LUCAS DE LUCENA SIMÕES E SILVA Efeito do treinamento físico na doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) em camundongos obesos: aspectos relacionados com a inflamação e resistência insulínica Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Programa de Ciências em Gastroenterologia Orientador: Prof. Dr. José Jukemura São Paulo 2020
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Transcript
LUCAS DE LUCENA SIMÕES E SILVA
Efeito do treinamento físico na doença hepática gordurosa não alcoólica
(DHGNA) em camundongos obesos: aspectos relacionados com a
inflamação e resistência insulínica
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Programa de Ciências em Gastroenterologia
Orientador: Prof. Dr. José Jukemura
São Paulo
2020
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca daFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
Responsável: Erinalva da Conceição Batista, CRB-8 6755
Silva, Lucas de Lucena Simões e Efeito do treinamento físico na doença hepáticagordurosa não alcoólica (DHGNA) em camundongosobesos : aspectos relacionados com a inflamação eresistência insulínica / Lucas de Lucena Simões eSilva. -- São Paulo, 2019. Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina daUniversidade de São Paulo. Programa de Ciências em Gastroenterologia. Orientador: José Jukemura.
Descritores: 1.Fígado gorduroso 2.Exercício3.Camundongos obesos 4.Resistência à insulina5.Inflamação 6.Fígado 7.Pâncreas
USP/FM/DBD-275/19
A todos aqueles qυе dе alguma forma
estiveram е estão próximos dе mim, fazendo
esta vida valer cada vеz mais а pena.
Agradecimentos
É chegado então o momento de expressar os mais sinceros agradecimentos a
muitos e tantos adorados familiares, amigos e colegas de trabalho.
Ao meu orientador, Prof. José Jukemura, por suas orientações, pelo seu
otimismo e senso de humor para enfrentar os momentos de dificuldades durante
esta jornada e que no alto de sua sabedoria, soube ser tão humilde ao repassar
todo o seu conhecimento e que esteve comigo até a sua completa conclusão.
À Prof.ª Claudia Oliveira pela sua diferenciada visão e perspectiva com as
diferentes áreas da saúde, por me acolher em seu grupo de pesquisa quando
ainda estava na graduação e ter dedicado um pouco da sua rotina agitada para
ouvir minhas ideias, além de suas orientações e contribuições não só para o
trabalho mas também para vida.
Ao Prof. Stefano Tadeu pelas boas e descontraídas conversas durante aquelas
tardes no laboratório, além de compartilhar seus conselhos e experiências de
vida para engrandecimento profissional e principalmente pessoal.
À Prof. Márcia Kubrusly, por suas orientações e experiências de vida, além de
conselhos e experiências de laboratório, por sempre estar me motivando a
continuar em frente de cabeça erguida principalmente nos momentos de
dificuldades.
Ao meu colega de mestrado e amigo Matheus Santos, por estar no dia-a-dia na
pesquisa ao meu lado, sempre visando o sucesso profissional e pessoal.
A todos os integrantes do grupo de pesquisa em NASH da prof.ª Claudia, em
especial ao Mauro Duarte por compartilhar um pouco de sua rotina não só no
grupo mas também suas experiências na USP, reforçando ainda mais a
importância e o papel das diversas áreas da saúde no tratamento multidisciplinar.
Aos integrantes do grupo de pesquisa da EACH e em especial a Fabiana
Evangelista por dividir seus conhecimentos profissionais e vivências de
laboratório para o treinamento dos animais.
À Vilma por sua disposição e sua paciência, por sempre me atender com aquele
sorriso descontraído e alegre mesmo em momentos corridos.
A todos os professores que contribuíram diariamente com seu conhecimento e
dedicação e que foram importantes na minha jornada acadêmica.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
apoio financeiro.
À Deus, por permitir que tudo isso acontecesse e pelo imenso prazer que é viver
amparado por suas mãos, por sua proteção e suas bênçãos.
À meus queridos pais e familiares por suas sábias lições de vida e de esperança,
sempre alimentando meus sonhos e me enchendo de amor e carinho,
depositando a confiança necessária para realizar meus sonhos.
À minha querida noiva Eline Autran por estar comigo desde o início desta jornada
sempre me dando forças e depositando suas esperanças, por me aguentar nos
momentos de raiva e angústia, por respeitar minhas vontades e necessidades
durante este processo, por sua compreensão, força de motivação e apoio moral
para a execução deste trabalho.
Há muito mais a quem agradecer. A todos aqueles que, embora não nomeados,
me brindaram com seus inestimáveis apoios em distintos momentos e por suas
presenças afetivas e inesquecíveis, o meu reconhecido e carinhoso muito
obrigado!
Todos vocês foram partes fundamentais para execução deste trabalho!
SuperScript™ III Platinum® One-Step Quantitative RT-PCR System (Invitrogen
Life Technologies, Carlsbad, EUA), conforme recomendação do fabricante. A
intensidade de expressão de cada gene foi obtida pelo valor de limiar do ciclo,
no qual o aumento no sinal associado à fase exponencial de amplificação do
fragmento começa a ser detectada. A reação para cada gene analisado foi
cuidadosamente padronizada com a finalidade de evitar qualquer amplificação
inespecífica. A temperatura de anelamento para a amplificação dos genes IRS-
2, GLUT-2 IL-6 e IL-10 foi 55 ºC, enquanto que para o gene de TNF-a foi de 57
ºC. Todas as reações de RT-q PCR foram realizadas em duplicata para cada
amostra de tecidos hepático e pancreático tanto para o gene alvo quanto para o
controle endógeno (β-actina).
32
Sequência dos primers (forward/reverse) utilizados na reação de qRT-PCR
para cada gene estudado
Genes Sequência
IRS-2 F: CGG CTG GAG TAC TAC GAG AG
R: CGC GCT TGT TGA TGT TCA GA
GLUT-2 F: TCA GAA GAC AGG GTA CAG CGA
R:TCC AGT GCC AGC GTA TAA GT
TNF-α F: CCA CCA CGC TCT TCT GTC TA
R: TCC TTC TTG CCC TCC TAA CC
IL-6 F: TTC TTG GGA CTG ATG CTG GT
R: CAG GTC TGT TGG GAG TGG TA
IL-10 F: TGC TGC TCC TCC CCT ATT TC
R: TTC GGA TGT GCC TGG GTT TA
Β-actina F: TGT CAC CAA CTG GGA CGA TA
R: GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA
F= forward; R= reverse
3.12 – Método de análise da expressão gênica
Para o cálculo do nível de expressão de cada gene alvo, utilizou-se o
método 2-delta delta Ct para a quantificação relativa [43], onde Ct (“threshold
cycle”) é o ciclo da PCR em tempo real, no qual a amplificação atinge a fase
logarítmica, onde delta Ct é a diferença de expressão entre gene alvo e controle
endógeno de uma determinada amostra e delta delta Ct corresponde à diferença
entre o delta Ct da amostra e o delta Ct do controle.
A fórmula utilizada para a quantificação relativa (QR):
QR= 2-ΔCt
ΔCt= Ct gene alvo-Ct gene referência
ΔΔCt= ΔCt amostra-ΔCt controle
33
3.13 – Análises Estatísticas:
Todos os dados foram expressos como média ou mediana (dependendo
do padrão de distribuição das variáveis) e seus respectivos valores mínimos
(min), máximos (máx) e de desvio padrão (DP). Para variáveis de distribuição
paramétrica foram utilizados teste-t, one-way ANOVA e o pós-teste Bonferroni
de múltiplas comparações. Para variáveis de distribuição não-paramétrica foram
utilizados os testes de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis e o pós-teste Dunn's de
comparações múltiplas. Para comparação dos escores histológicos entre os
grupos foram utilizados os testes de Qui-quadrado com exato de Fisher. Foram
consideradas variáveis significativas aquelas em que o p<0,05. Todos os
cálculos e análises foram realizados com o software GraphPad Prism V6.0
(GraphPad Software Inc).
34
RESULTADOS
35
4.0 – RESULTADOS
4.1 – Avaliações metabólicas:
4.1.1 – Peso corporal:
No momento inicial do protocolo de treinamento, não foram observadas
diferenças significativas entre os grupos de estudo, porém, ao final do protocolo,
foram observadas diferenças significativas da média de peso corporal do grupo
treinado em comparação ao grupo sedentário (12.9±2.9 VS 9.6±2.1 p= 0.008). Em
relação a evolução de peso corporal, a partir da terceira semana de treinamento,
foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos sedentário e treinado
(Figura 1). Ainda sobre este resultado, os animais sedentários obtiveram um
ganho de peso médio de 35% durante todo o protocolo experimental enquanto
que os animais submetidos ao treinamento aeróbio obtiveram um ganho médio
de 26%.
P e s o C o r p o r a l
Gra
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gr)
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5
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36
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S E D
TF
p = 0 .0 0 0 3
******
Fig 1: Gráficos de comparação da média de peso corporal entre os grupos e de evolução de peso corporal dos grupos de estudo frente ao protocolo de treinamento físico aeróbio de 8 semanas.
4.1.2 – Consumo alimentar:
Em relação ao consumo de água e ração, foram encontradas diferenças
significativas do grupo sedentário em comparação ao grupo de animais treinados
(Figura 2). Em ambas as variáveis, os animais sedentários apresentaram
maiores valores em comparação aos animais treinados (Tabela 1).
C o n s u m o d e Á g u a
mL
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ima
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4h
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DT
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37
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p < 0 .0 0 0 1* * * *
S E D
T F
Fig 2: Gráficos de consumo de água e ração de ambos os grupos de estudo frente ao protocolo de treinamento aeróbio de 8 semanas
Tabela 1 – Ganho de peso corporal e consumo alimentar ao final do protocolo experimental
Sedentários
(n=7) Treinados
(n=7) P
Ganho de peso corporal (g)
12.9±2.9 9.6±2.1 0.008
Ganho de peso (%) 35.6±10.1 26.8±6.5 0.03
Consumo de Água 6.6±1.5 4.9±1.2 0.001
Consumo de Ração 5.6±1.1 4.4±0.9 < 0.0001
p<0,05
4.1.3 – Tecidos Adiposos e Peso Hepático:
Em relação aos tecidos adiposos foram observadas diferenças para o
tecido retroperitoneal sendo os menores valores encontrados nos animais
pertencentes ao grupo TF (Tabela 2). No fígado foram encontradas diferenças
estatísticas sendo o grupo treinado com os menores valores em comparação aos
sedentários. Em relação aos outros tecidos foram encontradas diferenças
significativas no peso absoluto e peso relativo do fígado do grupo treinado em
comparação ao grupo sedentário.
38
Tabela 2 – Peso dos órgãos e tecidos adiposos de camundongos ob/ob de ambos os grupos ao final do protocolo de treinamento físico (peso absoluto e peso relativo)
Sedentários (n=7)
Treinados (n=7)
p
Peso absoluto
Fígado (gr) 2.5±0.3 2.2±0.2 0.04
T. adiposo peritonial (gr) 2.5 (2.0–5.5) 1.5 (1.5–4.0) 0.03
T. adiposo inguinal (gr) 2.4±0.6 1.8±0.8 0.10
T. adiposo periepididimal (gr) 3.0±1.3 2.9±0.9 0.87
Peso relativo
Fígado (mg) 54.0±4.8 50.3±5.3 0.04
T. adiposo peritonial (mg) 59.5 (40.0–103.1) 36.1 (32.6–93.0) 0.04
T. adiposo inguinal (mg) 51.5±15.9 42.5±20.1 0.49
T. adiposo periepididimal (mg) 64.4±32.1 66.4±18.9 0.88
p<0,05
4.2 – Teste de esforço físico máximo
No que diz respeito às variáveis ligadas ao treinamento físico, no momento
pré treinamento não foram observadas diferenças significativas para velocidade
pico, distância percorrida e tempo de exposição ao teste de esforço entre os
grupos de estudo, no entanto, ao final do protocolo foram observadas diferenças
significativas dos animais treinados no momento pré treinamento em
comparação ao momento pós treinamento do grupo sedentário (Fig 3).
39
V e lo c id a d e P ic o (k m /h )
Ve
loc
ida
de
(k
m/h
)
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min
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S E D P ó s
T F P ó s
p = 0 .0 0 6 9
*
Fig 3: Resultados de ambos os grupos de estudo obtidos através do teste de esforço físico máximo frente às variáveis ligadas ao protocolo de treinamento físico aeróbio
40
4.3 – Histologia Hepática:
Para as análises de avaliação histológica no fígado, não foram encontradas
diferenças significativas para esteatose macrovesicular, esteatose
microvesicular, hipertrofia hepatocelular e focos inflamatórios.
Tabela 3 – Tabela de características histológicas do tecido hepático de camundongos obesos (ob/ob)
Sedentários* Treinados* P
1 2 3 4 5 6 7 8
Esteatose
macrovesicular (0–3) 0 2 1 2 1 2 2 0
0.965
Esteatose
microvesicular (0 – 3) 0 3 2 3 2 3 2 3
Hipertrofia
hepatocelular (0 – 3) 0 2 2 2 1 2 1 2
Focos inflamatórios
(0 – 3) 0 2 3 3 2 2 3 0
*Identificação realizada por microchip;
4.4 – Histologia Pancreática:
Em relação ao pâncreas, devido à ausência de um escore específico para
este órgão, o grupo realizou uma tabela descritiva no qual foram analisadas as
necrose acinar, infiltrado inflamatório, hemorragia, e necrose de gordura. A
tabela a seguir descreve as características de cada animal avaliado.
41
Tabela 4 – Tabela de descrição da análise histológica pancreática realizada em ambos os grupos de estudo após o procotolo de treinamento físico
ID Gordura
interlobular
Gordura
Intralobular Fibrose Edema
Necrose
Acinar
Infiltrado
Inflamatório Hemorragia
Necrose
de
Gordura
Escore
Final
Grupo
Sedentário
0354 0 (5%) 0 0 0 0 0 0 0 0
1010 3 (40%) 0 0 0 0 11 – 15
pmn 0 0 0
0493 3 (40%) 0 0 0 0 0 0 0 0
1840 0 (5%) 0 0 0 0 11 – 15
pmn 0 0 0
0253 0 (5%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 2
1053 0 (5%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 0
2118 0 (2%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 0
Grupo
Treinado
0370 0 (0%) 0 0 0 0 0 0 0 0
0678 1 (10%) 0 0 0 0 0 0 0 1
0957 0 (0%) 0 0 0 0 0 0 0 0
0420 – – – – – – – – –
0529 1 (10%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 1
1581 3 (40%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 0
7796 3 (40%) 0 0 0 0 2 – 5 pmn 1 0 –
Identificação realizada por microchip
42
Fig 4 Histologia pancreática de camundongo ob/ob sedentário sem infiltração de gordura. 1= Ilhota de Langerhans; 2= vaso sanguíneo (ampliação original X 40)
Fig 5 Ácino pancreático de camundongo ob/ob sedentário. Presença de raros linfócitos (seta) em tecido frouxo periacinar. (ampliação original X 40)
43
Fig 6: Pâncreas de camundongo ob/ob treinado com gordura visceral adjacente (seta) ao parênquima pancreático sem sinais de infiltração lobular. (ampliação original X 5)
Fig 7: Visão panorâmica do pâncreas de camundongo ob/ob sedentário com morfologia e tecido preservados. (ampliação original X 20)
44
Fig 8: Histologia hepática de camundongos ob/ob. A e B: Histologia hepática de animais sedentários (Escala de 100 µm). C e D: Histologia hepática de animais treinados (Escala de 100 µm)
45
4.5 – Expressão genica:
4.5.1 – No tecido hepático:
Em relação a expressão gênica no tecido hepático, para os genes
relacionados com a resistência à insulina (Fig 9), foram observadas diferenças
significativas para o gene GLUT-2 (1.5±0.6 VS 0.7±0.3), e em relação aos genes
relacionados com inflamação foram encontradas diferenças signficativas para IL-
6 (1.1(0.3–1.9) VS 3.6 (0.7–5.3)) e IL-10 (0.7 (0.2–2.7) VS 1.3 (0.6–3.6)). Para
os outros genes do estudo, não foram observadas diferenças significativas.
IR S 2
F íg a d o
Un
ida
de
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itrá
ria
s
SE
D TF
0 .0
0 .5
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p = 0 .0 8 1 9
G L U T 2
F íg a d o
Un
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de
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s
SE
D TF
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
S E D
T F
p = 0 .0 3 3 6
*
Fig 9: Gráfico de comparação entre os animais sedentários e treinados frente as análises de resistência à insulina no tecido hepático
46
T N F -a
F íg a d o
Un
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de
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*
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s
SE
D TF
0
1
2
3
4
S E D
T F
p = 0 .0 3 5 5
*
Fig 10: Gráfico de comparação entre os animais sedentários e treinados referente as análises de expressão gênica de inflamação no tecido hepático
47
4.5.2 – No tecido pancreático:
No pâncreas, para os genes relacionados com a resistência à insulina
foram encontradas diferenças significativas para IRS-2 (0.3 (0.1–0.9) VS 1.7
(0.7–5.2)) e GLUT-2 (0.5±0.3 VS 1.8±1.3). Para os genes relacionados com a
resposta inflamatória, foram encontradas diferenças significativas para IL-6 (0.07
(0.04–0.10) VS 3.1 (0.9–3.9)) e IL-10 (0.7 (0.4–1.7) VS 6.1 (1.1–14.3)). Não
foram observadas diferenças significativas para análise de TNF-a.
IR S 2
P â n c re a s
Un
ida
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s
SE
D TF
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3
4
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S E D
T F
p = 0 .0 3 1 4
*
Fig 11: Gráfico de comparação dos grupos de estudo frente as análises de expressão gênica referentes à resistência insulínica no tecido pancreático
48
‘
T N F -a
P â n c re a s
Un
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s A
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s
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0
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SE
D TF
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IL - 10
P â n c re a s
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s
SE
D
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1 0
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S E D
T F
p = 0 .0 0 8 7
**
Fig 12: Gráfico de comparação dos grupos de estudo frente as análises de expressão gênica referentes à inflamação no tecido pancreático
49
DISCUSSÃO
50
5.0 – DISCUSSÃO:
O exercício físico tem sido empregado como uma das principais estratégias
profiláticas e terapêuticas no tratamento de diversos agravos a saúde e também
no tratamento e prevenção de doenças crônicas. Em muitos casos, o
treinamento físico pode incrementar o limiar de tolerância fisiológica além das
variáveis ligadas ao treinamento como melhoria da aptidão cardiorrespiratória,
aumento da velocidade pico e maior tolerância ao esforço físico. Além disso, o
treinamento físico é capaz de modular a dinâmica dos ácidos graxos intra e
extracelulares que são utilizados na produção de energia de acordo com o
estado nutricional e a aptidão física do praticante, além da intensidade e duração
do exercício. A quantidade de ácido graxo usada durante o exercício leve ou
moderado aumenta exponencialmente quando comparado em condições de
repouso [44 45]. Portanto, o exercício físico é uma ferramenta importante para o
controle e redução de peso corporal e tecido adiposo. No presente estudo, o
treinamento físico atenuou a evolução no ganho de peso corporal dos animais
treinados a partir da 3ª semana mostrando um importante impacto metabólico
nestes animais. Além disso, ao final do protocolo, os animais sedentários
apresentaram um percentual de 35% de ganho de peso enquanto os animais
treinados apresentaram um percentual de 26%, ou seja, uma diferença na
evolução do ganho de peso de 9%, mostrando que o treinamento físico é capaz
de estabilizar o ganho de peso em camundongos ob/ob.
Em um estudo realizado por Evangelista et al. [33] foi observado que o
treinamento físico foi capaz de melhorar aspectos relacionados ao controle de
peso corporal e equilíbrio energético em camundongos ob/ob, mostrando que os
animais treinados obtiveram um aumento no ganho de peso de 23% enquanto
os animais sedentários 41%. Em estudos realizados anteriormente pelo grupo,
foi observado que o treinamento físico foi capaz de controlar o ganho de peso
corporal em camundongos selvagens e em animais alimentados com dietas de
lanchonetes e com alto teor de gordura [46 47].
Gollisch et al. [48] mostraram em seu estudo que o exercício físico foi capaz
de melhorar a resistência à insulina, causar mudanças positivas no metabolismo
de lipídios e gerar uma maior tolerância ao esforço físico. Além disso, este
51
estudo, fornece novos dados e perspectivas sobre as respostas da gordura
subcutânea e visceral para dieta rica em gordura e treinamento físico neste
modelo animal, e que a obesidade induzida por dieta hiperlipídica e a resistência
à insulina podem ocorrer sem inflamação detectável.
Embora as reduções no ganho de peso corporal possam melhorar a
qualidade de vida e prevenir o desenvolvimento de complicações relacionadas à
obesidade, como resistência à insulina, diabetes tipo 2 e hipertensão, Broderick
et al. [49] mostraram que houve atenuação no ganho de peso corporal.
Entretanto, a atividade física voluntária não resultou na ativação do sistema
cardioprotetor peptídeo natriurético de ocitocina cardíaca (OT-NP) no modelo
ob/ob de obesidade e camundongos db/db, predispondo a fatores de risco para
doença cardiovascular. No entanto, este resultado é questionável, pois durante
o protocolo de exercício, os camundongos ob/ob, apesar de atingirem a
recomendação mínima de tempo exigida pelo American College of Sports
Medicine (ACSM) [50-52] , não foi possível verificar em que intensidade estes
animais atingiam durante as sessões diárias.
A diferença entre o consumo de energia e gasto energético são fatores
determinantes para o controle do peso corporal, e que quando há uma exposição
ao exercício físico de forma contínua, o organismo começa a responder de
maneira a obter mais energia com a finalidade de compensar os gastos
energéticos, visando a manutenção do metabolismo do praticante [53 54].
Portanto, é esperado observar um aumento compensatório na ingestão de
alimentos [55]. Além disso, os camudongos ob/ob são conhecidos pela sua
deficiência na produção de leptina funcional, consequentemente, levando ao
desenvolvimento acelerado da obesidade, aumento no consumo alimentar
(hiperfagia), hiperglicemia e hiperinsulinemia [56 57]. Em relação ao consumo
médio de água e ração por animal, esperávamos encontrar um aumento no
consumo alimentar dos animais submetidos ao treinamento físico, no entanto, foi
visto que os animais treinados obtiveram valores significativamente menores em
comparação aos animais sedentários. Uma das possíveis explicações para este
fenômeno pode ser o impacto que o exercício físico contínuo causa nos
processos fisiológicos. Como o exercício produz ajustes no fluxo sanguíneo, na
resposta hormonal gastrointestinal, no esvaziamento gástrico, no metabolismo
52
celular muscular, na bioquímica do tecido adiposo e na atividade cerebral, esta
mudança pode ter causado uma interferência em alguns dos mecanismos
envolvidos no controle do apetite [58 59]. Além disso, acreditamos que o
exercício físico, pode ter causado mudanças positivas na produção de leptina
funcional, gerando um menor consumo alimentar devido a esta melhoria. No
entanto, mais estudos são necessários para confirmar tal hipótese, pois os
mecanismos entre a prática regular de exercício físico, produção e manutenção
de leptina ainda não estão bem elucidados.
Em relação à velocidade pico, distância percorrida e tempo de tolerância
ao esforço, esperávamos encontrar uma diferença significativa no momento pré
treinamento do grupo sedentário em comparação ao momento pós treinamento
do grupo treinado. Apesar de não ter sido encontrado tais diferenças
significativas, a média de valores dos animais treinados para estas variáveis
foram maiores em relação aos sedentários, e que os animais do grupo sedentário
tiveram um decréscimo em relação ao teste de esforço físico. Baseado neste
resultado, podemos afirmar que o comportamento sedentário causa um
descréscimo em relação a velocidade pico, distância percorrida e tempo de
tolerância ao esforço, contribuindo para a progressão e gravidade da doença,
além de baixa aptidão cardiovascular, que por sua vez apresenta uma alta
prevalência em pacientes acometidos por esta doença [60]. Apesar de não terem
sido encontradas diferenças significativas do momento pré e pós treinamento no
grupo treinado, recomenda-se que a prática regular de exercício físico seja
encorajada para a população acometida pela DHGNA.
Sabe-se que o excesso de tecido adiposo visceral e hepático está
independentemente associado ao risco cardiometabólico, além de serem fatores
agravantes não só em relação a parâmetros da doença, mas tambem o
comprometimento da atividade de outros órgãos. Devido a alta variabilidade no
que diz respeito ao que se chama de histórico natural da DHGNA e apesar dos
avanços tecnológicos na área clínica contribuirem para um melhor tratamento da
doença, não há uma metodologia precisa para a prevenção das condições mais
severas como EHNA, fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). A perda
de peso através de modificações no estilo de vida pode reduzir tanto o tecido
adiposo visceral como a gordura do fígado, mas a perda de peso de 5 a 15% é
53
desejável para reduções clinicamente significativas no tecido adiposo visceral
[50] e para melhorias histológicas no fígado (65% de melhoria na pontuação do
NAS com perda de peso > 10%) [61 62]. Em nosso estudo, acreditamos que a
não visualização de diferenças significativas para as análises de histologia
hepática e pancreática entre os grupos, foi devido ao fato destes animais não
apresentarem perdas de peso ao longo do protocolo de treinamento físico, sendo
observado apenas a atenuação de peso corporal dos animais treinados. É
necessário mais estudos relacionando o comportamento de diferentes
intensidades, duração e volume do treinamento físico com aspectos ligados a
histologia destes órgãos, visto que este campo de pesquisa, não está
completamente elucidado. Os camundongos ob/ob, apresentam um fenótipo da
obesidade bastante agressivo no que diz respeito as características físicas e
histológicas, sendo difícil de observar perdas de peso significativas, no entanto,
alguns estudos apontam que apesar de não haver perdas de peso através do
exercício físico, é possivel observar efeitos positivos em características da
DHGNA [63-65]. Apesar dos animais do grupo treinado apresentarem mudanças
positivas nas variáveis de treinamento físico, em relação à histologia hepática,
não foram observadas diferenças significativas entre os grupos de estudo, sendo
os resultados encontrados semelhantes em todas as variáveis analisadas, ou
seja, em nosso estudo, 8 semanas de treinamento físico aeróbio em intensidade
moderada não foi capaz de atenuar os escores histológicos do fígado, em
camundongos ob/ob treinados.
Em relação histologia pancreática, devido à ausência de um escore
específico para este órgão, o grupo realizou uma tabela descritiva dos dados
analisados visto que os estudos envolvendo a infiltração de gordura pancreática
e aspectos da DHGNA, são escassos. Além disso, trata-se de uma área
relativamente nova, se comparada com o campo de investigação das doenças
hepáticas. Um estudo realizado por Mathur et al. [66] comparou as diferenças
entre as características pancreáticas de camundongos ob/ob e seu simliar
C57BL/6J (modelo magro). Nos resultados histopatológicos, apesar de não ter
sido encontrada diferenças significativas para as análises de gordura interlobular
e outros aspectos, foi visto que os animais obesos apresentaram maiores valores
no conteúdo de gordura pancreática. Baseado nos achados de Mathur e de Van
54
Geenen [42 66], esperávamos encontrar características semelhantes em nosso
estudo, no entanto, tanto os animais sedentários quanto os animais treinados
apresentaram valores semelhantes. Além disso, estudos com intervenções
ligadas a prática regular de atividade fisica e exercício físico relacionados com
histologia pancreática são escassos. Mais estudos investigativos são
necessários para melhor compreensão da infiltração de gordura pancreática e
sua relação com a DHGNA, neste modelo animal.
Sabe-se que tanto a resistência à insulina, quanto a inflamação são
elementos chave para a progressão da DHGNA e surgimento da EHNA. A
insulina possui um papel importante na regulação da homeostase de glicose em
vários níveis, reduzindo a produção hepática de glicose (via diminuição da
gliconeogênese e glicogenólise) e aumentando a captação periférica de glicose,
principalmente nos tecidos muscular e adiposo. Geralmente as membranas
celulares não são permeáveis a glicose, com isso, é necessário que haja
estruturas especializadas no transporte deste substrato para dentro da célula,
sendo denominado de transportadores de glicose (GLUT’s). O GLUT-2 é
expresso predominantemente no fígado, rim e pâncreas e desempenha um
papel importante na homeostase da glicose [67 68]. A insulina é secretada pelas
células-beta pancreáticas em resposta a níveis aumentados de glicose na
circulação sanguínea, sendo transportada para as células β através deste
transportador. Portanto, o GLUT-2 pode ser usado como um marcador para
avaliar a eficiência da atividade de glicose, e a diminuição da expressão está
associada à disfunção secretora de células β [69]. Sabe-se que quando há uma
exposição ao treinamento físico, independente de modalidade, há uma melhoria
nos aspectos relacionados a este hormônio [70]. De fato, nosso grupo encontrou
diferenças significativas na expressão dos genes IRS-2 e GLUT-2 no pâncreas,
ou seja, a exposição ao exercício físico foi capaz de aumentar a expressão de
tais genes, gerando melhorias tanto nos receptores quanto na captação e
utilização da glicose.
Por outro lado, o aumento na expressão de IRS-2 e GLUT-2 no fígado,
podem ter significados diferentes quando comparados ao pâncreas. Foi relatado
em estudos com ratos que a expressão de GLUT-2 é aumentada em resposta à
hiperglicemia [71 72] ] e diminuída pela hiperinsulinemia [73]. Em ratos Wistar
55
com diabetes, foi observado um aumento do RNAm do GLUT2 hepático, e esta
alteração era restaurada pela correção da glicemia por florizina, vanádio ou
insulina [74 75]. Outros estudos realizados em fígado de ratos, mostraram que a
proteína e o RNAm do GLUT-2 aumentaram 1,6 e 2 vezes, respectivamente,
após 3 semanas de diabetes [76 77] sendo este quadro revertido quando os
animais eram expostos ao tratamento com insulina por 5 dias apresentando
níveis de do gene semelhantes a animais não diabéticos [77].
Em um estudo realizado por Silva et al. 2011 [76], após 20 dias de
tratamento com aloxana, os ratos Wistar mostraram um ganho de peso inferior
ao grupo controle, o que está relacionado ao quadro catabólico decorrente da
hipoinsulinemia. No tecido hepático, o diabetes também promoveu aumento da
expressão do GLUT-2, sendo este quadro revertido com a administração de
insulina. Em nosso estudo, o grupo treinado apresentou menores valores da
expressão de GLUT-2 em comparação ao grupo sedentário, resultando em
valores de expressão deste gene semelhantes a condições de não diabetes.
Além disso, tais resultados corroboram com os achados de Silva et al.,
mostrando que a prática regular de exercício físico, apesar de não ter
apresentado melhorias significativas na histologia hepática, atua neste órgão
com o mesmo efeito da insulina sintética, contribuindo, a longo prazo para
melhorias em aspectos da DHGNA tanto no fígado quanto no pâncreas.
O exercício regular tem sido considerado uma poderosa ferramenta anti-
inflamatória quando realizado em intensidades controladas [78 79]. Na DHGNA,
a prática regular do exercício físico está associada à redução de citocinas pró-
inflamatórias, adipocinas e outros marcadores relacionados a lesões hepáticas
[80 81] , sendo observado um crescimento relevante no campo de investigações
acerca da inflamação e exercício físico na última década [82]. O treinamento
físico de intensidade moderada a alta induz a ativação de vias anti-inflamatórias
através de vários mecanismos, incluindo a supressão de citocinas pró-
inflamatórias [83], melhoria do estado anti-inflamatório do endotélio [84], e
melhorias na expressão de toll-like receptors (TLR’s) [85]. Os efeitos anti-
inflamatórios do exercício não são apenas mediados pela redução da gordura
visceral, mas também pela indução da cascata anti-inflamatória após cada
sessão de exercício [86 87].
56
A IL-6 é uma importante citocina pró-inflamatória secretada pelos
adipócitos sendo o tecido adiposo branco, o principal contribuinte com os níveis
circulantes desta citocina e está associada a condições como obesidade,
resistência à insulina, e um fator preditivo para diabetes mellitus tipo ll. No fígado
esta citocina apresenta um papel protetor, sendo capaz de suprimir a reação de
estresse oxidativo e prevenir a disfunção mitocondrial. No entanto, uma
exposição prolongada à IL-6 pode sensibilizar o fígado a lesões e contribuir para
a inflamação [88]. Os níveis circulantes de IL-6 estão aumentados em pacientes
com DHGNA comparados aos grupos controle, e níveis elevados de IL-6 estão
associados aos achados histopatológicos avançados [88]. Dessa forma, a IL-6
pode ser útil como único biomarcador não invasivo para distinguir a EHNA de
esteatose simples.
Durante o exercício físico, a IL-6 é uma das primeiras citocinas detectáveis
liberada através da contração muscular e liberada na corrente sanguínea. A IL-
6 derivada desta contração muscular aumenta a medida que o indivíduo é
exposto ao exercício de maneira frequente ou por longos períodos de tempo, no
entanto, a grande diferença entre a endotoxemia e a produção de citocinas
induzida pelo exercício é a ausência no aumento de outras citocinas como TNF-
a e IL-1b. Tal fenômeno foi observado no estudo de Starkie et al. [89] em que foi
administrado uma dose de E. coli para induzir um aumento nas concentrações
plasmáticas de TNF-a em indivíduos saudáveis, que foram randomizados para
repouso ou exercício antes a administração desta endotoxina. Em seus
resultados, a endotoxina foi responsável pelo aumento nos níveis circulantes de
TNF-a. No entanto, os participantes do grupo exercício conseguiram diminuir
totalmente os níveis de TNF-a, mostrando que os efeitos da prática regular de
exercício físico foram semelhantes ao tratamento com infusão de IL-6 para
supressão de TNF-a induzida por endotoxina.
O treinamento físico regular reduz a produção basal de IL-6, bem como a
magnitude da resposta aguda à IL-6, equilibrando vários estímulos potenciais da
IL-6. Portanto, é possível afirmar que uma das adaptações ao exercício físico
seria a redução na produção basal desta citocina, bem como a magnitude da
resposta aguda à IL-6 [90]. Além disso, enquanto que as concentrações
plasmáticas de IL-6 diminuem com a adaptação ao treinamento físico, os níveis
57
de expressão do seu receptor parecem estar aumentado, sugerindo que a
sinalização de IL-6 pode ser aumentada em indivíduos treinados [91]. Em nosso
estudo, os resultados encontrados para IL-6 em ambos os órgãos estavam
aumentados em comparação aos animais sedentários. Acreditamos que este
aumento foi devido a exposição ao exercício físico. Além disso, os resultados
encontrados de TNF-a dos animais treinados, em ambos os órgãos, foram
menores em relação aos sedentários, apesar de não terem sidos evidenciadas
diferenças signifcativas. Acreditamos que o aumento na expressão de IL-6 foi
responsável por estimular a atividade de IL-10, que por sua vez, é capaz de inibir
a produção exarcebada de TNF-a circulante. No entanto, esta hipótese não pode
ser comprovada por não ter sido objetivo do presente estudo. Além disso, não
foram realizadas dosagens de IL-6 no momento pré exercício para verificar se
houve alguma diferença antes e após a exposição ao porotoclo de treinamento,
portanto, não sabemos ao certo se este aumento no grupo treinado se deve ao
fato da exposição ao exercício físico ou aos achados histopatológicos destes
animais.
A IL-10 é uma citocina imunomoduladora potente cujo papel na DHGNA
não foi completamente elucidado [92 93]. Em camundongos exibindo doença
hepática gordurosa induzida por dieta, a inibição seletiva de IL-10 foi associada
com lipogênese aumentada, bem como aumento na expressão de TNF-a e
comprometimento da sensibilidade à insulina no fígado [94]. Além disso, estudos
adicionais em roedores alimentados com dieta hiperlipídica demonstraram que
a presença de DHGNA e hiperglicemia é acompanhada por baixos níveis
sistêmicos de IL-10, o que levou a propor que a IL-10 pode ter a capacidade de
prevenir a esteatose hepática e outras anormalidades metabólicas [95].
Estudos apontam efeitos benéficos da prática regular de exercício físico em
parâmetros não só da DHGNA mas também de doenças crônicas não
transmissíveis. No estudo de Batista et a. [96], a IL-10 parece responder de
maneira positiva à prática regular do exercício físico aeróbio, podendo atuar
como fator central na atenuação e/ou modulação da resposta inflamatória. Além
do aumento local na produção de IL-10, esse efeito poderia ter impacto
sistêmico, reduzindo, ou até mesmo evitando, o aumento de citocinas pró-
inflamatórias, como TNF-a, condição que, no caso da DHGNA está relacionada
58
à maior severidade dessa doença. Speretta et al. [97] avaliou o efeito de oito
semanas de treinamento de força de alta intensidade/curta duração e do
treinamento aeróbio de moderada intensidade/longa duração sobre a expressão
gênica de TNF-a e IL-10, e perfil lipídico. Independente de modalidade de
exercício, os animais submetidos ao treinamento físico apresentaram melhorias
significativas tanto na expressão de TNF-a, IL-10, além de melhorias no perfil
lipídico e conteúdo de gordura visceral em seus diferentes compartimentos. Tais
achados reforçam a ideia que a prática regular de exercício físico gera potenciais
benefícios no controle e manutenção não apenas do perfil lipídico, mas também
na melhoria da expressão de IL-10 e inibição na expressão de TNF-a.
Em nosso estudo, os animais treinados apresentaram níveis de expressão
de IL-10 maiores em comparação aos sedentários, corroborando com os
achados de Batista e Speretta. Além disso, os animais treinados apresentaram
menores valores na expressão de TNF-a em comparação ao grupo sedentário,
apesar de não ter sido evidenciado diferenças significativas. Baseado nos
achados da literatura, acreditamos que tal resultado poder ter sido influenciado
pela melhoria da citocina IL-10, visto que possui um papel importante na inibição
e controle da expressão de citocinas pró-inflamatórias. A partir dos resultados
encontrados em nosso estudo e nos achados da literatura, é possível afirmar
que o protocolo de treinamento físico aeróbio gerou efeitos positivos na resposta
anti-inflamatória, principalmente no pâncreas de animais ob/ob treinados e
consequentemente, a melhoria na expressão de IL-10 nestes animais também
favoreceu para a melhoria e manutenção da sensibilidade à insulina, visto que
esta citocina apresenta forte relação com tal fenômeno.
59
CONCLUSÃO
60
6.0 – CONCLUSÃO:
Na condição em que o estudo foi realizado, podemos concluir que:
• O protocolo de treinamento físico aeróbio realizado por 8 semanas foi
capaz de promover modificações positivas nos genes IRS-2 e GLUT-2
tanto no fígado quanto no pâncreas, além de melhorias na expressão de
citocinas anti-inflamatórias, conferindo um fator protetor em ambos os
órgãos.
• O estudo também mostrou que através deste protocolo, houve atenuação
no ganho de peso corporal de camundongos obesos, melhorias no
consumo alimentar e aumento da tolerância ao exercício físico.
• Quanto às características histopatológicas, não foi possível observar
diminuição nos escores para fígado enquanto que no pâncreas, apesar
de não ter sido evidenciada diferenças estatísticas, os camundongos
submetidos ao protocolo de treinamento aeróbio apresentaram menores
valores histológicos, principalmente em aspectos de infiltrado inflamatório.
61
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62
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca daFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
Responsável: Erinalva da Conceição Batista, CRB-8 6755
Silva, Lucas de Lucena Simões e Efeito do treinamento físico na doença hepáticagordurosa não alcoólica (DHGNA) em camundongosobesos : aspectos relacionados com a inflamação eresistência insulínica / Lucas de Lucena Simões eSilva. -- São Paulo, 2019. Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina daUniversidade de São Paulo. Programa de Ciências em Gastroenterologia. Orientador: José Jukemura.
Descritores: 1.Fígado gorduroso 2.Exercício3.Camundongos obesos 4.Resistência à insulina5.Inflamação 6.Fígado 7.Pâncreas
USP/FM/DBD-275/19
A todos aqueles qυе dе alguma forma
estiveram е estão próximos dе mim, fazendo
esta vida valer cada vеz mais а pena.
Agradecimentos
É chegado então o momento de expressar os mais sinceros agradecimentos a
muitos e tantos adorados familiares, amigos e colegas de trabalho.
Ao meu orientador, Prof. José Jukemura, por suas orientações, pelo seu
otimismo e senso de humor para enfrentar os momentos de dificuldades durante
esta jornada e que no alto de sua sabedoria, soube ser tão humilde ao repassar
todo o seu conhecimento e que esteve comigo até a sua completa conclusão.
À Prof.ª Claudia Oliveira pela sua diferenciada visão e perspectiva com as
diferentes áreas da saúde, por me acolher em seu grupo de pesquisa quando
ainda estava na graduação e ter dedicado um pouco da sua rotina agitada para
ouvir minhas ideias, além de suas orientações e contribuições não só para o
trabalho mas também para vida.
Ao Prof. Stefano Tadeu pelas boas e descontraídas conversas durante aquelas
tardes no laboratório, além de compartilhar seus conselhos e experiências de
vida para engrandecimento profissional e principalmente pessoal.
À Prof. Márcia Kubrusly, por suas orientações e experiências de vida, além de
conselhos e experiências de laboratório, por sempre estar me motivando a
continuar em frente de cabeça erguida principalmente nos momentos de
dificuldades.
Ao meu colega de mestrado e amigo Matheus Santos, por estar no dia-a-dia na
pesquisa ao meu lado, sempre visando o sucesso profissional e pessoal.
A todos os integrantes do grupo de pesquisa em NASH da prof.ª Claudia, em
especial ao Mauro Duarte por compartilhar um pouco de sua rotina não só no
grupo mas também suas experiências na USP, reforçando ainda mais a
importância e o papel das diversas áreas da saúde no tratamento multidisciplinar.
Aos integrantes do grupo de pesquisa da EACH e em especial a Fabiana
Evangelista por dividir seus conhecimentos profissionais e vivências de
laboratório para o treinamento dos animais.
À Vilma por sua disposição e sua paciência, por sempre me atender com aquele
sorriso descontraído e alegre mesmo em momentos corridos.
A todos os professores que contribuíram diariamente com seu conhecimento e
dedicação e que foram importantes na minha jornada acadêmica.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
apoio financeiro.
À Deus, por permitir que tudo isso acontecesse e pelo imenso prazer que é viver
amparado por suas mãos, por sua proteção e suas bênçãos.
À meus queridos pais e familiares por suas sábias lições de vida e de esperança,
sempre alimentando meus sonhos e me enchendo de amor e carinho,
depositando a confiança necessária para realizar meus sonhos.
À minha querida noiva Eline Autran por estar comigo desde o início desta jornada
sempre me dando forças e depositando suas esperanças, por me aguentar nos
momentos de raiva e angústia, por respeitar minhas vontades e necessidades
durante este processo, por sua compreensão, força de motivação e apoio moral
para a execução deste trabalho.
Há muito mais a quem agradecer. A todos aqueles que, embora não nomeados,
me brindaram com seus inestimáveis apoios em distintos momentos e por suas
presenças afetivas e inesquecíveis, o meu reconhecido e carinhoso muito
obrigado!
Todos vocês foram partes fundamentais para execução deste trabalho!
SuperScript™ III Platinum® One-Step Quantitative RT-PCR System (Invitrogen
Life Technologies, Carlsbad, EUA), conforme recomendação do fabricante. A
intensidade de expressão de cada gene foi obtida pelo valor de limiar do ciclo,
no qual o aumento no sinal associado à fase exponencial de amplificação do
fragmento começa a ser detectada. A reação para cada gene analisado foi
cuidadosamente padronizada com a finalidade de evitar qualquer amplificação
inespecífica. A temperatura de anelamento para a amplificação dos genes IRS-
2, GLUT-2 IL-6 e IL-10 foi 55 ºC, enquanto que para o gene de TNF-a foi de 57
ºC. Todas as reações de RT-q PCR foram realizadas em duplicata para cada
amostra de tecidos hepático e pancreático tanto para o gene alvo quanto para o
controle endógeno (β-actina).
32
Sequência dos primers (forward/reverse) utilizados na reação de qRT-PCR
para cada gene estudado
Genes Sequência
IRS-2 F: CGG CTG GAG TAC TAC GAG AG
R: CGC GCT TGT TGA TGT TCA GA
GLUT-2 F: TCA GAA GAC AGG GTA CAG CGA
R:TCC AGT GCC AGC GTA TAA GT
TNF-α F: CCA CCA CGC TCT TCT GTC TA
R: TCC TTC TTG CCC TCC TAA CC
IL-6 F: TTC TTG GGA CTG ATG CTG GT
R: CAG GTC TGT TGG GAG TGG TA
IL-10 F: TGC TGC TCC TCC CCT ATT TC
R: TTC GGA TGT GCC TGG GTT TA
Β-actina F: TGT CAC CAA CTG GGA CGA TA
R: GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA
F= forward; R= reverse
3.12 – Método de análise da expressão gênica
Para o cálculo do nível de expressão de cada gene alvo, utilizou-se o
método 2-delta delta Ct para a quantificação relativa [43], onde Ct (“threshold
cycle”) é o ciclo da PCR em tempo real, no qual a amplificação atinge a fase
logarítmica, onde delta Ct é a diferença de expressão entre gene alvo e controle
endógeno de uma determinada amostra e delta delta Ct corresponde à diferença
entre o delta Ct da amostra e o delta Ct do controle.
A fórmula utilizada para a quantificação relativa (QR):
QR= 2-ΔCt
ΔCt= Ct gene alvo-Ct gene referência
ΔΔCt= ΔCt amostra-ΔCt controle
33
3.13 – Análises Estatísticas:
Todos os dados foram expressos como média ou mediana (dependendo
do padrão de distribuição das variáveis) e seus respectivos valores mínimos
(min), máximos (máx) e de desvio padrão (DP). Para variáveis de distribuição
paramétrica foram utilizados teste-t, one-way ANOVA e o pós-teste Bonferroni
de múltiplas comparações. Para variáveis de distribuição não-paramétrica foram
utilizados os testes de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis e o pós-teste Dunn's de
comparações múltiplas. Para comparação dos escores histológicos entre os
grupos foram utilizados os testes de Qui-quadrado com exato de Fisher. Foram
consideradas variáveis significativas aquelas em que o p<0,05. Todos os
cálculos e análises foram realizados com o software GraphPad Prism V6.0
(GraphPad Software Inc).
34
RESULTADOS
35
4.0 – RESULTADOS
4.1 – Avaliações metabólicas:
4.1.1 – Peso corporal:
No momento inicial do protocolo de treinamento, não foram observadas
diferenças significativas entre os grupos de estudo, porém, ao final do protocolo,
foram observadas diferenças significativas da média de peso corporal do grupo
treinado em comparação ao grupo sedentário (12.9±2.9 VS 9.6±2.1 p= 0.008). Em
relação a evolução de peso corporal, a partir da terceira semana de treinamento,
foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos sedentário e treinado
(Figura 1). Ainda sobre este resultado, os animais sedentários obtiveram um
ganho de peso médio de 35% durante todo o protocolo experimental enquanto
que os animais submetidos ao treinamento aeróbio obtiveram um ganho médio
de 26%.
P e s o C o r p o r a l
Gra
ma
s (
gr)
SE
DT
F
0
5
1 0
1 5
2 0
p = 0 .0 0 8
* *
36
E v o lu ç ã o d e P e s o C o r p o r a l
S e m a n a s
Pe
so
Co
rp
ora
l (g
r)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
S E D
TF
p = 0 .0 0 0 3
******
Fig 1: Gráficos de comparação da média de peso corporal entre os grupos e de evolução de peso corporal dos grupos de estudo frente ao protocolo de treinamento físico aeróbio de 8 semanas.
4.1.2 – Consumo alimentar:
Em relação ao consumo de água e ração, foram encontradas diferenças
significativas do grupo sedentário em comparação ao grupo de animais treinados
(Figura 2). Em ambas as variáveis, os animais sedentários apresentaram
maiores valores em comparação aos animais treinados (Tabela 1).
C o n s u m o d e Á g u a
mL
/an
ima
l/2
4h
SE
DT
F
0
2
4
6
8
1 0
p = 0 .0 0 1
**
37
C o n s u m o d e R a ç ã o
gr/a
nim
al/
24
h
SE
DT
F
0
2
4
6
8
1 0
p < 0 .0 0 0 1* * * *
S E D
T F
Fig 2: Gráficos de consumo de água e ração de ambos os grupos de estudo frente ao protocolo de treinamento aeróbio de 8 semanas
Tabela 1 – Ganho de peso corporal e consumo alimentar ao final do protocolo experimental
Sedentários
(n=7) Treinados
(n=7) P
Ganho de peso corporal (g)
12.9±2.9 9.6±2.1 0.008
Ganho de peso (%) 35.6±10.1 26.8±6.5 0.03
Consumo de Água 6.6±1.5 4.9±1.2 0.001
Consumo de Ração 5.6±1.1 4.4±0.9 < 0.0001
p<0,05
4.1.3 – Tecidos Adiposos e Peso Hepático:
Em relação aos tecidos adiposos foram observadas diferenças para o
tecido retroperitoneal sendo os menores valores encontrados nos animais
pertencentes ao grupo TF (Tabela 2). No fígado foram encontradas diferenças
estatísticas sendo o grupo treinado com os menores valores em comparação aos
sedentários. Em relação aos outros tecidos foram encontradas diferenças
significativas no peso absoluto e peso relativo do fígado do grupo treinado em
comparação ao grupo sedentário.
38
Tabela 2 – Peso dos órgãos e tecidos adiposos de camundongos ob/ob de ambos os grupos ao final do protocolo de treinamento físico (peso absoluto e peso relativo)
Sedentários (n=7)
Treinados (n=7)
p
Peso absoluto
Fígado (gr) 2.5±0.3 2.2±0.2 0.04
T. adiposo peritonial (gr) 2.5 (2.0–5.5) 1.5 (1.5–4.0) 0.03
T. adiposo inguinal (gr) 2.4±0.6 1.8±0.8 0.10
T. adiposo periepididimal (gr) 3.0±1.3 2.9±0.9 0.87
Peso relativo
Fígado (mg) 54.0±4.8 50.3±5.3 0.04
T. adiposo peritonial (mg) 59.5 (40.0–103.1) 36.1 (32.6–93.0) 0.04
T. adiposo inguinal (mg) 51.5±15.9 42.5±20.1 0.49
T. adiposo periepididimal (mg) 64.4±32.1 66.4±18.9 0.88
p<0,05
4.2 – Teste de esforço físico máximo
No que diz respeito às variáveis ligadas ao treinamento físico, no momento
pré treinamento não foram observadas diferenças significativas para velocidade
pico, distância percorrida e tempo de exposição ao teste de esforço entre os
grupos de estudo, no entanto, ao final do protocolo foram observadas diferenças
significativas dos animais treinados no momento pré treinamento em
comparação ao momento pós treinamento do grupo sedentário (Fig 3).
39
V e lo c id a d e P ic o (k m /h )
Ve
loc
ida
de
(k
m/h
)
S E D P ré T F P ré S E D P ó s T F P ó s
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0S E D P ré
T F P ré
S E D P ó s
T F P ó s
p = 0 .0 3 1 0
*
D is tâ n c ia (k m )
Dis
tân
cia
(k
m)
S E D P ré T F P ré S E D P ó s T F P ó s
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3
0 .4
0 .5
S E D P ré
T F P ré
S E D P ó s
T F P ó s
*
p = 0 .0 4 5 5
T e m p o (m in )
Te
mp
o (
min
)
S E D P ré T F P ré S E D P ó s T F P ó s
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5S E D P ré
T F P ré
S E D P ó s
T F P ó s
p = 0 .0 0 6 9
*
Fig 3: Resultados de ambos os grupos de estudo obtidos através do teste de esforço físico máximo frente às variáveis ligadas ao protocolo de treinamento físico aeróbio
40
4.3 – Histologia Hepática:
Para as análises de avaliação histológica no fígado, não foram encontradas
diferenças significativas para esteatose macrovesicular, esteatose
microvesicular, hipertrofia hepatocelular e focos inflamatórios.
Tabela 3 – Tabela de características histológicas do tecido hepático de camundongos obesos (ob/ob)
Sedentários* Treinados* P
1 2 3 4 5 6 7 8
Esteatose
macrovesicular (0–3) 0 2 1 2 1 2 2 0
0.965
Esteatose
microvesicular (0 – 3) 0 3 2 3 2 3 2 3
Hipertrofia
hepatocelular (0 – 3) 0 2 2 2 1 2 1 2
Focos inflamatórios
(0 – 3) 0 2 3 3 2 2 3 0
*Identificação realizada por microchip;
4.4 – Histologia Pancreática:
Em relação ao pâncreas, devido à ausência de um escore específico para
este órgão, o grupo realizou uma tabela descritiva no qual foram analisadas as
necrose acinar, infiltrado inflamatório, hemorragia, e necrose de gordura. A
tabela a seguir descreve as características de cada animal avaliado.
41
Tabela 4 – Tabela de descrição da análise histológica pancreática realizada em ambos os grupos de estudo após o procotolo de treinamento físico
ID Gordura
interlobular
Gordura
Intralobular Fibrose Edema
Necrose
Acinar
Infiltrado
Inflamatório Hemorragia
Necrose
de
Gordura
Escore
Final
Grupo
Sedentário
0354 0 (5%) 0 0 0 0 0 0 0 0
1010 3 (40%) 0 0 0 0 11 – 15
pmn 0 0 0
0493 3 (40%) 0 0 0 0 0 0 0 0
1840 0 (5%) 0 0 0 0 11 – 15
pmn 0 0 0
0253 0 (5%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 2
1053 0 (5%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 0
2118 0 (2%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 0
Grupo
Treinado
0370 0 (0%) 0 0 0 0 0 0 0 0
0678 1 (10%) 0 0 0 0 0 0 0 1
0957 0 (0%) 0 0 0 0 0 0 0 0
0420 – – – – – – – – –
0529 1 (10%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 1
1581 3 (40%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 0
7796 3 (40%) 0 0 0 0 2 – 5 pmn 1 0 –
Identificação realizada por microchip
42
Fig 4 Histologia pancreática de camundongo ob/ob sedentário sem infiltração de gordura. 1= Ilhota de Langerhans; 2= vaso sanguíneo (ampliação original X 40)
Fig 5 Ácino pancreático de camundongo ob/ob sedentário. Presença de raros linfócitos (seta) em tecido frouxo periacinar. (ampliação original X 40)
43
Fig 6: Pâncreas de camundongo ob/ob treinado com gordura visceral adjacente (seta) ao parênquima pancreático sem sinais de infiltração lobular. (ampliação original X 5)
Fig 7: Visão panorâmica do pâncreas de camundongo ob/ob sedentário com morfologia e tecido preservados. (ampliação original X 20)
44
Fig 8: Histologia hepática de camundongos ob/ob. A e B: Histologia hepática de animais sedentários (Escala de 100 µm). C e D: Histologia hepática de animais treinados (Escala de 100 µm)
45
4.5 – Expressão genica:
4.5.1 – No tecido hepático:
Em relação a expressão gênica no tecido hepático, para os genes
relacionados com a resistência à insulina (Fig 9), foram observadas diferenças
significativas para o gene GLUT-2 (1.5±0.6 VS 0.7±0.3), e em relação aos genes
relacionados com inflamação foram encontradas diferenças signficativas para IL-
6 (1.1(0.3–1.9) VS 3.6 (0.7–5.3)) e IL-10 (0.7 (0.2–2.7) VS 1.3 (0.6–3.6)). Para
os outros genes do estudo, não foram observadas diferenças significativas.
IR S 2
F íg a d o
Un
ida
de
s A
rb
itrá
ria
s
SE
D TF
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
S E D
T F
p = 0 .0 8 1 9
G L U T 2
F íg a d o
Un
ida
de
s A
rb
itrá
ria
s
SE
D TF
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
S E D
T F
p = 0 .0 3 3 6
*
Fig 9: Gráfico de comparação entre os animais sedentários e treinados frente as análises de resistência à insulina no tecido hepático
46
T N F -a
F íg a d o
Un
ida
de
s A
rb
itrá
ria
s
SE
D
TF
0
2
4
6
8
S E D
T F
p = 0 .6 4 2 9
IL -6
F íg a d o
Un
ida
de
s A
rb
itrá
ria
s
SE
D TF
0
2
4
6
S E D
T F
p = 0 .0 1 4 0
*
IL -10
F íg a d o
Un
ida
de
s A
rb
itrá
ria
s
SE
D TF
0
1
2
3
4
S E D
T F
p = 0 .0 3 5 5
*
Fig 10: Gráfico de comparação entre os animais sedentários e treinados referente as análises de expressão gênica de inflamação no tecido hepático
47
4.5.2 – No tecido pancreático:
No pâncreas, para os genes relacionados com a resistência à insulina
foram encontradas diferenças significativas para IRS-2 (0.3 (0.1–0.9) VS 1.7
(0.7–5.2)) e GLUT-2 (0.5±0.3 VS 1.8±1.3). Para os genes relacionados com a
resposta inflamatória, foram encontradas diferenças significativas para IL-6 (0.07
(0.04–0.10) VS 3.1 (0.9–3.9)) e IL-10 (0.7 (0.4–1.7) VS 6.1 (1.1–14.3)). Não
foram observadas diferenças significativas para análise de TNF-a.
IR S 2
P â n c re a s
Un
ida
de
s A
rb
itrá
ria
s
SE
D TF
0
2
4
6
S E D
T F
p = 0 .0 0 4 1
**
G L U T 2
P â n c re a s
Un
ida
de
s A
rb
itrá
ria
s
SE
D TF
0
1
2
3
4
5
S E D
T F
p = 0 .0 3 1 4
*
Fig 11: Gráfico de comparação dos grupos de estudo frente as análises de expressão gênica referentes à resistência insulínica no tecido pancreático
48
‘
T N F -a
P â n c re a s
Un
ida
de
s A
rb
itrá
ria
s
SE
D TF
0
2
4
6
8
1 0
S E D
T F
p = 0 .8 1 3 5
IL -6
P â n c re a s
Un
ida
de
s A
rb
itrá
ria
s
SE
D TF
0
1
2
3
4
5
S E D
T F
p = 0 .0 0 2 2
**
IL - 10
P â n c re a s
Un
ida
de
s A
rb
itrá
ria
s
SE
D
TF
0
5
1 0
1 5
2 0
S E D
T F
p = 0 .0 0 8 7
**
Fig 12: Gráfico de comparação dos grupos de estudo frente as análises de expressão gênica referentes à inflamação no tecido pancreático
49
DISCUSSÃO
50
5.0 – DISCUSSÃO:
O exercício físico tem sido empregado como uma das principais estratégias
profiláticas e terapêuticas no tratamento de diversos agravos a saúde e também
no tratamento e prevenção de doenças crônicas. Em muitos casos, o
treinamento físico pode incrementar o limiar de tolerância fisiológica além das
variáveis ligadas ao treinamento como melhoria da aptidão cardiorrespiratória,
aumento da velocidade pico e maior tolerância ao esforço físico. Além disso, o
treinamento físico é capaz de modular a dinâmica dos ácidos graxos intra e
extracelulares que são utilizados na produção de energia de acordo com o
estado nutricional e a aptidão física do praticante, além da intensidade e duração
do exercício. A quantidade de ácido graxo usada durante o exercício leve ou
moderado aumenta exponencialmente quando comparado em condições de
repouso [44 45]. Portanto, o exercício físico é uma ferramenta importante para o
controle e redução de peso corporal e tecido adiposo. No presente estudo, o
treinamento físico atenuou a evolução no ganho de peso corporal dos animais
treinados a partir da 3ª semana mostrando um importante impacto metabólico
nestes animais. Além disso, ao final do protocolo, os animais sedentários
apresentaram um percentual de 35% de ganho de peso enquanto os animais
treinados apresentaram um percentual de 26%, ou seja, uma diferença na
evolução do ganho de peso de 9%, mostrando que o treinamento físico é capaz
de estabilizar o ganho de peso em camundongos ob/ob.
Em um estudo realizado por Evangelista et al. [33] foi observado que o
treinamento físico foi capaz de melhorar aspectos relacionados ao controle de
peso corporal e equilíbrio energético em camundongos ob/ob, mostrando que os
animais treinados obtiveram um aumento no ganho de peso de 23% enquanto
os animais sedentários 41%. Em estudos realizados anteriormente pelo grupo,
foi observado que o treinamento físico foi capaz de controlar o ganho de peso
corporal em camundongos selvagens e em animais alimentados com dietas de
lanchonetes e com alto teor de gordura [46 47].
Gollisch et al. [48] mostraram em seu estudo que o exercício físico foi capaz
de melhorar a resistência à insulina, causar mudanças positivas no metabolismo
de lipídios e gerar uma maior tolerância ao esforço físico. Além disso, este
51
estudo, fornece novos dados e perspectivas sobre as respostas da gordura
subcutânea e visceral para dieta rica em gordura e treinamento físico neste
modelo animal, e que a obesidade induzida por dieta hiperlipídica e a resistência
à insulina podem ocorrer sem inflamação detectável.
Embora as reduções no ganho de peso corporal possam melhorar a
qualidade de vida e prevenir o desenvolvimento de complicações relacionadas à
obesidade, como resistência à insulina, diabetes tipo 2 e hipertensão, Broderick
et al. [49] mostraram que houve atenuação no ganho de peso corporal.
Entretanto, a atividade física voluntária não resultou na ativação do sistema
cardioprotetor peptídeo natriurético de ocitocina cardíaca (OT-NP) no modelo
ob/ob de obesidade e camundongos db/db, predispondo a fatores de risco para
doença cardiovascular. No entanto, este resultado é questionável, pois durante
o protocolo de exercício, os camundongos ob/ob, apesar de atingirem a
recomendação mínima de tempo exigida pelo American College of Sports
Medicine (ACSM) [50-52] , não foi possível verificar em que intensidade estes
animais atingiam durante as sessões diárias.
A diferença entre o consumo de energia e gasto energético são fatores
determinantes para o controle do peso corporal, e que quando há uma exposição
ao exercício físico de forma contínua, o organismo começa a responder de
maneira a obter mais energia com a finalidade de compensar os gastos
energéticos, visando a manutenção do metabolismo do praticante [53 54].
Portanto, é esperado observar um aumento compensatório na ingestão de
alimentos [55]. Além disso, os camudongos ob/ob são conhecidos pela sua
deficiência na produção de leptina funcional, consequentemente, levando ao
desenvolvimento acelerado da obesidade, aumento no consumo alimentar
(hiperfagia), hiperglicemia e hiperinsulinemia [56 57]. Em relação ao consumo
médio de água e ração por animal, esperávamos encontrar um aumento no
consumo alimentar dos animais submetidos ao treinamento físico, no entanto, foi
visto que os animais treinados obtiveram valores significativamente menores em
comparação aos animais sedentários. Uma das possíveis explicações para este
fenômeno pode ser o impacto que o exercício físico contínuo causa nos
processos fisiológicos. Como o exercício produz ajustes no fluxo sanguíneo, na
resposta hormonal gastrointestinal, no esvaziamento gástrico, no metabolismo
52
celular muscular, na bioquímica do tecido adiposo e na atividade cerebral, esta
mudança pode ter causado uma interferência em alguns dos mecanismos
envolvidos no controle do apetite [58 59]. Além disso, acreditamos que o
exercício físico, pode ter causado mudanças positivas na produção de leptina
funcional, gerando um menor consumo alimentar devido a esta melhoria. No
entanto, mais estudos são necessários para confirmar tal hipótese, pois os
mecanismos entre a prática regular de exercício físico, produção e manutenção
de leptina ainda não estão bem elucidados.
Em relação à velocidade pico, distância percorrida e tempo de tolerância
ao esforço, esperávamos encontrar uma diferença significativa no momento pré
treinamento do grupo sedentário em comparação ao momento pós treinamento
do grupo treinado. Apesar de não ter sido encontrado tais diferenças
significativas, a média de valores dos animais treinados para estas variáveis
foram maiores em relação aos sedentários, e que os animais do grupo sedentário
tiveram um decréscimo em relação ao teste de esforço físico. Baseado neste
resultado, podemos afirmar que o comportamento sedentário causa um
descréscimo em relação a velocidade pico, distância percorrida e tempo de
tolerância ao esforço, contribuindo para a progressão e gravidade da doença,
além de baixa aptidão cardiovascular, que por sua vez apresenta uma alta
prevalência em pacientes acometidos por esta doença [60]. Apesar de não terem
sido encontradas diferenças significativas do momento pré e pós treinamento no
grupo treinado, recomenda-se que a prática regular de exercício físico seja
encorajada para a população acometida pela DHGNA.
Sabe-se que o excesso de tecido adiposo visceral e hepático está
independentemente associado ao risco cardiometabólico, além de serem fatores
agravantes não só em relação a parâmetros da doença, mas tambem o
comprometimento da atividade de outros órgãos. Devido a alta variabilidade no
que diz respeito ao que se chama de histórico natural da DHGNA e apesar dos
avanços tecnológicos na área clínica contribuirem para um melhor tratamento da
doença, não há uma metodologia precisa para a prevenção das condições mais
severas como EHNA, fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). A perda
de peso através de modificações no estilo de vida pode reduzir tanto o tecido
adiposo visceral como a gordura do fígado, mas a perda de peso de 5 a 15% é
53
desejável para reduções clinicamente significativas no tecido adiposo visceral
[50] e para melhorias histológicas no fígado (65% de melhoria na pontuação do
NAS com perda de peso > 10%) [61 62]. Em nosso estudo, acreditamos que a
não visualização de diferenças significativas para as análises de histologia
hepática e pancreática entre os grupos, foi devido ao fato destes animais não
apresentarem perdas de peso ao longo do protocolo de treinamento físico, sendo
observado apenas a atenuação de peso corporal dos animais treinados. É
necessário mais estudos relacionando o comportamento de diferentes
intensidades, duração e volume do treinamento físico com aspectos ligados a
histologia destes órgãos, visto que este campo de pesquisa, não está
completamente elucidado. Os camundongos ob/ob, apresentam um fenótipo da
obesidade bastante agressivo no que diz respeito as características físicas e
histológicas, sendo difícil de observar perdas de peso significativas, no entanto,
alguns estudos apontam que apesar de não haver perdas de peso através do
exercício físico, é possivel observar efeitos positivos em características da
DHGNA [63-65]. Apesar dos animais do grupo treinado apresentarem mudanças
positivas nas variáveis de treinamento físico, em relação à histologia hepática,
não foram observadas diferenças significativas entre os grupos de estudo, sendo
os resultados encontrados semelhantes em todas as variáveis analisadas, ou
seja, em nosso estudo, 8 semanas de treinamento físico aeróbio em intensidade
moderada não foi capaz de atenuar os escores histológicos do fígado, em
camundongos ob/ob treinados.
Em relação histologia pancreática, devido à ausência de um escore
específico para este órgão, o grupo realizou uma tabela descritiva dos dados
analisados visto que os estudos envolvendo a infiltração de gordura pancreática
e aspectos da DHGNA, são escassos. Além disso, trata-se de uma área
relativamente nova, se comparada com o campo de investigação das doenças
hepáticas. Um estudo realizado por Mathur et al. [66] comparou as diferenças
entre as características pancreáticas de camundongos ob/ob e seu simliar
C57BL/6J (modelo magro). Nos resultados histopatológicos, apesar de não ter
sido encontrada diferenças significativas para as análises de gordura interlobular
e outros aspectos, foi visto que os animais obesos apresentaram maiores valores
no conteúdo de gordura pancreática. Baseado nos achados de Mathur e de Van
54
Geenen [42 66], esperávamos encontrar características semelhantes em nosso
estudo, no entanto, tanto os animais sedentários quanto os animais treinados
apresentaram valores semelhantes. Além disso, estudos com intervenções
ligadas a prática regular de atividade fisica e exercício físico relacionados com
histologia pancreática são escassos. Mais estudos investigativos são
necessários para melhor compreensão da infiltração de gordura pancreática e
sua relação com a DHGNA, neste modelo animal.
Sabe-se que tanto a resistência à insulina, quanto a inflamação são
elementos chave para a progressão da DHGNA e surgimento da EHNA. A
insulina possui um papel importante na regulação da homeostase de glicose em
vários níveis, reduzindo a produção hepática de glicose (via diminuição da
gliconeogênese e glicogenólise) e aumentando a captação periférica de glicose,
principalmente nos tecidos muscular e adiposo. Geralmente as membranas
celulares não são permeáveis a glicose, com isso, é necessário que haja
estruturas especializadas no transporte deste substrato para dentro da célula,
sendo denominado de transportadores de glicose (GLUT’s). O GLUT-2 é
expresso predominantemente no fígado, rim e pâncreas e desempenha um
papel importante na homeostase da glicose [67 68]. A insulina é secretada pelas
células-beta pancreáticas em resposta a níveis aumentados de glicose na
circulação sanguínea, sendo transportada para as células β através deste
transportador. Portanto, o GLUT-2 pode ser usado como um marcador para
avaliar a eficiência da atividade de glicose, e a diminuição da expressão está
associada à disfunção secretora de células β [69]. Sabe-se que quando há uma
exposição ao treinamento físico, independente de modalidade, há uma melhoria
nos aspectos relacionados a este hormônio [70]. De fato, nosso grupo encontrou
diferenças significativas na expressão dos genes IRS-2 e GLUT-2 no pâncreas,
ou seja, a exposição ao exercício físico foi capaz de aumentar a expressão de
tais genes, gerando melhorias tanto nos receptores quanto na captação e
utilização da glicose.
Por outro lado, o aumento na expressão de IRS-2 e GLUT-2 no fígado,
podem ter significados diferentes quando comparados ao pâncreas. Foi relatado
em estudos com ratos que a expressão de GLUT-2 é aumentada em resposta à
hiperglicemia [71 72] ] e diminuída pela hiperinsulinemia [73]. Em ratos Wistar
55
com diabetes, foi observado um aumento do RNAm do GLUT2 hepático, e esta
alteração era restaurada pela correção da glicemia por florizina, vanádio ou
insulina [74 75]. Outros estudos realizados em fígado de ratos, mostraram que a
proteína e o RNAm do GLUT-2 aumentaram 1,6 e 2 vezes, respectivamente,
após 3 semanas de diabetes [76 77] sendo este quadro revertido quando os
animais eram expostos ao tratamento com insulina por 5 dias apresentando
níveis de do gene semelhantes a animais não diabéticos [77].
Em um estudo realizado por Silva et al. 2011 [76], após 20 dias de
tratamento com aloxana, os ratos Wistar mostraram um ganho de peso inferior
ao grupo controle, o que está relacionado ao quadro catabólico decorrente da
hipoinsulinemia. No tecido hepático, o diabetes também promoveu aumento da
expressão do GLUT-2, sendo este quadro revertido com a administração de
insulina. Em nosso estudo, o grupo treinado apresentou menores valores da
expressão de GLUT-2 em comparação ao grupo sedentário, resultando em
valores de expressão deste gene semelhantes a condições de não diabetes.
Além disso, tais resultados corroboram com os achados de Silva et al.,
mostrando que a prática regular de exercício físico, apesar de não ter
apresentado melhorias significativas na histologia hepática, atua neste órgão
com o mesmo efeito da insulina sintética, contribuindo, a longo prazo para
melhorias em aspectos da DHGNA tanto no fígado quanto no pâncreas.
O exercício regular tem sido considerado uma poderosa ferramenta anti-
inflamatória quando realizado em intensidades controladas [78 79]. Na DHGNA,
a prática regular do exercício físico está associada à redução de citocinas pró-
inflamatórias, adipocinas e outros marcadores relacionados a lesões hepáticas
[80 81] , sendo observado um crescimento relevante no campo de investigações
acerca da inflamação e exercício físico na última década [82]. O treinamento
físico de intensidade moderada a alta induz a ativação de vias anti-inflamatórias
através de vários mecanismos, incluindo a supressão de citocinas pró-
inflamatórias [83], melhoria do estado anti-inflamatório do endotélio [84], e
melhorias na expressão de toll-like receptors (TLR’s) [85]. Os efeitos anti-
inflamatórios do exercício não são apenas mediados pela redução da gordura
visceral, mas também pela indução da cascata anti-inflamatória após cada
sessão de exercício [86 87].
56
A IL-6 é uma importante citocina pró-inflamatória secretada pelos
adipócitos sendo o tecido adiposo branco, o principal contribuinte com os níveis
circulantes desta citocina e está associada a condições como obesidade,
resistência à insulina, e um fator preditivo para diabetes mellitus tipo ll. No fígado
esta citocina apresenta um papel protetor, sendo capaz de suprimir a reação de
estresse oxidativo e prevenir a disfunção mitocondrial. No entanto, uma
exposição prolongada à IL-6 pode sensibilizar o fígado a lesões e contribuir para
a inflamação [88]. Os níveis circulantes de IL-6 estão aumentados em pacientes
com DHGNA comparados aos grupos controle, e níveis elevados de IL-6 estão
associados aos achados histopatológicos avançados [88]. Dessa forma, a IL-6
pode ser útil como único biomarcador não invasivo para distinguir a EHNA de
esteatose simples.
Durante o exercício físico, a IL-6 é uma das primeiras citocinas detectáveis
liberada através da contração muscular e liberada na corrente sanguínea. A IL-
6 derivada desta contração muscular aumenta a medida que o indivíduo é
exposto ao exercício de maneira frequente ou por longos períodos de tempo, no
entanto, a grande diferença entre a endotoxemia e a produção de citocinas
induzida pelo exercício é a ausência no aumento de outras citocinas como TNF-
a e IL-1b. Tal fenômeno foi observado no estudo de Starkie et al. [89] em que foi
administrado uma dose de E. coli para induzir um aumento nas concentrações
plasmáticas de TNF-a em indivíduos saudáveis, que foram randomizados para
repouso ou exercício antes a administração desta endotoxina. Em seus
resultados, a endotoxina foi responsável pelo aumento nos níveis circulantes de
TNF-a. No entanto, os participantes do grupo exercício conseguiram diminuir
totalmente os níveis de TNF-a, mostrando que os efeitos da prática regular de
exercício físico foram semelhantes ao tratamento com infusão de IL-6 para
supressão de TNF-a induzida por endotoxina.
O treinamento físico regular reduz a produção basal de IL-6, bem como a
magnitude da resposta aguda à IL-6, equilibrando vários estímulos potenciais da
IL-6. Portanto, é possível afirmar que uma das adaptações ao exercício físico
seria a redução na produção basal desta citocina, bem como a magnitude da
resposta aguda à IL-6 [90]. Além disso, enquanto que as concentrações
plasmáticas de IL-6 diminuem com a adaptação ao treinamento físico, os níveis
57
de expressão do seu receptor parecem estar aumentado, sugerindo que a
sinalização de IL-6 pode ser aumentada em indivíduos treinados [91]. Em nosso
estudo, os resultados encontrados para IL-6 em ambos os órgãos estavam
aumentados em comparação aos animais sedentários. Acreditamos que este
aumento foi devido a exposição ao exercício físico. Além disso, os resultados
encontrados de TNF-a dos animais treinados, em ambos os órgãos, foram
menores em relação aos sedentários, apesar de não terem sidos evidenciadas
diferenças signifcativas. Acreditamos que o aumento na expressão de IL-6 foi
responsável por estimular a atividade de IL-10, que por sua vez, é capaz de inibir
a produção exarcebada de TNF-a circulante. No entanto, esta hipótese não pode
ser comprovada por não ter sido objetivo do presente estudo. Além disso, não
foram realizadas dosagens de IL-6 no momento pré exercício para verificar se
houve alguma diferença antes e após a exposição ao porotoclo de treinamento,
portanto, não sabemos ao certo se este aumento no grupo treinado se deve ao
fato da exposição ao exercício físico ou aos achados histopatológicos destes
animais.
A IL-10 é uma citocina imunomoduladora potente cujo papel na DHGNA
não foi completamente elucidado [92 93]. Em camundongos exibindo doença
hepática gordurosa induzida por dieta, a inibição seletiva de IL-10 foi associada
com lipogênese aumentada, bem como aumento na expressão de TNF-a e
comprometimento da sensibilidade à insulina no fígado [94]. Além disso, estudos
adicionais em roedores alimentados com dieta hiperlipídica demonstraram que
a presença de DHGNA e hiperglicemia é acompanhada por baixos níveis
sistêmicos de IL-10, o que levou a propor que a IL-10 pode ter a capacidade de
prevenir a esteatose hepática e outras anormalidades metabólicas [95].
Estudos apontam efeitos benéficos da prática regular de exercício físico em
parâmetros não só da DHGNA mas também de doenças crônicas não
transmissíveis. No estudo de Batista et a. [96], a IL-10 parece responder de
maneira positiva à prática regular do exercício físico aeróbio, podendo atuar
como fator central na atenuação e/ou modulação da resposta inflamatória. Além
do aumento local na produção de IL-10, esse efeito poderia ter impacto
sistêmico, reduzindo, ou até mesmo evitando, o aumento de citocinas pró-
inflamatórias, como TNF-a, condição que, no caso da DHGNA está relacionada
58
à maior severidade dessa doença. Speretta et al. [97] avaliou o efeito de oito
semanas de treinamento de força de alta intensidade/curta duração e do
treinamento aeróbio de moderada intensidade/longa duração sobre a expressão
gênica de TNF-a e IL-10, e perfil lipídico. Independente de modalidade de
exercício, os animais submetidos ao treinamento físico apresentaram melhorias
significativas tanto na expressão de TNF-a, IL-10, além de melhorias no perfil
lipídico e conteúdo de gordura visceral em seus diferentes compartimentos. Tais
achados reforçam a ideia que a prática regular de exercício físico gera potenciais
benefícios no controle e manutenção não apenas do perfil lipídico, mas também
na melhoria da expressão de IL-10 e inibição na expressão de TNF-a.
Em nosso estudo, os animais treinados apresentaram níveis de expressão
de IL-10 maiores em comparação aos sedentários, corroborando com os
achados de Batista e Speretta. Além disso, os animais treinados apresentaram
menores valores na expressão de TNF-a em comparação ao grupo sedentário,
apesar de não ter sido evidenciado diferenças significativas. Baseado nos
achados da literatura, acreditamos que tal resultado poder ter sido influenciado
pela melhoria da citocina IL-10, visto que possui um papel importante na inibição
e controle da expressão de citocinas pró-inflamatórias. A partir dos resultados
encontrados em nosso estudo e nos achados da literatura, é possível afirmar
que o protocolo de treinamento físico aeróbio gerou efeitos positivos na resposta
anti-inflamatória, principalmente no pâncreas de animais ob/ob treinados e
consequentemente, a melhoria na expressão de IL-10 nestes animais também
favoreceu para a melhoria e manutenção da sensibilidade à insulina, visto que
esta citocina apresenta forte relação com tal fenômeno.
59
CONCLUSÃO
60
6.0 – CONCLUSÃO:
Na condição em que o estudo foi realizado, podemos concluir que:
• O protocolo de treinamento físico aeróbio realizado por 8 semanas foi
capaz de promover modificações positivas nos genes IRS-2 e GLUT-2
tanto no fígado quanto no pâncreas, além de melhorias na expressão de
citocinas anti-inflamatórias, conferindo um fator protetor em ambos os
órgãos.
• O estudo também mostrou que através deste protocolo, houve atenuação
no ganho de peso corporal de camundongos obesos, melhorias no
consumo alimentar e aumento da tolerância ao exercício físico.
• Quanto às características histopatológicas, não foi possível observar
diminuição nos escores para fígado enquanto que no pâncreas, apesar
de não ter sido evidenciada diferenças estatísticas, os camundongos
submetidos ao protocolo de treinamento aeróbio apresentaram menores
valores histológicos, principalmente em aspectos de infiltrado inflamatório.
61
REFERÊNCIAS
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