This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Lumineszcencia spektrometria – összefoglaló
Ismétlés:
fény (elektromágneses sugárzás) elnyelés: abszorpció
elektron gerjesztés: excitáció
alap és gerjesztett állapot
atomi energiaszintek, energiaszintek energia különbsége, foton energia, rezonancia feltétel
elektromos, vibrációs, rotációs energiaszintek és azok függetlensége → Jablonsky diagram
Fluoreszcencia élettartam ()A molekula gerjesztett állapotból fotonemisszióval kerül vissza alapállapotba. A fluoreszcencia-élettartam az az idő, amely alatt a gerjesztett állapotban levő molekulák száma az e-ed részére csökken.
kkf - a fluoreszcencia-átmenet valószínűségeic - internal conversion (belső konverzió)isc - intersystem crossing (rendszerek közti átmenet)nr - nonradiativ (sugárzás nélküli átmenet)
2012.02.11.
11
Fluoreszcencia kvantumhatásfok
Q = Nemit. / N abs. < 1
Q = kf / (kf + kic + kisc) = kf ·
Polarizált fény, abszorpciós vektor, elektromos vektor
Elektromos dipolmomentum
Elektromágneses hullám elektromos térerősség vektora, rezgési sík
2012.02.11.
12
Síkban ill. lineárisan polarizált fény
Az animáció egyfüggőleges síkban polarizált
hullámot mutat be.
A metszősíkot szemből nézveaz alábbi kép tárul elénk:
Ha az elektromos térerősség vektora
http://esr.elte.hu/~noemi/labor/cd/demo0.html
Ha az elektromos térerősség vektoraa tér valamely, a fénysugárvonalában lévő, rögzített pontjábanegy egyenes mentén rezeg, akkorsíkban vagy lineárisan polarizálthullámról beszélünk.
Az alábbi animáció egy vízszintes síkban polarizált hullámot mutat be.
A metszősíkot szemből nézve
http://esr.elte.hu/~noemi/labor/cd/demo0.html
2012.02.11.
13
Elektromos és abszorbciós vektorok
Abszorbciós vektor
forgáskúp !!!
meghatározza az abszorbcióvalószínűségét
Elektromos térerősség vektor
Abszorpció maximális, ha az abszorpciós vektor és a fény p yelektromos térerősség vektora párhuzamos.
Abszorpció képessége függ cos2θ-tól (θ az absz. vektor és a fény elektromos térerősség vektora közötti szög).
A kúpon belüli abszorpciós vektor esetén a fluorofor gerjesztésének valőszínűségenagyobb, mint 50%. (függőleges polariáció esetén)
polarizálatlan fény
FotoszelekcióVéletlenszerű, izotróp eloszlás
vertikálisan polarizált fényfluoroforok
random
Anizotróp eloszlás
„fotoszelekció” =rendezett orientációjú
szubpopuláció szelektálódik
randomorientációjú populációja
izotróp: irányfüggetlenMinden irányban azonos.
2012.02.11.
14
Fluorofórok
Ismétlés: Fehérjék abszorpciója - aminosavak
A három fontos aminosav,amelyek UV ban abszorbeálnakamelyek UV-ban abszorbeálnak,azaz gerjeszthetők.
exti
nkc
ió
hullámhossz
2012.02.11.
15
Fluorofórokfluoreszcenciára alkalmas kémiai anyagok
1. Intrinsic, natív (belső) fluorofórok
Fehérjékben: aromás aminosavakElőny: Nem kell módosítani a vizsgált biológiai rendszertElőny: Nem kell módosítani a vizsgált biológiai rendszert.
Élő sejtek saját fluoreszcenciája
Aequorea victoriaGFP (green fluorescent protein)
szalagdiagrammja
2012.02.11.
16
Kémiai módosításokkal egy alapvegyület abszorpciója és emissziója hangolható!
2. Extrinsic (külső) fluorofórok - fluoreszcens festékekA jelölő kémiai anyagok minősége és elhelyezkedése tervezhető.
A fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez köthetjük. (pl.: cisztein, glutamin, lizin)
A fehérje aktivitását tesztelni kell.
IAEDANS PIRÉNIAF
példák:
IAEDANS-IAF: FRET donor-akceptor pár
Pirén: aktin polimerizáció
fluoreszcein, dansyl, rhodamine száramzékok...
Aktin monomer szalagdiagramja
2012.02.11.
17
Kémiai háttér
Könnyű gerjeszteni az elektronokat, ha
R
• Aromás gyűrűben, vagy
• Konjugált kettős kötésű rendszerben
találhatók.
Minél több kettős kötés van a molekulában, annál kisebb energia kell a gerjesztéshez! Hangolható, tervezhető!
Külső (extrinsic) fluorofór alkalmazásakor:fluorofór
A kromofór (fluorofór) lokális
makromolekula
A kromofór (fluorofór) lokális mozgása elkülöníthetőa molekula egészénekmozgásától.
Térszerkezeti változás a makromolekulában hat a kromofór mozgására is. Ez a változás mérhető.
2012.02.11.
18
Fluoreszcencia alkalmazási lehetőségeiJól detektálható jel (alacsony koncentrációjú minták esetén is).
A fluoreszcencia paraméterek érzékenyek a környezeti tényezők
megváltozására.
A molekuláris szintű vizsgálatok fontos eszköze
Szerkezeti és dinamikai információt ad a vizsgált rendszerről.
Biológiai rendszerek vizsgálata (nem károsítjuk a vizsgálandó rendszert).
Molekulák közötti és molekulán belüli kölcsönhatások tanulmányozása.
Molekula szerkezeti részleteinek, és az egyes csoportok elérhetőségének
feltérképezése (quenching).
További alkalmazások:
Szerkezeti tulajdonságok vizsgálataF hé j d á ió kö é• Fehérje denaturáció nyomonkövetése
• Protein-ligand kapcsolat vizsgálata• Szerkezet vizsgálata a környezeti paraméterek (pH, ionok) változásának függvényében
Dinamikus tulajdonságok vizsgálata• Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája• Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a membrán belsejében lévő viszkozitásról•Fehérjékhez kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a fehérjemátrix flexibilitásáról
2012.02.11.
19
Mikroszkópia – fluoreszcens jelöléssel
Aktin filamentum
Mikrotubulus
DNS
Hogyan mérjük a fluoreszcenciát?Egy fluoriméter működésének elméleti sémája