ECOGENETIQUE (Pharmaco/Toxicogénétique) Principes, applications et perspectives Vers une Médecine Prédictive du Risque Chimique Pr Franck Broly, MD, PhD Unité de Génopathies, Pharmacogénétique et Toxicogénétique, Centre de Biologie et Pathologie, CHRU Lille. EA4483: « Impact de l’environnement chimique sur la santé » Pôle Recherche, Faculté de Médecine, Lille.
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M2RToxMed octobre 2013 Paris · ECOGENETIQUE (Pharmaco/Toxicogénétique) Principes, applications et perspectives Vers une Médecine Prédictive du Risque Chimique Pr Franck Broly,
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ECOGENETIQUE (Pharmaco/Toxicogénétique)Principes, applications et perspectives
Vers une Médecine Prédictive du Risque Chimique
Pr Franck Broly, MD, PhDUnité de Génopathies, Pharmacogénétique et Toxicogénétique, Centre de Biologie et Pathologie, CHRU Lille.
EA4483: « Impact de l’environnement chimique sur la santé »Pôle Recherche, Faculté de Médecine, Lille.
ECOGENETIQUE
COMPRENDRE,PREVOIR et PREVENIR
Les effets de l’environnement chimique
Étude de l’influence de l’hérédité sur notre réponse aux composés chimiques de l’environnement
qui nous sont étrangers (xénobiotiques)
1 Identification des variations de réponse aux xénobiotiquesd'origine génétique
2 Compréhension de leur mécanisme moléculaire
3 Évaluation de leur importance clinique
4 Développement de méthodes d'identification des individusà risque Avant exposition ++++
• 35 % of people do not respond to beta blockers• 50 % do not respond to tricyclic antidepressants• 30 % of schizophrenics do not respond to treatment by antipsychotics••
50-60% do not respond to 5-FU combined with irinotecan and oxaloplatine for colorectal K
CHU Lille, Institut de Biochimie et Biologie Moléculaire ,UF Génopathies et Pharmacogénétique, UF Neurobiologie
CHU de Tours,Laboratoire
d’Immunologie
Hôpital Michallon,Dpt de Biologie et
Pathologie de la Cellule,UF de Pharmacologie
CHU Caremeau,Service deBiochimie
Hôpital Arnaud deVilleneuve, Lab de Biologie
Cellulaire et Hormonale
CHU Pellegrin, Servicede Biochimie
Lyon
Hôpital Herriot, Fédération deBiologie, UF de
Pharmacologie Spécialisée
CHU Dupuytren, Service dePharmacologie et Toxicologie
CHU Nancy Brabois,Service de Biochimie
Hôpital EGP, Service de BiochimieHôpital Bicêtre, Lab de Génétique Moléculaire et PharmacogénétiqueHôpital Robert Debré, Lab de Pharmacologie PédiatriqueHôpital Henri Mondor, Lab de Génétique Moléculaire
PHARMACOGENETIQUE CONSTITUTIONNELLE: Applications actuellesDonnées Pharmacogénétiques introduitesdans les AMM par la FDA ou l’EMEATest obligatoire avant traitementDes recommandations (doses) thérapeutiques existent
Débrisoquine 4-Hydroxydébrisoquine
NH
N - C - NH2
OH
NH
N - C - NH2
POLYMORPHISME D'OXYDATION DE LA DEBRISOQUINE(CYP2D6)
( mécanismes moléculaires, interêts cliniques, identification phenotypique et genotypique)
• non substrats quinidine,...Inhibiteurs non compétitifs cimetidine,...
METABOLISEUR EXTENSIF ou LIMITE• Voie métabolique accessoire propranolol,..• Précurseur et métabolite(s) actifs propafénone,..• Index thérapeutique large tropisetron,..
TRICYCLICANTIDEPRESSANTS
DRUG PM (%) IM (%) EM (%) UM (%)amitryptiline 73 92 111 130clomipramine 60 87 121 155desipramine 42 83 125 167doxepin 36 82 127 172imipramine 28 79 131 183nortriptyline 53 96 119 142trimipramine 32 76 141 206
Dosing recommendations according to CYP2D6 phenotype
Dos
e in
mg/
day
INTERETS POUR LE POLYMORPHISME DU CYP2D6dans l'industrie pharmaceutique
Développement de nouveaux médicaments
- Etudes in vitroModélisationPréparation subcellulaireExpression de cDNA
- Essais cliniques
AUTRES INTERETS POUR LE POLYMORPHISME DUCYP2D6
• Association du phénotype et de :- Personnalité- Préférence alimentaire- Dépendance aux opiacés- Variables biologiques- Sensibilité à la douleur- Plaisir du tabac
• Anticorps anti LKM1
• CYP2D6 dans le cerveau
POLYMORPHISMEgénétique d'hydroxylation de la débrisoquine
(CYP2D6)
PHENOTYPES
- Phénotypage- Génotypage
Capacité métaboliquenombreux médicaments
. Surdosage
. Inefficacité thérapeutique
. Interactions médicamenteuses
Prévisions de risques
Associations pathologiques
Pathologies
POORMETABOLISERS
CALCUL DU RAPPORTMETABOLIQUE
Substancetest
EXTENSIVE METABOLISERS
0.01 0.1 1 10 100 1000
Number ofindividuals
0
90
75
60
45
30
15 antimode
ULTRARAPID
INTERMEDIATE
[substrat][métabolite(s)]
MESURE DE LACONCENTRATION
[substrat] [métabolite(s)]HPLC, CPG, ...
- Protocol for testing- Risk of adverse drug reactions- Coadministration of drugs- Confounding effects of disease- Underlying genotype ?
LIMITATION OF PHENOTYPE DETERMINATION BY USING PROBE DRUGS
Number of subject ELIGIBLE for study:
Number of subject EXCLUDED from study for:
- Hazard with phenotyping- Schedule conflict
- Quinidine use
100 %
44 %
23.5 %19.6 %0.7 %
719
315
169141
5
Génotype
Expression
Phénotype
METABOLISEURSEXTENSIFS
METABOLISEURSLIMITES
Protéine CYP2D6Absence de la protéine
CYP2D6
gène CYP2D6fonctionnel
gène CYP2D6non fonctionnel
debrisoquine/4-hydroxydebrisoquine
Identification directe des anomalies génétiques responsables du polymorphisme d'activité du CYP2D6GENOTYPAGE
PHARMACOGENETIQUE CONSTITUTIONNELLE: Applications actuellesDonnées Pharmacogénétiques introduitesdans les AMM par la FDA ou l’EMEATest obligatoire avant traitementDes recommandations (doses) thérapeutiques existent
Génotype
Expression
Phénotype
Proportion desujet (%) par0.5 Unité/ml
d'activité TPMT
ACTIVITEINDETECTABLE
(1/300)
ACTIVITE ELEVEE(89 %)
TPMTcytoplasmique
déficitaire
TPMTcytoplasmiquefonctionnelle
Gène TPMT fonctionnel
Gène TPMT non fonctionnel
0
10
5
0 Activité TPMT(Unités/ml)
5 10 15 20
ThiopurineS-méthyltransférase
(TPMT)N
N NH
NSH
N
N NH
NS
CH3
S-adénosyl-L-méthionine
S-adénosyl-L-homocystéine
ACTIVITEINTERMEDIAIRE
(11 %)
6-mercaptopurine 6-méthylmercaptopurine
Polymorphisme génétique de la thiopurine S-methyl transferase (TPMT)
Azathioprine(Imurel® )
6-thioguanine(Lanvis®)
Voiesmétaboliques
Métabolites actifs(6-ThioGuanine Nucleotides,
6-TGNs)
Métabolitesinactifs
Métabolites inactifs
Hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase
(HGPRT)
Xanthine Oxidase(XO)
ThiopurineS-Methyltransferase
(TPMT)
6-mercaptopurine(Purinéthol® )
METHYLEURRAPIDE
METHYLEURLIMITE
Toxicité médullaire Cancer secondaire
Inefficacité thérapeutique
LeukopeniaGood responsePoor response
TPMT level (U/ml RBCs)10 15 20 25
Dose ofAzathioprine
(mg/kg per Day)
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
ECHAPPEMENT THERAPEUTIQUE CHEZ DES ENFANTS LEUCEMIQUESA ACTIVITE TPMT ELEVEE
Taux
de
rém
issi
on s
ans
rech
ute
(%)
Temps (mois)
0
50
100
0 50 100
Activité TPMTMédiane (U/ml GR)
14,1 (7-21,6)
20,9 (13-25,1)
N = 48
N = 47
Royal Dutch Association for the Advancement of Pharmacy, Pharmacogenetic Working Group
Pharmacogenetic Based Therapeutic (dose) Recommandations
Drug(Gene)
Azathioprine6-Mercaptopurine
(TPMT)
6-Thioguanine(TPMT)
Pharmacogenetics: From bench to byte. An update of guidelines. Nijenhuis JJ et al. Clin Pharmacol Ther. May 2011, 89 (5): 663-673.
Subjects(N)
2853
792
Genotypeor
Phenotype
Poor
Intermediate
Poor
Intermediate
Level ofevidence(0 → 4)
4
4
2
3
Clinicalrelevance(A → F)
F
E
F
D
Therapeutic (dose) recommendation
Select alternative drug or reduce dose by 90%.Increase dose in response to hematologic monitoring,TGNs monitoring and efficacy
Select alternative drug or reduce dose by 50%.Increase dose in response to hematologic monitoring,TGNs monitoring and efficacy
Select alternative drug.Insufficient data to allow calculation of dose adjustement.
Select alternative drug.Insufficient data to allow calculation of dose adjustement
BHN 300 (81 euros) , Délai de rendu des résultats: 10 jours
G238C
Ala80→ Pro
A719G
Tyr240→ Cys
G460A
Ala154→ Thr
Chromosome 6(6p22.3)
MUTATIONS DU GENE TPMT
I II III IV V VI VII VIII IX X
5' 3'
G292T
Glu98→ Stop
G → AT146C
Leu49→ Ser
A539T
Tyr180→ Phe
C474T
Ile158→ Ile
C339T
Thr113→ Thr
T-30AcT114A
T35CC58TG96T
Génotypage prospectif des 3 mutations inactivatrices les plus fréquentes: 48 hrs, BHN 500 (135 euros)
Splice site
T681G
His227→ Gln
G644A
Arg215→ His
A356C
Lys119→ Tyr
G430C
Gly144→ Arg
C374T
Ser125→ Leu
A83T
Glu28→ Val
A1G
Met1→ Val
G → ASplice site
G488A
Arg163→ HisC124G
Gln42→ Glu
G211A
Gly71→ Arg
A365C
Lys122→ Thr
VNTRMotif de 17/18pb répété 4 à 8 fois
Séquençage rétrospectif des 10 exons du gène et de son extrémité 5’: 1 semaine, BHN 2500 (675 euros)
Days after transplantation
0
300
200
100
Peripheral bloodleucocyte(106/ml)
Azathioprinedose
(mg/day)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Pneumoniaeand septicemia
Death
0
2
4
6
8
10
12
14
16
PRETREATMENT COUNSELLING AND TPMT SCREENING
In the context of the information presented, it is recommended that safety and efficacy issuesrelating to azathioprine are discussed fully with patients before treatment with azathioprine isstarted. The obvious concern is the one in 300 chance of an absolute deficiency in TPMT whichwould predispose a patient to a serious risk of early and severe pancytopenia. Both patients andtheir physicians will have different responses to such a risk which will be influenced by cultural,educational and emotional factors in addition to the medical indication for its usage. What iscertain is that it is no longer adequate for the physician to recommend azathioprine on the basisof their personal experience of the efficacy and safety of the drug without more detaileddiscussion concerning possible risks of therapy than has hitherto been the case. Patients in theUK will need to be informed that susceptibility to the risk of severe toxicity with azathioprinewhilst rare, is not yet detectable by pretreatment screening. Neither TPMT assay nor themeasurement of 6-TGNs is currently routinely available in the UK and until they are, safetymonitoring for azathioprine will continue to follow the manufacturer’s guidelines. These are beingamended to highlight concerns about the genetically determined susceptibility of someindividuals to azathioprine toxicity. The gold standard for TPMT assay is the radiochemicalassay of Weinshilboum et al., although work from several groups to assess an HPLC techniquehas recently been completed. The cDNA for TPMT has recently been cloned, sequenced andexpressed and this opens up the possibility of a genotyping test which, if successful, promises tohave the potential for usage in routine TPMT monitoring. Until such a test becomes widelyavailable in the UK an element of Russian roulette will continue to characterise azathioprineusage.
Anstey A. Journal of the Royal Society of Medicine, 1995, 88: 155-160.
IRINOTECAN(CPT11)
Transcription factor IID
ATG TAG
A(TA)TAA5, 6, 7 or 8 (TA) repeats
Promoter 1 2 3 4 5
OxidizedIRINOTECAN
(inactive)
SN-38(active)
SN-38-G (inactive)
Bile
Antitumouractivity
Liver
UGT1A1
Carboxylesterase
UGT1A1Chromosome 2q37
CYP3A4
A(TA)7TAA / A(TA)7TAA
Expression
Lowglucuronidation
Diarrhoea and/orLeucopenia
Expression
Normalglucuronidation
Tolerance
URIDINE DIPHOSPHATE GLUCURONOSYLTRANSFERASE 1A1(UGT1A1) GENETIC POLYMORPHISM AND IRINOTECAN THERAPY
Plasma concentration400 mg / day → 374 ± 233 ng / mlControl population
100 mg / day + Fluvoxamine → 615 ng / ml
CYP1A2Chromosome
15q22-qter
Genetic polymorphism ofCytochrome P450 CYP1A2 in clozapine therapy
ECOGENETIQUEApplications en Médecine Légale
Genetic tests to prevent adversedrug reactions may save tens ofthousands of lives a year, but fora troubled boy named mickaelthey came too late
Forbes Magazine
…While recuperating from what seemed to be flu, Michael went into a prolonged grand mal seizure and died. His grievingparents, Jayne and Neil, soon got another shock: an autopsy showed a massive overdose of Prozac in Michael's blood andtissues, raising the specter of a murder charge against them …Thus began the Adams-Conroys' painful pilgrimage to a medical frontier known as pharmacogenetics, the study of howgenetic influences responses to drugs…”
A DNA tragedy FLUOXETINE: DEATH IN A CHILD WITHPOLYMORPHISME OF CYTOCHROMEP450 2D6
A 9-year-old died due to fluoxetinetoxicity. Genetic tests confirmed that hehad a gene defect at the CYP2D6 locus,which made him a poor metabolizer offluoxetine.
Sallee et al. J Child Adolesc Psychopharmacol. 2000;10:27-34The death of nine-year-old Michael Adams-Conroy didn'tseem at first like a signal event in medicine.It seemed like homicide.
Pharmacogenetics of morphine poisoning in a breastfed neonate of a codeine-prescribed mother.G Koren, J Cairns, D Chitayat, A Gaedigk, SJ Leeder; Lancet 2006; 368: 704.
Morphine poisoning in a breastfed neonateof a codeine-prescribed mother
Codeine30 mg daily
O-demethylationCYP2D6*2A/CYP2D6 2x2
metabolizerUltra-rapid
Morphine
Milk stored on day 10Morphine concentration: 87 ng/ml(normal: 1.9-20.5 ng/ml at codeine doses of 60 mg/6h)
Death on day 13 Opioid toxicityPost-mortem analysisMorphine concentration: 70 ng/ml(normal: 0-2 ng/ml)
X X
2D8P 2D7P 2D6L 2D6LX
X X
2D8P 2D7P 2D6LX
Patient dépendant aux opiacésTraité par méthadone à doses standardMort subite
(R, S) -méthadone(60 mg/day)
S-METHADONE
S-EDDP(2-éthylidene-1,5-diméthyl-3,
3-diphénylpyrrolidine)inactif
821 ng / ml209 ng / ml612 ng / ml
CYP2B6
PHENOTYPING GENOTYPING
Gene sequencingATG ATG
Mutation 785A>G (Lys262Arg)Genotype *6/*6
METABOLISEUR LIMITE(~ 6 % Caucasiens)
1 2 3 4 5 6 7
Concentration plasmatique420 ng / ml210 ng / ml205 ng / ml
Control population(R, S)-methadone
(R)-methadone(S)-methadone
KCNH2Canal potassique
cardiaque
Anomalie duRythme cardiaqueRepolarisation et durée du
potentiel d’actionLong QT
Torsade de pointe etMort subite
R-METHADONE
R-EDDP(2-éthylidene-1,5-diméthyl-3,
3-diphénylpyrrolidine)inactif
CYP3A4
Recepteurs µaux opiacés
Inhibition
CYP2B6Chromosome
19q13.2
ECOGENETIQUEApplications en Nutrigénétique
We are Antiaging Group BarcelonaDr. Laura Salvador, responsible for the nutrigenetic/nutrigenomic studies will offer you to design a type of highlypersonalized diet, based on your genetic profile.The nutrigenetic study is carried out in a very simple way. After the first consultation with our specialist, when theindividual characteristics, the lifestyle and the pathological antecedents will be gauged, |he|she will take a sampleof saliva that will be sent to the laboratory. 13 polymorphisms associated with the nutrition are evaluated. With theobtained results we will carry out a series of recommendations highly personalized, indicating which foodsincrease or reduce the risk of developing certain illnesses related with the different diets; that will allow us toprevent different types of illnesses related with the environment.
• Fèves (vicine et convicine)• Teintures au Henné• Boules de naphtaline• Colorants alimentaires artificiels• Insecticides DDT• Nitrobenzène• Médicaments• …..
G6PDH
NADPNADPH
H2O2
H2O
Glutathionperoxydase
Glutathionréductase
Glucose-6-phosphate
Ribulose-5phosphate
2 GSH GSSGO2
peroxydes
AnémieHémolytique
Globule rougeGlobule rouge
Glucose-6-PhosphateDéshydrogénase
Aflatoxine B1
Mutation
Desactivation
Aflatoxine (G)-ADN adduit
EPOXYDE
GSTM1, EPHX1
In vivo, P53: 249
Adduits protéines:Témoin d’exposition
CYP3A4
HEPATOCARCINOME
GSTM1, EPHX1
Cruciferousvegetables
ChemopreventiveEffect
Desactivation
IsothiocyaniteConcentration
Isothiocyanites
GSTM1, GSTT1
HomozygousNull Genotype
GSTM1, GSTT1Homozygous
Wild-type Genotype
Lung cancer2141 patients, 2168 controlsHigh consumption of cruciferous vegetables+ null GSTM1 (RR = 0.7, CI 0.5-0.9)+ null GSTT1 (RR = 0.6, CI 0.4-1.0)+ null GSTM1 and GSTT1 (RR = 0.3, CI 0.1-0.7)
Protective effect of cruciferous vegetables wasabsent in individuals with active GSTM1 and GSTT1alleles
CANCER
William Shakespeare,The Tempest, Act 2. Scene 2. (Trinculo's monologue)"What have we here? a man or a fish? dead or alive? A fish: he smells like a fish; a very ancient and fish-like smell; a kind of not ofthe newest Poor-John. A strange fish! Were I in England now, as once I was, and had but this fish painted, not a holiday fool therebut would give a piece of silver: there would this monster make a man; any strange beast there makes a man: when they will notgive a doit to relieve a lame beggar, they will lazy out ten to see a dead Indian. Legged like a man and his fins like arms! Warm o'my troth! I do now let loose my opinion; hold it no longer: this is no fish, but an islander, that hath lately suffered by a thunderbolt.«
• Embarrassment,• Ridicule,• Low self-esteem,• Social exclusion,• Isolation,• Anxiety,• Depression
Aberrant methylation pattern of thepromoters of estrogen-responsive genes
associated with the development of reproductive organs
Reproductive tractabnormalities
XENOBIOTICEXPOSURE
Vaginal and cervical cancer at young age
Diethylstilbestrol
MOTHER DAUGHTERGRANDDAUGHTER
+
AberrantMethylationPattern Transfer
First 3 months of pregnancy
New Faster Illumina Sequencer HiSeq 2500HiSeq® 2500 is Illumina’s next-generation sequencing system that that can allow researchers sequence an entiregenome in approximately 24 hours, “Genome in a Day”.Feb 17, 2012 « Advances in Genome Biology and Technology conference” in FloridaOxford Nanopore Technologies Ltd. is entering the gene-sequencing race with a new portable device that willallow people to analyze DNA on the go. The product, called MinION, is about the size of a USB memory stick, theclosely held Oxford, England-based company said today. MinION will be ready for sale in the second half of theyear at a cost of less than $900.The equipment can be clustered to sequence an entire human genome in as littleas 15 minutes.
Life Technologies, based in Carlsbad, California, on Jan. 10, 2012 said it is taking orders for its benchtop IonProton Sequencer. The machine, available for $149,000, is designed to provide a full transcript of a person’s DNAin a day for $1,000.
ECOGENETIQUE MOLECULAIRE
Problèmes d’organisation au plan national
• Dispersée• Fractionnée• Manque de visibilité• Manque de coordination
Problèmes économiques
• Selon la région, l’hôpital • Hétérogénéité des modes de financement et de fonctionnement
Inégalités • d’accés aux tests• de prise en charge et de paiement• de qualité et fiabilité des analyses
Considérations éthiques, légales, sociales et économiques
Proposition du test• Connaissances • Médecin
• Patient• Informations scientifiques
• Recommandations • Autorités• Industriels
• Xénobiotique / pathologie / poste• Facilités à réaliser le test• Coût de l'analyse• Responsabilités • Médicales
• Autorités
Prospectif ou Rétrospectif
Consentement éclairé écrit du patient
• Dépend de l'information que transporte le test • Pharmacogénétique• Révélatrice d'une pathologie• Facteur de risque pathologique ou autre
• Contenu va dépendre • Capacité du patient à comprendre l'information et ses conséquences• Effet psychologique du résultat du test• Informations complémentaires devront être données
Au cas par cas
Fréquence des phénotypes, pénétrance•
Considérations éthiques, légales, sociales et économiques
Réalisation de l'analyse
Qui doit faire les tests et dans quels conditions ?
• Vide juridique• Professionnel de la santé agréés dans des structures autorisées
• Possibilité d'information touchant à la santé• Difficultés d'interprétation et de fiabilité des tests
Résultats et interprétation de l'analyse
Fournis au prescripteur
Interprétés par le labo et le prescripteur • Pharmacologue ?• Généticien ?• Conseil génétique ?Utilisation du résultat
• Dépend de nb facteurs • Maladie / emploi• Traitement / emploi alternatif ou non• Thérapeutique / exposition "off-label"• Balance bénéfice / risque
• Toxicologue ?
Considérations éthiques, légales, sociales et économiques
Propriété et confidentialité de l'information
Pour le sujet • Résultats inclus dans le dossier médical• Information disponible à l'ensemble du personnel médical directement
responsable de sa santé mais appréhende la possibilité d'un accès à cesinformations par d'autres groupes sociaux
Pour la famille• Conséquences possibles Information PG+++ ex: situation d'urgence
Susceptibilité à une pathologie ou autres
Informations donnés par le médecin aux patients avec ses conséquences
Il est évident que dans certaines circonstances le médecin doitencourager le patient à donner ces informations au reste de la famille.
Autres groupes sociaux
• Inconvénients • Patient "difficile à traiter " "cher à traiter" ou "maladie sérieuse intraitable "
• Informations associées (maladie, addictions)
• Avantages • Patient pourra être traité efficacement, mieux que la population générale