dikultur dalam FCS dengan penambahan (+) deksametason

ataupun tanpa penambahan deksametason (-) selama 28 hari. Amplifikasi dilakukan

pada 5 µl cDNA dari larutan A . dan pengenceran B menggunakan P1 primer dan T1

Primer. Produk diferensial amplifikasi diamati sekitar 300bp untuk sampel 1 dan 2

hanya tanpa deksametason.

Sequencing (urutan) dari fragment ditentukan berurutan sebuah sequence dari

285 bp dan mengungkapkan bahwa cDNA tidak teridentifikasi pada kelinci. Namun,

sequence menunjukkan 86% dari identitas moesin mRNA manusia (Gambar. 2) .

Protein Moesin terlibat dalam organisasi sitiskeletal.

Gambar 2 Identifikasi produk diferensial amplifikasi “fcob”. Sequence menunjkkan

86% homologi dengan sequence mRNA moesin manusia. Upstream dan downstream

primer ditunjukkan dengan gambar yang dicetak tebal dan digaris bawah.

Ekspresi moesin mRNA pada sel stroma sumsum tulang kelinci

Ekspresi dari mRNA moesin dianalisis dengan real-time RT-PCR

menggunakan RNA total diekstraksi dari sel-sel stroma sumsum tulang dari tiga ekor

kelinci yang dikultur, hasilnya dinyatakan sebagai relative ekspresi mRNA moesin,

dinormalisasgi ke dalam endogen reference (36B4) dan relative terhadap

deksametason tanpa treatment. Sampel yang dipilih untuk mewakili 100% dari

ekspresi gen ini.

Penelitian dilakukan dengan analisis display diferensial seperti ditunjukkan

pada Gambar 3. Ekspresi moesin mRNA menurun pada ketiga sampel setelah diberi

perlakuan pemberian deksametason. Dalam kondisi ini, deksametason diperlakukan

sampel 1 dan sampel 2 menunjukkkan penurunan tingkat ekspresi mRNA moesin

masing-masing 75% dan 85%.

Namun, variasi ekspresi mRNA moesin pada sampel 3 masih lemah yaitu

73% ekspresi yang tersisa setelah diberi perlakuan dengan pemberian deksametason.

Namun demikian, ukuran kecil panel sampel yang diteliti (dari 3 kelinci yang

berbeda) tidak memungkinkan untuk dianalisis secara statistik karena perbedaan

moesin ekspresi dianggap signifikan pada masing-masing kelinci percobaan. Hasil

percobaab dapat dilihat pada Gambar 3 berikut ini.

Gambar 3 Real-Time PCR . Ekspresi mRNA moesin dianalisis dengan Real-

Time RT-PCR kuantitatif menggnakan RNA total diekstraksi dari sel stroma sumsum

tulan dari ketiga ekor kelinci percobaan, (L1, L2, dan L3) yang dikultur pada FCS

dengan pemberian deksametason (+) atau tanpa pemberian deksametason (-). Tingkat

mRNA moesin dinormalisasi dengan gen 36B4. Ekspresi moesin menurun secara

signifikan dalam dua sampel setelah pemberian deksametason.

BAB III

SIMPULAN

Pengaruh pemberian deksametason pada diferensiasi osteoblastik sesuai

dengan literature, bahkan hasil percobaan pemberian deksametason dalam stimulasi

osteoprogenitor sel proliferasi, memproduksi lebih banyak sel-sel yang mampu

menghasilkan nodul tulang. Diferensiasi osteoblast diperoleh untuk sel-sel stroma

sumsum tulang kelinci yang dikultur pada FSC dan diberi perlakuan dengan

pemberian deksametason selama 28 hari. Pemberian pengobatan deksametason dapat

memodulasi gen moesin. Efek dari pemberian deksametason ini dapat menjelaskan

beberapa tindakan terhadap proliferasi dan diferensiasi sel-sel osteoblastik.

DAFTAR PUSTAKA

Cornet, F. Broux, O, Anselme, K., Hardouin, P dan Jeanfis, J. 2004. Effect of

Dexamethasone on Moesin Gene Expression in Rabbit Bone Marrow Stromal Cells.

Vol 265 Hal 79-83.

Yudaniayanti, I, Timora F, dan Rosilawati E. 2012. Kombinasi Ampicillin, Dextran-

40, dan Deksametason dalam Mencegah Adhesi Intra-Abdominal Pasca Operasi

Histerotomi Kucing (Fellis Catus)