Élucidation du mécanisme d'action des immunoglobulines … · 2018-04-21 · Élucidation du mécanisme d’action des immunoglobulines intraveineuses menant à l’inhibition des
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Élucidation du mécanisme d’action des immunoglobulines intraveineuses menant à l’inhibition
des lymphocytes T cytotoxiques.
Mémoire
Dominique Chabot
Programme de maîtrise en biochimie Maître ès sciences (M. Sc.)
Les immunoglobulines intraveineuses (IgIV) sont une préparation thérapeutique
utilisée dans le traitement de certains désordres auto-immuns. L’utilisation accrue
des IgIV expose les patients ainsi que les fournisseurs à un risque de pénurie. Le
but de nos travaux était donc d’élucider les mécanismes d’action des IgIV menant
à une inhibition des fonctions des lymphocytes T CD8 suite à la présentation
croisée d’antigènes et ce, afin d’aider au développement d’un bio-équivalent qui
pourrait mimer les effets des IgIV. Nos résultats ont permis de mettre en évidence
qu’un traitement aux IgIV affecte l’expression de la sélectine CD62L chez les
lymphocytes T CD8 et stimule l’expression de l’enzyme Indoleamine 2,3-
dioxygenase (IDO) et du récepteur intracellulaire NLRP10 ( « nucleotide-binding
oligomerization domain receptor family pyrin domain containing 10 ») chez les
monocytes, améliorant ainsi notre compréhension des mécanismes produisant des
effets immunomodulateurs en plus d’identifier de nouvelles cibles pour le
développement de bio-équivalents aux IgIV.
v
Table des Matières
Résumé ................................................................................................................... iii Table des Matières ................................................................................................... v
Liste des tableaux ................................................................................................... ix
Liste des figures ...................................................................................................... xi Liste des abréviations ........................................................................................... xiii Avant-propos .......................................................................................................... xv
1.3.1 Les lymphocytes T cytotoxiques dans l’auto-immunité .......................... 16
1.3.2 Traitement de l’auto-immunité ............................................................... 17
1.3.3 Les immunoglobulines intraveineuses et l’auto-immunité ...................... 18
1.3.4 Mécanismes d’action des immunoglobulines intraveineuses dans l’auto-immunité ......................................................................................................... 18
2.3.3 Mesure de la prolifération des lymphocytes T OT-I ................................ 32
2.3.4 Évaluation d’un possible blocage des marqueurs de surface par les IgIV ........................................................................................................................ 33
2.4 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) .............................................. 33
3.1 Caractérisation des cellules dendritiques ..................................................... 39
3.1.1 Différenciation des cellules de moelle osseuse murines en cellules dendritiques .................................................................................................... 39
3.1.2 Activation des cellules dendritiques ....................................................... 42
3.2.3 Effet des IgIV sur l’expression du complexe majeur d’histocompatibilité I ........................................................................................................................ 44
3.2.4 Effet des IgIV sur l’expression de l’intégrine CD11c : réel ou blocage ? 48
3.3 Effet des IgIV sur la dégradation de l’antigène par les cellules dendritiques 49
3.4 Effet des IgIV sur les lymphocytes T OT-I .................................................... 54
3.4.2 Effet des IgIV sur l’expression de CD62L par des lymphocytes T CD8 humains .......................................................................................................... 59
3.5 Effet des IgIV sur le pouvoir tolérogène des monocytes .............................. 62
Tableau 2.1: Détails des anticorps (cibles extracellulaires) utilisés pour la cytométrie en flux. ................................................................................................. 29 Tableau 2.2: Détails des amorces utilisées pour les expériences de PCR en temps réel. ....................................................................................................................... 34 Tableau 2.3: Détails des cycles d’amplification effectués lors des expériences de PCR en temps réel. ............................................................................................... 35
xi
Liste des figures
Figure 1.1 Éléments cellulaires du sang ................................................................. 2 Figure 1.2 Effets immunosuppresseurs de l’enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase sur certaines cellules du système immunitaire. ....................................................... 7 Figure 1.3 Synapse immunologique ...................................................................... 10 Figure 1.4 Présentation antigénique ..................................................................... 13 Figure 1.5 Réponse lymphocytaire cytotoxique..................................................... 15 Figure 1.6 Inhibition de l’activation des lymphocytes T OT-I par les IgIV. ............ 21 Figure 3.1 : Stratégie de caractérisation des cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 au terme du protocole de différenciation en cellules dendritiques par cytométrie en flux. ................................................................................................. 40 Figure 3.2 : Pourcentage d’expression des marqueurs CD11c, CMH I et DEC-205 par les cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 au terme du protocole de différenciation. ....................................................................................................... 41 Figure 3.3 : Pourcentage d’expression des marqueurs CD11c, CMH I et DEC-205 par les cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 suite au protocole de différenciation et à une stimulation avec LPS........................................................ 43 Figure 3.4 : Diminution de l’expression du CMH I en surface des cellules dendritiques en présence d’IgIV: neutralisation des endotoxines présentes dans l’ovalbumine. ......................................................................................................... 46 Figure 3.5 : Comparaison de l’inhibition de l’activation des lymphocytes T OT-I par les IgIV avec une utilisation de l’ovalbumine non-exempte ou exempte d’endotoxines. ....................................................................................................... 47 Figure 3.6 : Blocage des sites de liaison de l’anti-CD11c par les IgIV. ................. 48 Figure 3.7 : Effet des IgIV à différents stades de la présentation croisée mesuré par l’activation des lymphocytes T OT-I. ............................................................... 52 Figure 3.8 : Effet des IgIV sur les différents stades de présentation croisée mesuré par inhibition de la prolifération. ............................................................................ 53 Figure 3.9 : Effet des IgIV sur l’expression de CD62L par des lymphocytes T OT-I non-activés. ........................................................................................................... 55 Figure 3.10 : Cinétique de l’effet des IgIV sur l’expression de CD62L par des lymphocytes T OT-I activés en présence ou en absence d’IgIV............................ 57 Figure 3.11 : Effet des IgIV sur l’expression relative de l’ARNm codant pour la sélectine CD62L au temps T= 24 h par des lymphocytes T OT-I activés. ............. 58 Figure 3.12 : Cinétique de l’expression de CD62L par les lymphocytes T CD8 humains provenant de PBMC incubés en présence ou en absence d’IgIV pendant 48 h. ...................................................................................................................... 60 Figure 3.13 : Effet des IgIV sur l’expression relative de l’ARNm codant pour la sélectine CD62L par des PBMC humains après 10 h et 24 h d’incubation. .......... 61 Figure 3.14 : Effet des IgIV sur l’expression de l’enzyme Indoleamine 2,3-dioxygenase par des monocytes purifiés à partir de PBMC. ................................. 63 Figure 3.15: Effet des IgIV sur l’activité enzymatique de l’enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase exprimé par des monocytes purifiés à partir de PBMC. ................... 64 Figure 3.16 : Effet des IgIV sur l’expression des cytokines TNF-α et TGF-β. ....... 65
xii
Figure 3.17 : Effet des IgIV sur l’expression des récepteurs NOD NLRP6 et NLRP10. ................................................................................................................ 67
xiii
Liste des abréviations
ADN: Acide désoxyribonucléique
ADNc: ADN complémentaire
AGE: Advanced glycation end-product
CPA: Allophycocyanin
ARN: Acide ribonucléique
ARNm: ARN messager
BSA : Albumine de sérum bovin
CMH I: CMH de classe I
CMH II: CMH de classe II
CMH: Complexe majeur d'histocompatibilité
CPA: Cellule présentatrice d'antigène
DC : Cellules dendritiques
ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
ENDO-: Ne contenant peu ou pas d'endotoxines (≤ 0,1 EU/ml)
DC des fonctions immunosuppressives telle que la génération de lymphocytes T
régulateurs et ce, sans être associé à une diminution du Trp disponible dans le
milieu [34].
Figure 1.2 Effets immunosuppresseurs de l’enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase sur certaines cellules du système immunitaire.
Indoleamine 2,3-dioxygenase est une enzyme hautement impliquée dans le pouvoir
tolérogène des cellules dendritiques à long terme. Bien que l’induction d’un manque de Trp soit le mécanisme menant à l’inhibition de la prolifération des lymphocytes T le plus détaillé, un mécanisme indépendant de l’activité enzymatique est également impliqué.
Figure modifiée à partir de Löb et al. [29].
1.1.6 La cellule dendritique et la présentation antigénique
cellulaire [39]. Les DC et les lymphocytes T subissent donc des transformations
mécaniques afin de potentialiser la stabilité de la synapse immunologique et
d’améliorer la présentation du complexe CMH-peptide (figure 1.3) [37]. Enfin, il
revient aux molécules d’adhésion telles que les intégrines et les sélectines
(protéines transmembranaires) de capter l’information concernant l’environnement
physique et chimique extracellulaire et de transmettre les renseignements recueillis
vers l’intérieur de la cellule [40]. Ce phénomène de communication est
extrêmement important dans l’établissement d’une liaison stable entre une cellule
et une autre cellule ou alors entre une cellule et son environnement [40]. Les
intégrines, comparativement aux sélectines, sont une grande famille de récepteurs
d’adhésion dont les fonctions (adhésion, communication extérieur-intérieur et
modulation du cytosquelette) sont plutôt bien comprises et détaillées à ce jour [41].
Par exemple le récepteur d’adhésion LFA-1, exprimé par les CPA, va lier son
ligand ICAM-1 exprimé par les lymphocytes T et cette liaison viendra stabiliser et
potentialiser les interactions lors de la synapse immunologique [42]. Le rôle exact
des sélectines est encore méconnu, mais elles participent également à l’adhésion
cellulaire en plus de jouer un rôle dans la régulation de l’activation des
lymphocytes et des granulocytes [43]. Dans le cadre du présent travail, seule la
présentation de peptides en association avec des CMH I à des lymphocytes T CD8
sera détaillée.
10
Figure 1.3 Synapse immunologique
La mise en place d’une interaction cellulaire prolongée et d’un dialogue entre les lymphocytes T et les cellules dendritiques lors de la présentation antigénique est cruciale
et est assurée par la formation de la synapse immunologique. Tirée de Huppa et al. [44]
1.2 La présentation par le complexe majeur d’histocompatibilité I
La présentation par le CMH I comprend deux voies principales qui se distinguent
par l’emplacement initial de l’antigène, c’est-à-dire à l’intérieur de la cellule
présentatrice ou alors dans l’environnement extracellulaire. Les complexes CMH I-
peptides sont reconnus par des lymphocytes T CD8. Les détails concernant
l’activation ainsi que les fonctions effectrices de ceux-ci seront décrits dans la
section 1.2.3.
11
1.2.1 Présentation d’antigènes intracellulaires
Les virus peuvent se répliquer directement dans le compartiment cytosolique d’une
cellule infectée. La cellule infectée présente alors des fragments antigéniques
provenant de l’hydrolyse des protéines pathogéniques présentes dans le cytosol. Il
en est de même pour les cellules tumorales [45]. Les protéines virales et tumorales
sont hydrolysées dans le cytosol par les protéasomes [46]. Ceux-ci peuvent être
décrits comme des complexes enzymatiques ayant pour rôle l’hydrolyse des
protéines dénaturées ou mal repliées par des protéases. Les polypeptides qui en
résultent sont ensuite transportés au RE par des transporteurs de peptides (TAP 1
et TAP 2) où ils sont transformés en peptides de huit à dix acides aminés par des
aminopeptidases (ERAP1 et IRAP) [46, 47]. Ces dernières permettent le clivage
terminal requis pour le chargement des peptides sur les molécules du CMH I. Les
peptides sont ensuite insérés dans des complexes CMH I par un complexe
d’apprêtement composé de tapasine, de calréticuline, de calnexine et de ERp57
[48, 49]. La tapasine est une protéine associée au complexe TAP qui forme un
pont entre le CMH I et celui-ci. Elle joue donc un rôle central dans la capacité des
peptides à être chargés sur les CMH I. La calréticuline et la calnexine sont des
protéines chaperonnes qui retiennent la molécule CMH I dans un état partiellement
replié dans le RE en attente d’un peptide à être chargé. Enfin, ERp57 joue un rôle
dans la révision et le contrôle du peptide à charger. Les vésicules contenant le
complexe CMH I et le peptide sont ensuite acheminés vers la membrane
plasmique où elles fusionnent et exposent leur contenu à la surface de la cellule.
Le lymphocyte T CD8 spécifique à cette combinaison reconnaîtra le complexe
CMH I-peptide et s’activera que si celui-ci est présenté par une CPA
professionnelle en raison de la présence obligatoire de signaux de co-stimulation
[25, 50]. Si la cellule infectée est une CPA professionnelle, l’activation du
lymphocyte T CD8 se fera via cette voie. Par contre, advenant le cas où la cellule
infectée ne possède pas les molécules de costimulation requises pour activer un
lymphocyte T naïf, une seconde voie de présentation par le CMH I doit être
utilisée.
12
1.2.2 Présentation d’antigènes extracellulaires
De récentes études ont démontré que des peptides provenant du milieu
extracellulaire pouvaient être présentés par une voie impliquant des CMH I,
processus maintenant nommé présentation croisée (figure 1.4) [50] [46]. Les DC
sont les seules CPA capables de ce type de présentation [51]. Autrefois inconnue,
la présentation croisée est maintenant reconnue comme un mécanisme majeur par
lequel l’organisme contrôle la présence d’éventuels intrus pathogènes [50]. Les
antigènes internalisés pour la présentation croisée subissent quelques
transformations et peuvent ensuite emprunter la voie classique (décrite à la section
1.3.1) ou une autre voie dite vacuolaire. Cette dernière voie ne nécessite pas la
collaboration du complexe TAP et est donc également nommée TAP-indépendante
pour cette raison [52]. Elle est méconnue comparativement à la voie classique,
mais de récentes études ont démontré que cette voie n’est pas inhibée par des
inhibiteurs de protéasome [52], contrairement à la voie classique, indiquant qu’il
s’agit bel et bien de deux avenues distinctes. Cette voie de présentation implique
que les antigènes sont internalisés par phagocytose ou par le biais d’une
membrane altérée. Ils sont ensuite hydrolysés en oligopeptides au sein de
compartiments d’endocytose et non directement dans le cytosol. Les protéases
endosomales impliquées dans ce processus sont méconnues à ce jour mais les
cathepsines, et plus spécifiquement la cathepsine S, joueraient un rôle
fondamental [53]. Les peptides sont ensuite chargés dans des molécules CMH I
directement dans les endosomes et exposés à la surface de la CD qui devient
alors apte à jouer son rôle de présentation antigénique. Le récepteur d’endocytose
DEC-205 est reconnu pour diriger efficacement ses ligands vers les sentiers de la
présentation antigénique croisée [54]. Ce récepteur appartient à la famille des
lectines (protéines qui se lient spécifiquement et de façon réversible à certains
glucides) et possède dix domaines de liaison spécifiques et réversibles aux
glucides. Une étude récente a permis de démontrer que les capacités des DC à
effectuer la présentation croisée d’antigènes étaient augmentées de 100 fois si une
13
petite quantité de polypeptides (provenant d’un antigène) était couplée à un anti-
DEC-205 [54].
Figure 1.4 Présentation antigénique
Alors que la présentation par le CMH II se produit seulement suite à la capture d’un antigène extracellulaire, la présentation par le CMH I comprend deux voies distinctes qui se distinguent par l’emplacement initial de l’antigène, c’est-à-dire à l’intérieur de la cellule
présentatrice ou alors dans l’environnement extracellulaire. Tirée de Burgdorf et al. [46].
1.2.3 La réponse lymphocytaire cytotoxique (CD8)
L’activation des lymphocytes T CD8 par les CPA mène ceux-ci à acquérir des
propriétés cytotoxiques. Les lymphocytes T CD8, une fois activés, peuvent prendre
deux chemins distincts : soit ils deviennent des lymphocytes T CD8 à mémoire qui
survivront même lorsque l‘infection sera résorbée ou alors ils se différencient en
14
lymphocytes T CD8 cytotoxiques effecteurs (Tc) à courte vie [55]. Ces derniers
vont acquérir des capacités cytotoxiques, caractérisée par l’’expression du
marqueur CD107a (LAMP-1) [56], et vont proliférer pour former une armée de
clones qui détruira ensuite les cellules infectées ou cancéreuses via la sécrétion de
vésicules contenant toujours au moins deux effecteurs cytotoxiques, soit la
perforine et les granzymes [57]. La perforine, une protéine capable de créer des
pores transmembranaires dans la cellule cible, est larguée afin de créer un chemin
pour l’entrée des secondes protéines, les granzymes (A et B). Il existe cependant
un mécanisme qui n’est pas encore clairement expliqué à ce jour et qui permet aux
granzymes de pénétrer les cellules cibles sans l’aide de la perforine [58]. Une fois
à l’intérieur de la cellule cible, la granzyme B entraine une cascade de signalisation
impliquant les caspases qui aboutit à la mort cellulaire programmée (apoptose) de
la cellule infectée [59]. Le rôle de la granzyme A est moins bien détaillé, mais son
action est indépendante de la granzyme B et l’induction de l’apoptose des cellules
cibles par celle-ci passe par une voie de signalisation qui n’implique pas les
caspases [60]. D’autres mécanismes peuvent également être employés par les Tc
pour détruire leurs cibles. Parmi ceux-ci, la liaison du ligand Fas (FasL) exprimé
sur les Tc activés au récepteur Fas sur la cellule cible semble être un mécanisme
considérablement important dans la mesure où il en résulte une activation de
caspases à l’intérieur de la cellule visée qui mène finalement à l’apoptose (figure
1.5) [61]. Enfin, les Tc libèrent également des cytokines pro-inflammatoires telles
que l’IFNγ et le TNFα. Une question fondamentale demeure; comment des
granules cytotoxiques, qui n’ont aucune spécificité contre l’antigène cible et qui
sont larguées dans l’environnement extracellulaire, parviennent à détruire les
cellules infectées seulement ? Une partie de la réponse pourrait provenir de la
capacité des Tc à modifier leur cytosquelette de façon à contrôler leurs contacts
avec les cellules cibles [44] (voir section 1.1.4). En effet, des travaux suggèrent
que les Tc pourraient, par un modelage de leur cytosquelette, contrôler où seront
larguées les granules, mais contrôleraient également la distance et la durée du
contact [62]. D’autres effecteurs sont également impliqués dans la régulation de la
cytotoxicité des Tc.
15
Figure 1.5 Réponse lymphocytaire cytotoxique
Induction de l’apoptose chez une celle cible par un lymphocyte T cytotoxique via la
sécrétion de perforine et des granzymes et via la liaison FasL-Fas. Tirée de Thomas et al. [61]
1.2.4 CD62L et la régulation de la cytotoxicité
La sélectine CD62L est présente de façon constitutive sur les lymphocytes T naïfs.
Suivant l’activation des lymphocytes T via le TCR, la cinétique d’expression de
CD62L suit un modèle « triphasique » [63, 64]. Dans la phase précoce, entre 2 h et
4 h après l’activation, il est possible d’observer un clivage rapide de la sélectine.
Dans la phase intermédiaire, environ 24 h suivant l’activation, une resynthèse de
celle-ci est observée. Enfin, dans la phase tardive, soit après 48 h, il est possible
d’observer une seconde diminution de l’expression de CD62L, mais de façon
moins importante que dans la phase précoce. La sélectine CD62L a récemment
été associée à la régulation des capacités lytiques des Tc [65]. En effet, des
chercheurs ont mis en évidence un lien de dépendance entre le clivage de CD62L
et l’acquisition des capacités lytiques des Tc [65]. Dans le même ordre d’idées,
d’autres chercheurs ont effectué une étude à l’aide de souris mutantes résistantes
16
au clivage de la sélectine pour répondre aux questions suivantes : est-ce que le
clivage de CD62L est nécessaire pour que les Tc puissent migrer vers les tissus
infectés; est-il nécessaire de cliver la sélectine L sur les Tc à mémoire pour qu’ils
puissent se rendre dans les organes non-lymphoïdes et est-ce que l’expression de
CD62L régule la fonction antivirale des Tc [66]. Les auteurs ont démontré que,
contrairement à ce qu’ils pensaient observer, une résistance au clivage de CD62L
chez les souris mutantes n’affectait pas significativement la distribution des Tc
activés, mais diminuaient fortement l’efficacité de l’immunité antivirale [66]. Via un
mécanisme toujours inconnu, la sélectine CD62L semble jouer un rôle clé dans la
régulation de l’activité lytique des Tc.
1.3 L’auto-immunité
Il importe que les réponses immunitaires soient hautement régulées afin de ne pas
détruire des éléments du soi, de tolérer des éléments externes qui ne constituent
pas un réel danger (nourriture) et de mettre fin à la réponse immune adverse
lorsque l’infection est résorbée. Ces capacités sont introduites par le mécanisme
d’induction de la tolérance centrale [23] et sont ensuite maintenues par l’induction
de tolérance périphérique. Comme mentionné précédemment, l’induction de la
tolérance centrale se fait lors du développement des lymphocytes T dans le
thymus via les sélections positives et négatives. Lorsque des lymphocytes T
échappent à cette sélection, ils peuvent être détruits ultérieurement par des
mécanismes qui impliquent les CPA tolérogènes [34] et les lymphocytes T
régulateurs [67]. Une maladie auto-immune survient quand les mécanismes de
tolérance au soi deviennent défaillants, permettant alors aux lymphocytes auto-
réactifs de détruire des constituants du soi. Malheureusement, l’origine de cette
défaillance est souvent extrêmement difficile à identifier et multifactorielle.
1.3.1 Les lymphocytes T cytotoxiques dans l’auto-immunité
17
Les maladies auto-immunes causent des lésions qui se développent à partir d’un
seul ou de plusieurs des mécanismes pathologiques. Les Tc autoréactifs induisent
des dommages cellulaires considérables en appliquant chacun des mécanismes
cytotoxiques qu’ils possèdent contre les cellules exprimant des constituants du soi,
soit la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires, la libération de granules
cytotoxiques et l’induction de l’apoptose. La contribution des Tc dans le
développement et le maintien de certaines maladies auto-immunes est maintenant
reconnue, notamment dans certains désordres neurologiques [68] et dans le lupus
[69]. Une composante CD8 a également été associée à d’autres désordres auto-
immuns comme la sclérose multiple [70] et le diabète [71] .
1.3.2 Traitement de l’auto-immunité
Il existe à ce jour quelques traitements possibles qui soulagent les symptômes de
l’auto-immunité et ralentissent ou freinent totalement la progression de la maladie.
Parmi ceux-ci, les glucocorticostéroïdes sont les plus couramment utilisés en
raison de leur efficacité et de leur prix. Ceux-ci lient différents facteurs de
transcription tel le NF-κB dont la principale fonction est la régulation de l’activation
des cellules phagocytaires [72]. La prise de cette médication peut par contre
engendrer des problèmes de santé telle l’obésité [73]. Des anticorps monoclonaux
peuvent également être utilisés. Des anticorps dirigés contre le TNF-α permettent
le traitement de l’arthrite rhumatoïde [74]et des anticorps anti-CD20
(commercialisés sous le nom de Rituximab) lient la molécule de surface CD20
exprimée par les lymphocytes B et permet de diminuer de façon substantielle le
nombre de ces cellules par un effet toxique direct sur celles-ci [75]. Certaines
thérapies anti-inflammatoires alternatives sont parfois prescrites lorsque les
traitements décrits plus hauts s’avèrent non efficaces.
18
1.3.3 Les immunoglobulines intraveineuses et l’auto-immunité
Les IgIV sont utilisées depuis plusieurs années en tant que traitement pour un très
large spectre de maladies auto-immunes et inflammatoires [76]. Ce sont des
préparations thérapeutiques d’immunoglobulines G (IgG) humaines obtenues à
partir du fractionnement d’un ensemble de plasmas sanguins provenant de
plusieurs milliers de donneurs en santé. Les IgG sont séparées du reste du plasma
par une précipitation des protéines plasmatiques à l’éthanol froid où le pH, la force
ionique, la température et la concentration de protéines sont minutieusement
contrôlés. Les fractions de plasma sont séparées de façon séquentielle et, à
chaque étape, le culot et/ou le surnageant est utilisé pour l’étape suivante. À la fin
du processus, on récolte presque exclusivement des IgG intactes et pures (98%),
bien que des traces d’IgA et d’IgM puissent s’y retrouver [77]. Les IgG sont des
glycoprotéines dotées d’une fonction anticorps. Sécrétées par les Lymphocytes B,
elles sont formées de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères (κ ou λ) et
représentent 75% des anticorps sériques du plasma. La principale fonction des
IgG est de reconnaître et de se lier spécifiquement à un antigène. Les IgG peuvent
également bloquer des sites spécifiques sur les exotoxines bactériennes et les
virus, les empêchant ainsi d’endommager les cellules de l’organisme. Les IgIV ont
donc d’abord été utilisées comme substitut de défense immunitaire chez des
patients souffrant d’immunodéficience [78]. Cependant, plusieurs études ont
permis d’étendre les applications thérapeutiques des IgIV jusqu’aux maladies auto-
immunes. Depuis maintenant près de trente ans, les IgIV sont utilisées dans le
traitement de la thrombocytopénie immune (PTI), dans la maladie de Kawasaki et
dans le traitement non approuvé de nombreux autres désordres auto-immuns [79].
1.3.4 Mécanismes d’action des immunoglobulines intraveineuses dans l’auto-
immunité
19
Bien que les IgIV soient connues depuis quelques décennies pour leurs propriétés
anti-inflammatoires, leurs mécanismes d’action ne sont toujours pas clairement
définis. Dans le passé, plusieurs hypothèses ont été émises quant à l’origine des
effets thérapeutiques des IgIV dans les maladies auto-immunes. Les mécanismes
d’action ont été investigués de façon importante dans le contexte de la PTI. La PTI,
qui se caractérise par une destruction auto-immune massive des plaquettes, a été
soignée pour la première fois par un traitement aux IgIV en 1981 [80]. Certains
chercheurs ont proposé que le pouvoir immunosuppresseur des IgIV dans la PTI
pourrait provenir d’un blocage de l’activité phagocytaire des plaquettes par les
macrophages [81]. Selon eux, les IgG contenues dans les préparations pourraient
reconnaître et lier des antigènes de surface chez les globules rouges et ainsi
bloquer l’accessibilité aux auto-anticorps pour les récepteurs FcγR impliqués dans
la phagocytose des plaquettes [81]. Découlant de ces travaux, une thérapie
utilisant un anticorps monoclonal anti-D dans le traitement de la PTI a fait l’objet
d’une étude qui a eu bien peu de succès [82], suggérant que d’autres mécanismes
d’action soient impliqués dans les bienfaits des IgIV dans cette maladie. D’autres
études ont mis en évidence un effet bénéfique des IgIV sur la PTI via un blocage
direct des récepteurs FcγR [83, 84]. L’application de ces découvertes dans le
cadre d’un traitement de la PTI a encore une fois eu un succès mitigé. Il a
également été suggéré que les IgIV réduisaient la présence d’auto-anticorps
antiplaquettaires en neutralisant ceux-ci par la formation de complexes idiotypes
anti-idiotypes [85]. Des recherches plus approfondies seront sans doute
nécessaire pour déterminer avec certitude quels sont les mécanismes d’action des
IgIV dans le traitement de la PTI. Dans un autre ordre d’idée, des études ont
également mis en évidence que les IgIV avaient un pouvoir inhibiteur in vivo et in
vitro sur l’expression de certaines cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α
[86], l’IL-2 [87, 88] et l’IFN-γ [88]. À l’opposé, il a été montré que les IgIV entrainent
une augmentation de la synthèse de l’IL-8 et de l’IL-1RA par les monocytes in vitro
[89]. Il est également rapporté que les IgIV entrainent une inhibition de l’expansion
des lymphocytes B [90] et des effets sur la prolifération et l’apoptose des
lymphocytes T [91-93]. Enfin, certaines études ont plutôt montré des effets des
20
IgIV en agissant sur la maturation ainsi que les fonctions des DC. Allant dans ce
sens, Bayry et al. ont montré que les IgIV avaient un pouvoir inhibiteur sur
l’expression des molécules de costimulation CD80, CD86 et CD40 et sur
l’expression de l’intégrine CD11c et du CMH II dans un modèle in vitro d’activation
des DC [94]. Ces mêmes auteurs ont également montré que les IgIV pouvaient
bloquer la maturation des DC et inhiber la sécrétion d’IL-12 par les DC lorsque
celles-ci étaient prétraitées aux IgIV [94].
1.4 Résultats antérieurs
Les travaux de l’équipe du Dre Renée Bazin ont permis de mettre en évidence un
nouveau mécanisme d’action des IgIV menant à l’inhibition des lymphocytes T
CD4 en agissant directement sur les CPA. Il a été démontré que l’inhibition de la
réponse CD4, observable dans des modèles in vivo et in vitro, est due à l’inhibition
de l’internalisation de l’antigène par un blocage des récepteurs Fc (fragment
cristallisable) à la surface des CPA [95] et à une compétition intracellulaire des IgIV
avec l’antigène pour la formation de complexes CMH II-peptides [96]. Dans cette
même voie, les travaux de Padet et al. ont permis de montrer que les IgIV
diminuaient l’expression du CMH II et de certaines molécules de cotimulation
(CD80, CD86 et ICOSL) en plus d’entrainer une augmentation de la molécule
inhibitrice PD-L1 sur des monocytes dans un contexte de réaction lymphocytaire
mixte [97, 98]. D’autres travaux effectués par l’équipe ont permis de démontrer un
effet inhibiteur des IgIV sur l’activation des lymphocytes T CD8 par les CPA [99].
Une diminution du pouvoir cytotoxique des lymphocytes T CD8 à la suite d’un
traitement aux IgIV a également été mise en évidence par la suite [100]. La figure
1.6, sélectionnée dans l’article de Trépanier et al. (2012) [99], montre l’effet
inhibiteur des IgIV sur l’activation des lymphocytes T cytotoxiques. En effet, suite à
un essai de présentation antigénique impliquant des DC et des lymphocytes T OT-
I, le marqueur d’activation précoce CD69 est absent sur les lymphocytes T non-
activés, présent sur 29% des lymphocytes T activés et quasi absent (1.8%) sur les
21
lymphocytes T activés en présence d’IgIV (10 mg/ml). La recherche du ou des
mécanisme(s) d’action responsable(s) de l’effet observé a été le point de départ de
mes travaux de maîtrise.
Figure 1.6 Inhibition de l’activation des lymphocytes T OT-I par les IgIV. L’expression du marqueur CD69 a été mesurée à la surface des Lymphocytes T OT-I CD8b+ par
cytométrie en flux suite à une incubation de 72 h avec des DC dans un ratio 1 :1 avec ou sans
ovalbumine (1 mg/ml) et ce, en présence ou en absence d’IgIV. La figure A représente la condition
sans ovalbumine, la figure B représente la condition avec ovalbumine et la figure C représente la
condition avec ovalbumine et IgIV. Figure tirée de Trépanier et Bazin, [99].
1.5 Problématique, hypothèse et objectifs
Alors que les mécanismes d’action des IgIV dans le traitement des maladies auto-
immunes n’ont pas encore été complètement élucidés, le nombre de maladies
traitées par celles-ci augmente annuellement et les doses thérapeutiques utilisées
sont souvent très élevées. Cependant, la quantité de dons de plasma desquels on
extrait les IgG ne connaît pas une croissance annuelle aussi élevée. Le
développement d’un substitut aux IgIV est donc très souhaitable et deviendrait
même essentiel dans le cas d’une éventuelle pénurie. Dans cette optique, l’équipe
du Dre Bazin tente donc de découvrir quels sont les mécanismes d’action de cette
22
avenue thérapeutique afin d’aider au développement d’un bio-équivalent. Dans un
monde idéal, celui-ci pourrait mimer l’action des IgIV et sa fabrication serait
indépendante des dons de plasma. Par ailleurs, toute avancée scientifique qui
permet de potentialiser le rendement thérapeutique des IgIV est bénéfique. Nous
avons émis l’hypothèse que les IgIV agissaient sur la réponse des lymphocytes T
CD8 en produisant un effet immunomodulateur sur les CPA, diminuant ainsi leur
capacité à activer les lymphocytes T CD8 et à générer des Tc. Pour étudier cette
hypothèse, nous avons défini les objectifs ci-dessous, lesquels ont été divisés en
deux volets distincts, chacun comportant des expériences réalisées à la fois avec
des cellules d’origine murine et humaine. Le premier volet comprend les objectifs
en lien avec un effet direct des IgIV sur les CPA (DC murines et monocytes
humains).
1. Évaluer l’effet des IgIV sur la maturation des cellules dendritiques.
2. Déterminer l’effet des IgIV sur l’internalisation des antigènes par les cellules
dendritiques.
3. Évaluer l’effet des IgIV sur la dégradation de l’antigène par les cellules
dendritiques.
4. Évaluer l’effet des IgIV sur l’expression de l’enzyme indoleamine 2,3-
dioxygenase par des monocytes.
5. Évaluer l’effet des IgIV sur l’expression de certains récepteurs NOD (NLRP6
et NLRP10) à la surface des monocytes.
Par contre, nous avons également abordé un second volet qui comprend un
objectif en lien avec un effet potentiel des IgIV sur les lymphocytes T CD8 qui
pourrait influencer la formation de la synapse immunologique et la réponse
cytotoxique.
6. Évaluer l’effet des IgIV sur la sélectine CD62L.
23
2. Matériel et Méthodes
Les sections concernant l’isolement et la culture des différentes cellules du
système immunitaire sont chacune divisée en deux parties, soit un volet
concernant la culture des cellules murines et un autre concernant la culture des
cellules humaines. Les détails concernant les anticorps et les protocoles utilisés
pour la cytométrie en flux sont détaillés dans la section 2.2.
2.1 Isolement des cellules
2.1.1 Cellules murines
2.1.1.1 Isolement des cellules de la moelle osseuse de souris C57BL/6
Afin d’extraire les cellules de la moelle osseuse de souris C57BL/6 (Charles River,
Montréal, Canada), les fémurs de 12 souris ont été récupérés et coupés aux
extrémités. Une fine aiguille a ensuite été fixée au bout d’une seringue contenant
du milieu RPMI-1640 supplémenté de 10% de sérum bovin fétal (FBS) (Invitrogen
Canada Inc., Burlington, Canada), 100 unités/ml de pénicilline et de streptomycine
(Sigma-Aldrich, Canada Ltd, Toronto, Canada). Le contenu de la seringue a été
injecté dans la lumière du fémur afin d’en extraire la moelle osseuse qui a été
recueilli dans le mélange décrit précédemment. La suspension obtenue a ensuite
été transférée dans un falcon 15 ml et une solution saline tamponnée au
phosphate (PBS) (Invitrogen Canada Inc.) contenant 2% de FBS et de l’EDTA
(1mM) a été ajoutée pour compléter le volume jusqu’à 14 ml. La suspension
cellulaire a été lavée (1000g, 6 minutes) et le culot récolté a été remis en
suspension dans 5 ml de tampon de lyse NKC (10 mM NAHCO3, 187 mM NH4Cl et
0.1 mM EDTA) afin de lyser les globules rouges présents dans le mélange. Les
cellules ont été lavées et remises en suspension dans 5 ml de PBS 2% FBS et
2.3.1.2 Préparation des cellules pour les analyses en cytométrie
Suite à l’incubation, les cellules destinées à être analysées par cytométrie (environ
100 000 cellules par tube) ont été lavées trois fois dans du PBS 1% FBS (1000g, 5
minutes) et incubées pendant 10 minutes à 4°C en présence de 2% d’anticorps
monoclonal 2.4 G2 afin de bloquer les récepteurs Fc murins. Les cellules ont
ensuite été lavées à nouveau et incubées avec des anticorps déjà couplés à des
fluorochromes pendant 30 minutes à 4°C à la noirceur selon les recommandations
des manufacturiers. Les cellules ont été lavées et remises en suspension dans du
PBS 1% FBS contenant du Sytox Blue (1/2000) et analysées immédiatement au
cytomètre.
2.3.1.3 Stratégies d’analyse
Le cytomètre a d’abord été ajusté en utilisant des cellules non-colorées ou
colorées avec un seul anticorps et positives pour cet anticorps afin de déterminer
les gains à utiliser pour l’analyse des échantillons. Avant de débuter les
acquisitions, afin d’éliminer la plupart des débris cellulaires, une première région a
été établie en fonction de la taille et de la granularité en utilisant un tube qui
contenait des cellules non-colorées seulement. L’appareil a été ajusté afin qu’il
fasse l’acquisition d’environ 30 000 évènements par tube dans cette région. Le
31
logiciel d’analyse a été utilisé pour établir une seconde région ne contenant que les
cellules non-colorées par le marqueur de viabilité. Pour l’analyse des cibles
extracellulaires, l’emplacement des quadrants délimitant les cellules positives et
les cellules négatives pour chaque marqueur a été établi selon deux stratégies
différentes. Lorsqu’un seul anticorps était utilisé, des cellules non-colorées ont été
utilisées pour établir les limites. Lorsque deux anticorps étaient utilisés, des
cellules contenant l’anticorps non-analysé seulement ont été utilisées pour établir
les limites. Ces contrôles ont permis d’éliminer des biais qui peuvent survenir en
raison de l’auto-fluorescence des cellules ou par l’émission non-spécifique de
fluorescence dans un canal du fluorochrome voisin. Sur le logiciel FCS Express 4,
les analyses ont été effectuées sur des populations variant entre 5000 et 30 000
évènements.
2.3.2 Cibles intracellulaires
2.3.2.1 Anticorps
Trois anticorps intracellulaires ont été utilisés. Ceux-ci ont tous été générés chez le
lapin et étaient non-couplés à des fluorochromes. L’anticorps anti-IDO a été acheté
chez Cell Signaling Technology (Danvers, MA) et les anticorps anti-NLRP6 et anti-
NLRP10 ont été acheté chez Sigma. L’anticorps de détection utilisé a été généré
chez la chèvre, était dirigé contre les IgG du lapin et était couplé à l’Alexa Fluor
488 (Life Technologies).
2.3.2.2 Préparation des cellules pour les analyses en cytométrie
Les cellules destinées à être analysées en cytométrie (environ 300 000 cellules par
tube) ont été lavées trois fois dans du PBS 1% FBS (1000g, 5 minutes) et
incubées pendant 10 minutes à 4°C en présence de 2% d’un agent bloquant les
récepteurs Fc humains (FcR Bock, Miltenyi Biotec). Les cellules ont ensuite été
32
lavées et incubées 30 minutes à 4°C dans du PBS 0,05% saponine (Sigma)
contenant un seul anticorps par tube parmi les trois énumérés. Les cellules ont
ensuite été lavées et incubées à nouveau 30 minutes à 4°C dans du PBS 0,05%
saponine avec l’anticorps de détection. Toutes les cellules ont subi un dernier
lavage et ont été remises en suspension dans du PBS et analysées par cytométrie
en flux.
2.3.2.3 Stratégies d’analyse
Comme mentionné précédemment, le cytomètre a d’abord été ajusté avant de
débuter les acquisitions. Afin d’éliminer la plupart des débris cellulaires, une
première région a été établie en fonction de la taille et de la granularité en utilisant
un tube qui contenait des cellules non-colorées seulement. L’appareil a été ajusté
afin qu’il fasse l’acquisition d’environ 30 000 évènements par tube dans cette
région. Afin d’établir les limites des quadrants séparant les cellules positives des
cellules négatives lors de l’analyse avec le logiciel FCS Express 4 et afin de vérifier
que les anticorps conjugués à l’Alexa 488 ne donnaient pas une réactivité non-
spécifique, des cellules marquées avec l’anticorps de détection seulement ont été
utilisées. Sur le logiciel FCS Express 4, les analyses ont été effectuées sur des
populations variant entre 10 000 et 30 000 évènements.
2.3.3 Mesure de la prolifération des lymphocytes T OT-I
Les lymphocytes T OT-I ont été marqués au début de certains essais à l’aide du
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Labelling (eBioscience) afin de mesurer la
prolifération de ceux-ci. Les lymphocytes T OT-I ont été lavés deux fois dans du
PBS et ont ensuite été remis en suspension dans du PBS à une concentration
finale deux fois plus élevée que celle utilisée dans les essais. Le marqueur de
prolifération a ensuite été dilué à une concentration de 20 µM dans du PBS et le
mélange a été ajouté aux cellules T (ratio 1:1) et incubé pendant 10 minutes à
37°C à la noirceur. La réaction a été arrêtée en transférant le tube sur glace
33
pendant 5 minutes et, suite à deux lavage dans du PBS (1000g et 5 minutes) les
cellules ont été utilisées dans les essais selon le protocole décrit à la section
2.2.1.3. La fluorescence émise par le marqueur de prolifération était maximale au
début de l’expérience et a été mesurée par cytométrie en flux.
2.3.4 Évaluation d’un possible blocage des marqueurs de surface par les IgIV
Lorsque nécessaire, la possibilité d’un blocage des sites de liaison des anticorps
utilisés par les IgIV a été vérifiée. Les cellules ont été incubées pendant 30
minutes sur glace avec ou sans IgIV (15 mg/ml) et l’expression des marqueurs de
surface a ensuite été analysée en cytométrie en flux.
2.4 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
2.4.1 Transcriptase inverse
Au terme des cultures, certaines cellules ont été sélectionnées pour l’analyse
quantitative de l’ARN messager (ARNm) de deux protéines, soit la L-sélectine par
les lymphocytes T CD8 et le récepteur DEC-205 par les DC murines. Une trousse
complète de mirVana (miRNA isolation kit, Life Technologies) a été utilisée pour
l’extraction des ARN totaux. Les cellules ont d’abord été remises en suspension
dans du Lysis Binding Buffer (Life Technologies), agitées vigoureusement au
vortex et l’ARN a été isolée par une extraction phénol-chloroforme en conditions
acides. Les ARNm totaux ont ensuite été dosées par spectrophométrie (NanoDrop
ND-1000, Thermo Scientific,) et 250 ng d’ARN total par échantillon ont été
linéarisés par un chauffage à 65°C pendant 10 minutes et ont ensuite été incubés
à 37°C pendant 60 minutes avec le mélange de réactifs suivant : 0.5 mM dNTP
(Amersham, GE Healthcare, Baie d’Urfe, Canada), des amorces universelles
(oligosDT, 0.25 µg/ml) (Amersham), 200U RT-MMLV (Invitrogen) et du tampon 1X
(Invitrogen) afin de convertir les ARNm en ADN complémentaire (ADNc).
34
2.4.2 PCR en temps réel
L’ADNc a été ajouté à un mélange réactionnel comprenant du SybrGreen 1X
(Qiagen Inc.,Mississauga, Canada), des amorces sens et anti-sens (20 µM) et de
l’eau sans nucléase (Sigma) pour compléter à un volume final de 25 µL par tube.
Le gène de contrôle utilisé était la GAPDH. Les niveaux d’expression ont été
calculées à l’aide de la méthode comparative ΔΔCt [103]. Les amorces utilisées et
leur orientation (sens (S) ou anti-sens (AS)) sont détaillées dans le tableau 2.1.
Les amorces utilisées pour cibler les amplicons codant pour la GAPDH humain et
murin ont été commandées de façon manuelle chez IDT à partir de séquences
trouvées dans la littérature. Les amorces utilisées pour cibler les amplicons codant
pour CD62L humain et murin ont été commandées respectivement chez Fisher et
IDT. Dans les deux cas, les séquences des amorces étaient fournies par les
fabricants.
Tableau 2.2: Détails des amorces utilisées pour les expériences de PCR en temps réel.
Cible Sens Séquence 5’ --- 3’
Taille amplicon
(pb)
Fabricant
CD62L S - - Fisher (humain) AS - - Fisher GAPDH S TGGTGAAGACGCCAGTGGA 138 IDT
(humain)[104] AS GCACCGTCAAGGCTGAGAAC 138 IDT CD62L S CCATCCTTTCTTGAGATTTCTTGC - IDT (murin) AS CTTCATTCCTGTAGCCGTCAT - IDT GAPDH S TGTCTCCTGCGACTTCAACAGC 300 IDT
(murin)[105] AS TGTAGGCCATGAGGTCCACCAC 300 IDT
L’expression de CD62L et de la GAPDH a été quantifiée avec un thermocycleur
Stratagene 3005p (Agilent technologies, Mississauga, Canada). Les détails des
cycles utilisés sont décrits dans le tableau 2.2.
35
Tableau 2.3: Détails des cycles d’amplification effectués lors des expériences de PCR en temps réel.
Temps Température Activation initiale 15 minutes 95°C
30 s 95°C Cycle en 3 étapes 30 s 60°C
(40 cycles) 60 s 70°C
2.5 Dosage de facteurs solubles par ELISA
Afin de doser l’expression des cytokines TGF-β et TNF-α, des plateaux Immulon
96 puits (Dynatech Laboratories) ont été remplis avec 50 µL/puits de tampon
carbonate (NaN3 0,02%, NaHCO3 7,1 g/l et Na2CO3 3,28 g/l) (Sigma) contenant un
anticorps anti-TGF-β ou un anti-TNF-α (Peprotech) à une concentration finale de 1
µg/ml. Les plaques ont été incubées toute la nuit à 4°C et lavées six fois dans une
solution de lavage PBS-Tween (Tampon PO4 1M, NaCl 8,5 g/l et Tween20-10%
5ml/l) le lendemain avant l’ajout de la solution de blocage (PBS contenant 1%
d’albumine de sérum bovin (BSA) (Fisher Scientific) filtré 0.22µm) pour une heure
à température de la pièce (TP). Les plateaux ont ensuite été lavés et les
échantillons à tester ont été ajoutés dans les puits contenant les anticorps. Les
plateaux ont ensuite été incubés à nouveau pendant 2 h à TP. Suite à une autre
série de six lavages, un premier anticorps de détection biotinylé (Peprotech) a été
ajouté à une concentration prédéfinie par le fabricant (Peprotech) et les plateaux
ont été incubés pendant 2 heures à TP. Les plateaux ont ensuite été lavés et un
second anticorps (streptavidine) dirigé contre la biotine et couplé à la HRP
(Peprotech) a été ajouté pour 2 h à TP à une concentration prédéfinie par le
fabricant. Enfin, les plateaux ont été lavés et du 3,3',5,5’-tetramethylbenzidine
(TMB) (MP Biomedicals, Montréal, Canada) a été ajouté à raison de 50 µL par
puits suivi d’une incubation de 15 minutes à l’abri de la lumière. La réaction a été
36
arrêtée par l’ajout de 50 µL de H2SO4 (1N) (Fisher Scientific) et l’analyse a été
effectuée à l’aide du lecteur de plaques ELISA (SpectraMax Plus384 Absorbance
Les lysats cellulaires pour analyses en immunobuvardage ont été dosés par la
méthode de Bradford (réactif de Bradford, Bio-Rad, Mississauga, Canada) afin
d’approximer leur concentration en protéines totales. Une fois la concentration des
échantillons connue, ceux-ci ont été déposés sur gel de polyacrylamide 10% [106]
à raison de 20 µg de protéines par puits et ont migré dans du tampon
d’électrophorèse (Tris 15 g/l, glycine 72 g/let SDS 5 g/l) pendant 2 h sous
l’influence d’un courant de 130 volts (Bio-Rad).
2.6.2 Transfert de protéines
Suite à leur séparation, les protéines sont transférées depuis le gel sur une
membrane de polyvinylidene fluoride (PVDF) (Millipore, Billerica, MA)
préalablement trempée dans le méthanol 100% pendant 15 secondes. . Les
protéines sont transférées depuis le gel vers la membrane pendant 1 h à 4°C et
sous un courant de 100 volts dans une solution contenant du Tris 25mM, de la
glycine 192 mM et du méthanol 10% à l’aide d’un appareil Transblot (Bio-Rad). Le
transfert des protéines à la membrane a été vérifié par l’application de Rouge
Ponceau pendant 5 minutes à TP. Les protéines chargées ont migré depuis le gel
vers la membrane pendant 1 h à 4°C et 100 volts dans une solution contenant du
Tris 25mM, de la glycine 192 mM et du méthanol 10% à l’aide d’un appareil
Transblot (Bio-Rad) tout en conservant l'organisation relative qu'elles avaient dans
37
le gel. La fixation des protéines à la membrane a été vérifiée par l’application de
Rouge Ponceau pendant 5 minutes à TP.
2.6.3 Détection
Le blocage des sites d'interaction non spécifique entre la membrane et les
anticorps a été réalisé en plongeant la membrane dans une solution de tampon
salin-Tris (Tris 10 mM, NaCl 100 mM) supplémenté de Tween-20 0,1%) (TTBS)
contenant 5% d’albumine de sérum bovin pendant une heure à TP sous agitation.
L’anticorps anti-IDO humain a été généré chez le lapin et acheté chez Cell
Signaling Technology. Après le blocage, la membrane a été incubée sous agitation
dans une solution contenant l'anticorps primaire dilué (1/5000) dans du TTBS 1%
BSA toute la nuit à 4°C. Après rinçage de la membrane, celle-ci a été exposée à
un anticorps dilué dans du TTBS 1% BSA (1/10 000) généré chez la chèvre et
dirigé contre une portion espèce-spécifique de l'anticorps primaire (anti-IgG du
lapin, Life Technologies) et couplé à la biotine. L'anticorps secondaire
(streptavidine) étant couplé à la HRP, l'identification visuelle de la protéine étudiée
sur la membrane a été possible suite à l’ajout d’une solution cheminluminescente
ECL (GE Healthcare).
2.7 Évaluation de l’activité enzymatique de l’enzyme IDO
L’activité enzymatique de l’enzyme a été déterminée en mesurant la quantité de
Trp et de kynurénine retrouvée dans les surnageants de culture par
chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC, INAF, Université
Laval). Brièvement, le Trp a été détecté par son émission de fluorescence naturelle
à 366 nm suite à une excitation à 286 nm. Le 3-Nitro-L-tyrosine, utilisé comme
standard interne, ainsi que la kynurénine ont été dosés par spectroscopie
ultraviolet-visible. Un mélange composé de Trp (50 µM) et de kynurénine (10 µM)
(tous deux provenant de Sigma-Aldrich) et de sérum à base d’albumine a été
38
utilisé comme standard externe. Les concentrations de l’acide aminé et de son
métabolite ont été mesurées par HPLC suivant leur précipitation à l’acide
trichloroacétique (ajout de 25 µL d’une solution à 2 M) en comparant les pics
obtenus dans le chromatogramme.
2.8 Dosage des endotoxines présentes dans l’ovalbumine
Les endotoxines ont été dosées avec un appareil spécialement conçu à cet effet
par les laboratoires Charles River (Endosafe-PTS Portable LAL Test System). Ce
dernier utilise la technologie LAL chromogénique pour relier directement une
densité optique à une concentration d’endotoxines dans l’échantillon testé. Chaque
plaquette utilisé contient un réactif LAL, un substrat chromogénique et un standard
qui sert de contrôle. Toutes les plaquettes sont certifiées et sont prêtes à utiliser
dès la réception. Avant de déposer 25 µL d’échantillon sur la plaquette et de
l’insérer dans l’appareil pour l’analyse, celui-ci est dilué dans du β-bloquant et de
l’eau certifiée sans endotoxine fourni par le fabricant. Les embouts stériles utilisés
doivent être autoclavés et ne contenir aucune trace d’endotoxines (<0.1 EU/ml).
L’appareil mélange les échantillons aux réactifs contenus dans les plaquettes et
mesure ensuite la densité optique. Celle-ci est transférée dans un logiciel Excel et
ajoutée à l’équation d’une courbe standard pour finalement arriver à un résultat se
situant entre 0,1 et 1000 EU/ml.
39
3. Résultats
3.1 Caractérisation des cellules dendritiques
3.1.1 Différenciation des cellules de moelle osseuse murines en cellules
dendritiques
Des cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 ont été extraites des fémurs
d’un groupe de douze souris, mélangées ensemble et congelées jusqu’à
l’application des différents protocoles. Pour le protocole de différenciation, environ
5 x 105 cellules ont été mises en culture pendant sept jours avec du GM-CSF (20
ng/ml) tel que décrit précédemment (section 2.2.1.1). Afin de valider le protocole
de différenciation, l’expression de certains marqueurs par les cellules a été
mesurée par cytométrie en flux au terme de la culture. Les cellules totales ont
d’abord été sélectionnées selon leur taille et leur granularité (voir figure 3.1 A) afin
d’en extraire les débris cellulaires. La viabilité a ensuite été déterminée grâce à un
marqueur fluorescent (Sytox Blue) qui pénètre les cellules mortes seulement et lie
les acides nucléiques à l’intérieur du noyau de celles-ci. Une émission de
fluorescence autour de 470 nm indique que les cellules ne sont pas viables et elles
sont alors exclues des analyses (voir figure 3.1 B). Les cellules résiduelles ont été
analysées selon leur expression du marqueur de DC matures chez les cellules
murines CD11c [102, 107], mais également selon leur expression des marqueurs
CMH I et DEC-205. La figure 3.1 C montre un résultat représentatif des marqueurs
exprimés par les cellules totales vivantes au terme d’un protocole de
différenciation.
40
Figure 3.1 : Stratégie de caractérisation des cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 au terme du protocole de différenciation en cellules
dendritiques par cytométrie en flux.
Des cellules de moelle osseuse extraites des fémurs d’un groupe de douze souris C57BL/6 ont été
différenciées avec ajout de GM-CSF (20 ng/ml) tel que décrit dans la section 2.2.1.1. Environ 5 x
105 cellules ont été incubées dans un volume final de 2 ml. (A) Sélection des cellules totales selon
leur taille et leur granularité. (B) Sélection des cellules totales vivantes. (C) Expression des
marqueurs CD11c, CMH I et DEC-205 sur les cellules totales vivantes sélectionnées selon (A) et
(B).
Les données compilées, tel qu’illustré dans la figure 3.2 A, indiquent que, en
moyenne, environ 60% des cellules totales expriment CD11c au terme de la
41
culture alors que 42% et 25% des cellules expriment les marqueurs CMH I et DEC-
205. Les cellules CD11c+, considérées dans le cadre de ce projet comme étant
des DC matures [102], expriment quant à elles plus fortement les marqueurs CMH
I et DEC-205, soit dans respectivement 59% et 34% des cas (figure 3.2 B).
Figure 3.2 : Pourcentage d’expression des marqueurs CD11c, CMH I et DEC-205 par les cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 au terme du protocole de
différenciation.
Des cellules de moelle osseuse extraites des fémurs d’un groupe de douze souris C57BL/6 ont été
différenciées avec ajout de GM-CSF (20 ng/ml) tel que décrit dans la section 2.2.1.1. Environ 5 x
42
105 cellules ont été incubées dans un volume final de 2 ml. (A) Compilation du pourcentage de
cellules totales vivantes qui expriment les marqueurs CD11c, CMH I et DEC-205. (B) Compilation
du pourcentage de cellules totales vivantes CD11c+ qui expriment les marqueurs CMH I et DEC-
205. Les résultats ont été compilés à la suite de neuf cultures indépendantes pour l’analyse des
marqueurs CD11c et CMH I et de trois cultures indépendantes pour l’analyse du marqueur DEC-
205.
3.1.2 Activation des cellules dendritiques
Comme mentionné précédemment, les DC réagissent à certains stimuli, tel que du
LPS, et modifient leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles. Afin de
mesurer l’impact des IgIV sur l’activation des DC, les variations dans l’expression
de certains marqueurs (CMH I et DEC-205) ont d’abord été mesurées suite à une
stimulation. Environ 1 x 106 cellules totales différentiées à partir de la moelle
osseuse extraite des fémurs d’un groupe de 12 souris ont été mises en culture
avec ou sans LPS (1 µg/ml) pendant 24 h afin d’induire leur activation. Leur
phénotype a ensuite été caractérisé par cytométrie en flux selon la stratégie décrite
à la figure 3.1. Tel qu’illustré à la figure 3.3 A, une fois les cellules stimulées, le
pourcentage des cellules vivantes totales qui expriment CD11c, CMH I et DEC-205
est respectivement de 61%, 58% et 31%. Tel qu’illustré à la figure 3.3 B, le
pourcentage de cellules vivantes CD11c+ qui expriment les molécules de surface
CMH I et DEC-205 augmente respectivement de 20% et de 13% pour atteindre
79% et 47%.
43
Figure 3.3 : Pourcentage d’expression des marqueurs CD11c, CMH I et DEC-205
par les cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 suite au protocole de différenciation et à une stimulation avec LPS.
Les cellules de moelle osseuse extraites des fémurs d’un groupe de douze souris C57BL/6 ont été
différenciées avec ajout de GM-CSF (20 ng/ml) tel que décrit dans la section 2.2.1.1. Environ 1 x
106 cellules ayant subi le protocole de différenciation ont été incubées pendant 24 h avec des LPS
(1 μg/ml). (A) Compilation du pourcentage de cellules totales vivantes qui expriment les marqueurs
CD11c, CMH I et DEC-205 suite à l’activation avec LPS. (B) Compilation du pourcentage de
cellules totales vivantes CD11c+ qui expriment les marqueurs CMH I et DEC-205 suite à l’activation
aux LPS. Les résultats ont été compilés à la suite de neuf cultures indépendantes pour l’analyse
des marqueurs CD11c et CMH I et de trois cultures indépendantes pour l’analyse du marqueur
DEC-205.
44
3.2.3 Effet des IgIV sur l’expression du complexe majeur d’histocompatibilité I
Afin de déterminer si l’effet des IgIV sur l’inhibition de l’activation des lymphocytes
T OT-I était la conséquence d’un impact sur l’activation des DC et sur leur capacité
à présenter efficacement un antigène, l’activation de celles-ci a été comparée dans
des conditions avec ou sans IgIV et l’expression du marqueur CMH I a été
analysée. Les DC ont été incubées avec ou sans ovalbumine et avec ou sans IgIV
pendant 24 h à 37°C. Il est à noter que la plupart des préparations commerciales
d’ovalbumine, incluant celle utilisée, contiennent des concentrations non-
négligeables d’endotoxines (≥850 EU/ml) qui stimulent les DC de façon
équivalente au LPS. Les cellules ont ensuite été caractérisées par cytométrie en
flux. Comme mentionné précédemment, les cellules ont d’abord été sélectionnées
selon leur taille et leur granularité afin d’exclure les débris cellulaires. Les cellules
mortes ont ensuite été exclues et des cellules non-colorées ont permis d’établir les
limites des quadrants délimitant les cellules positives et négatives pour le
marqueur CD11c. Les cellules CD11c+ ont ensuite été analysées quant à
l’intensité de fluorescence émise via l’anti-CMH I en utilisant des cellules colorées
avec l’anti-CD11c seulement pour établir les limites des quadrants. Tel que montré
dans la figure 3.4 A, la fluorescence émise via l’anti-CMH I est diminuée en
présence d’IgIV. La compilation des moyennes d’intensité de fluorescence
obtenues lors de six expériences indépendantes a permis de mettre en évidence
une diminution significative de la MFI pour l’anti-CMH I en présence d’IgIV
(diminution d’environ 20%). Cependant, avant de conclure que les IgIV pouvaient
diminuer l’expression du CMH I sur les DC activées, nous avons considéré la
possibilité que les IgIV pouvaient lier les endotoxines et inhiber les effets
activateurs que celles-ci ont normalement sur les DC [108]. Les DC ont donc été
stimulées avec une préparation commerciale d’ovalbumine exempte d’endotoxines
(endo -) (≤0,1 EU/ml) afin d’éviter de confondre un effet direct des IgIV sur
l’expression du CMH I à une neutralisation des endotoxines. Avec de l’ovalbumine
endo-, les courbes correspondant à l’intensité de fluorescence de l’anti-CMH I suite
45
à une incubation des DC activées pendant 24 h à 37°C sont identiques avec ou
sans IgIV (figure 3.4 B). Cette expérience a été réalisée deux fois et des résultats
similaires ont été obtenus, c’est-à-dire une émission de fluorescence similaire via
l’anti-CMH I dans des conditions avec ou sans IgIV (voir les résultats pour les deux
expériences dans la figure 3.4 B). Afin de confirmer les résultats obtenus, des LPS
ont été ajoutés à l’ovalbumine endo- afin qu’elle atteigne une concentration en
endotoxines d’environ 1000 EU/ml et l’essai a été répété deux fois. Comme le
démontrent les résultats de la figure 3.4 C, l’ajout de LPS à l’ovalbumine endo-
permet aux IgIV de retrouver un effet inhibiteur apparent sur l’expression de CMH
I.
46
Figure 3.4 : Diminution de l’expression du CMH I en surface des cellules dendritiques en présence d’IgIV: neutralisation des endotoxines présentes dans
l’ovalbumine. Les DC ont été activées par une incubation de 24 h avec (A) de l’ovalbumine (1 mg/ml, 850 EU/ml)
avec ou sans IgIV (15 mg/ml), (B) de l’ovalbumine sans endotoxines (1 mg/ml, ≤0,1 EU/ml) avec ou
sans IgIV (15 mg/ml) ou (C) de ovalbumine sans endotoxines + LPS (1 mg/ml, 850 EU/ml) avec ou
sans IgIV (15 mg/ml). L’intensité de fluorescence émise via l’anti-CMH I a été déterminée sur les
cellules CD11c+ vivantes. Les résultats sont représentatifs de (A) six et (B) (C) deux expériences
indépendantes (cumul des données présenté à côté de chaque histogramme).
Ces résultats nous ont incité à vérifier si les IgIV conservaient un effet inhibiteur
sur l’activation des lymphocytes T OT-I même si de l’ovalbumine endo- était
utilisée pour activer les DC. Les DC ont donc été incubées pendant 24 h avec de
l’ovalbumine (1 mg/ml) contenant ou non des endotoxines (850 EU/ml). Les
cellules ont été lavées et ajoutées aux lymphocytes T OT-I (ratio 1 :1) pour une
incubation de 24 h à 37°C. L’expression du marqueur d’activation précoce CD69 a
été mesurée par cytométrie en flux. Les cellules ont d’abord été sélectionnées
selon leur taille et leur granularité. Des cellules non-colorées ont ensuite été
utilisées pour cibler les cellules positives pour l’expression du marqueur de
lymphocytes T CD8b. Les cellules CD8b+ ont ensuite été analysées quant à leur
intensité de fluorescence émise pour le marqueur CD69 en utilisant des cellules
colorées avec l’anti-CD8b seulement pour établir les quadrants délimitant les
cellules positives et négatives pour le marqueur CD69. Les résultats de la figure
3.5 montrent que la fluorescence émise par les cellules marquées avec l’anti-CD69
est diminuée d’environ 20% en présence d’IgIV lorsque l’ovalbumine utilisée est
certifiée endo-. Cette tendance a été observée lors de deux expériences
indépendantes. L’hypothèse d’une interférence entre les IgIV et les sites de liaison
de l’anti-CD69 a été évaluée. Pour ce faire, des cellules T OT-I ont été incubées
avec des DC préalablement activées avec de l’ovalbumine pendant 24 h à 37°C.
Environ trente minutes avant la lecture au cytomètre, des IgIV ont été ajoutées
dans un des tubes qui a ensuite été déposé sur glace avant d’effectuer le protocole
de coloration et d’analyse des cellules tel que décrit précédemment. Comme
illustré à la figure 3.5 B, le pourcentage de cellules positives pour l’expression de
47
CD69 et l’intensité de fluorescence sont hautement similaires dans des conditions
sans IgIV ou avec IgIV pendant 30 minutes sur glace, suggérant que les IgIV ne
lient pas les sites de liaison de l’anti-CD69 utilisé. Ainsi, bien que moins important
dans la condition avec de l’ovalbumine endo-, l’effet d’inhibition des IgIV sur
l’activation des lymphocytes T CD8 demeure considérable et l’investigation a donc
été poursuivie.
Figure 3.5 : Comparaison de l’inhibition de l’activation des lymphocytes T OT-I
par les IgIV avec une utilisation de l’ovalbumine non-exempte ou exempte d’endotoxines.
(A) Les DC ont été incubées pendant 24 h avec de l’ovalbumine (1 mg/ml) contenant ou non des
endotoxines (850 EU/ml). Les cellules ont été lavées et ajoutées aux lymphocytes T OT-I (ratio
1 :1) pour une incubation de 24 h à 37°C. L’expression du marqueur d’activation précoce CD69 a
été mesurée par cytométrie en flux sur les cellules T CD8b+. Les résultats sont représentatifs de
deux expériences indépendantes. (B) Intensité de fluorescence et pourcentage de cellules T OT-I
CD8b+ positives pour l’anti-CD69-CPA suite à une incubation avec ovalbumine (1 mg/ml) pendant
24 h sans IgIV ou avec IgIV pendant 30 minutes sur glace.
48
3.2.4 Effet des IgIV sur l’expression de l’intégrine CD11c : réel ou blocage ?
L’expression du marqueur CD11c par les DC dans des conditions avec ou sans
IgIV a ensuite été investiguée. Nous avons vérifié l’hypothèse d’une interférence
entre les IgIV et l’anti-CD11c pour la liaison à la surface des cellules (protocole
section 2.3.3). Les cellules totales ont été sélectionnées selon leur taille et leur
granularité et les cellules mortes ont été exclues des analyses grâce à l’utilisation
du marqueur de viabilité Sytox Blue. L’expression de CD11c sur les cellules
résiduelles a ensuite été analysée par cytométrie en flux en utilisant des cellules
non-colorées pour définir les quadrants nécessaires. L’expérience a été réalisée à
deux reprises. Les résultats (figure 3.6) montrent que les IgIV ont un effet inhibiteur
sur l’expression du marqueur CD11c (détectée via la fluorescence émise par l’anti-
CD11c par cytométrie en flux) par les DC suite à une incubation de 30 minutes sur
glace. En effet, dans les deux expériences, il est possible d’observer que plus de
10% des cellules cessent d’émettre de la fluorescence via l’anti-CD11c lorsque
celles-ci sont traitées aux IgIV et que la MFI diminue d’environ 20%.
Figure 3.6 : Blocage des sites de liaison de l’anti-CD11c par les IgIV.
49
Des DC ont été incubées pendant 24 h à 37°C avec de l’ovalbumine (1 mg/ml). Trente minutes
avant la lecture au cytomètre, des IgIV (15 mg/ml) ont été ajoutées à la moitié des cellules et celles-
ci ont été incubées sur glace pendant 30 minutes. L’expression de CD11c par les cellules vivantes
a été analysée par cytométrie en flux. Les résultats proviennent de deux expériences
indépendantes.
3.3 Effet des IgIV sur la dégradation de l’antigène par les cellules dendritiques
Des essais de présentation croisée ont été effectués directement avec le peptide
SIINFEKL (peptide immunodominant reconnu par les lymphocytes T OT-I). En
utilisant directement le peptide au lieu de l’ovalbumine soluble, l’antigène n’a pas à
être dégradé et peut directement être chargé sur des CMH. Ces essais ont été
réalisés avec ou sans ajout d’IgIV. Quelques difficultés ont alors été rencontrées
puisque le modèle ne permettait pas d’observer à chaque fois une inhibition de la
réponse des lymphocytes T OT-I (mesurée par CD69), peu importe si les DC
étaient incubées avec le peptide ou avec l’ovalbumine soluble (résultats non
montrés). Un effet des IgIV était certes visible, mais généralement plus faible que
ce qui était attendu. Il importait donc de revoir les bases du modèle expérimental
puisque, sans l’observation d’une inhibition significative et constante de l’activation
des lymphocytes T OT-I par le peptide SIINFEKL ou par l’ovalbumine soluble en
présence d’IgIV, l’hypothèse de départ s’en trouvait invalidée.
Un des atouts de notre approche expérimentale est que celle-ci permet d’avoir une
vision globale de l’effet des IgIV, tant sur les DC que sur les lymphocytes T. En
effet, il est possible d’ajouter les IgIV en pré-incubation soit avec les DC [95] ou
alors au moment du contact entre les deux types de cellules (synapse
immunologique). Cet atout a été utilisé pour tenter de déterminer quel était le type
cellulaire le plus affecté par les IgIV lors de la présentation croisée. Les essais de
présentation ont donc été effectués en ajoutant les IgIV à deux moments différents,
soit seulement avec les DC en pré-incubation ou au moment du contact entre les
50
deux cellules. L’activation des cellules T a été mesurée via leur expression de
CD69 en cytométrie en flux. Comme le montre les figures 3.7 A et B, les cellules
totales ont d’abord été sélectionnées afin d’extraire les débris cellulaires des
analyses. Une région a ensuite été fixée pour sélectionner les cellules CD8b+ en
utilisant des cellules non-colorées pour établir les limites des quadrants.
L’expression de CD69 sur les cellules CD8b+ a ensuite été analysée en utilisant
des cellules colorées avec l’anti-CD8b seulement pour établir les quadrants
nécessaires. La figure 3.7 C illustre un résultat représentatif de huit expériences
indépendantes. À des fins de statistique, l’index d’expression de CD69 a été
calculé pour chaque condition et dans chaque expérience en multipliant l’intensité
de fluorescence moyenne émise via l’anti-CD69 par le pourcentage de cellules
positives pour le marqueur. L’analyse des index d’expression (figure 3.7 D) nous a
permis de conclure que les IgIV avaient un effet inhibiteur significatif sur l’activation
des cellules T CD8 seulement lorsque les IgIV étaient ajoutées au moment du
contact entre les DC et les lymphocytes T. Il est possible d’observer une diminution
de l’expression de CD69 par les cellules T lorsque les DC sont incubées avec des
IgIV, mais celle-ci est non-significative.
51
52
Figure 3.7 : Effet des IgIV à différents stades de la présentation croisée mesuré par l’activation des lymphocytes T OT-I.
Les lymphocytes T OT-I ont été incubés pendant 24 h à 37°C avec des DC préalablement incubées
avec ou sans ovalbumine soluble (1 mg/ml) pendant 24 h à 37°C et ce, dans un ratio 1 :1. Des IgIV
(15 mg/ml) ont été ajoutées pendant la pré-incubation des DC ou au moment du contact entre les
deux types de cellules. L’analyse de l’expression du marqueur CD69 a été effectuée par cytométrie
en flux sur les lymphocytes T CD8b+. (A) Sélection des cellules totales. (B) Sélection des cellules
CD8b+. (C) Expression du marqueur CD69 sur les cellules totales CD8b+ dans les différentes
conditions. (D) Index d’expression du marqueur CD69 dans les différentes conditions. N=8, * P˂0,05 (ANOVA).
Comme ces résultats suggéraient davantage un impact des IgIV lors de la
formation de la synapse immunologique que directement sur les DC, la
prolifération des lymphocytes T OT-I a été mesurée pour confirmer les résultats
obtenus avec le marqueur CD69. L’index de prolifération illustré à la figure 3.8
indique le nombre moyen de cellules-filles auxquelles les cellules-mères initiales
ont donné naissance. Dans la condition sans activation des lymphocytes T (DC
sans ovalbumine), celui-ci est de 1,95 et augmente à 4,75 dans la condition où les
lymphocytes T sont activés. Il diminue à 3,37 dans la condition où les IgIV sont
ajoutées en pré-incubation avec les DC et n’atteint que 2,22 dans la condition où
les IgIV sont ajoutées au moment du contact entre les deux types de cellules, en
accord avec nos observations basées sur l’expression du CD69.
53
Figure 3.8 : Effet des IgIV sur les différents stades de présentation croisée mesuré par inhibition de la prolifération.
Les conditions expérimentales sont similaires à celles décrites à la figure 3.9, sauf que les
Lymphocytes T OT-I ont été colorées avec le marqueur de prolifération Cell Proliferation Dye-
CD8b+ ont été analysés après 48 h par cytométrie en flux. Les intensités de fluorescence moyenne
(MFI) sont écrites au-dessus des courbes de chaque condition analysée. Les index de prolifération
ont été calculés à l’aide du logiciel FCS Express 4.
Ainsi, nos résultats suggèrent que les IgIV inhibent l’activation des lymphocytes T
OT-I par la présentation antigénique croisée en affectant en partie les DC mais
probablement de façon plus importante la synapse immunologique qui se forme
entre la DC et le lymphocyte T.
Ces résultats nous ont donc mené à nous questionner sur un effet potentiel des
IgIV directement sur les lymphocytes T CD8, lequel a été exploré dans la section
suivante.
54
3.4 Effet des IgIV sur les lymphocytes T OT-I
3.4.1 CD62L
Les lymphocytes T OT-I ont été incubés avec ou sans IgIV (15 mg/ml) pendant 24
h à 37°C et l’expression de CD62L a été mesurée par cytométrie en flux. Les
cellules totales ont d’abord été sélectionnées via leur taille et leur granularité. Les
cellules mortes ont été exclues des analyses et des cellules non-colorées ont
permis d’établir les quadrants délimitant les cellules négatives et les cellules
positives pour l’expression du marqueur CD8b. Les cellules vivantes CD8b+ ont
ensuite été analysées quant à leur expression de la sélectine CD62L; des cellules
colorées avec l’anti-CD8b seulement ont été utilisées pour délimiter les quadrants
nécessaires. La figure 3.9 A illustre un résultat représentatif de quatre expériences
indépendantes. L’expression de CD62L est maximale au début de l’expérience. La
sélectine est clivée dans les heures suivantes pour ensuite être re-synthétisée
après environ 24 h, tel que décrit dans la section 1.2.4. L’expression de CD62L est
similaire dans des conditions avec ou sans IgIV dans les premières heures, mais
on note une resynthèse accrue dans la condition avec IgIV après 24 h. Afin
d’appuyer les résultats par des données statistiques, l’index d’expression de
CD62L a été calculé pour chaque expérience en multipliant l’intensité de
fluorescence moyenne émise via l’anti-CD62L par le pourcentage de cellules
positives. Tel que montré dans la figure 3.9 B, aucune différence significative n’a
été observée quant à l’index d’expression de CD62L dans des conditions avec ou
sans IgIV après 4 h d’incubation. Cependant, après 24 h, on note une expression
significativement plus importante de CD62L dans la condition avec IgIV.
55
Figure 3.9 : Effet des IgIV sur l’expression de CD62L par des lymphocytes T OT-I non-activés.
56
Les lymphocytes T OT-I ont été incubés avec ou sans IgIV (15 mg/ml) pendant 24 h. L’expression
de CD62L a été mesurée après 4 h et 24 h d’incubation par cytométrie en flux sur les cellules
vivantes CD8b+. (A) Résultat représentatif de quatre expériences indépendantes. (B) Index
d’expression du marqueur CD62L après 4 h et 24 h d’incubation avec ou sans IgIV. N=4, *P<0,05
(Test T apparié).
Nous avons poussé plus loin l’analyse de l’expression de CD62L en présence
d’IgIV en effectuant une cinétique sur 48 heures et ce, en incubant les lymphocytes
T OT-I en présence de DC préalablement activées afin de déterminer la cinétique
de l’expression dans un contexte de présentation croisée. Les résultats illustrés à
la figure 3.10 A sont représentatifs de quatre expériences indépendantes. L’index
d’expression de CD62L a été calculé comme décrit précédemment et les résultats
sont montrés à la figure 3.10 B. Les niveaux de CD62L sont maximaux au début
de l’expérience et la sélectine est rapidement clivée suite à l’ajout des DC
préalablement activées avec de l’obalbumine. Les résultats suggèrent que les IgIV
n’ont pas d’effet significatif sur le clivage de la molécule puisque les niveaux
d’expression sont presque identiques avec ou sans IgIV après 4 h d’incubation.
Cependant, après 24 h, au moment de la resynthèse de la molécule, on note un
index d’expression significativement plus élevé dans la condition avec IgIV.
57
Figure 3.10 : Cinétique de l’effet des IgIV sur l’expression de CD62L par des lymphocytes T OT-I activés en présence ou en absence d’IgIV.
Les lymphocytes T OT-I ont été activés par des DC (préalablement incubés pendant 24 h avec de
l’ovalbumine (1 mg/ml)) avec ou sans IgIV (15 mg/ml) pendant 48 h. L’expression de CD62L a été
mesurée par cytométrie en flux sur les cellules vivantes CD8b+ après 4 h, 24 h et 48 h. (A) Résultat
58
représentatif de quatre expériences indépendantes. (B) Index d’expression du marqueur CD62L
après 4 h et 24 h d’incubation avec ou sans IgIV. N=4, *P<0,05 (Test T apparié).
Ces résultats suggérant que les IgIV agissent en induisant une synthèse de novo
de CD62L chez les lymphocytes T CD8, l’ARNm de CD62L a été dosée par PCR
en temps réel à l’aide d’extraits nucléiques prélevés après 24 h d’incubation.
Comme le démontrent les résultats de la figure 3.11, la quantité d’ARNm codant
pour la sélectine est environ sept fois plus élevée dans la condition avec IgIV après
24 h d’incubation, signe d’une synthèse accrue du messager et en accord avec
l’augmentation d’expression de la protéine à la surface des cellules OT-I après 24
h.
Figure 3.11 : Effet des IgIV sur l’expression relative de l’ARNm codant pour la
sélectine CD62L au temps T= 24 h par des lymphocytes T OT-I activés. Les lymphocytes T OT-I ont été activés par des DC (préalablement incubées pendant 24 h avec de
l’ovalbumine (1 mg/ml)) avec ou sans IgIV (15 mg/ml) pendant 24 h. Des extraits nucléiques ont été
prélevés après 24 h et l’expression relative de l’ARNm codant pour CD62L a été mesurée par PCR
en temps réel.
59
3.4.2 Effet des IgIV sur l’expression de CD62L par des lymphocytes T CD8
humains
Afin d’analyser l’expression de CD62L sur des lymphocytes T CD8 humains, les
PBMC récoltés des filtres de leuco-réduction ont été mis en culture avec ou sans
IgIV ou HSA pendant 48 h et l’expression de la sélectine et de son ARNm par les
cellules CD8+ ont été respectivement quantifiées par cytométrie en flux et par PCR
en temps réel à différents temps durant l’incubation. Les cellules totales ont
d’abord été sélectionnées via leur taille et leur granularité et les cellules mortes ont
été exclues des analyses. Des cellules non-colorées ont été utilisées pour
sélectionner les cellules positives pour l’expression de CD8. Les cellules vivantes
CD8+ ont ensuite été analysées quant à leur expression de CD62L; des cellules
colorées avec l’anti-CD8 seulement ont été utilisées pour fixer les quadrants
délimitant les cellules positives et les cellules négatives pour l’expression du
marqueur. Tel que décrit précédemment, l’index d’expression a été calculé pour
les quatre temps de la cinétique. Les résultats obtenus sont illustrés à la figure
3.12 et confirment une expression de CD62L significativement plus élevée sur les
lymphocytes T CD8 provenant des PBMC ayant été incubés avec des IgIV
pendant 48 h. La différence est presque significative après 24 h. Un traitement à la
HSA dans les mêmes conditions n’entraine aucune modulation significative de
l’expression de CD62L, ce qui démontre la spécificité de l’effet des IgIV.
60
Figure 3.12 : Cinétique de l’expression de CD62L par les lymphocytes T CD8
humains provenant de PBMC incubés en présence ou en absence d’IgIV pendant 48 h.
Les PBMC ont été incubés avec ou sans IgIV (15 mg/ml) pendant 48 h. L’expression de CD62L a
été mesurée par cytométrie en flux à différents temps sur les cellules CD8+. Les résultats
représentent une compilation des données obtenues suite à l’analyse des lymphocytes T CD8 de
quatre donneurs différents. * P<0,05 (ANOVA)
L’analyse de l’ARNm codant pour CD62L a ensuite été réalisée par PCR en temps
réel. Les résultats de la figure 3.13 démontrent que, tout comme dans le modèle
murin, il y a une présence significativement plus élevée de l’ARNm codant pour la
protéine dans la condition avec IgIV comparativement à la condition contrôle. Cette
différence n’est présente qu’au temps T= 10 h.
61
Figure 3.13 : Effet des IgIV sur l’expression relative de l’ARNm codant pour la
sélectine CD62L par des PBMC humains après 10 h et 24 h d’incubation. Les PBMC ont été incubés avec ou sans IgIV (15 mg/ml) pendant 24 h et des extraits nucléiques
ont été prélevés après 10 h et 24 h d’incubation. L’expression relative de l’ARNm codant pour
CD62L a été mesurée à différents temps par PCR en temps réel. Les résultats représentent une
compilation des données obtenues suite à l’analyse des PBMC de quatre donneurs différents. ***
P<0.001 (Test T apparié).
Ainsi, nos résultats ont permis de mettre en évidence un effet des IgIV directement
sur les lymphocytes T CD8 murins et humains, au niveau de l’expression de la
sélectine CD62L. Par contre, notre hypothèse de départ voulait que les IgIV
produisent un effet direct sur les CPA. Bien que cet effet ne soit pas prononcé
dans le contexte de la présentation croisée chez la souris, nous nous sommes tout
de même intéressés aux effets des IgIV sur les monocytes humains, qui sont les
précurseurs des DC. Plus particulièrement, nous avons analysé l’effet des IgIV sur
le pouvoir tolérogène des monocytes en étudiant leur impact sur l’expression de
molécules telles que l’enzyme IDO et certains récepteurs NOD, afin de mieux
comprendre les effets immunomodulateurs des IgIV dans les maladies auto-
immunes et inflammatoires. .
***
62
3.5 Effet des IgIV sur le pouvoir tolérogène des monocytes
3.5.1 Indoleamine 2,3-dioxygenase
IDO est une enzyme qui catalyse la dégradation du Trp un acide aminé essentiel
et est désormais reconnue pour son implication majeure dans la régulation des
réponses immunes. Afin de déterminer les IgIV avaient un effet sur l’expression de
IDO par les monocytes humains, ceux-ci ont été purifiés (≥95% cellules CD14+
vivantes) à partir des PBMC de quatre différents donneurs et mis en culture
pendant 96 h avec ou sans IgIV ou HSA. Les cellules ont été récoltées toutes les
24 h et l’expression intracellulaire de l’enzyme a été évaluée par cytométrie en flux.
Les cellules totales ont d’abord été sélectionnées via leur taille et leur granularité
afin d’en extraire les débris cellulaires. Des cellules colorées avec l’anticorps
secondaire seulement ont été utilisées afin d’établir les quadrants qui délimitent les
cellules positives et les cellules négatives pour l’anticorps primaire (anti-IDO). Les
résultats de la figure 3.14 indiquent que cinq à six fois plus de monocytes
expriment l’enzyme s’ils ont été traités aux IgIV. Une forte augmentation
significative du nombre de cellules exprimant IDO est observée à partir de T=48 h
et se maintient jusqu’à T=96 h. L’expression de la protéine a également été
quantifiée par immunobuvardage de type western au temps T=96 h et la même
tendance a été observée (résultat non montré).
63
Figure 3.14 : Effet des IgIV sur l’expression de l’enzyme Indoleamine 2,3-
dioxygenase par des monocytes purifiés à partir de PBMC. Les monocytes purifiés ont été incubés avec ou sans IgIV ou HSA (15 mg/ml) pendant 96 h.
L’expression intracellulaire de l’enzyme par les cellules a été mesurée par cytométrie en flux. Les
résultats représentent une compilation des données obtenues suite à l’analyse des monocytes de
quatre donneurs différents. *** P˂0.001, n.s, non-significatif (ANOVA)
Afin de déterminer si l’augmentation de l’expression de l’enzyme par les
monocytes entrainait également un accroissement de la dégradation du Trp, cet
acide aminé a été quantifié par chromatographie en phase liquide à haute
performance. Les résultats illustrés à la figure 3.15 montrent les résultats obtenus
pour le dosage du Trp. Comparativement aux résultats précédents, aucune
différence significative (ANOVA) n’est observée quant à la quantité de Trp
présente dans le milieu entre les conditions avec ou sans IgIV.
64
Figure 3.15: Effet des IgIV sur l’activité enzymatique de l’enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase exprimé par des monocytes purifiés à partir de PBMC.
Les monocytes purifiés ont été incubés avec ou sans IgIV ou HSA (15 mg/ml) pendant 96 h. La
quantité de Trp a été mesurée par chromatographie en phase liquide à haute performance et est
exprimée de façon relative au standard 3-nitro-tyrosine. Les résultats représentent une compilation
des données obtenues suite à l’analyse des surnageants provenant de la culture de monocytes de
quatre donneurs différents.
Comme mentionné, l’enzyme étudiée peut exercer ses fonctions
immunomodulatrices en dégradant le Trp, ce qui ne semble pas être le cas ici. Par
contre, il a également été démontré qu’elle peut agir en induisant une cascade de
signalisation intracellulaire qui confère aux cellules qui l’expriment un pouvoir
tolérogène stable, indépendamment de son action sur le Trp. En présence de
TGF-β et de TNF-α, l’expression accrue de l’enzyme permet aux cellules de
réguler les réponses immunes à long terme en participant à la génération de Treg.
Comme l’activité enzymatique de IDO n’est pas altérée par les IgIV, mais que la
présence de l’enzyme est accrue, il a été supposé que ce second mécanisme via
le TGF-β et le TNF-α pouvait être induit et/ou amplifié par les IgIV dans les
65
conditions étudiées. La concentration de TNF-α a été dosée à l’aide d’un test
ELISA et l’ARNm codant pour la cytokine TGF-β a été mesuré par PCR en temps
réel. La figure 3.16 illustre les résultats obtenus. Tel qu’attendu, les IgIV semblent
induire une augmentation significative de la sécrétion du TNF-α et de l’expression
du TGF-β par les monocytes après 24 h d’incubation. En effet, la
sécrétion/expression des deux cytokines est environ trois fois plus importante dans
la condition avec IgIV qu’elle ne l’est dans la condition contrôle ou dans la
condition avec HSA.
Figure 3.16 : Effet des IgIV sur l’expression des cytokines TNF-α et TGF-β. Les monocytes purifiés ont été incubés avec ou sans IgIV ou HSA (15 mg/ml) pendant 24 h. La
sécrétion du (A) TNF-α a été dosée par ELISA à partir des surnageants de culture. L’ARNm codant
pour la (B) cytokine TGF-β a été quantifiée par PCR en temps réel. Les résultats représentent une
compilation des données obtenues suite à l’analyse des monocytes de quatre donneurs différents. *
P˂0.05 (ANOVA)
Ces résultats combinés suggèrent un mécanisme d’action potentiel des IgIV en
agissant sur la voie TNF-α/TGF-β/IDO menant à l’induction de la tolérance. Nous
66
avons poussé plus loin l’étude des effets des IgIV sur le pouvoir tolérogène des
monocytes en étudiant l’expression de certains récepteurs de type NOD.
3.5.2 Récepteurs NOD
Des résultats antérieurs obtenus par des membres de l’équipe ont mis en évidence
un rôle pour les IgIV dans l’inhibition de l’activation du facteur de transcription NF-
κB (L. Loubaki et al, en préparation). Comme le NLRP6 et NLRP10 sont connus
pour leur rôle dans la régulation (positive et négative respectivement) de
l’activation de NK-κB, l’hypothèse d’un effet des IgIV sur ceux-ci s’avérait plausible.
Les monocytes purifiés (≥95% CD14+ vivants) de PBMC provenant de quatre
donneurs ont été activés par une incubation de quatre heures à 37°C avec du LPS
(1µg/ml), ce qui permet de simuler un contact avec un pathogène bactérien, et ont
été lavés extensivement avant d’être incubés à nouveau pendant 96 h à 37°C,
cette fois-ci, en présence ou en absence d’IgIV. L’expression de NLRP6 et de
NLRP10 a été analysée par cytométrie en flux. Les cellules totales ont d’abord été
sélectionnées via leur taille et leur granularité afin d’en extraire les débris
cellulaires. Des cellules colorées avec l’anticorps secondaire seulement ont été
utilisées afin d’établir les quadrants qui délimitent les cellules positives et les
cellules négatives pour l’anticorps primaire (anti-NLRP6 et anti-NLRP10). Comme
le démontrent les résultats d’analyse par cytométrie en flux de la figure 3.17 A, les
IgIV ne semblent avoir aucun effet sur l’expression de NLRP6 par les monocytes
purifiés et ce à tous les temps analysés. En effet, le pourcentage des cellules qui
expriment NLRP6 est sensiblement le même dans chacune des conditions pour un
temps donné. Par contre, il est possible de noter une différence significative quant
à l’expression de NLRP10 par les monocytes ayant été incubés en présence d’IgIV
au temps T=48 h et T=72 h (figure 3.17 B). Bien que la différence d’expression ne
soit pas significative aux temps T= 24 h et T=96 h en raison du grand écart-type
entre les données recueillies, les résultats démontrent que la tendance se
maintient tout au long de l’expérience. Alors que plus de 50% des monocytes
activés expriment NLRP10 au temps T=48 h dans la condition avec IgIV,
67
seulement 15% expriment le récepteur dans la condition sans IgIV ou avec HSA.
L’effet est également du même ordre (35% contre 5%) au temps T= 72 h.
Figure 3.17 : Effet des IgIV sur l’expression des récepteurs NOD NLRP6 et NLRP10.
Les monocytes purifiés ont été activés aux LPS et incubés avec ou sans IgIV ou HSA (15 mg/ml)
pendant 96 h. L’expression intracellulaire des récepteurs (A) NLRP6 et (B) NLRP10 par les
monocytes a été mesurée par cytométrie en flux. Les résultats représentent une compilation des
données obtenues suite à l’analyse des monocytes de quatre donneurs différents. ***P˂0.001,
**P˂0.01, n.s, non-significatif (ANOVA)
69
4. Discussion
Des travaux récents de notre équipe ont permis de mettre en évidence une
inhibition de l’activation (CD69, prolifération et sécrétion de cytokines pro-
inflammatoires) des lymphocytes T CD8 in vitro [99] ainsi qu’une atteinte aux
capacités lytiques de ceux-ci in vitro et in vivo [100] suite à un traitement aux IgIV.
L’objectif de cette étude était donc de déterminer les mécanismes d’action qui
pouvaient expliquer ces effets inhibiteurs afin d’aider au développement d’un bio-
équivalent aux IgIV. Nous avons émis l’hypothèse que les IgIV agissaient en
produisant un effet immunomodulateur sur les CPA, diminuant ainsi leur capacité à
activer les lymphocytes T CD8 et à générer des Tc. Les résultats de ce projet ont
permis l’identification de cibles potentielles des IgIV, soit l’intégrine CD11c, la
sélectine CD62L, l’enzyme IDO et le récepteur NLRP10.
4.1 Effet des IgIV sur l’activation des cellules dendritiques
Dans le cadre de ce mémoire, nous avons établi les effets des IgIV sur
l’expression de certaines molécules exprimées à la surface des DC pour tenter
d’expliquer l’inhibition de l’activation des lymphocytes T CD8 par présentation
antigénique croisée.
4.1.1 Complexe majeur d’histocompatibilité I
Il a été démontré quelques années plus tôt que les IgIV inhibent l’augmentation de
l’expression du CMH II qui survient normalement à la surface des DC suite à une
stimulation au LPS [94]. Nous avons vérifié si cet effet était également présent sur
l’expression du CMH I. L’ovalbumine commerciale utilisée pour activer les DC
contient une concentration importante d’endotoxines qui peuvent stimuler les DC
de façon similaire au LPS [109, 110]. Par contre, comme les IgIV peuvent inhiber
70
le pouvoir activateur des endotoxines [111-113], le protocole a également été
effectué avec de l’ovalbumine exempte d’endotoxines (endo -) afin d’éviter de
confondre un effet direct des IgIV sur l’expression du CMH I à une neutralisation
des effets pro-inflammatoires normalement induits par les endotoxines. Nous
avons démontré qu’avec une préparation régulière d’ovalbumine, les IgIV
réduisaient significativement l’expression du CMH I à la surface des DC. Par
contre, lorsqu’une préparation d’ovalbumine endo- était utilisée, les IgIV perdaient
leur effet inhibiteur apparent, suggérant que les IgIV neutralisent les endotoxines
présentes dans l’ovalbumine et empêche l’activation des DC. L’ovalbumine endo-
active moins fortement les DC en raison de sa concentration nulle en endotoxines
(signaux de danger). Les variations dans l’expression du CMH I deviennent alors
plus difficiles à détecter. Cependant, malgré des variations plus modestes dans
l’expression du CMH I en présence d’ovalbumine endo-, aucune baisse n’a pu être
observée dans l’expression de celles-ci en surface des DC en présence d’IgIV.
Dans des travaux subséquents, nous avons démontré que lorsque du LPS était
ajouté aux préparations d’ovalbumine endo- pour atteindre une concentration en
endotoxines équivalente à celle dans les préparations d’ovalbumine commerciales,
les IgIV retrouvaient leur pouvoir inhibiteur apparent sur l’expression du CMH I.
Ces résultats ont permis de conclure que dans le modèle utilisé, les IgIV ont un
pouvoir inhibiteur sur l’expression du CMH I par les DC qui s’explique par une
neutralisation des endotoxines présentes dans les préparations d’ovalbumine
commerciales. Cette capacité qu’a les IgIV à cibler et à inhiber les effets pro-
inflammatoires des endotoxines a d’ailleurs été exploité dans le passé dans le
traitement de certaines infections bactériennes [114-117].
Est-ce que l’inhibition de l’expression du CMH II par les IgIV à la surface des DC
décrite par Bayry et al. [94] pourrait également s’expliquer par une neutralisation
des endotoxines ? Un élément du protocole utilisé par ces auteurs peut être
questionné, soit le contact possible entre les endotoxines et les IgIV. En effet, les
auteurs ne mentionnent pas qu’ils s’assurent de laver entièrement les DC
prétraitées aux IgIV avant d’ajouter le LPS pour stimuler leur activation. Ce faisant,
71
il est très plausible que l’effet observé dans ce modèle soit également un effet de
neutralisation des propriétés pro-inflammatoires du LPS, tel que nous l’avons
montré dans nos travaux. Le rôle essentiel des endotoxines dans l’activation des
DC a fait l’objet de plusieurs études. Un article publié en 2002 par Bausinger et al.
a permis de mettre en évidence que les protéines de choc thermique (Hsp) de la
sous-classe HSP70 (constituante majeure des protéines Hsp [118]) perdaient leurs
effets pro-inflammatoires dans l’induction de la maturation des DC si celles-ci ne
contenaient pas d’endotoxines [119]. Dans le même ordre d’idées, il fut également
démontré que certaines protéines AGEs (Advanced glycation end-product),
normalement reconnues pour leur activation de plusieurs cellules immunes telles
que les DC et les monocytes [120], perdaient leurs propriétés pro-inflammatoires si
les préparations utilisées étaient exemptes d’endotoxines [121]. Ensemble, ces
résultats suggèrent une dépendance des endotoxines dans certaines voies
d’activation des CPA et laissent penser que les effets observés sur l’expression du
CMH I dans la présente étude ainsi que les effets observés par Bayry et al. sur
l’expression du CMH II pourraient découler d’un impact des IgIV sur l’activation
normalement induite par le LPS. Des études ayant mis en évidence des effets
bénéfiques des IgIV dans le traitement des chocs septiques en diminuant la
concentration d’endotoxines présentes dans le sang des patients traités vont
également dans ce sens [122-124]. Ces études ont certainement été bénéfiques
dans le développement d’anticorps monoclonaux anti-LPS qui sont maintenant
parfois utilisés dans le traitement des chocs septiques [125, 126]. Par contre, l’effet
des IgIV sur le LPS ayant grandement été étudié et n’ayant pas mené à
l’élaboration d’un substitut qui mimerait adéquatement les impacts bénéfiques de
la préparation thérapeutique dans le traitement de l’auto-immunité, les travaux
dans cette voie n’ont pas été approfondis.
4.1.2 CD11c
Dans le passé, il a également été démontré que les IgIV inhibent l’augmentation de
l’expression de l’intégrine CD11c qui survient normalement suite à une stimulation
au LPS [94]. Comme les IgG contenues dans les préparations thérapeutiques
72
d’IgIV peuvent lier différentes molécules, l’hypothèse d’un blocage des sites de
liaison de l’anti-CD11c par les IgIV a été vérifiée. En effet, les préparations d'IgIV
contiennent une grande variété d’anticorps anti-idiotypes dirigés contre les auto-
anticorps. Il importe donc de ne pas négliger la possibilité que les IgG contenues
dans les IgIV puissent également lier des paratopes présents sur les sites de
liaison des anticorps anti-CD11c utilisés. Allant dans ce sens, des études ont mis
en évidence qu’il y avait des anticorps anti-CD4 [127] et anti-CD5 [128] présents
dans les IgIV, ce qui laisse supposer que ces préparations pourraient également
contenir des anti-CD11c qui pourraient bloquer la liaison des anti-CD11c
fluorescents servant à détecter l’expression du marqueur CD11c à la surface des
DC. Pour déterminer si les IgIV pouvaient interférer avec la détection du CD11c,
des DC activées ont été incubées pendant 30 minutes sur glace en présence ou
en absence d’IgIV. Comme les DC sont sur glace pendant seulement 30 minutes
avec IgIV, il est peu probable que celles-ci aient la capacité et le temps de modifier
l’expression du CD11c en réponse aux IgIV. Grâce à ce contrôle, nous avons
démontré une diminution de la fluorescence émise via l’anti-CD11c lorsque les DC
étaient incubées pendant 30 minutes sur glace avec des IgIV (diminution de 10%
des cellules positives et de 20% de la MFI). La molécule de surface CD11c est
légèrement exprimée sur les monocytes et les macrophages [129], mais elle est
généralement utilisée pour cibler spécifiquement les DC qui expriment fortement
celle-ci [102, 130]. Elle fait partie de la grande famille des intégrines et, via son
interaction avec ICAM-1 [131, 132] exprimé sur les lymphocytes T, elle est
impliquée dans le contact DC-lymphocytes T. Dans une étude menée par Garnotel
et al. [133], les auteurs ont démontré que l’ajout d’un anticorps anti-CD11c dans
une culture de monocytes humains purifiés entrainait des difficultés d’adhésion
chez les monocytes traités. Un blocage de cette intégrine par les IgIV pourrait donc
inhiber la formation d’une synapse immunologique fonctionnelle et ainsi inhiber
l’activation des lymphocytes T CD8 qui en résulte. Des études plus approfondies
seraient nécessaires afin de déterminer si le blocage de CD11c par les IgIV
entraine réellement des répercussions sur la formation de la synapse
immunologique.
73
4.2 Effet des IgIV sur les lymphocytes T OT-I
Un des atouts de notre approche expérimentale est que celle-ci permet d’avoir une
vision globale de l’effet des IgIV, tant sur les DC que sur les lymphocytes T. En
effet, il est possible d’ajouter les IgIV en pré-incubation soit avec les DC [95] ou
alors au moment du contact entre les deux types de cellules (synapse
immunologique). Cet atout a été utilisé pour tenter de déterminer quel était le type
cellulaire le plus affecté par les IgIV lors de la présentation croisée. Les essais de
présentation ont donc été effectués en ajoutant les IgIV à deux moments différents,
soit seulement avec les DC en pré-incubation ou au moment du contact entre les
deux cellules. Nos résultats ont permis de démontrer que les IgIV avaient un
pouvoir inhibiteur significatif sur l’activation des lymphocytes T OT-I (déterminé via
l’expression de CD69) seulement lorsque celles-ci étaient ajoutées au moment de
la synapse immunologique.
4.2.1 Effet des IgIV sur CD62L
Nous avons mis en évidence un effet des IgIV sur l’expression de la sélectine
CD62L par les lymphocytes T CD8, laquelle est principalement impliquée dans
l’adhésion des cellules à leur environnement extracellulaire [134, 135]. Nos
résultats suggèrent que les IgIV agissent en induisant une synthèse de novo de
CD62L par les lymphocytes T CD8 murins et humains. Il est connu qu’une fois
activés, les lymphocytes T vont perdre l’expression de la sélectine CD62L
exprimée constitutivement par les lymphocytes T naïfs suite au clivage de celle-ci
par la métallo-protéase ADAM-17 [136]. Le clivage de CD62L joue un rôle pro-
inflammatoire dans les réponses immunitaires en inhibant l’adhésion des
lymphocytes T à leur environnement extracellulaire dans les organes lymphoïdes
secondaires, initiant ainsi un mouvement des lymphocytes T vers les lieux
d’inflammation afin d’exercer leurs rôles effecteurs [137]. Lorsque les signaux
74
d’activation se résorbent, on peut ensuite observer une resynthèse de la sélectine
[138]. Nos résultats montrent une resynthèse significativement accrue de la
protéine suite à une incubation de 24 h avec IgIV (expression significativement
plus importante de la protéine en surface des cellules CD8 murines et humaines).
Des résultats préliminaires montrent également une augmentation de l’ARNm
codant pour la sélectine suite à un traitement aux IgIV. Par contre, des analyses
supplémentaires sont nécessaires pour appuyer ses derniers résultats. En effet,
aucune analyse statistique n’a pu être effectuée pour les résultats concernant les
cellules murines étant donné que l’expérience a été réalisée une seule fois. De
plus, comme les IgIV sont des protéines qui peuvent causer des problèmes au
niveau des analyses en PCR en temps réel, il est nécessaire de laver au moins
cinq fois les cellules afin d’éviter des problèmes d’interférence. Dans ces travaux,
les cellules n’ont été lavées que trois fois. Les IgIV peuvent influencer
négativement l’expression relative de la GAPDH et biaiser les résultats.
L’utilisation d’autres gènes de référence seraient une bonne méthode pour
contourner ce biais dans des études futures. Enfin, nous n’avons pas discriminé la
provenance cellulaire de l’expression de l’ARNm codant pour la sélectine et
l’ARNm de toutes les cellules a été analysé. Comme la sélectine CD62L est
également exprimée sur les cellules NK et sur les lymphocytes B, les données
englobent également l’expression de CD62L par ces cellules. L’isolement des
cellules CD8+ avant le recueillement des extraits nucléiques permettraient d’éviter
ce biais dans des études ultérieures. Par contre, nos résultats montrent une
augmentation significative de l’expression de la sélectine sur les cellules CD8
murines et humaines suite à une incubation variant entre 24 h et 48 h avec des
IgIV. Comme la sélectine CD62L a récemment été associée à la régulation de
l’activité lytique des lymphocytes T CD8 activés [65], nous pouvons émettre
l’hypothèse que l’effet des IgIV sur la synthèse accrue de celle-ci pourrait jouer un
rôle dans l’inhibition des capacités lytiques des lymphocytes T CD8 observée in
vitro et in vivo par des membres de l’équipe [100].
75
4.3 Effet des IgIV sur le pouvoir tolérogène des monocytes
4.3.1 Indoleamine 2,3-dioxygenase
La tolérance aux molécules du soi par le système immunitaire est fondamentale et
les IgIV sont maintenant reconnues comme étant un traitement qui peut susciter un
état de tolérance immunologique sur certaines cellules immunes de patients traités
[139-142]. Un acteur important de la tolérance immune est l’enzyme IDO qui est
exprimée par plusieurs cellules, incluant les monocytes et les DC. En plus d’agir
comme un agent régulateur des réponses immunes en dégradant le Trp [28], IDO
agit également comme un transducteur en conférant aux CPA des propriétés
tolérogènes en réponse au TGF-β [28, 34, 143, 144]. Nos résultats ont permis de
mettre en évidence un effet des IgIV sur l’expression de l’enzyme IDO par des
monocytes isolés à partir des PBMC de quatre différents donneurs. En effet, le
pourcentage des monocytes qui expriment l’enzyme est de quatre à cinq fois plus
important lorsque ceux-ci ont subi un traitement aux IgIV variant de 48 à 96 h.
L’activité enzymatique de IDO a également été mesurée dans des conditions avec
ou sans IgIV et les résultats n’ont pas permis d’observer une différence
significative entre les deux conditions. L’augmentation de l’expression de IDO par
les monocytes traités aux IgIV ne semble donc pas associée à une augmentation
de l’activité enzymatique de celle-ci. Cela indique donc que l’enzyme agirait plutôt
ici via son pouvoir transducteur (mécanisme par lequel la simple augmentation de
son expression suffit) [34] et non via ses capacités enzymatiques afin d’induire un
pouvoir tolérogène aux monocytes traités aux IgIV.
Comme cette voie indépendante de l’activité enzymatique est fortement associée à
la présence de TGF-β dans l’environnement extracellulaire des cellules qui
expriment l’enzyme [145, 146], nous avons comparé l’expression du TGF-β par les
mêmes monocytes dans des conditions avec ou sans IgIV. Nous avons alors
observé une augmentation significative de la quantité d’ARNm codant pour le TGF-
β par les monocytes ayant subi un traitement aux IgIV. Cette cytokine aux effets
76
anti-inflammatoires est reconnue pour ses capacités à inhiber les aptitudes de
présentation antigénique des macrophages [147-149] et pour ses capacités à
permettre aux CPA d’acquérir un pouvoir tolérogène [147-150]. Enfin, le TGF-β
joue un rôle crucial dans l’induction et le maintien des lymphocytes T régulateurs
[147-149, 151]. Ces résultats suggèrent donc que l’induction de la tolérance par les
IgIV pourrait s’expliquer par leur capacité à induire la sécrétion du TGF-β par les
monocytes traités.
Il a été démontré que les effets du TGF-β dans l’induction du pouvoir tolérogène
étaient dépendants d’une seconde cytokine, le TNF-α [152], En effet, suite à une
administration systémique d’anti-TNF-α chez des souris, le pouvoir tolérogène des
CPA a été fortement diminué [152]. De plus, il a été rapporté que le TNF-α, lorsque
sécrété par des CPA ayant été en contact avec du TGF-β, agit comme un support
aux capacités tolérogènes des CPA [153]. Nos résultats montrent que, tout comme
pour le TGF-β, la sécrétion du TNF-α par les monocytes des 4 mêmes donneurs
est significativement augmentée lorsque les cellules sont traitées aux IgIV.
Regroupés ensemble, nos résultats sur l’expression des cytokines par les
monocytes suggèrent une interaction complexe entre ces derniers et les IgIV dans
laquelle les modifications de l’environnement extracellulaire (présence de TGF-β et
de TNF-α) pourraient mener les monocytes à acquérir des propriétés tolérogènes
en exprimant plus fortement l’enzyme IDO. Cependant, d’autres études devront
être menées pour évaluer plus précisément le rôle de la voie TNF-α/TGF-β/IDO
dans l’induction de la tolérance par les IgIV.
4.3.2 NLRP6 et NLRP10
Nos résultats ont permis de démontrer un effet significatif des IgIV sur l’expression
de NLRP10, lequel est exprimé par un pourcentage de monocytes plus élevé suite
à un traitement de 48 et 72 h. Nous avons également démontré que les IgIV n’ont
aucun effet significatif sur l’expression de NLRP6 par des monocytes humains
traités pendant 24 à 96 h. Comme NLRP6 est clairement associé à un effet pro-
77
inflammatoire en collaborant à la formation de l’inflammasome [9, 10], il était
attendu que les IgIV inhibent ou n’aient aucun effet sur ce récepteur. En
démontrant par contre que les IgIV, reconnues pour leurs effets anti-inflammatoires
chez les patients traités, agissent en augmentant l’expression de NLRP10 par des
monocytes humains purifiés, nos résultats appuient les conclusions de deux
études traitant de la découverte [12] et du rôle anti-inflammatoire [11] de NLRP10.
Ces études, menées par le même groupe de recherche en 2004 et 2010
respectivement, sont en fait les premières à avoir démontré un rôle anti-
inflammatoire pour ce membre de la famille des NLRP. Par la suite, d’autres
chercheurs se sont intéressés au récepteur, mais le rôle exact de NLRP10 dans la
régulation négative de l’inflammasome demeure mal compris. En effet, alors
qu’une étude subséquente a démontré qu’une liaison de la caspase-1 par le
NLRP10 pourrait être à l’origine de l’effet inhibiteur observé sur la sécrétion des
cytokines IL-1β et IL-18 [154], d’autres chercheurs ont démontré que NLRP10 était
essentiel à l’établissement d’une immunité innée et adaptative fonctionnelle [155].
Ces chercheurs ont utilisé des souris dont le gène codant pour NLRP10 avait été
invalidé et ne sont pas parvenus à établir un lien entre celui-ci et la régulation de
l’inflammasome, mais ont par contre mis en évidence une défaillance dans leur
habileté à répondre à différents signaux de danger tel le LPS [155]. Par contre, les
résultats obtenus dans la présente étude suggèrent que la modulation de
l’expression de NLRP10 par les IgIV contribue à leur activité immunomodulatrice et
appuient les travaux d’Imamura et al. qui proposent un rôle anti-inflammatoire pour
NLRP10 [11]. La mise en évidence d’un lien clair entre NLRP10 et les IgIV pourrait
mener à une meilleure compréhension des mécanismes d’action des IgIV dans le
traitement de l’auto-immunité.
5. Conclusion
Dans cette étude, nous avons montré que les effets des IgIV dans l’inhibition de
l’activation des lymphocytes T OT-I subséquente à la présentation croisée de
78
l’ovalbumine soluble s’explique partiellement par une neutralisation des
endotoxines présentes dans les préparations commerciales d’ovalbumine
classiques utilisées pour activer les DC. Ce faisant, l’expression des molécules de
surfaces CMH I, normalement accrue suivant un traitement aux endotoxines,
demeure à un niveau basal si les DC sont activées avec de l’ovalbumine en
présence d’IgIV. Nos résultats suggèrent également que les IgIV lient l’intégrine
CD11c présente sur les DC, laquelle lie normalement la molécule ICAM-I présente
sur les lymphocytes T pour ainsi stabiliser les interactions DC-lymphocytes T au
moment de la synapse immunologique. Nos résultats ont permis de mettre en
évidence une nouvelle cible potentielle des IgIV en agissant sur l’expression de la
sélectine CD62L, laquelle régule l’acquisition des capacités lytiques des
lymphocytes T CD8 et participe, via son interaction avec les filaments d’actine, au
modelage de la cellule nécessaire dans l’établissement des contacts cellule-cellule
ou cellule-environnement extracellulaire. Enfin, nos résultats ont permis de
démontrer un impact positif des IgIV sur le pouvoir tolérogène des monocytes
humains en augmentant le pourcentage de monocytes qui expriment l’enzyme IDO
ainsi que le récepteur intracellulaire NLRP10.
À ce jour, les théories concernant les mécanismes d’action des IgIV dans l’auto-
immunité divergent généralement vers deux grandes tendances, soit elles
expliquent l’effet anti-inflammatoire des IgIV via un effet direct sur les lymphocytes
ou alors elles expliquent les effets observés par des mécanismes dirigés plutôt
vers les CPA responsables d’activer les lymphocytes. Dans l’ensemble, les
résultats des travaux entourant mon projet de maîtrise ne suggèrent pas que les
IgIV exercent leur pouvoir immunosuppresseur en agissant seulement sur les
lymphocytes T ou alors seulement sur les CPA, mais suggèrent plutôt un effet
bidirectionnel en agissant à la fois sur les CPA et sur les lymphocytes T CD8.
79
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