Page 1
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
1
MỞ ĐẦU
Ở mọi cơ thể sinh vật, vật chất sống được cấu tạo từ các đại phân tử sinh học,
trong đó quan trọng nhất là nucleic acid và protein. Các nucleic acid đóng vai trò
quan trọng trong sự lưu trữ và truyền đạt thông tin di truyền cho thế hệ sau. Hơn nữa,
các thông tin này sẽ được biểu hiện trên cơ thể thông qua sự tạo thành các phân tử
protein. Trong các quá trình sao chép cũng như tổng hợp protein luôn xuất hiện
nhiều biến đổi, đây chính là nguồn gốc của sự tiến hóa và tính đa dạng của sinh giới.
Vì vậy việc tìm hiểu, phân tích các phân tử DNA, RNA là rất cần thiết. Khi hiểu rõ
cấu trúc, đặc điểm của các đại phân tử này, chúng ta có thể kết hợp với sự phát triển
các kỹ thuật, các công nghệ hiện đại để tiến hành lai tạo, chọn giống mới, sản xuất
các hợp chất thứ cấp dùng trong y học, sản xuất các chất kháng sinh…..
Có rất nhiều kỹ thuật được ứng dụng trong công nghệ sinh học để nghiên cứu
vật chất sống, trong đó điện di là một kỹ thuật rất hữu ích sử dụng nhằm phân tích,
xác định và tinh sạch các đoạn DNA bằng cách dựa vào sự dịch chuyển của chúng
trong môi trường điện trường.
Page 2
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
2
NỘI DUNG
I. NGUYÊN TẮC CHUNG
Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các phân tử tích điện dưới tác động
của điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA, RNA,
protein dựa trên các đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thực của chúng.
Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch
chuyển về các cực (+) hoặc (-) tùy theo điện tích của chúng. Protein có điện tích
thực hoặc dương hoặc âm, còn các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ
khung phosphate của mình và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương.
Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn
đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc
polyacrylamide gel. Tuy nhiên, kỹ thuật điện di trên giá rắn (agarose hoặc
polyacrylamide) được sử dụng phổ biến nhất. Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch
đệm để dẫn điện và tạo điện trường đều, một bản gel để phân tách các phân tử và
các chất nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di.
Trong đó, polyacrylamide gel được dùng để phân tách các phân tử protein và các
phân tử DNA có chiều dài <1 kb, còn agarose gel phân tách hiệu quả các phân tử
DNA hoặc RNA có kích thước từ 20 bp-20 kb.
II. ĐIỆN DI AGAROSE GEL
Agarose có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da, là một trong hai thành
phần chính của agar chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30%.
Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ
nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose.
Agarose gel là một chất trong suốt hoặc trong mờ, tạo thành khi hỗn hợp
agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100 oC và sau đó được làm
lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45 oC. Bản chất quá trình đông lại của agarose
là phản ứng trùng hợp gắn nhiều gốc monomer tạo thành polymer nhờ nhiệt độ. Các
Page 3
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
3
chuỗi polymer liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích
thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ agarose và phản ứng polymer hoá.
Hình 1. Cấu trúc hoá học của agarose và cấu trúc agarose gel
1. Nguyên tắc
Các phân t ử nucleic acid co khôi lương va điên tich khac nhau đươc tach ra
khi di chuyên tư cưc âm sang cưc dươn g cua hê điên di trong môt điên trương co
điên thê va cương đô thich hơp . Tốc độ dịch chuyển của các phân tử trong gel phụ
thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường... Điện di
agarose gel được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác định và
tinh sạch các đoạn DNA
Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp : các băng DNA trong gel
đươc nhuôm ơ nông đô thâp cua thuôc nhuôm huynh quang ethidium bromide (EtBr)
và co thê phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.
2. Các yếu tố ảnh hưởng
2.1. Kich thươc cua phân tư
Các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ
dịch chuyển càng chậm. Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các
tôc đô ty lệ nghịch với hàm log10 của khối lượng phân tư cua chung.
Page 4
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
4
Hình 2. Môi quan hê giưa kich thươc DNA va độ linh đông điên di cua no
2.2. Nông đô agarose
Đoan DNA mang kich thươc khác nhau dich chuyên ơ cac tôc đô khac nhau
qua cac ban gel chưa cac nông đô agarose khac nhau .
Bảng 1. Các thông số điên di DNA băng agarose gel
Hàm lương agarose
(%) trong gel
Kich thươc DNA mạch
thăng (kb) sư dung co
hiêu qua
0,3 60-5
0,6 20-1
0,7 10-0,8
0,9 7-0,5
1,2 6-0,4
1,5 4-0,2
2,0 3-0,1
0,5%
0,9%
1,2% 1,4%
0,7%
5
4
3
2
Log
10 c
ủa c
ác
cặp n
ucl
eotide
đệm: 0,5 x TBE – 0,5 μg/mL EtBr
điện di: 1 V/cm trong 16 giờ
1 2 3 4 5 6
Page 5
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
5
Hình 3. Điên di các mẫu DNA giống nhau ở các nồng độ agarose khác nhau. A: 1%, B: 1,5%
và C: 2%.
Theo hình trên, sự dịch chuyển của tập hợp các đoạn DNA trong hai mẫu ở ba
nồng độ khác nhau của agarose, tất cả chúng ở trong một khay gel và được điện di ở
cùng một điện áp trong một thời gian xác định. Kết quả cho thấy, các đoạn lớn được
phân tách tốt hơn ở gel 1%, trong khi các đoạn nhỏ thích hợp với gel 2%.
2.3. Câu hinh cua DNA
Các DNA dạng vong đong , vòng đứt và mạch thẳng có cùng một kh ối lượng
phân tư se dich chuyên trên agarose gel ơ cac tôc đô khac nhau.
DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid
cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng.
Hình 4. Kết quả điên di vơi plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại
mạch thẳng ở bên phải.
1 2 1 2 1 2
A B C
DNA mạch vòng DNA mạch thẳng
Dạng vòng đứt
Dạng vòng đóng
Page 6
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
6
2.4. Thanh phân base va nhiêt đô
Điên di cua DNA trong agarose gel không bi anh hương ro bơi thanh phân
base cua DNA hoăc nhiêt đô . Trong agarose gel , tính linh động điện di tương đối
của các đoạn DNA có kích thước khác nhau không thay đổi trong kho ảng từ 4 o
C
đến 30 oC. Nói chung, agarose gel thương đươc chay ơ nhiêt đô phong.
3. Phương pháp điên di
3.1. Thiết bị điên di
Hình 5. Cấu trúc thiết bị điên di agarose gel
Thiết bị điện di agarose gel gồm 3 bộ phận cơ bản: nắp, khay vận hành và
buồng điện di.
+ Nắp: trên nắp có đầu ra của dây cáp điện nối điện cực trên buồng điện di
với nguồn điện.
+ Khay vận hành bao gồm: khay đổ gel, khuôn đổ gel, lược.
Page 7
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
7
+ Buồng điện di: là nơi đặt gel trong quá trình điện di. Buồng có rãnh để cài
lược, hai điện cực tạo ra điện trường trong dung dịch.
3.2. Đêm pH
Một số đệm điện di DNA thích hợp là Tris-acetate-EDTA (TAE), Tris-
borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng 50 mM va
pH 7,5-7,8. Trong đó, TAE sư dung nhiêu nhât , nhưng kha năng đêm lai thâp . Đêm
TBE và TPE đêu co kha năng hoa tan tôt cac đoan DNA va kha năng đêm cao hơn .
Các đoạn DNA sẽ dịch chuyển với các tốc độ hơi khác nhau trong ba loại đệm trên.
Đệm giúp thiết lập một giá trị pH, cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn.
Bảng 2. Các loại đêm sử dụng phổ biến trong điên di
Đêm Nồng độ dung dịch sử
dụng Dung dịch stock (1 lít)
Tris-acetate-EDTA(TAE)
40 mM Tris
20 mM acetic acid
1 mM EDTA
(50) 242 g Tris base
57,1 mL glacial acetic acid
100 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0)
Tris-borate-
EDTA (TBE)
89 mM Tris 89 mM boric acid
2 mM EDTA
(10) 108 g Tris base
55 g boric acid 40 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0)
Tris-phosphate-
EDTA (TPE)
80 mM Tris- phosphate 2 mM EDTA
(10)
108 g Tris base 15,5 mL H3PO4 85%
40 mL EDTA
3.3. Quy trinh điên di
3.3.1. Chuẩn bị agarose gel
Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di , loại agarose dùng
tôt nhât trong thi nghiêm la type -II-agarose co nôi thâm thâu thâp (low-endo-
osmotic). Nó dê dàng chảy ra va tao thanh môt dung dich trong suôt , kêt qua la gel
đan hôi thâm chi ơ cac nông đô thâp . Tuy nhiên , type-II-agarose dê bi bân b ởi
sulphate polysaccharides (SP), hơn nưa SP con ưc chê cac enzyme như ligase ,
polymerase va RE . Vì thế, các đoạn DNA dung ly từ những gel như thế phải được
làm sạch cân thận trước khi chúng được dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chất
cho cac enzyme nay.
Page 8
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
8
Cách tiến hành: Cho 1% type-II-agarose vao 100 mL đêm 0,5 TAE. Đun
trong nồi khử trùng hoăc lò vi sóng cho đên khi agarose tan hoan toan . Nêu qua
trình đun mất nước quá nhiều thì phải thêm nước cho đủ 100 mL. Đê nguôi khoang
60oC va đô vao bu ồng điên di co cai s ẵn lươc. Chiêu day gel khoang 5 mm la thích
hơp. Sau 30-40 phút, khi gel đa đông cưng, gơ lươc ra.
3.3.2. Đăt mâu DNA vao giếng
Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau có thể sử dụng nồng độ DNA
cao hoăc thâp. Chăng han theo ty lê sau:
DNA (1 g/1 µL ) : 1 L
Đêm mau bromophenol (10 loading dye):1 L
Nước cât 2 lân: 9 L
Tổng số : 11 L
Dùng micropipette hút 11 L dung dich trên cho vao giêng .
Thương đăt mâu sau khi đa đô dich đêm 0,5 TAE vao buồng điên di cho ngâp
gel, ít khi đăt mâu trước rồi đổ đệm sau . Thường dùng micropipette loại 20-200 L
và đặt bu ồng điên di trên ban co nên đen . Khi tăng điện thế của quá trình điện di,
các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn so với các đoạn nhỏ. DNA dịch
chuyên tư cưc âm đên cưc dương . Quan sat sư d ịch chuyên băng mau bromophenol
để biết lúc nào cân ngưng điên di.
3.3.3. Nhuôm DNA băng EtBr
Phương phap quan sat DNA trong agarose gel thuân lơi nhât la dung thuôc
nhuôm huynh quang EtBr . Sau khi chay điên di xong lây nhe ban gel ra khoi khuôn
và ngâm vào dung dịch EtBr nông đô 0,5 g/mL, trong thơi gian 30-45 phút, tôt nhât
trên một may lăc nhe (đô 10 vòng/phút ). Đổ dịch nhuộm EtBr vào một binh riêng đê
xư ly va rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước cất hai lần, môi lân 15-20 phút. EtBr
thương pha săn ơ dang đâm đăc 5 mg/mL va giư ở 4oC trong tôi.
EtBr đươc dung đê phát hi ện DNA sơi đôi va RNA sơi đơn . Tuy nhiên, ái lực
(affinity) của thuôc nhuôm đôi vơi nucleic acid sơi đơn la tương đôi thâp va co hiêu
Page 9
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
9
suât huynh quang không cao . Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của
nucleic acid và cho phép phát hiện dê dàng chúng ở trong gel.
Thương EtBr (0,5 g/mL) đươc đưa vào trong agarose gel đ ể phản ứng nhuộm
xảy ra trong suốt quá trình điện di. Măc du tinh linh đông điên di cua DNA sơi đôi
mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhưng kha năng xac đinh
gel trưc tiêp dươi anh sang UV trong suôt qua trinh điện di hoăc ơ giai đoan cuôi co
ưu thê ro rêt . Tuy nhiên , nêu cân co thê ch ạy điện di gel không co EtBr va chi
nhuôm DNA ho ặc RNA sau khi điên di xong . Gel đươc ngâm trong đêm điên di
hoăc H2O chưa EtBr (0,5 g/mL)/45 phút ở nhiệt độ phòng.
Hình 6. Sơ đồ minh họa các bươc trong quá trình điên di agarose gel
3.3.4. Quan sat va chup anh
Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ( = 302
nm). Dùng thiế t bi chuyên dung đ ể phân tích và lưu trữ hình ảnh DNA (Gel
Documentation System).
a. Khuôn đổ gel
Dung dịch agarose gel
Băng dính
Lược
Giếng
b. Gắn lược và đổ agarose gel
vào khuôn c. Lấy lược ra khỏi khuôn gel
Micropipette
Nguồn điện di
Cable
Đệm điện di
Nắp
Buồng điện di
d. Nạp mẫu DNA vào giếng e. Chạy điện di
Vị trí gắn lược
Page 10
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
10
(a) (b)
Hình 7: Quan sát DNA dươi ánh sáng tử ngoại (a) và hình ảnh điên di DNA
trên agarose gel (b)
3.4. Môt số phương pháp thu hôi DNA tư agarose gel
a) Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp
Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm được cắt
ra khỏi bản gel và cho vào trong đệm với ty lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M,
sau đó được nóng chảy ở 70oC để hòa tan hoàn toàn trong đệm. Dung dịch gel có DNA
được chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa. Lưu ý DNA được tách chiết bằng
phương pháp này không thích hợp cho mọi phương thức thao tác tiếp theo, do sự hiện
diện của các nhân tố ức chế trong agarose.
Agarose gel có nhiệt
độ nóng chảy thấp
Cắt
Đoạn DNA quan
tâm
Đoạn DNA quan
tâm
Cho vào trong đệm
với ty lệ 1:1
Chiết bằng phenol/chloroform
và kết tủa
Bổ sung muối đến
nồng độ 0,5M
Dung dịch gel có
DNA
70oC
Hình 8. Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm
băng cách dùng agarose có nhiêt độ nóng chảy thấp
Page 11
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
11
b) Ly tâm
Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm
chiết, làm nóng để hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp
bông thủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại 0,5 ml. Cột này được
cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5 mL và được ly tâm ở tốc độ cao 10.000-15.000
rpm trong 10-15 phút. DNA sẽ liên kết với màng còn dung dịch đệm sẽ đi qua lớp
bông thủy tinh vào tube vi ly tâm. Cho đệm rửa vào cột và rửa cột vài lần bằng cách
ly tâm nhanh. Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào cột và ly tâm để
dung ly (elution) DNA ra khỏi màng vào tube. Dung dịch DNA thu được có thể
được tinh sạch thêm nếu cần. Cũng có thể đông lạnh mẫu gel trước khi dùng phương
pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA.
c) Điện di vào bẫy
* Cách 1: Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của
băng DNA quan tâm. Rãnh này được làm đầy bằng glycerol và gel được điện di
nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol (quá trình điện di
agarose gel chứa
băng DNA
Cắt
Đoạn DNA quan
tâm
cho vào đệm chiết,
làm nóng hòa tan hoàn toàn
ly tâm ở 10.000-
15.000 rpm trong
10-15 phút.
thủy tinh đặt trong
một cột lọc
cho vào tube ly tâm
rửa cột vài lần
DNA liên kết với màng
dung ly DNA ra khỏi màng
Hình 9. Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm
băng cách dùng ly tâm
Page 12
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
12
có thể được kiểm soát bằng UV). Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết bằng
pipette.
* Cách 2: sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng
DNA quan tâm và đặt trong khe một mẫu giấy loại NA-45. Gel sau đó được điện di
trở lại và băng DNA quan tâm sẽ dịch chuyển vào trong mẫu giấy. Mẫu giấy sau đó
được rửa và DNA được dung ly trong đệm bằng cách đun nóng mẫu giấy tới 70oC.
DNA sau đó có thể được tách chiết bằng phenol và kết tủa.
d) Dùng hạt thủy tinh
Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI ở nồng độ khoảng 4
M. Sau đó, các hạt thủy tinh được bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu quả với
các đoạn DNA được phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI. RNA, protein và các
tạp chất khác không liên kết với các hạt thủy tinh. Tiếp theo, tiến hành rửa và kết tủa
tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh trong đệm muối thấp. Tuy
nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có phạm vi tối ưu hẹp.
Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quả lắm và các đoạn lớn
Cắt một rãnh nhỏ phía trước
băng DNA quan tâm
Làm đầy bằng glycerol
Điện di nhanh trở lại để chuyển DNA
từ gel vào trong dung dịch glycerol
Chiết dung dịch glycerol-DNA
bằng pipette
Cắt một rãnh nhỏ trước
băng DNA quan tâm
Đặt trong khe một mẫu
giấy loại NA-45
Điện di nhanh trở lại để
chuyển DNA từ gel vào
mẫu giấy
Rửa mẫu giấy và dung
ly DNA trong đệm
Tách chiết DNA bằng
phenol
và kết tủa
Hình 10. Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm băng cách dùng
điên di vào bẫy. (a): cách 1, (b): cách 2
(a) (b)
Page 13
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
13
(>15 kb) có thể liên kết với các hạt thủy tinh khác nhau và các sợi DNA có thể bị
phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa.
4. Ứng dụng của điên di agarose gel
Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt
hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…).
Phân tích các sản phâm PCR (ví dụ: trong chân đoán di truyền phân tử hoặc
in dấu di truyền…).
Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thâm tích Southern,
hoặc RNA trước khi thâm tích Northern.
5. Ưu điểm và nhươc điểm
* Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dê dàng, không gây biến tính
mẫu và bền vững vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dê thu hồi.
* Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm
có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định.
II. ĐIỆN DI POLYACRYLAMIDE GEL
Acrylamide là một monomer có cấu trúc như sau:
Khi có mặt các gốc tự do, được cung cấp bởi ammonium persulphate và ổn
định bởi TEMED (N, N, N', N
'-tetramethylathylene-diamine), phản ứng chuỗi
Hòa tan gel trong dung dịch
muối NaI (4 M).
Bổ sung hạt thủy tinh
vào dung dịch
Rửa và kết tủa tiểu thể
Tách chiết DNA bằng phenol
và kết tủa
Dung ly DNA ra khỏi hạt thủy
tinh trong đệm muối thấp
DNA liên kết với hạt thủy
tinh
Hình 11: Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm băng cách dùng
hạt thủy tinh.
CH2 = CH C NH2
O
Page 14
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
14
bắt đầu khi các acrylamide monomer được polymer hoá thành một chuỗi dài.
Khi bisacrylamide (N, N'-methylenebisacrylamide) được bổ sung trong phản
ứng polymer hoá, các chuỗi sẽ liên kết chéo để tạo thành dạng gel. Độ xốp của gel
được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo. Mức độ liên kết
chéo sẽ xác định kích thước lỗ, từ đó phân tách các phân tử protein với kích thước
khác nhau. Kích thước trung bình của các lỗ gel được điều chỉnh bằng cách thay đổi
ty lệ acrylamide và bisacrylamide.
Hình 12. Hình thành liên kết chéo
Hình 13. Hình thành polyacrylamide gel
CONH2 CONH2 CONH2
S2O42-
SO4- + nCH2 = CH nCH2 CH CH2 CH
TEMED
Page 15
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
15
1. Nguyên tắc điên di polyacrylamide gel
Dùng để phân tách các phân t ử protein, các đoan DNA , kể cả RNA và
DNA/RNA. Gel phai đươc rot vao giưa hai tâm kinh đươc ngăn cach bơi cac miêng
đệm (gel spacers) để ngăn không cho polyacrylamide tiêp xuc vơ i không khi . Gel co
thê dai tư 10-100cm tuy thuôc vao yêu câu phân tich va chung thương đươc chay trong
phương thăng đưng .
Có thể đúc bản gel ở các nồng độ khác nhau của polyacrylamide từ 3,5%-
20% tùy thuộc vào kích thước của phân tử protein hoặc đoan DNA quan tâm . Nồng
độ thấp tạo ra các lỗ có kích thước lớn hơn và vì thế có thể phân tách các phân tử
lớn hơn Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thể được điều chỉnh để
kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel. Điều này cho phép tối ưu hóa một khuôn gel để phân
tách một phạm vi kích thước đặc biệt của các phân tử protein.
Hình 14. Polyacrylamide gel
2. Điên di acid nucleic
Điện di polyacrylamide gel đươc dung đê phân tich va thu h ồi cac đoan DNA
có chiều dài từ 5-2.000 bp. Nồng độ polyacrylamide gel được sử dụng trong khoảng
tư 3,5-20% tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA quan tâm.
Hai loai polyacrylamide gel thường đươc sư dung la:
- Polyacrylamide gel không biên tinh dung đ ể phân tách và tinh sạch các
đoan DNA sơi đôi.
- Polyacrylamide gel biên tinh b ằng urea và formamide dung đê phân tách va
tinh sach cac đoan DNA sơi đơn.
Page 16
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
16
Trong đó, polyacrylamide gel không biến tính là loại gel hay được sử dụng
nhất. Hiêu quả của sự phân tách DNA trong lo ại gel này phu thuôc vào nông đô cua
acrylamide, kích thước và điện tích của DNA.
Bảng 2. Hiêu qua cua sư phân tách DNA trong
polyacrylamide gel không biên tinh
Hình 15. Cấu trúc thiết bị điên di polyacrylamide gel
Acrylamide (% w/v)
Hiêu qua phân tich
(nucleotide)
3,5 1.000-2.000
5,0 80-500
8,0 60-400
12,0 40-200
15,0 25-150
20,0 6-100
Page 17
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
17
2.1. Phương pháp điên di polyacrylamide gel không biến tính
2.1.1. Chuẩn bị polyacrylamide gel không biến tính
Kích thước phổ biến của tấm kính đổ gel thường là 20 cm40 cm. Miêng
đệm dày khoảng 0,5 mm-2,0 mm. Các gel dày hơn thường nóng lên trong quá
trình điện di nên sẽ làm nhòe các băng DNA , vì thế ng ười ta thường sử dụng các
gel mong . Tuy nhiên , khi khi chay môt lương lơn DNA (>1 g/băng) thì cần
chuân bi gel day .
2.1.2. Các bước tiến hành:
a) Chuẩn bị dung dịch: 30% acrylamide (gôm bis-acrylamide), 1 TBE, 10%
ammonium persulphate.
b) Lau sach hai tâm kinh dung lam khuôn gel va miêng đêm băng
KOH/methanol hoăc ethanol . Xư ly bê măt cua hai tâm kinh băng dung dich silicon
để ngăn gel dính chặt vào hai tấm kính gây rách gel lúc lấy nó ra khỏi khuôn sau khi
điên di xong.
c) Tính toán thể tích của các dung dịch dùng đ ể tạo polyacrylamide gel trên
cơ sơ kich thươc tâm kinh, đô day cua miếng đệm.
Bảng 3. Dung tich cua cac chât dung cho polyacrylamide gel
d) Bô sung 35 L TEMED vao môi 100 mL dung dich tao polyacrylamide
gel, trôn hôn hơp băng cach vortex . Rót dung dịch tạo gel vào giữa hai tấm kính .
Dung dich
Sô mL cua cac nông đô (%) khác nhau
để chuân bị gel
3,5% 5,0% 8,0% 12,0% 20,0%
30% acrylamide
(bao gôm bis-acrylamide) 11,6 16,6 26,6 40,0 66,6
Nươc 67,6 62,7 52,7 39,3 12,7
5 TBE 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0
10% ammonium persulphate 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7
Page 18
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
18
Găn nhanh lươc vao , tránh bọt khí ở răng lược (giêng). Đinh cua răng lươc pha i hơi
cao hơn mep gel. Nêu cân, bô sung môt it dung dich tao gel đê lam đây mep gel .
e) Cho phep acrylamide polymer hoa trong khoang 60 phút ở nhiệt độ phòng,
bô sung thêm dung dich tao gel nêu thây gel co vao nhiêu .
f) Sau khi polymer hoa hoan toan , rút lược cân thân , tháo băng dính ra khỏi
đay khuôn gel . Găn khuôn gel vao bu ồng điên di va lam đây bu ồng điên di băng
đệm 1 TBE, dùng Pasteur pipette để phá các bọt khí ra khỏi đáy gel và các giếng
băng đêm 1 TBE.
g) Trôn cac mâu DNA vơi m ột lương thich hơp cua đêm 6 gel-loading dye.
Đặt mẫu vào trong giếng bằng micropipette hoặc Hamilton syringe .
h) Nôi buông điên di vơi bô nguôn . Polyacrylamide gel không biên tinh
thương chạy điện di trong khoảng 1 V/cm đên 8 V/cm. Chạy gel cho đến khi thuốc
nhuôm chi thi dich chuyên đên vi tri mong muôn . Tăt nguôn, lây khuôn gel ra va đăt
lên ban. Tháo tấm kính nhỏ ở mặt trước ra , tâm kinh lơn ơ phi a sau được dùng làm
giá đỡ và chuân bị nhuộm gel.
Hình 16. Các bươc chuân bị điên di
Page 19
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
19
2.2. Phát hiên DNA trong polyacrylamide gel
2.2.1. Nhuôm băng ethidium bromide
Ngâm nhe gel trong dung dich nhuôm (0,5 g/mL EtBr trong 1 TBE). Sau
30-45 phút, lây gel và tấm kính đơ ra, cân thân thâm khô bê măt gel b ằng giây thâm
Kimwipe. Phủ lên bề mặt gel bằng gi ấy nylon (Saran wrap ), tránh tạo ra bọt khí
hoăc nêp gâp cua Saran wrap. Quan sát và chụp ảnh trên may soi tư ngoai.
Polyacrylamide co thê la m mât huynh quang cua EtBr , do đo không thê phat
hiên cac băng DNA băng phương phap nay nêu ham lương cua no thâp hơn 10 ng.
2.2.2. Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc:
Thuốc nhuộm bạc sử dụng hiệu quả để phát hiện cho phép phát hiện một
lượng protein ở dạng vết trong polyacrylamide gel và một lượng nhỏ nucleic acid
(pg), nhạy gấp 1.000-10.000 lần phương pháp nhuộm bằng EtBr.
Hai phương pháp nhuộm bạc thường được sử dụng là: 1) Dùng các dung
dịch diamine silver hay ammoniacal silver cho thấm vào gel và pha loãng các dung
dịch acid của formaldehyde. 2) Thấm dung dịch silver nitrate vào gel trong môi
trường acid yếu và dùng formaldehyde khử có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim
loại dưới điều kiện kiềm. Phương pháp diamine kiềm kém nhạy hơn nhưng thích
hợp đối với các gel dày, trong khi phương pháp acid nhanh và bắt màu tốt hơn đối
với các gel mỏng.
Quá trình nhuộm bao gồm các bước sau:
- Cố định nucleic acid trong acetic acid 7,5% tối thiểu 5 phút để ngăn cản sự
khuếch tán của các phân tử nucleic acid đã được phân tách trong gel, loại bỏ và
trung hòa các hóa chất không mong muốn (urea và đệm).
- Rửa gel trong nước khử ion tối thiểu 2 phút để loại bỏ acetic acid, các chất
bân dạng vết và phần thừa của các thành phần gel hòa tan sau khi cố định.
- Nhuộm gel trong dung dịch bạc với sự có mặt của formaldehyde để cải
thiện độ nhạy và độ tương phản. Thời gian nhuộm tối ưu khoảng 20 phút. Tuy nhiên,
đối với loại gel có tấm đỡ polyester (8×10 cm) chỉ cần 10 phút để có chất lượng
hình ảnh cao mà không làm giảm độ nhạy.
- Rửa gel sau khi nhuộm bạc để loại bỏ thuốc nhuộm thừa có thể gây ra kết
tủa màu nâu trong quá trình phát triển màu.
Page 20
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
20
- Phát triển màu của gel bằng hỗn hợp dung dịch sodium carbonate (4g/L),
sodium thiosulfate (4 µM) và formaldehyde để giảm các background không đặc hiệu
một cách hiệu quả. Nhiệt độ rửa thích hợp từ 8-10 oC, thời gian rửa thay đổi tùy vào
thành phần của dung dịch phát triển màu trong khoảng từ vài giây đến vài phút.
- Dừng phản ứng phát triển màu khi thu được hình ảnh tối ưu càng nhanh
càng tốt bằng cách dùng acetic acid lạnh 7,5%.
2.2.3. Phóng xạ tự ghi:
DNA có thể được phát hiện bằng đồng vị phóng xạ 32
P. Cố định nucleic acid
trong acetic acid 7,5%. Sau đó, tiến hành rửa gel trong nươc khư ion . Dùng giấy
thâm Kimwipe đê thâm khô bê măt gel . Tiếp theo, đánh dấu phóng xạ và sấy gel ở
80oC trong điều kiện chân không từ 1-2 giờ. Ủ phim phóng xạ khoảng 24 giơ. Quan
sát kết quả.
Hình 17. Phát hiên DNA băng thuốc nhuộm bạc
Page 21
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
21
Hình 18. Hình ảnh điên di DNA có đánh dấu 32
P trên polyacrylamide gel ở phim X-quang.
2.3. Phân lâp cac đoan DNA tư polyacrylamide gel
Phương phap tôt nhât đê phân lâp DNA tư polyacrylamide gel la ky thuât cua
Maxam và Gilbert (1977). Ưu điểm của phương pháp:
+ DNA thu đươc co đô tinh sach cao
+ Phân lâp ca hai loai DNA sơi đôi va sơi đơn tư cac polyacrylamide gel
không biến tinh va biến tính.
Phương thưc sau đây đươc cai tiến tư ky thuât cua Maxam va Gilbert (1977):
- Chạy điện di polyacrylamide gel. Xác định vị trí của DNA quan tâm bằng
phóng xạ tự ghi hoặc bằng EtBr quan sát dưới ánh sáng UV.
- Dùng dao cắt mảnh gel chứa băng DNA quan tâm . Không loai bo Saran wrap
khỏi gel trươc khi căt , căt ca gel l ẫn Saran wrap, sau đó bóc mảnh gel nhỏ có chứa
DNA quan tâm ra khoi Saran wrap .
- Chuyên gel vao trong E -tube (eppendorf tube), dùng tip của micropipette để
ép mảnh gel theo thành của tube.
- Tính toán thể tích thích hợp của mảnh gel và bổ sung 1-2 thê tich cua đêm chiêt
vào E-tube.
- Đong tube va u ơ 37oC kem theo lăc vong nhe . Đoan DNA nho (<500 bp)
đươc dung ly trong khoang 3-4 giơ, đoan lơn hơn mât khoang 12-16 giơ
- Ly tâm 12.000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Chuyên thê nôi vao E-tube sach.
Page 22
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
22
- Bô sung thêm 0,5 thê tich đêm chiêt vao E -tube cu co manh polyacrylamide
gel, vortex nhanh va ly tâm. Trôn hai thê nôi lai vơi nhau.
- Bô sung hai thê tich ethanol ơ 4oC, bảo quản dung dịch trên đá tuyết 30 phút.
Thu hôi DNA băng cach ly tâm 12.000 vòng trong 10 phút ở 4oC.
- Hòa tan trơ lai DNA trong 200 L đêm TE (pH 7,6) và bổ sung 25 L cua 3 M
sodium acetate và kết tủa DNA.
- Rưa cân thân tiêu thê vơi ethanol 70% và hòa tan trở lại DNA trong đêm TE
(pH 7,6) tơi thê tich cuôi cung la 10 L.
- Kiêm tra sô lương va chât lương cua đoan DNA băng điên di polyacrylamide
gel. Lây môt th ể tích nhỏ tối thiểu trôn vơi 10 L TE (pH 7,6), bô sung thêm 2 L
gel-loading dye. Nạp mẫu và chạy điện di polyacrylamide gel ở nồng độ thích hợp.
Hình 19. Sơ đồ tóm tắt phương pháp cải tiến từ kỹ thuật của Maxam và Gilbert (1977)
Chạy điện di
polyacrylamide gel
Xác định vị trí DNA
Cắt băng DNA ra khỏi gel,
chuyển vào eppendorf tube
Bổ sung đệm chiết
ủ ở 37ºC kèm lắc nhẹ
Ly tâm 12.000 vòng/phút
ở 4ºC, lấy thể nổi
Kết tủa DNA bằng ethanol ở
4ºC trong 30 phút
Ly tâm 12.000 vòng trong
10 phút ở 4ºC để thu hồi
DNA
Hòa tan trở lại DNA trong
200 L đệm TE (pH 7,6)
Page 23
Mạc Văn Trọng
[email protected] or [email protected]
23
KẾT LUẬN
Phương pháp điện di giúp nhận biết, phân tích và tinh sạch DNA. Nhờ
phương pháp này mà người ta ứng dụng để phân tích giải trình tự DNA, ứng dụng
trong các nghiên cứu về DNA rất hiệu quả.
Có nhiều loại khuôn đỡ được áp dụng cho kỹ thuật này. Nhưng mỗi loại phân
tử khác nhau sẽ phù hợp đối với loại khuôn đỡ khác nhau. Điện di agarose gel là
phương pháp tối ưu nhất đối với DNA còn polyacrylamide gel điện di được cả
nucleic acid và protein. Nói chung mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược
điểm riêng, tùy vào từng trường hợp để tiến hành điện di theo cách nào là tốt nhất.