LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

LÊ THỊ BẠCH

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG

KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH CỦA CỎ SỮA LÁ LỚN

(Euphorbia hirta L.) VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

TRÊN ĐỐI TƯỢNG CÁ TRA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Cần Thơ – 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

LÊ THỊ BẠCH

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG

KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH CỦA CỎ SỮA LÁ LỚN

(Euphorbia hirta L.) VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

TRÊN ĐỐI TƯỢNG CÁ TRA

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 9.44.01.14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. Bùi Thị Bửu Huê

2. PGS. TS. Lê Tiến Dũng

Cần Thơ – 2020

i

LỜI CAM ĐOAN

----------

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Bùi Thị Bửu Huê và PGS.TS. Lê Tiến Dũng.

Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa được công bố

trong bất kỳ công trình nào khác.

TP. Cần Thơ, tháng 05 năm 2020

Tác giả luận án

Lê Thị Bạch

ii

LỜI CẢM ƠN

----------

Trong suốt quá trình thực hiện luận án, tôi đã học hỏi thêm được rất nhiều kiến

thức, kinh nghiệm và kỹ năng chuyên môn bổ ích, thiết thực từ quý thầy cô và bạn bè.

Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gởi lời trân trọng cảm ơn đến:

+ PGS.TS Bùi Thị Bửu Huê, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên,

Trường Đại học Cần Thơ

+ PGS.TS Lê Tiến Dũng, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam

là hai Thầy Cô trực tiếp hướng dẫn, đã dành nhiều thời gian, công sức để truyền

đạt cho tôi những kiến thức quý báu, hướng dẫn tận tình, giúp tôi định hướng con đường

nghiên cứu của mình trong suốt quá trình thực hiện luận án.

+ GS. Joëlle Quetin-Leclercq, Trường Đại học Catholique de Louvain, Bỉ

đã dành nhiều thời gian hướng dẫn khoa học cho tôi trong thời gian nghiên cứu

tại Bỉ cùng những kinh nghiệm, góp ý quý báu của GS dành cho tôi.

+ Trân trọng cám ơn GS. Kaeko Kamei và GS. Kenji Kanaori ở Viện Công nghệ

Kyoto, Nhật Bản

đã hỗ trợ hóa chất, dụng cụ trong quá trình thực hiện thí nghiệm ở Viện Kyoto

cũng như đã giúp đỡ việc đo phổ NMR, HRMS của các chất sạch phân lập được.

+ Chân thành cám ơn dự án AQUABIOACTIVE, ARES – dự án hợp tác giữa

các trường Đại học ở Bỉ và Đại học Cần Thơ

đã hỗ trợ kinh phí giúp tôi hoàn thành luận án.

+ Quý Thầy - Cô: GS.TS Nguyễn Cửu Khoa, PGS.TS Trần Ngọc Quyển, TS.

Nguyễn Hoàng Duy, TS. Lại Thị Kim Dung, TS. Nguyễn Thị Thanh Thủy, TS Nguyễn

Đại Hải… Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam

là những Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu, đã giảng dạy,

hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành các học phần, các chuyên đề.

iii

+ Quý Thầy, Cô cùng các Anh, Chị, Em ở Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự

nhiên, Trường Đại học Cần Thơ đặc biệt là anh Nguyễn Trọng Tuân và em Mai Văn

Hiếu

là những người bạn đồng môn đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi

trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

+ Xin cám ơn hai bạn đồng nghiệp Trương Quỳnh Như và Nguyễn Lê Anh Đào

đã đồng hành, hỗ trợ cho các thí nghiệm tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.

+ Xin cám ơn các em sinh viên lớp Hóa học và Hóa dược K39, K40 đã đồng hành

cùng tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện luận án.

+ Chân thành cám ơn gia đình đã luôn quan tâm và san sẻ khó khăn.

* Xin gởi lời chân thành cám ơn đến các cấp lãnh đạo Học viện Khoa học và Công

nghệ, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng và Trường Đại học Cần Thơ đã tạo mọi điều

kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành chương trình đào tạo bậc tiến sĩ.

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn.

Cần Thơ, tháng 05 năm 2020

Lê Thị Bạch

iv

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................ i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii

MỤC LỤC ................................................................................................................. iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................... vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................viii

DANH MỤC PHỤ LỤC ........................................................................................... xi

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

TỔNG QUAN ...................................................................................... 3

Giới thiệu về chi Euphorbia .................................................................................. 3

Đặc điểm thực vật của chi Euphorbia ........................................................ 3

Hoạt tính sinh học của chi Euphorbia ........................................................ 4

Thành phần hóa học của chi Euphorbia ..................................................... 7

Tổng quan về Cỏ sữa lá lớn ................................................................................. 21

Đặc điểm thực vật .................................................................................... 21

Công dụng trong dân gian ........................................................................ 22

Hoạt tính sinh học của Cỏ sữa lá lớn ........................................................ 23

Thành phần hóa học của Cỏ sữa lá lớn ..................................................... 26

Tổng quan về miễn dịch ...................................................................................... 36

Miễn dịch và miễn dịch học ..................................................................... 36

Các loại miễn dịch ................................................................................... 37

Lysozyme ................................................................................................ 38

Bổ thể ...................................................................................................... 38

Kháng thể ................................................................................................ 39

Miễn dịch học ứng dụng trong cá ............................................................. 39

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 41

Mẫu thực vật, hóa chất và thiết bị ....................................................................... 41

Mẫu thực vật............................................................................................ 41

Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 41

Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 42

Phương pháp điều chế 20 loại cao tổng .................................................... 42

Xác định hàm lượng tổng polyphenol và flavonoid .................................. 42

Phương pháp phân lập các hợp chất ......................................................... 42

v

Phương pháp xác định cấu trúc và định danh ........................................... 43

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học ............................................ 43

THỰC NGHIỆM ............................................................................... 51

Sàng lọc các đối tượng nghiên cứu theo định hướng hoạt tính tăng cường hệ miễn

dịch trên cá tra ........................................................................................................... 51

Chiết tách, phân lập các hợp chất từ Cỏ sữa lá lớn .............................................. 52

Xử lý nguyên liệu và điều chế các cao phân đoạn .................................... 52

Phân lập các hợp chất .............................................................................. 52

Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ Cỏ sữa lá lớn 60

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 63

Kết quả sàng lọc hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra của 20 cao chiết . 63

Hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid toàn phần của Cỏ sữa lá lớn ............... 66

Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập ......................................................... 67

Hợp chất Eup16 (chất mới) ...................................................................... 67

Các hợp chất flavonoid ............................................................................ 71

Các hợp chất phenol ................................................................................ 92

Các hợp chất triterpenoid ......................................................................... 95

Hợp chất steroid .................................................................................... 104

Hợp chất diterpenoid ............................................................................. 106

Hợp chất khác ........................................................................................ 108

Kết quả đánh giá hoạt tính tăng cường miễn dịch .............................................. 112

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ............................................................ 115

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa .......................................................... 119

Hoạt tính kháng oxi hóa theo phương pháp DPPH và ABTS•+ ............... 119

Kết quả đánh giá khả năng kháng oxi hóa trên tế bào MIN6 .................. 120

Khả năng bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi ER stress ............................................. 125

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 129

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN.................. 132

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 134

vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng Anh Diễn giải

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

1D-NMR one-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

2D-NMR two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều

ABTS 2,2-azino-bis(3-ethylbenzo thiazoline-6-sulphonic acid)

BHT Butylated hydroxytoluene

br s Broad singlet Tín hiệu đơn rộng

CC Column chromatography Sắc ký cột

CD3COCD3 CH3COCH3 đã thế hydro (H) bằng deuteri (D)

CD3OD CH3OH đã thế hydro (H) bằng deuteri (D)

CHCl3 Chloroform

CDCl3 CHCl3 đã thế hydro (H) bằng deuteri (D)

COSY Correlation Spectrocopy Phổ COSY

d Doublet Mũi đôi

DCM Dichloromethane

dd Doublet of doublets Mũi đôi đôi

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

Phổ DEPT

DMSO Dimethylsulfoxyde ((CH3)2SO)

DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

Môi trường nuôi cấy tế bào

ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

ĐTĐ Đái tháo đường

EtOAc Ethyl acetate

ER Endoplasmic reticulum Mạng nội chất

FT-IR Fourier transform-infrared spectroscopy

Phổ hồng ngoại

vii

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

HR-ESI-MS High Resolution Electrospray Ionization Mass Spectrum

Phổ khối lượng ion hóa phân giải cao

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

Phổ tương tác dị hạt nhân trực tiếp H→C

Hz Hertz Đơn vị đo tần số

IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm

J Hằng số ghép spin

m Multiplet Mũi đa

MeOH Methanol

MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

MIN6 Mouse Insulinoma 6 Tế bào tụy tạng

MS Mass Spectroscopy Khối phổ

BuOH n-butanol

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectrocopy Phổ NOESY

ppm parts per million Phần triệu

Peak Mũi tín hiệu

q Quartet Mũi bốn

Rf Retention factor

RNS Reactive nitrogen species Phần tử hoạt động chứa nitơ

ROS Reactive oxygen species Phần tử hoạt động chứa oxi

TOCSY Total Correlated Spectrocopy Phổ TOCSY

s Singlet Mũi đơn

t Triplet Mũi ba

TLC Thin layer chromatography Sắc ký bản mỏng

TMS Tetramethylsilane

H Proton chemical shift Độ dịch chuyển hóa học của proton (ppm)

C Carbon chemical shift Độ dịch chuyển hóa học của carbon (ppm)

UV-Vis Ultraviolet - visible spectroscopy Phổ tử ngoại - khả kiến

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Danh sách các loài thực vật thuộc chi Euphorbia ở Việt Nam ...................... 3

Bảng 1.2 Các hợp chất được phân lập từ Cỏ sữa lá lớn và các loài khác thuộc chi

Euphorbia .................................................................................................................. 32

Bảng 3.1 Danh sách các cao chiết ethanol tổng thu được ........................................... 51

Bảng 4.1 Kết quả sàng lọc các chỉ tiêu miễn dịch trên cá tra của 20 cao chiết ............ 65

Bảng 4.2 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup16 và số liệu tham khảo ............... 70








Bảng 4.10 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup14 và số liệu tham khảo ............. 85









Bảng 4.19 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup17 và số liệu tham khảo ........... 101





Bảng 4.24 Tổng hợp các hợp chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn ........................... 110

Bảng 4.25 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết .................................... 117

Bảng 4.26 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của chất phân lập và kháng sinh đối chứng

................................................................................................................................ 118

Bảng 4.27 Kết quả MIC của các mẫu thử ................................................................ 119

Bảng 4.28 Hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH và ABTS•+ của các mẫu thử ........... 120

ix

Bảng 4.29 Khả năng gây độc tế bào của Cỏ sữa lá lớn ............................................. 121

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình lá và hoa, mẫu tiêu bản của Cỏ sữa lá lớn ........................................... 22

Hình 2.1 Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH của chất kháng oxi hóa ...................... 46

Hình 2.2 Phản ứng hình thành gốc tự do ABTS• ...................................................... 47

Hình 3.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất của phân đoạn ME 2.6 và ME 4 từ cao methanol

.................................................................................................................................. 54


.................................................................................................................................. 54

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất của cao chiết n-butanol từ Cỏ sữa lá lớn ......... 56

Hình 3.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất của phân đoạn EE 2, 5, 6 từ cao ethyl acetate . 58

Hình 3.5 Sơ đồ phân lập các hợp chất của phân đoạn EE 7, 8, 9 từ cao ethyl acetate . 58

Hình 3.6 Sơ đồ phân lập các hợp chất của cao chiết n-hexane từ Cỏ sữa lá lớn ......... 59

Hình 4.1 Ảnh hưởng của 20 cao chiết lên hoạt tính lysozyme của (A) tế bào máu và

(B) tế bào thận cá tra so với đối chứng DMSO ........................................................... 63

Hình 4.2 Ảnh hưởng của 20 cao chiết lên hoạt tính bổ thể của (A) tế bào máu và

(B) tế bào thận cá tra so với đối chứng DMSO ........................................................... 64

Hình 4.3 Ảnh hưởng của 20 cao chiết lên tổng kháng thể của (A) tế bào máu và (B) tế

bào thận cá tra so với đối chứng DMSO .................................................................... 65

Hình 4.4 Công thức cấu tạo của 12-hydroxy jasmonic acid ....................................... 69

Hình 4.5 Các tương quan HMBC chính của hợp chất Eup16 .................................... 69

Hình 4.6 Công thức cấu tạo của hợp chất Eup16 ...................................................... 70

Hình 4.7 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup01 và Eup02 ........................................ 75



Hình 4.10 Tương quan HMBC trong vòng B của hợp chất Eup14 ............................ 86

Hình 4.11 Tương quan HMBC trong vòng A của hợp chất Eup14 ............................ 86

Hình 4.12 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup11, Eup14 và Eup15 ......................... 88

Hình 4.13 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup19 và Eup21 ...................................... 90

Hình 4.14 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup10, Eup12 và Eup13 ......................... 94

Hình 4.15 Tương quan HMBC của hợp chất Eup06.................................................. 96

Hình 4.16 Tương quan HMBC của hợp chất Eup17................................................ 101

Hình 4.17 Công thức cấu tạo của hợp chất Eup06, Eup07 và Eup17...................... 102

x

Hình 4.18 Công thức cấu tạo của hợp chất Eup03 và Eup20 .................................. 106

Hình 4.19 Công thức cấu tạo của hợp chất Eup23 và Eup18 .................................. 109

Hình 4.20 Hoạt tính lysozyme của tế bào bạch cầu cá tra ........................................ 113

Hình 4.21 Hoạt tính bổ thể của tế bào bạch cầu cá tra ............................................. 114

Hình 4.22 Hoạt tính tổng kháng thể của tế bào bạch cầu cá tra ................................ 114

Hình 4.23 Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến tế bào MIN6 ..................................... 122

Hình 4.24 Ảnh hưởng của cao chiết đến khả năng bảo vệ tế bào MIN6 do H2O2 gây ra

................................................................................................................................ 123

Hình 4.25 Ảnh hưởng của rutin, quercitrin, taraxerol đến khả năng bảo vệ tế bào MIN6

do H2O2 gây ra ......................................................................................................... 123

Hình 4.26 Ảnh hưởng của luteolin, quercetin, caffeic acid đến khả năng bảo vệ MIN6

do H2O2 gây ra ......................................................................................................... 125

Hình 4.27 Ảnh hưởng của cao chiết đến khả năng bảo vệ tế bào MIN6 do TG gây ra

................................................................................................................................ 126


do TG gây ra ............................................................................................................ 126

Hình 4.29 Ảnh hưởng của luteolin, quercetin, caffeic acid đến khả năng bảo vệ tế bào

MIN6 do TG gây ra .................................................................................................. 127

xi

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Các phổ của hợp chất Eup16 (sodium β-D-glucopyranosyl 12

hydroxyjasmonate) .................................................................................................. 160

Phụ lục 2: Các phổ của hợp chất Eup01 (quercitrin) ............................................... 186

Phụ lục 3: Các phổ của hợp chất Eup02 (rutin) ....................................................... 195

Phụ lục 4: Các phổ của hợp chất Eup04 (avicularin)............................................... 202

Phụ lục 5: Các phổ của hợp chất Eup05 (astragalin) ............................................... 206

Phụ lục 6: Các phổ của hợp chất Eup08 (luteolin) .................................................. 209

Phụ lục 7: Các phổ của hợp chất Eup09 (quercetin) ................................................ 212

Phụ lục 9: Các phổ của hợp chất Eup14 (afzelin) ................................................... 221

Phụ lục 10: Các phổ của hợp chất Eup15 (myricitrin) ............................................. 227

Phụ lục 11: Các phổ của hợp chất Eup19 (hymenoxin) ........................................... 234

Phụ lục 12: Các phổ của hợp chất Eup21 (cynaroside) ........................................... 241

Phụ lục 13: Các phổ của hợp chất Eup10 (caffeic acid) .......................................... 246

Phụ lục 14: Các phổ của hợp chất Eup12 (protocatechuic acid) .............................. 249

Phụ lục 15: Các phổ của hợp chất Eup13 (gallic acid) ............................................ 251

Phụ lục 16: Các phổ của hợp chất Eup06 (taraxerol) .............................................. 253

Phụ lục 17: Các phổ của hợp chất Eup07 (taraxerone) ............................................ 260

Phụ lục 18: Các phổ của hợp chất Eup17 (cycloart -23-ene-3β,25-diol).................. 264

Phụ lục 19: Các phổ của hợp chất Eup03 (3β,7β,25-trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien-

19-al) ....................................................................................................................... 273

Phụ lục 20: Các phổ của hợp chất Eup20 (campesterol) ......................................... 277

Phụ lục 21: Các phổ của hợp chất Eup23 (2β,16α,19-trihydroxy-ent-kaurane) ....... 281

Phụ lục 22: Các phổ của hợp chất Eup18 (1-O-benzyl-rutinoside) ......................... 289

1

MỞ ĐẦU

Ngành thủy sản Việt Nam gần đây đã phát triển mạnh mẽ và giữ vai trò quan

trọng trong xuất khẩu. Tuy nhiên, đi đôi với việc phát triển nuôi trồng thủy sản thì dịch

bệnh cũng bùng phát mạnh mẽ và gây thiệt hại đáng kể. Việc sử dụng thuốc và hóa chất

sẽ gây ra nhiều trở ngại cho nghề nuôi như sự kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng

nhiều, ô nhiễm môi trường nuôi, sự tồn lưu thuốc trên cá thương phẩm ảnh hưởng đến

sức khoẻ của người tiêu dùng và cũng là rào cản cho các doanh nghiệp Việt Nam trong

xuất khẩu thủy sản. Để hạn chế dịch bệnh cũng như việc sử dụng thuốc và hóa chất trong

nuôi trồng thủy sản, một số giải pháp được nhiều người quan tâm và áp dụng trong các

mô hình nuôi thủy sản hiện nay như sử dụng các chất tăng cường miễn dịch, sử dụng

vaccine, chế phẩm sinh học hay các sản phẩm nâng cao miễn dịch không đặc hiệu…

Trong đó, sử dụng thảo dược để thay thế kháng sinh, tăng cường hệ miễn dịch cho vật

nuôi và kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm thủy sản… đang là hướng đi mới cho ngành

thủy sản.

Với sự khác biệt lớn về khí hậu, từ vùng gần xích đạo tới giáp vùng cận nhiệt đới,

cùng với sự phân hóa cao về địa hình đã góp phần tạo nên sự đa dạng về hệ sinh thái nói

chung cũng như hệ thực vật nói riêng ở Việt Nam. Theo các nhà khoa học, Việt Nam có

khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, 800 loài rêu và 600 loài nấm; trong đó, hơn 5.000

loài được sử dụng làm dược liệu và thuốc chữa bệnh, đặc biệt hơn là gần 90% trong số

chúng là cây thuốc mọc tự nhiên. Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong những quốc gia

có nền y học cổ truyền lâu đời sử dụng nhiều loại thảo dược trong điều trị bệnh và tăng

cường sức khỏe. Đây là một nguồn hợp chất thiên nhiên vô cùng quý báu cần được

nghiên cứu về mặt hóa học và hoạt tính sinh học để tìm ra các hoạt chất có thể phát triển

thành thuốc phục vụ cho đời sống và hướng nghiên cứu này đang được nhiều nhà khoa

học quan tâm.

Cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.), theo Đông y có tác dụng thanh nhiệt, giải

độc, thông sữa, chống ngứa, được dân gian dùng làm thuốc hạ sốt, làm mát cơ thể, trị

ho, cảm lạnh, sổ mũi, viêm phổi và hen suyễn nhờ tác dụng làm giãn phế quản... Theo

kết quả sàng lọc ban đầu của chúng tôi trên tác dụng tăng cường hệ miễn dịch cá tra của

20 loài dược thảo, Cỏ sữa lá lớn thể hiện hoạt tính khá tốt, nhưng các nghiên cứu về

thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài này ở Việt Nam chưa nhiều. Do vậy

2

đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kích thích hệ miễn dịch của Cỏ

sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) vùng Đồng bằng sông Cửu Long trên đối tượng cá

tra” được thực hiện nhằm đóng góp thêm những hiểu biết về thành phần hóa thực vật

cũng như tác dụng sinh học của loài Cỏ sữa lá lớn ở Việt Nam.

Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh

học của Cỏ sữa lá lớn, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra sản

phẩm ứng dụng trong thủy sản nói riêng hay cuộc sống nói chung.

Nội dung luận án bao gồm:

1. Sàng lọc các loài dược thảo có hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra;

2. Phân lập các hợp chất từ toàn cây Cỏ sữa lá lớn thu hái tại thành phố Cần Thơ;

3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp

vật lý và hóa học;

4. Đánh giá hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra, hoạt tính kháng khuẩn,

kháng oxi hóa và hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6 khỏi ER stress của các cao chiết và một

số hợp chất sạch phân lập được.

3

TỔNG QUAN

Giới thiệu về chi Euphorbia

Đặc điểm thực vật của chi Euphorbia

Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae, còn gọi là họ Đại kích) là một họ lớn của thực vật

có hoa với khoảng 240 chi và 6000 loài. Phần lớn là cây thân thảo, nhưng ở khu vực

nhiệt đới cũng tồn tại các loài cây bụi hoặc cây thân gỗ. Một số loài cây chứa nhiều nước

và tương tự như các loài xương rồng. Họ này phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới, với

phần lớn các loài tập trung trong khu vực sinh thái Đông Dương Indomalaya và sau đó

là khu vực nhiệt đới châu Mỹ. Tại khu vực nhiệt đới Châu Phi cũng có nhiều loài, giống,

thứ, nhưng không đa dạng như hai khu vực kể trên [1].

Một trong những chi lớn nhất của họ Thầu dầu là Euphorbia với khoảng 2000

loài [2]. Các loài thuộc chi Euphorbia có lá mọc so le với các lá kèm, hiếm khi mọc đối.

Hình dạng lá chủ yếu là lá đơn, nhưng cũng có loài có lá phức, chủ yếu là loại dạng chân

vịt, không thấy dạng lông chim. Các lá kèm có thể bị suy thoái thành gai, lông tơ hay

các tuyến nhỏ. Với một họ lớn như họ Thầu dầu, chắc chắn sẽ có sự đa dạng lớn về cấu

trúc hoa. Hoa thường có dạng đối xứng xuyên tâm và đơn tính, với hoa đực và hoa cái

thường cùng trên một cây. Quả thường là loại quả nứt, đôi khi là quả hạch. Loại quả nứt

là một loại quả nang với ba hoặc nhiều hơn các ô, mỗi ô tách ra khi chín thành các phần

riêng biệt [1, 3].

Theo GS. Phạm Hoàng Hộ, ở Việt Nam có khoảng 30 loài thuộc chi Euphorbia

(Bảng 1.1) phân bố ở nhiều vùng miền khác nhau [4].

Bảng 1.1 Danh sách các loài thực vật thuộc chi Euphorbia ở Việt Nam

STT Tên khoa học Tên loài STT Tên khoa học Tên loài

1 Euphorbia tirucalli L.

Xương khô 16 Euphorbia lathyris L.

Tục tùy

2 Euphorbia pulcherrima Willd.

Trạng nguyên 17 Euphorbia coudercii Gagnep.

Cỏ mộc nhẵn

3 Euphorbia cyathophora Murr.

Tiểu trạng 18 Euphorbia hirta L.

Cỏ sữa lá lớn

4 Euphorbia heterophylla L.

Cỏ mủ 19 Euphorbia hypericifolia L.

Cỏ sữa lá ban

4

5 Euphorbia antiquorum L.

Xương rồng ông 20 Euphorbia indica Lamk.

Cỏ sữa Ấn

6 Euphorbia neriifolia Roxb.

Xương rồng 21 Euphorbia laeta Jacq.

Cỏ sữa sáng

7 Euphorbia edulis Lour.

Xương rồng ngọc lân

22 Euphorbia heyneana Sprengl.

Cỏ sữa tròn

8 Euphorbia nivula Buch.

Giang lâm 23 Euphorbia prostrata Ait.

Cỏ sữa nằm

9 Euphorbia trigona Mill.

Xương rồng cảnh

24 Euphorbia rosea Retz.

Cỏ sữa hồng

10 Euphorbia milii Desmoul

Xương rắn 25 Euphorbia sessiflora Roxb.

Cỏ sữa hoa không cuống

11 Euphorbia arenarioides Gagnep.

Cỏ sữa 26 Euphorbia maculate L.

Đại kích điểm

12 Euphorbia atoto Forst.

Đại kích biển 27 Euphorbia thymifolia L.

Cỏ sữa lá nhỏ

13 Euphorbia capillaris Gagnep.

Cỏ sữa rừng còi 28 Euphorbia vachellii Hook. et Arn.

Cỏ sữa rừng khô

14 Euphorbia cristata Heyne ex Roth.

Đại kích sóng 29 Euphorbia harmvàii Gagn.

-

15 Euphorbia chrysocoma Lévl. et Vaniot

Cỏ sữa lông vàng

30 Euphorbia linearifolia Heyne ex Roth.

-

Hoạt tính sinh học của chi Euphorbia

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các loài thực vật họ Thầu dầu, đặc biệt là các loài

thuộc chi Euphorbia, có nhiều hoạt tính sinh học đáng quý như: hoạt tính kháng khuẩn,

kháng nấm, kháng virus, kháng viêm giảm đau, kháng oxi hóa, hoạt tính hạ glucose máu,

bảo vệ thần kinh, điều hòa miễn dịch và nhất là hoạt tính chống ung thư rất tốt.

Loài Euphorbia tibetica đã được nghiên cứu tác dụng ức chế đối với sự phát triển

tế bào ung thư phổi ở người A-549 [5]. Loài Euphorbia connate Boiss. được sử dụng

nhiều trong dân gian ở Iran để điều trị các bệnh ung thư. Các hợp chất diterpene được

phân lập từ phần trên mặt đất của loài này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên hai dòng

tế bào ung thư vú ở người MDA-MB và MCF-7 [6]. Các cao chiết phân đoạn và một số

hợp chất phân lập được từ rễ của loài Euphorbia fischeriana có hoạt tính gây độc tế bào

đối với hai dòng tế bào ung thư gan Hep-3B và ung thư phổi A-549 [7]. Một nghiên cứu

5

khác cũng trên loài này đối với chuột đã cho thấy tiềm năng để điều trị giảm đau, an

thần [8]. Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc, một số hợp chất

phân lập được từ rễ của loài Euphorbia ebracteolata Hayata đã thể hiện hoạt tính gây

độc tế bào đối với năm dòng tế bào ung thư ở người đó là: HL-60, SMMC-7721, A-549,

MCF-7 và SW-480 [9]. Một số hợp chất phân lập được từ loài Euphorbia kansui cũng

thể hiện tốt hoạt tính gây độc tế bào đối với hai dòng tế bào ung thư gan và phổi ở người:

Hep-G2 và A-549 [10]. Các hợp chất jatrophane diterpene polyester đã được phân lập

từ loài Euphorbia pubescens thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với ba dòng tế bào

ung thư ở người: MCF-7, NCI-H460 và SF-268 [11]. Từ rễ của loài Euphorbia

ebrateolata các hợp chất diterpen đã được phân lập và cũng chứng minh được hoạt tính

gây độc tế bào đối với ba dòng tế bào ung thư: ANA-1, B-16 và Jurkat của các hợp chất

này [12]. Các hợp chất được phân lập từ loài Euphorbia esula, E. davidii có khả năng

ức chế sự tăng sinh của các dòng tế bào: B-16, KB, SMMC, BGC, HeLa, Ishikawa, A-

431, A-2780 và MCF-7 [13-15]. Ngoài ra, các cao chiết từ toàn thân của các loài

Euphorbia esula, E. peplus, E. Salicifolia, E. Serrulata, E. exigua và E. lagascae cùng

các hợp chất phân lập được đã thể hiện khả năng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung

thư [16-18]. Các hoạt chất phân lập được từ E. helioscopia và E. alatavica có khả năng

gây độc các dòng tế bào HL-60, HeLa, MCF-7, A-431, A-2780 và A-549 [19, 20].

Các hợp chất phân lập được từ Euphorbia peplis cho thấy hoạt tính kháng nấm

và kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Mycobacterium tuberculosis và nấm Cvàida albicans, Cvàida parapsilosis, Cvàida

glabrata và Cryptococcus neoformans [21]. Guyoniain C và D phân lập từ Euphorbia

guyoniana kháng vi khuẩn Gram dương (Bacillus cereus và Staphylococcus aureus) và

vi khuẩn Gram âm (Serratia sp. và Pseudomonas sp.) [22]. Cao chiết (chiết Soxhlet và

chiết ngâm dầm) từ loài E. heliscopa kháng lại B. cereus với giá trị MIC lần lượt là 1.25

và 0.5 mg/mL [23].

Avila và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của cao chiết và hai diterpene phân lập

được từ mủ của loài E. laurifolia và E. lactea lên hoạt động HIV-1 ở tế bào Jurkat-LAT-

GFP. Kết quả cho thấy hợp chất 3,12-di-O-acetyl-8-O-tigloommeol, thu được từ E.

lactea, đã chứng tỏ hoạt động HIV-1 phụ thuộc vào nồng độ với EC50 = 0.5 μg/mL [24].

Tian và cộng sự đã thử nghiệm khả năng kháng virus của các diterpene phân lập từ E.

6

micractina, kết quả đã khẳng định lathyra 15- (cinnamoyloxy) 5,12-dien-3-ol-14-one có

thể chống lại HIV-1 (IC50 = 8.2 µM) trong thử nghiệm in vitro [25]. Một nghiên cứu

khác cho thấy hợp chất jatrophane diterpene được phân lập từ Euphorbia hyberna, có

khả năng kháng virus đáng kể thông qua việc điều hòa thụ thể HIV-1 [26]. Ngoài ra, cao

chiết của E. spinidens có hàm lượng phenol và flavonoid cao cùng với tác dụng kháng

virus HSV-1 [27].

Nhóm nghiên cứu của Xu và cộng sự đã công bố tác dụng bảo vệ thần kinh của

19 hợp chất diterpene phân lập từ rễ của loài E. prolifera. Kết quả chỉ ra rằng tất cả các

hợp chất khảo nghiệm đều có tác dụng bảo vệ thần kinh do MPP+ (ion 1-methyl-4-

phenylpyridinium) gây chết tế bào SH-SY5Y [28]. Ngoài ra, 2α-O-isobutyryl

3β,5α,7β,10,15β-penta-O-acetyl-14α-O-benzoyl-10,18-dihydromyrsinol và 2α-O-

isobutyryl-3β-O-propionyl-5α,7β,10,15β-tetra-O-acetyl-10,18-dihydromyrsinol phân

lập từ rễ của E. prolifera đều có khả năng bảo vệ tế bào thần kinh [29].

Paraliane và pepluane diterpene, hai thành phần của Euphorbia paralias, đã được

chứng minh có tác dụng kháng viêm tốt [30]. Năm 2010, Chang cùng các cộng sự đã

chứng minh tác dụng kháng viêm với STAT3 gây ra bởi IL-6 đã bị ức chế bởi

kansuinines A và B - hai hợp chất phân lập được từ Euphorbia kansui [31].

Hai triterpenoid là betulin và (3β, 23E)-cycloarta-23-ene-3,25-diol phân lập từ

phần trên mặt đất của E. spinidens có khả năng điều hòa miễn dịch qua sự tăng sinh của

tế bào lympho máu ngoại vi người được kích hoạt bởi PHA [32]. Ở liều 400 mg/kg/ngày

trọng lượng cơ thể, cao chiết từ lá của loài Euphorbia neriifolia Linn có khả năng điều

hòa miễn dịch ở thử nghiệm trên chuột [33].

Dịch chiết của Euphorbia heyneana đã thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa in vitro

thông qua khả năng ức chế gốc tự do superoxide và hydroxyl tương ứng từ 43.17% đến

91.22% và từ 32.54% đến 78.34%; lần lượt với giá trị IC50 = 68.11; 67.55 µg/mL (so

với giá trị IC50 của vitamin C là 62.27; 55.24 µg/mL) [34]. Hoạt tính kháng oxi hóa của

các cao chiết ethanol, acetone và petroleum ether của ba loài Euphorbia acanthothamnos

Heldr, Euphorbia macroclada Boiss và Euphorbia rigida Bieb đã được tiến hành. Kết

quả cho thấy cao chiết ethanol của E. acanthothamnos đã thể hiện hiệu quả cao nhất

theo phương pháp DPPH. Cao chiết acetone của E. macroclada cho hoạt tính kháng oxi

hóa cao hơn BHT và α-Tocopherol dựa trên phương pháp khử Fe2+ [35]. Mười hợp chất

7

phân lập được từ phần trên mặt đất của loài E. petiolata đã được thử nghiệm hoạt tính

kháng oxi hóa theo phương pháp DPPH, kết quả chỉ ra rằng các dẫn xuất của kaempferol,

quercetin và myricetin là những hợp chất cho kết quả kháng oxi hóa tốt [36].

Dịch chiết ethanol của loài Euphorbia neriifolia với liều dùng 200 và 400 mg

chiết xuất/kg thể trọng có tác dụng hạ đường huyết đáng kể sau 15 ngày với thử nghiệm

trên chuột bị bệnh đái tháo đường gây ra bởi alloxan [37]. Cao nước và methanol của

Euphorbia thymifolia với liều dùng 250 và 500 mg chiết xuất/kg thể trọng có tác dụng

hạ đường huyết, nồng độ HbA1c, urê và tổng protein trên chuột bị bệnh đái tháo đường

gây ra bởi streptozotocin-nicotinamide sau 28 ngày [38].

Thành phần hóa học của chi Euphorbia

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Euphorbia cho thấy có rất nhiều

hợp chất có cấu trúc lý thú trong chi này bao gồm các nhóm diterpenoid, triterpenoid,

coumarin, flavonoid, hợp chất phenol và các hợp chất khác.

Các hợp chất diterpenoid

Các công bố nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi Euphorbia

cho thấy hầu hết các loài của chi này đều chứa thành phần diterpenoid.

Năm 2016, Shao Nan Liu và cộng sự đã cô lập được ba hợp chất ent-rosane

diterpenoid gồm: euphomilone A (1), euphomilone B (2) và euphomianol A (3) từ phần

trên mặt đất của loài Euphorbia milii [39].

O

HO

H

HHO

1

O

HH

HO

2

H

OHHO

O

3

Cũng vào năm 2016, Yi Kuang và cộng sự đã cô lập được hai ent-atisane

diterpenoid mới từ toàn cây Euphorbia wallichii đó là ent-atisane-16β,17-isopropyliden

edioxy-19-ol-3-one (4) và ent-atisane-16β,17-isopropylidenedioxy-11β,18-dihydroxyl-

3-one (5) [40].

8

Một nghiên cứu khác về thành phần hóa học của loài Euphorbia connata Boiss

bởi Shadi S và cộng sự vào năm 2014 đã tách được ba diterpenoid: 3,7,14,15-tetraacetyl-

5-propanoyl-13(17)-epoxy-8,10(18)-myrsinadiene (6); 3,7,10,14,15-pentaacetyl-5-

butanoyl-13,17-epoxy-8-myrsinene (7) và 5,6-epoxy-8,9,15-triacetyl-3-benzoyl-14-

oxo-jatropha-11(E)-ene (8) [6].

Từ rễ của loài Euphorbia fischeriana, sáu diterpenoid đã được phân lập bao gồm:

ent-kaurane-3-oxo-16β,17-acetonide (9); jolkinolide B (10); ent-(3α,5β,8β,9α,

10β,12β)-3-hydroxyatis-16-en-14-one (11); ent-atisane-3α,16β,17-triol (12); ent-

kaurane-3-oxo-17β-ol (13) và 12-deoxyphorbaldehyde-13-hexadecanoate (14) [7].

9

Một diterpenoid 3R,12R-dihydroxy-ent-8(14),15-isopimaradien-18-al (15) đã

được phân lập từ Euphorbia quinquecostata [41] và từ loài Euphorbia peplus, một hợp

chất mới: 3,5,7,15-tetraacetoxy-9-nicotinoyloxy-14-oxojatropha-6(17),11-diene (16)

cũng đã được phân lập [42]. Ngoài ra, helioscopinolide A (17) và helioscopinolide B

(18) đã phân lập được từ loài Euphorbia helioscopia [43].

Nhiều diterpenoid khác cũng đã được chiết tách từ các loài khác nhau của chi

Euphorbia, đó là: 12-deoxyphorbaldehyde-13-hexadecanoate (14); langduin A (19);

prostratin (20); 12-deoxyphorbol (21) và 12-deoxyphorbol-13,20-diacetate (22) từ

Euphorbia fischeriana [8]; 2α,3β,5α,7β,10-O-pentacetyl-14α-O-benzoyl-15β-O-

nicotinoyl-10,18-dihydromyrsinol (23) và proliferin (24) từ loài Euphorbia

dracunculoides [44]. Ngoài ra, ba diterpenoid mới đã được phân lập từ rễ của Euphorbia

ebracteolata Hayata bởi Wen-Juan Yuan và cộng sự vào năm 2016 bao gồm Ebrateolata

A, B, C (25-27) [9].

10

Khá gần đây, năm 2016, Ju-Ying Tsai và các cộng sự đã tách được bảy hợp chất

từ loài Euphorbia grvàicornis đó là prostratin (20); 16-angeloyloxy-13α-

isobutanoyloxy-4β,9α-dihydroxytiglia-1,6-dien-3-one (28); 20-acetoxy-13α-

isobutanoyloxy-4β,9α,16-trihydroxytiglia-1,6-dien-3-one (29); 16-angeloyloxy-13α-

isobutanoyloxy-20-acetoxy-4β,9α-dihydroxytiglia-1,6-dien-3-one (30); 13α-

isobutanoyloxy-4β,9α,20-trihydroxytiglia-1,6-dien-3-one (31); 20-acetoxy-13α-

isobutanoyloxy-4β,9α-dihydroxytiglia-1,6-dien-3-one (32) và 20-acetoxy-13α-(2-

methylbutanoyloxy)-4β,9α-dihydroxytiglia-1,6-dien-3-one (33) [45].

R1 R2 R3 28. H iBu OAng 29. OAc iBu OH 30. OAc iBu OAng 31. OH iBu H 32. OAc iBu H 33. OAc MeBu H

Năm 2016, từ loài Euphorbia kansui các nhà nghiên cứu của Trung Quốc đã phân

lập được sáu hợp chất diterpenoid đó là: esulone A (34), kansuinin B (35), kansuinin A

(36), kansuinin D (37), kansuinin E (38) và kansuinin G (39) [10]. Gần đây, các nhà

nghiên cứu của Ý cũng đã tìm ra được năm diterpenoid mới từ loài Euphorbia laurifolia

đó là: laurifolioside (40), 2-epi-laurifolioside (41), 7β,8α,15β-triacetoxy-3β-(2-

methylpropanoyloxy)-4α,9αH,11αH-lathyra-5E,12E-dien-14-one (42), 20-deoxy-16-

hydroxyingenol-3-β-D-glucopyranoside (43) và 2α-hydroxy-ent-abieta-8,13-dien-

12,16-olide (44) [46].

11

Năm 2004, từ loài Euphorbia pubesccens đã phân lập được các diterpenoid đó

là: Euphopubescenol (45), Euphopubescene (46), Jolkinol A (47), Jolkinol A (48) [11]

và 3β,9α,-diacetoxy-7β-benzoyloxy-15β-hydroxy-14-oxo-2βH-jatropha-5E,12E-diene

(49) [42]. Từ rễ của loài Euphorbia ebracteolata đã phân lập được ba diterpenoid mới

là Yuexivàajisu D (50), Yuexivàajisu E (51) và Yuexivàajisu F (52) [47]. Năm 2009, từ

rễ của loài Euphorbia ebracteolata Hayata, nhóm nghiên cứu của Trung Quốc đã phân

lập được ba diterpenoid là: ingenol-5β,20-O,O-isopropylidene-3β-palmitate (53),

ingenol-5β,20-O,O-isopropylidene-3β-myristinate (54) và 3β,19-dihydroxy-1(10),15-

rosadien-2-one (55) [12].

O

OHBzOBzOAcO

HO

AcOO

34

12

Từ các loài E.esula và E. serrulata đã phân lập được các diterpenoid: esulatins

H-M (56-61), (2R,3S,6S,7R,8R,9S,13S,15R)-7,8,9,15-tetraacetoxy-3-benzoyloxy-6-

hydroxy-14-oxojatropha-4E,11E-dien (62); (2R,3R,6S,7R,8R,9S,13S,15R)-6,7,8,9,15-

pentaacetoxy-3-benzoyloxy-2-hydroxy-14-oxojatropha-4E,11E-diene (63); (2S,3S,6S,

7R,8R,9S,13S,14S,15R)-7,8,9,14,15-pentaacetoxy-3-benzoyloxy-6-hydroxyjatropha-

4E,11E-diene (64); (2S,3S,6S,7R,8R,9S,13S,14S,15R)-8,9,14,15-tetraacetoxy-3,7-

dibenzoyloxy-6-hydroxjatropha-4E,11E-diene (65); (2R,3S,4S,7S,8S,9S,13S,

14S,15R)-8,9,14,15-tetraacetoxy-3-benzoyloxy-7-hydroxy jatropha-5E,11E-diene (66)

[13, 16].

13

Bốn hợp chất diterpenoid mới thuộc khung premyrsinane (67-70) cũng đã được

chiết tách từ cao methanol của loài Euphorbia falcata vào năm 2011 [48]. Ngoài ra, từ

các loài Euphorbia exigua, Euphorbia lagascae và Euphorbia peplus nhiều hợp chất

diterpenoid mới cũng đã được phân lập đó là: rel-(2R,3R,4S,5R,7S,8R,13S,14S,15R)-

2,7,8,14-tetraacetoxy-5-(benzoyloxy)-3,15-dihydroxy-9-oxojatropha-6(17),11E-diene

(71); rel-(2R,3S,4S,5R,7S,8S,9S,13S,14S,15R)-3-(benzoyloxy)-9-[(E)-cinnamoyloxy]-

5,8,15-trihydroxy-7-(propanoyloxy)-14-oxojatropha-6(17),11E-diene (72);

Latilagascenes A, B và C (73-75); (2R,3R,4S,5R,7R,9R,13R,15R)-2,3,5,7,15-

pentaacetoxy-9-nicotinoyloxy-14-oxojatropha-6(1),11E-diene (76); (2R,3R,4S,5R,7S,

8S,9S,l3S,14S,15R)-2,5,7,8,9,14-hexaacetoxy-3-benzoyloxy-15-hydroxyjatropha-

6(17),11E-diene (77); (2R,3R,4S,5R, 7S,8S,9S,l3S,14S,l5R)-2,5,14-triacetoxy-3-

benzoyloxy-8,15-dihydroxy-7isobutyroyloxy-9-nicotinoyl-oxyjatropha-6(17),11E-

diene (78); (2R,3R,4S,5R,7S,8S, 9S,13S,14S,15R)-2,5,9,14-tetraacetoxy-3-benzoyloxy-

8,15-dihydroxy-7isobutyroyloxy jatropha-6(17),11E-diene (79); (2R,3R,4S,5R,7S,

8S,9S,13S,14S,15R)-2,5,7,14-tetraacetoxy-3-benzoyloxy-8,15-dihydroxy-9-nicotinoyl

oxyjatropha-6(17),11E-diene (80); (2R,3R,4S,5R,7S,8S,9S,13S,14S,15R)-2,5,7,9,14-

pentaacetoxy-3-benzoyloxy-8,15-dihydroxy jatropha-6(17),11E-diene (81); (2S,3S,4R,

5R,6R,8R,9R,10R,12S,13S,14R,15R)-5,8,9,10,14-pentaacetoxy-3-benzoyloxy-15-

hydroxypepluane (82) [17, 18, 49].

BzO

AcOO

AcO

AcOOAc

OAc

HO

63

HO OAc

OAc

AcOAcO

BzO H

66

14

AcO

AcO

AcO

H

O

ONic

AcOOAc

76

Năm 1996, J. Alberto Marco và cộng sự đã tách chiết được hai hợp chất từ cao

methanol của loài Euphorbia terracina là Terracinolide A (83) và Terracinolide B (84)

[50]. Sevil Öksüz và nhóm cộng sự (1996) đã tách ra được bảy hợp chất từ loài

Euphorbia aleppica trong đó có hai hợp chất diterpenoid mới đó là Aleppicatine A (85)

và Aleppicatine B (86) [51]. Đến năm 2002, hai hợp chất mới từ loài Euphorbia esula

đã được phân lập là 11,14-epoxy-3β,5α,7β,8α,9α,15β-hexaacetoxy-12-oxo-13αH-

jatropha-6(17)-ene (87) và 1α,3β-diacetoxy-5α,7β-dibenzoyloxy-9,14-dioxo-11β,12α-

epoxy-2α,8α,15β-trihydroxy-13βH-jatropha-6(17)-ene (88) [14]. Ngoài ra, Judit

Hohmann và cộng sự đã phân lập bốn hợp chất trong đó có ba hợp chất mới trong loài

Euphorbia platyphyllos là rel-(2S,3S,4E,6S,7R,8R,9S,11E,13S,14S,15R)-7,8,9,14,15-

15

pentaacetoxy-3-(benzoyloxy)-6-hydroxyjatropha-4,11-diene (89); rel-(2S,3S,4S,5E,

7S,8S,9S,11E,13S,14S,15R)-7,8,9,14,15-pentaacetocy-3(benzoyloxy)jatropha-5,11-

diene (90); rel-(2R,3S,4E,6S,7R,8S,9R,11E,13R,14S,15R)-8,14,15-triacetoxy-3,7bis

(benzoyloxy)-6,9-epoxy-9-hydroxyjatropha-4,11-diene (91) [52]. Hong-Wen Tao và

cộng sự (2008) đã phân lập được năm hợp chất từ loài Euphorbia helioscopia là

Euphornin L (92), Euphoscopin F (93), Epieuphoscopin B (94), Euphoscopin B (95) và

Euphoscopin C (96) [19].

Năm 2016, Cầm Thị Ính và các cộng sự đã phân lập được một diterpenoid mới là

lα,l3β,14α-trihydroxy-3β-benzoyloxy-7β-methoxy-9β,15β-diacetoxy-jatrophan-5,11E-

dien (97) từ Euphorbia tithymaloides (P.) cùng với lα,l3β,14α-trihydroxy-3β,7β-

dibenzoyloxy-9β,15β-diacetoxyjatrophan-5,11E-dien (98) và lα,7β,l3β,14α-

tetrahydroxy-3β-benzoyloxy-9β,15β-diacetoxy-jatrophan-5,11E-dien (99) [53].

16

OAc

BzO

AcO

AcOOAc

OAc

H

90

OAc

BzO

AcO

AcOOAc

OAc

H

91

OBzAcO

OAc

H OAc

H

H

H

92

OBzO

OAc

H O

H

H

H

OAc

93

OBzO

OAc

H OH

H

H

H

OAc

94

OBzO

OR

H OAc

H

H

H

OAc

95. R = Ac96. R = Bz

H

HO

H

HO

OAc

ORO

CO

HO

AcO

97. R = CH3

98. R = Bz

99. R = H

Các hợp chất triterpenoid

Hợp chất triterpenoid cũng được tìm thấy trong chi Euphorbia tuy không phổ

biến như các hợp chất diterpenoid. Dưới đây là những hợp chất triterpenoid phân lập

được lần lượt từ các loài Euphorbia alatavica, Euphorbia fischeriana, Euphorbia kansui

và Euphorbia heteradena đó là: alatavolide (100) và alatavoic acid (101) [20];

langdudajiin A (102) và lupeol acetate (103) [7]; (3β,11β)-3,11-dihydroxylanosta-8,24-

dien-7-one (104) [46]; 24-methylenecycloartanol (105), cycloart-25-en-3β,24-diol

(106), cycloart-22-en-3β,25-diol (107) [54].

O

O

OH

100

HOOC

HOOC

101

HO

HO

102

17

AcO

103

HO

HO O

104

R

HO

105. R =

106. R =

107. R=

OH

OH

Các hợp chất coumarin

Theo các tài liệu đã tham khảo [10, 41, 43, 54, 55] các hợp chất coumarin đã

được phân lập từ một số loài của chi Euphorbia: 7,7′-dihydroxy-6,8′-bicoumarin

(bicoumol) (108); 6-hydroxy-7-methoxycoumarin (isoscopoletin) (109); scopoletin

(110), scoparone (111), 3,4,3-tri-O-methoxy ellagic acid (112).

O

O

OH

O

O

OH

108

O OHO

H3CO

109 110

H3CO

HO

OO

H3CO

H3CO O O

111

O

O

O

H3CO

OCH3

O

OCH3

OH

112

Các hợp chất flavonoid

Các nghiên cứu về thành phần hóa học trong chi Euphorbia cho thấy các

hợp chất flavonoid được phân lập từ các loài Euphorbia helioscopia và Euphorbia

davidii Subils gồm có: licochalone A (113); quercetin (114); 7,4-dihydroxy-5-methoxy

flacanone (115); 2,4-dihydroxy-6-methoxydihydrochalcone (116); pinocembrin

18

(117); kaempferol 3-O-rhamnoside (118); myricetin 3-O-rhamnoside (119) và quercetin

3-O-rhamnoside (120) [15, 43].

O

HO OH

OCH3

113

O

OH

O

HO

OH

OH

OH

114

O

O

HO

OMe

OH

115

O

HO

OH

OCH3

116

O

O

HO

OH

117

OHO

OH

O

R1

OH

R2

118. R1 = H, R2 = H

119. R1 = OH, R2 = H

120. R1 = OH, R2 = OH

O

OHHO

H3C

O

HO

Các hợp chất phenol

Từ các loài Euphorbia quinquecostata và Euphorbia ebracteolata, các nhà nghiên

cứu đã phân lập được một số hợp chất phenol: vanillin (121); syringic acid (122); 2,4-

dihydroxy-6-methoxy-3-aldehydoacetophenone (123); 2,4-dihydroxy-6-methoxy-3-

methylacetophenone (124); 2,4-dihydroxy-6-methoxy-3-methyl

acetophenone 4-O-β-D-glycopyranoside (125); 2,4-dihydroxy-6-methoxy-3-methyl

acetophenone 4-O-α-L-arabinofuranosyl (1→6)-β-D-glucopyranoside (126) [41, 56].

HO

OCH3

O

H

121

COOH

H3CO OCH3

OH

122

H3COC

H3CO OR2

R1

OH

123 . R1 = CHO, R2 = H

124. R1 = CH3, R2 = H

125 . R1 = CH3, R2 = -D-glucopyranosyl

126 . R1 = CH3, R2 = -D- glucopyranosyl (61)--L-

arabinofuranosyl

19

Các hợp chất khác

Theo thống kê từ các công trình khoa học đã công bố, từ các loài khác nhau của

chi Euphorbia, các nhà nghiên cứu còn phân lập được nhiều hợp chất khác như: 2-

(furan-2-yl)-6-(2S,3S,4-trihydroxybutyl) pyrazine (127); (-)-trans-9-acetyl-4,9′-di-O-

methyl-3′-de-O-methyldehydrodiconiferyl alcohol (128); 3,4-dimethoxy

cinnamaldehyde (129); N-butylaniline (130); vomifoliol (131), vomifoliol 9-O-β-D-

glucopyranoside (132) [8, 9, 35]. Năm 2005, các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã cô lập

được ba hợp chất: 3,3-diacetyl-2,2,6,6-tetrahydroxy-4,4dimethoxy diphenylmethane

(133); 2,2,4,4-tetrahydroxy-6-6-dimethoxy-3,3-dimethyl-7,5-bisacetophenone (134)

và decahydro-1a,4a,7,7-tetramethyl-1H-cycloprop[e]azulene-2,5-diol (1aR,2R,4aS,

5S,7aR,7bR) (135) [56]. Ngoài ra, vào năm 2004, Guang-Miao fu và cộng sự đã cô lập

được hai dẫn xuất phlorogucinol từ loài Euphorbia ebracteolata Hayata đó là: 3,3-

diacetyl-2,4-dimethoxy-2,4,6,6-tetrahydroxy-5-methyl diphenyl-methane (136) và 1-

[3,5-bis-(3-acetyl-2,6-dihydroxy-4-methoxy-benzyl)-2,4,6-trihydroxy-phenyl]-

ethanone (137) [57].

N

NOH

O OH OH

OH

127

MeO

MeO

O

OMe

OAc

OH

128

HN CH3

130

H

O

MeO

MeO

129

OR

O

OH

131. R = H132. R = glucopyranoside

O CH3

H3CO

H

OH

OH HO

O CH3

OCH3

OH133

O CH3

H3CO

H

OH

OH HO

O CH3

OH

OCH3

COCH3

134

O CH3

HO

H

OH

OCH3 HO

O CH3

OCH3

OH

CH3

136

20

Năm 2016, từ loài Euphorbia laurifolia đã phân lập được deglucosy lauroside B

(138) [46]. Francesca Cateni và cộng sự đã phân lập bốn hợp chất từ loài Euphorbia

peplis là: 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8Z)-2N-[(2R)-2-hydroxytetracosenoil]-

8(Z)-octadecene 1,3,4-triol (139); 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8Z)-2N-[(2R)-

2hydroxyhexacosenoil]-8(Z) octadecene-1,3,4-triol (140); 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-

(2S,3S,4R,8Z)-2N-[(2R)-2-hydroxytetracosanoil]-8 (Z)-octadecene-1,3,4-triol (141) và

1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4E,8E)-2N-[(2R)-2hydroxyhexadecanoylamino]-

4(E),8(E)-octadecadiene-1,3 diol (142) [21].

21

Tổng quan về Cỏ sữa lá lớn

Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) là một loài cây cỏ mọc hoang ở Việt Nam.

Chúng dễ dàng sinh trưởng và phát triển ở nhiều vùng khí hậu và thổ nhưỡng khác nhau.

Tuy là loài cỏ dại nhưng từ xa xưa Cỏ sữa lá lớn đã được nhân dân các miền sử dụng

trong dân gian với nhiều tác dụng chữa bệnh hiệu quả.

Cỏ sữa lá lớn là một loài thực vật có hoa trong họ Thầu dầu. Cỏ sữa lá lớn có

nguồn gốc từ Trung Mỹ, nhưng phân bố chủ yếu ở các nước thuộc khu vực nhiệt đới

Đông Nam Á, Nam Á như Ấn Độ, Malaysia, Thái Lan, Lào, Việt Nam. Ở Việt Nam, Cỏ

sữa lá lớn phân bố tương đối phổ biến ở hầu hết các tỉnh từ đồng bằng đến miền núi.

Cây ưa ẩm, ưa sáng, thường mọc trên đất ẩm còn tương đối màu mỡ, lẫn với các loại cỏ

khác trên các bãi hoang, vườn ruộng [58].

Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Euphorbia hirta L.

Tên đồng nghĩa: Dạng pố (K’Ho), Hairy Spurge, Pill-bearing Spurge, Asthma

Herb, Herbe à pilules [4].

Tên Việt Nam: Cỏ sữa lá lớn

Giới thực vật (Plantae)

Ngành: Magnoliophyta

Lớp: Magnoliopsida

Bộ: Euphorbiales

Họ: Thầu dầu (Euphorbiaceae)

Chi: Euphorbia

Loài: Euphorbia hirta

Đặc điểm thực vật:

+ Thân: Cây thảo sống hằng năm hay nhiều năm, có thân mảnh cao 15-40 cm,

toàn cây có lông ráp và có nhựa mủ trắng.

+ Lá: Mọc đối, cuống ngắn, phiến lá hình mũi mác, dài 4-5 cm, rộng 7-15 mm,

mép có răng cưa nhỏ. Gốc cuống lá có hai lá kèm nhỏ hình lông cứng. Nhiều cụm hoa

hình chén nhỏ ở các nách lá.

22

+ Hoa: Mỗi chén mang các hoa đơn tính, tổng bao hình chuông, có lông ở mặt

ngoài, 4 tuyến hình trái xoan, 5 thùy hình tam giác nhọn, nhẵn ở mặt trong; bao phấn

gần hình cầu, mở ở đỉnh và ở cạnh; bầu có cuống, có lông.

+ Quả: Quả nang, màu trắng nhạt, đường kính 1.5 mm, khi già nứt thành 3 mảnh

vỏ mang 3 hạt rất nhỏ. Hạt hình trứng hoặc hình 4 cạnh, mặt ngoài hơi nhăn nheo. Mùa

ra hoa kết quả vào khoảng tháng 5-10 [3, 58-60].

Hình 1.1 Hình lá và hoa, mẫu tiêu bản của Cỏ sữa lá lớn

Công dụng trong dân gian

Trên thế giới, Cỏ sữa lá lớn được sử dụng khá nhiều trong dân gian. Ở Ấn Độ,

Cỏ sữa lá lớn được dùng để chữa các bệnh về đường hô hấp như ho, viêm phế quản và

hen suyễn; bệnh nhiễm giun trong trẻ em, kiết lỵ, vàng da, nổi mụn cóc, các vấn đề về

tiêu hóa và khối u [61, 62]. Tại Malaysia và Bangladesh, người dân thường dùng Cỏ sữa

lá lớn để trị các bệnh hen suyễn, các bệnh ngoài da như mụn cóc, mụn nhọt, và bệnh

tăng huyết áp [63, 64]. Cỏ sữa lá lớn cũng được sử dụng nhiều trong các bài thuốc dân

gian ở Philippines nhằm điều trị bệnh sốt xuất huyết [65].

Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam, cây Cỏ sữa lá lớn được sử dụng để chữa

các bệnh về đường tiêu hóa như tiêu chảy, kiết lỵ, viêm ruột, nhiễm khuẩn đường ruột

[3, 58, 59]; các bệnh về đường hô hấp như ho, hen, viêm phế quản; các bệnh đường niệu,

sinh dục [58]; bệnh viêm thận [3], các bệnh về da như hắc lào, lang ben [66]. Đặc biệt,

Cỏ sữa lá lớn cũng giúp gia tăng lượng sữa cho những phụ nữ đang trong thời kỳ cho

con bú [58].

23

Hoạt tính sinh học của Cỏ sữa lá lớn

Tác dụng tăng cường miễn dịch

Nghiên cứu của Pratheepa và Sukumaran đã cho thấy cao chiết từ lá của Cỏ sữa

lá lớn có khả năng tăng cường miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu trên cá chép

Cyprinus carpio. Các nghiên cứu đã được thực hiện trên cá bị nhiễm bệnh bởi khuẩn

Aeromonas hydrophila. Kết quả cho thấy số lượng hồng cầu, bạch cầu, haemoglobin và

hoạt tính lysozyme, tỷ lệ thực bào đã tăng lên đáng kể khi được bổ sung cao chiết từ lá

Cỏ sữa lá lớn vào thức ăn với liều dùng 25 và 50 g cao chiết/kg thức ăn [67]. Nhiều

nhóm nghiên cứu khác cũng đã minh chứng khả năng tăng cường miễn dịch của Cỏ sữa

lá lớn cả thử nghiệm in vitro và in vivo [68, 69].

Tác dụng kháng khuẩn

Cao chiết ethanol của Cỏ sữa lá lớn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với chủng

vi khuẩn Salmonella typhi với giá trị MIC là 0.031 mg/mL. Ngược lại, cao chiết n-

hexane thể hiện khả năng ức chế trên chủng vi khuẩn Proteus vulgaris với MIC = 1.00

mg/mL. Đặc biệt, tất cả các loại cao chiết thử nghiệm không có tác dụng gây độc tế bào

trên dòng tế bào Vero [70].

Năm 2010 theo nghiên cứu của Mohammad Abu Basma Rajeh và các cộng sự,

khả năng kháng khuẩn của các cao chiết methanol từ lá, hoa, thân và rễ của Cỏ sữa lá

lớn đã được đánh giá trên một số vi khuẩn và nấm men gồm vi khuẩn Gram dương

(Staphylococcus aureus, Micrococcus sp., Bacillus subtilis và Bacillus thuringensis), vi

khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Klebsiella, Salmonella typhi và Proteus mirabilis) và

nấm men (Cvàida albicans). Cao chiết từ lá có khả năng ức chế sự phát triển của tất cả

các vi sinh vật kiểm định, tiếp theo là hoa cũng ức chế tất cả các vi khuẩn ngoại trừ C.

albicans. Cao chiết từ rễ có khả năng ức chế mạnh vi khuẩn Gram dương hơn vi khuẩn

Gram âm và khả năng ức chế cao hơn so với cao chiết từ thân. Giá trị MIC thấp nhất thu

được đối với E. coli và C. albicans (3.12 mg/mL), sau đó là S. aureus (12.50 mg/mL)

và P. mirabilis (50.00 mg/mL) [71].

Năm 2011, Geeta Singh và Padma Kumar cho biết cao chiết từ thân có hoạt tính

ức chế các chủng vi khuẩn kiểm định với giá trị MIC = 0.078 mg/mL đối với khuẩn E.

coli và P. mirabilis; và MIC = 0.039 mg/mL của các cao chiết từ rễ và quả trên khuẩn

P. mirabilis [72].

24

Tác dụng kháng oxi hóa

Năm 2016, Cao Huy Bình và cộng sự đã tiến hành đánh giá khả năng kháng oxi

hóa trên mô hình DPPH cho thấy quercetin và quercitrin thể hiện hoạt tính kháng oxi

hóa mạnh với giá trị IC50 tương ứng là 7.18 µg/mL và 3.04 µg/mL [73].

Dịch chiết nước từ lá Cỏ sữa lá lớn thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa thông qua

khả năng làm sạch các gốc tự do DPPH, hydroxyl và ức chế quá trình peroxid hóa lipid

với giá trị IC50 tương ứng là 0.175; 0.162 và 0.143 mg/mL [74].

Năm 2011, Abu Arra Basma và cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hoá

của cao methanol lần lượt từng bộ phận lá, thân, hoa, và rễ của cây Cỏ sữa lá lớn bằng

phương pháp DPPH. Kết quả cho thấy khả năng kháng oxi hoá của cao lá Cỏ sữa lá lớn

hiệu quả nhất, với giá trị IC50 của lá, hoa, rễ, thân so với BHT lần lượt là 0.803, 0.972,

0.989, 1.358 và 0.794 mg/mL [75].

Theo kết quả nghiên cứu của Neelesh Sharma và cộng sự vào năm 2014, cao chiết

ethanol Cỏ sữa lá lớn trên mô hình DPPH có giá trị IC50 = 0.21±0.21 mg/mL (IC50 của

vitamin C là 0.02±0.04 mg/mL) [76].

Tác dụng kháng viêm

Các công trình nghiên cứu khoa học trước đây cho thấy cao chiết ethanol của Cỏ

sữa lá lớn ở nồng độ 200 µg/mL đã ức chế sự sản sinh NO trên dòng tế bào RAW 264.7

được kích thích bởi LPS [76]. Ngoài ra, dịch chiết ethanol của Cỏ sữa lá lớn và β-amyrin

có tác dụng kháng viêm qua việc kiểm soát hầu hết các chức năng của protein iNOS và

sự cảm ứng NO; thể hiện tiềm năng ức chế chọn lọc NO để điều trị viêm khớp [77].

Tác dụng kiểm soát glucose máu

Năm 2010, R.M. Widharna đã nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường (ĐTĐ)

của dịch chiết ethanol và ethyl acetate từ cây Cỏ sữa lá lớn. Các thử nghiệm in vitro và

in vivo đã chứng minh cơ chế hạ glucose máu của các dịch chiết này có liên quan đến

khả năng kháng oxi hóa và ức chế α-glucosidase [78].

Tamboli P và cộng sự tại Ấn Độ đã nghiên cứu về hiệu quả giảm glucose máu

của các cao chiết Cỏ sữa lá lớn trên chuột bệnh ĐTĐ gây ra bởi alloxan và fructose. Kết

quả cho thấy lượng glucose máu, cholesterol huyết, triglyceride, creatinine và HDL ở

chuột giảm đáng kể [79].

25

Cao chiết ethanol của các bộ phận (lá, thân, hoa) của Cỏ sữa lá lớn với liều (250

và 500 mg/kg) được dùng để đánh giá tác dụng hạ glucose máu trên chuột gây ĐTĐ bởi

streptozotocin. Kết quả hàm lượng glucose máu sau 21 ngày của các nhóm chuột khi xử

lý với cao chiết đều giảm so với nhóm đối chứng [80]. Kết quả của một nghiên cứu khác

trên cao ethanol và ether dầu hỏa từ lá của Cỏ sữa lá lớn để đánh giá tác dụng hạ glucose

máu trên chuột gây ĐTĐ bởi alloxan bằng đường uống cho thấy nồng độ glucose máu

sau 21 ngày ở chuột đều giảm so với nhóm đối chứng và cao ethanol cho kết quả tốt hơn

cao ether dầu hỏa [81].

Tại Việt Nam, trong tài liệu Cây thuốc và động vật làm thuốc có đề cập đến chi

tiết cây Cỏ sữa lá lớn giúp kiểm soát glucose máu trên động vật [58]. Trên thực tế, cây

Cỏ sữa lá lớn đã được người dân Nam Bộ sử dụng theo phương pháp đông y để dùng

chữa bệnh cho bệnh nhân ĐTĐ.

Gần đây, theo kết quả nghiên cứu thử nghiệm kiểm soát glucose máu sau ăn của

trà Cỏ sữa lá lớn trên bệnh nhân ĐTĐ và trên người khỏe mạnh cho thấy trà Cỏ sữa lá

lớn có khả năng kiểm soát glucose máu, không làm tăng glucose máu sau ăn trên cả hai

đối tượng. Trên người khỏe mạnh, tại thời điểm 30 phút sau ăn, nồng độ glucose máu

của người uống trà Cỏ sữa lá lớn đã giảm một cách có ý nghĩa thống kê so với đối chứng

(8.12 so với 8.97 mmol/L tại 30 phút; p<0.05) [82].

Một số phân đoạn cao chiết từ Cỏ sữa lá lớn ở Việt Nam đã được chứng minh có

khả năng hạ đường huyết trên mô hình chuột bị bệnh ĐTĐ. Hàm lượng glucose máu của

chuột cho uống cao n-hexane giảm 54.3%, cao ethanol giảm 61.7% và cao ethyl acetate

giảm 61.0% so với chuột bình thường. Liều uống 2000 mg/kg thể trọng chuột bị bệnh

ĐTĐ của các cao ethanol, n-hexane và ethyl acetate sau 21 ngày điều trị: chỉ số

cholesterol toàn phần giảm tương ứng 5.85%, 13.14% và 32.62%; chỉ số triglyceride

giảm tương ứng 52.91%, 2.69% và 31.84%; và chỉ số LDL giảm mạnh, lần lượt là

46.2%, 58.8% và 37.9% [83].

Tác dụng chống ung thư

Tác dụng ức chế khối u của cao chiết (ethanol, chloroform, ether dầu hỏa) từ phần

trên mặt đất của Cỏ sữa lá lớn được đánh giá trên dòng tế bào EL-4 của chuột bạch Swiss

albino ở liều lượng 200 mg/kg được uống mỗi ngày trong vòng 10 ngày. Kết quả cho

26

thấy cao chiết ethanol và chloroform có tác dụng kéo dài thời gian sống trung bình và

giảm rõ rệt kích thước khối u [84].

Neelesh Sharma và các cộng sự đã chỉ ra rằng cao chiết ethanol Cỏ sữa lá lớn có

chứa hoạt chất có khả năng ức chế tế bào ung thư HL-60 hiệu quả nhất ở nồng độ 100

µg/mL [76]. Anitha P và cộng sự (2014) nhận thấy cao ethanol của lá Cỏ sữa lá lớn có

khả năng gây độc trên dòng tế bào Dalton Lymphoma Ascites và Ehrlich Ascites

Carcinoma với giá trị IC50 lần lượt là 560.83 µg/mL và 384.7 µg/mL [85].

Các tác dụng khác

Dịch chiết nước từ toàn cây Cỏ sữa lá lớn (350 mg/kg và 700 mg/kg) và quercitrin

(25 mg/kg) có tác dụng chống tiêu chảy [86].

Năm 2009, Daphne Sue Yen Loh, Hui Meng Er và Yu Sui Chen nhận thấy

quercetin (25 µg/mL) có khả năng gây biến đổi mạnh Salmonella typhimurium TA98

khi không có và có mặt chất kích hoạt chuyển hóa S-9. Cao nước (100 µg/mL) và cao

methanol (10 và 100 µg/mL) biểu hiện hoạt tính chống đột biến khi chống lại sự gây

biến đổi gen của 2-aminoanthracene với sự hiện diện của enzyme kích hoạt chuyển hóa

S-9 [87].

Thành phần hóa học của Cỏ sữa lá lớn

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Cỏ sữa lá lớn cho thấy có các nhóm

hợp chất chính sau: flavonoid, tannin, triterpenoid, sterol, acid hữu cơ và các thành phần

khác. Các hợp chất đã được phân lập từ Cỏ sữa lá lớn cũng đã được tìm thấy ở nhiều

loài khác nhau thuộc cùng chi Euphorbia. Dưới đây là cấu trúc các hợp chất đã được

phân lập từ Cỏ sữa lá lớn trên thế giới và Việt Nam.

R

143. R = OCOCH3

144. R = OH

145. R = O=

H

CH3H

CH3

HH

O

146

H

H

HO

149

27

R1

R2

R3

H

HR4

150. R1 = OH, R2 = H, R3 = CH3, R4 = OH, R5 = CH3

151. R1 = H, R2 = O=, R3 = CH3, R4 = CH2OH, R5 = OH

152. R1 = H, R2 = O=, R3 = CH3, R4 = OH, R5 = CH2OH

153. R1 = H, R2 = OH, R3 = CH3, R4 = OH, R5 = CH2OH

154. R1 = R2 = H, R3 = CH2OH, R4 = OH, R5 = CH2OH

R5

28

29

30

31

32

Bảng 1.2 Các hợp chất được phân lập từ Cỏ sữa lá lớn và các loài khác thuộc chi Euphorbia

Ký hiệu Tên chất Các loài khác thuộc chi Euphorbia TLTK

109 Isoscopoletin Euphorbia helioscopia, E. sororia, E. kansui, E. alatavica

[10, 88-92]

110 Scopoletin Euphorbia heteradena, E. sororia, E. supine, E. schimperi

[54, 88, 89, 93-95]

111 Scoparone Euphorbia helioscopia, E. fusiformis

[88-90, 96]

143 Taraxerol acetate Euphorbia antiquorum, E. stygiana [88, 97-99]

144 Taraxerol Euphorbia myrsinitis, E. tortilis [88, 100-102]

33

145 Taraxerone Euphorbia stygiana, E. tirucalli, E. alatavica

[20, 88, 97, 99, 103-105]

146 Friedelin Euphorbia sororia, E. kamerunica, E. tirucalli

[88, 106-108]

147 Cycloarternol Euphorbias canarias [88, 97, 109]

148 Cyclolanostan-3β-ol - [88]

149 ent-kaur-16-ene-3β-ol Euphorbia wangii [88, 110]

150 2β, 16α, 19-trihydroxy-ent-kaurane

- [88, 111]

151 16β, 17-dihydroxy-ent-kaurane-3-one

Euphorbia sieboldiana, E. stracheyi [88, 112, 113]

152 16α, 17-dihydroxy-ent-kaurane-3-one

Euphorbia lagascae, E. tibetica [88, 114, 115]

153 3β, 16α, 17-trihydroxy-ent-kaurane

- [88]

154 16α, 17, 19-trihydroxy-ent-kaurane

- [88]

155 Esculetin Euphorbia lathyris, E. fischeriana, E. lunulata

[88, 116-118]

156 Umbelliferone Euphorbia maculate, E. lathyris [88, 116, 119]

157 Daphnoretin Euphorbia dracunculoides [88, 120]

158 6,7,8-trimethoxy-coumarin

Euphorbia antiquorum [88, 121]

159 (-)-pinoresinol Euphorbia helioscopia, E. tirucalli, E. alatavica

[88, 92, 122, 123]

160 (+)-syringaresinol Euphorbia alatavica [88, 92]

161 (-)-pinoresinol glucoside - [88]

162 (+)-syringaresinol glucoside

- [88]

163 Campesterol Euphorbia tirucalli, Euphorbia bivonae

[97, 124, 125]

164 Quercitrin Euphorbia canescens, E. franchetii, E. tirucalli, E. schimperi

[73, 97, 123, 126-131]

165 Myricitrin Euphorbia lunulata [97, 118, 126, 127]

166 Ellagic acid Euphorbia soongarica, E. supina [97, 132, 133]

34

167 β-amyrin Euphorbia bivonae, E. kansui [97, 125, 127, 134]

168 1-hexacosanol Euphorbia peplus, E. retusa [97, 135, 136]

169 11α, 12α-oxidotaraxerol Euphorbia supina, E. chamaesyce [100, 127, 137-139]

170 24-methylene-cycloartenol

Euphorbia retusa [88, 97, 127, 136, 137]

171 Quercetin Euphorbia lunulata, E. canescens, E. franchetii, E. helioscopia

[73, 89, 118, 122, 129, 130]

172 Isorhamnetin Euphorbia alatavica [89, 140]

173 Pinocembrin Euphorbia helioscopia [89, 90]

174 Kaempferol Euphorbia schimperi, E. canescens, E. franchetii, E. dracunculoides

[89, 95, 120, 127, 130]

175 Luteolin Euphorbia schimperi, E. lunulata [89, 95, 118]

176 Gallic acid Euphorbia lunulata, E. supine, E. helioscopia

[89, 118, 122, 127, 133]

177 Euphorbin-E Euphorbia heterophylla [141, 142]

178 16α,19-dihydroxy-ent-kaurane

- [111]

179 2β,16α-dihydroxy-ent-kaurane

- [111]

180 Afzelin Euphorbia neriifolia, E. tirucalli [126, 127, 143, 144]

181 Rutin Euphorbia ebracteolata, E. lathyris [127, 145, 146]

182 Euphorbin-A Euphorbia humifusa, E. ebracteolata

[127, 147, 148]

183 Euphorbin-B Euphorbia humifusa, E. ebracteolata

[127, 147, 148]

184 Euphorbin-C Euphorbia ebracteolata [127, 148]

185 Euphorbin-D - [127]

186 Tinyatoxin Euphorbia poisonii [127, 149]

187 n-butyl-1-O-β-L-rhamnopyranoside

- [150]

188 n-butyl-1-O-α-L-rhamnopyranoside

- [150]

35

189 3-oxo-D-friedoolean-14-ene

- [150]

190 3β-hydroxy-urs-12-ene - [150]

191 3β-hydroxy-urs-12-ene-28-oic acid

- [150]

192 3-hydroxyoctanoic acid glucoside

- [151]

193 Hirtionoside A - [151]

194 Hirtionoside B - [151]

195 Hirtionoside C - [151]

196 Caffeic acid Euphorbia lathyris, E. helioscopia [146, 152, 153]

197 (-)-epicatechin 3-gallate (ECG)

- [152]

198 Hirtacoumaroflavonoside - [128]

199 Hirtaflavonoside-B - [128]

200 Dimethoxy quercitrin - [128]

201 β-sitosterol Euphorbia bivonae, E. kansui, E. peplus

[103, 125, 134, 135]

202 Methyl gallate Euphorbia helioscopia, E. supina [100, 129, 133, 154]

203 β-Sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside

Euphorbia kansui, E. peplus [100, 134, 155]

204 Myricetin Euphorbia lunulata, E. helioscopia [118, 122, 129]

205 (1R, 5R)-5-(5 carboxymethyl-2 oxocyclopentyl)-3Z-pentenyl acetate

- [156]

206→210 Euphorhirtin A, B, C, D, E

- [157]

211 Dehydrochebulic acid triethyl ester

Euphorbia formosana [157, 158]

212 Euphorhirtin F - [157]

213 Chebulic acid triethyl ester

- [157]

214 Chebulic acid-14,15-diethyl ester

- [157]

215 Euphorhirtin G - [157]

36

216 Phyllanthusiin E methyl ester

Euphorbia humifusa [157, 159]

217 Phyllanthusiin E - [157]

218→224 Euphorhirtin H, I, J, K, L, M, N

- [157]

225 Brevifolin Euphorbia soongarica, E. humifusa [157, 159, 160]

226 Brevifolin carboxylic acid

Euphorbia humifusa [157, 159]

227 Methyl brevifolin carboxylate

Euphorbia humifusa [157, 159, 161]

228 Ethyl brevifolin carboxylate

Euphorbia humifusa [157, 159, 161]

Qua nghiên cứu tài liệu cho thấy hiện tại chỉ có 08 hợp chất (144, 145, 164, 171,

201, 202, 203, 204) được phân lập từ Cỏ sữa lá lớn ở Việt Nam so với nhiều hợp chất

đã được phân lập và công bố từ Cỏ sữa lá lớn trên thế giới. Điều này cho thấy tuy thành

phần hóa học của loài Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) đa dạng nhưng các nghiên cứu,

công trình công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Cỏ sữa lá lớn ở Việt

Nam còn rất hạn chế. Do đó, việc nghiên cứu loài cây này sẽ góp phần làm sáng tỏ thêm

thành phần hóa học và định hướng nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.

Tổng quan về miễn dịch

Miễn dịch và miễn dịch học

Miễn dịch là trạng thái bảo vệ đặc biệt của cơ thể sinh vật có khả năng nhận ra

và giúp cơ thể chống lại sự tấn công của vi sinh vật hay các vật chất từ bên ngoài và loại

thải chúng ra khỏi cơ thể. Miễn dịch là một quá trình đấu tranh lâu dài xảy ra trong máu

và ở các mô của cơ thể. Tất cả mọi loài sinh vật trong sinh giới đều có ít nhiều khả năng

tự bảo vệ chống lại sự xâm nhập của bất kỳ vật lạ bên ngoài nào cho dù có hại hay không

nhằm bảo vệ tính vẹn toàn cơ thể của chúng. Khả năng tự bảo vệ xuất hiện ngay ở những

cơ thể sống thấp nhất và ngày càng trở nên phong phú và hoàn thiện.

Miễn dịch học là một môn khoa học chuyên nghiên cứu các quá trình nhận biết

các chất lạ (gọi là kháng nguyên) và hậu quả của sự nhận biết đó (là sự đáp ứng miễn

dịch). Quá trình nhận biết các chất lạ và quá trình đáp ứng miễn dịch có được là do khả

37

năng tương tác của một phức hệ tế bào trong hệ miễn dịch của cơ thể người và động vật

[162].

Các loại miễn dịch

Đáp ứng miễn dịch ở người và động vật được chia làm hai loại là miễn dịch tự

nhiên và miễn dịch thu được.

+ Miễn dịch tự nhiên (miễn dịch bẩm sinh, miễn dịch không đặc hiệu): là khả

năng tự bảo vệ có sẵn từ khi được sinh ra và mang tính chất di truyền trong các cơ thể

cùng loài. Miễn dịch bẩm sinh không đòi hỏi phải có sự tiếp xúc trước của cơ thể với

mầm bệnh hay vật lạ và giữ vai trò quan trọng khi miễn dịch thu được chưa phát huy tác

dụng.

+ Miễn dịch thu được (miễn dịch đặc hiệu): là trạng thái miễn dịch xuất hiện

sau khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên (antigen) và có phản ứng sinh ra kháng thể đặc

hiệu chống lại chúng.

Miễn dịch thu được có hai đặc điểm khác cơ bản với miễn dịch tự nhiên là khả

năng nhận dạng và trí nhớ đặc hiệu về kháng nguyên. Hệ thống miễn dịch đặc hiệu có

thể ghi nhớ lại các tác nhân gây bệnh và ngăn cản tác động gây bệnh của chúng ở lần

tiếp xúc lặp lại tiếp theo. Miễn dịch đặc hiệu lại được chia ra làm hai loại dựa vào phương

thức tạo ra tình trạng miễn dịch.

Miễn dịch chủ động:

Miễn dịch chủ động tự nhiên là trạng thái miễn dịch do tiếp xúc ngẫu nhiên với

kháng nguyên và vi sinh vật có trong môi trường xung quanh.

Miễn dịch chủ động nhân tạo là trạng thái miễn dịch thu được nhờ tiêm vaccine

hoặc do truyền tế bào lympho thường hoặc lympho miễn dịch, ít khi là do ghép.

Miễn dịch thụ động:

Miễn dịch thụ động tự nhiên là trạng thái miễn dịch thu được do kháng thể ghép

hoặc truyền từ sữa mẹ.

Miễn dịch thụ động nhân tạo là miễn dịch nhờ kháng thể chuyển từ bên ngoài do

truyền kháng huyết thanh [162].

38

Lysozyme

Lysozyme, hay còn được gọi là muramidase hoặc N-acetylmuramide

glycanhydrolase là một loại enzyme kháng khuẩn được động vật tổng hợp và là một

phần của hệ thống miễn dịch bẩm sinh. Lysozyme xúc tác cho quá trình thủy phân liên

kết 1,4-beta giữa acid N-acetylmuramic và chuỗi bên N-acetyl-D-glucosamine

trong peptidoglycan, thành phần chính của thành tế bào vi khuẩn Gram dương. Sự thủy

phân này sẽ phá hủy thành tế bào của vi khuẩn, từ đó gây ra sự chết của vi khuẩn.

Lysozyme có trong nhiều chất tiết như nước mắt, nước bọt, sữa mẹ và các dịch nhầy.

Chất này cũng có mặt trong các hạt tế bào chất của đại thực bào và bạch cầu trung tính

đa nhân.

Bổ thể

Bổ thể (Complement, C) là hệ thống các protein huyết tương, được kích hoạt

ngay khi mầm bệnh vừa xâm nhập vào cơ thể, tương tác với tác nhân gây bệnh để đánh

dấu cho sự phá hủy, gồm khoảng 30 protein hòa tan và protein màng. Hệ thống bổ thể

là một trong những cơ chế chủ chốt; từ sự nhận ra mầm bệnh, bổ thể được biến đổi thành

hàng rào phòng thủ có hiệu quả của vật chủ chống lại sự nhiễm trùng ban đầu.

Tham gia vào cả hệ miễn dịch tự nhiên và miễn dịch thu được.

Được tạo ra chủ yếu bởi tế bào gan, ngoài ra cũng được tạo ra bởi bạch cầu đơn

nhân, biểu mô, lớp màng nhày của ruột,...

Chiếm khoảng 5% protein hòa tan của huyết tương.

Nhiều bổ thể là proenzyme (zymogen) ở dạng bất hoạt, cần được biến đổi để hoạt

động.

Huyết tương có chứa lysozyme (hàm lượng thấp), protein phản ứng C, các thành

phần của bổ thể, interferon,…cũng tham gia vào sự đề kháng không đặc hiệu của cơ thể.

Các vi khuẩn Gram âm nhờ có vỏ bọc ngoài là lipopolysaccharide nên không bị ly giải

trực tiếp. Tuy nhiên, khi vỏ ngoài bị chọc thủng do tác dụng của bổ thể thì lysozyme sẽ

cùng hiệp lực tấn công màng vi khuẩn. Bổ thể được hoạt hóa theo con đường không đặc

hiệu bởi các chất như carbohydrate, lipopolysaccharide,.. của vi khuẩn, nhờ đó mà chọc

thủng và làm dung giải vi khuẩn. Các chức năng sinh học quan trọng của hệ thống bổ

39

thể khi được hoạt hóa là: tăng tuần hoàn tại chỗ và tăng tính thấm thành mạch, kết dính

miễn dịch, chiêu mộ bạch cầu và làm thủng màng tế bào, màng vi khuẩn dẫn đến ly giải.

Kháng thể

Kháng thể là các globulin trong máu của động vật, có khả năng liên kết đặc hiệu

với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó và được gọi là kháng thể miễn dịch

(Immunoglobulin, Ig) hay kháng thể đặc hiệu. Kháng thể chủ yếu được tìm thấy trong

huyết thanh của động vật, do vậy huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên

được gọi là kháng huyết thanh. Kháng thể còn được tìm thấy trong các thể dịch khác

của cơ thể như sữa. Những kháng thể có sẵn trong sữa hay huyết tương của người và

động vật từ trước khi có sự tiếp xúc với kháng nguyên được gọi là kháng thể tự nhiên

hay kháng thể không đặc hiệu. Tổng kháng thể giúp hệ thống miễn dịch nhận biết và vô

hiệu hóa các tác nhân lạ. Nó có chức năng hoạt hóa bổ thể, kết hợp với kháng nguyên

bảo vệ cơ thể [162, 163].

Miễn dịch học ứng dụng trong cá

Cơ chế bảo vệ không đặc hiệu

Dịch nhờn: là một yếu tố đặc thù và bao phủ toàn cơ thể của cá. Dịch nhờn không

những giúp cá giảm được ma sát trong quá trình vận chuyển mà còn đóng vai trò quan

trọng trong quá trình bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật hay các vật

lạ từ môi trường vào cơ thể cá.

Da: da cá tương đối khác với các động vật trên cạn là không hoá sừng, nhưng khả

năng phục hồi của da rất nhanh do sự hình thành lớp tế bào Malpighi huy động từ vùng

lân cận. Phản ứng phì đại các tế bào Malpighi và lớp biểu bì cũng rất nhanh, giúp cho

da trở thành một hàng rào vật lý tương đối vững chắc để bảo vệ cơ thể. Ngoài ra, ở một

số loài cá có vẩy thì chính hệ thống này sẽ bảo vệ da và cơ thể cá được vững chắc hơn.

Mang: là nơi thực hiện quá trình hô hấp cơ bản của cá, cũng là nơi tiếp xúc

thường xuyên với các sinh vật bên ngoài môi trường. Cho nên, mang là con đường xâm

nhiễm quan trọng của mầm bệnh. Tuy nhiên, ở mang có sự tập trung của đại thực bào

rất cao. Nó cũng được bao phủ bởi dịch nhờn và sự xuất hiện của các tế bào Malpighi

giúp cho mang có khả năng thực hiện được chức năng chống lại các sinh vật từ bên

ngoài môi trường. Mang đóng vai trò quan trọng trong việc tiếp thụ kháng nguyên, đặc

40

biệt là các kháng nguyên không hoà tan. Ở mang có rất nhiều tế bào lympho, đại thực

bào và tương bào cư trú. Mang có khả năng sản xuất kháng thể tại chỗ đóng vai trò đề

kháng quan trọng đối với các bệnh ở mang do vi khuẩn.

Cơ chế bảo vệ đặc hiệu

Khi kháng nguyên xâm nhập vào trong cơ thể cá thì sẽ bị các tế bào trình diện

kháng nguyên bắt giữ, xử lý và trình diện yếu tố quyết định kháng nguyên lên bề mặt

làm kích hoạt các tế bào lympho T. Sau đó, tế bào lympho T sẽ tác động lên tế bào

lympho B, chuyển tế bào này thành tương bào để sản sinh ra kháng thể. Tương bào bắt

đầu xuất hiện và số lượng tăng mãnh liệt trong lách và thận khoảng 1 tuần sau khi có

kích thích của kháng nguyên. Kháng thể huyết thanh thường xuất hiện ngay trước thời

điểm số lượng tương bào đạt cực đại khoảng ngày thứ 10-15 và hàm lượng Ig tăng lên

mãnh liệt để đạt cực đại khoảng ngày thứ 20-30 sau khi tiêm kháng nguyên. Như vậy,

so với động vật có vú, pha mẫn cảm ở cá kéo dài hơn, nhưng thời gian duy trì hàm lượng

kháng thể lại lâu dài hơn.

Thận được xem là cơ quan lympho ngoại vi ở cá, nơi xảy ra quá trình bắt giữ, xử

lý và trình diện kháng nguyên cho hệ thống đáp ứng miễn dịch. Hệ thống miễn dịch của

cá xương thì được hình thành tương đối hoàn chỉnh hơn ở giáp xác, nó có cả đáp ứng

miễn dịch đặc hiệu lẫn không đặc hiệu. Các tế bào lympho tham gia vào quá trình đáp

ứng miễn dịch cũng có nguồn gốc và chức năng gần giống như động vật trên cạn.

Ig đã được phát hiện trong dịch nhớt ở da cá. Có bằng chứng cho thấy chúng

không có nguồn gốc từ kháng huyết thanh và được giả định rằng đây là các sản phẩm

được sản xuất tại chỗ. Đồng thời cũng có sự hiện diện của tế bào lympho, tương bào và

đại thực bào ở lớp biểu bì da cá. Sự có mặt của các tế bào này ở da cá cho thấy việc hình

thành phản ứng miễn dịch cục bộ có thể xảy ra ở đây [162].

41

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mẫu thực vật, hóa chất và thiết bị

Mẫu thực vật

Dựa vào kết quả khảo sát kinh nghiệm dân gian trong các hộ nông dân nuôi trồng

thủy sản ở vùng ĐBSCL kết hợp với lược khảo tài liệu, 20 loài thực vật (Bảng 3.1) đã

được chọn để tiến hành khảo sát hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra.

20 mẫu thực vật sau khi thu hái về được xử lý và điều chế các cao ethanol tổng,

được sử dụng cho việc sàng lọc hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra.

Mẫu Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) được thu hái vào cuối tháng 2 năm 2016

tại thành phố Cần Thơ. Tên khoa học được TS. Đặng Minh Quân - Bộ môn Sinh, Khoa

Sư phạm, Trường Đại học Cần Thơ giám định và mẫu tiêu bản được lưu trữ tại đây.

Hóa chất và thiết bị

Hóa chất

Bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254, có độ dày 0.2 mm và bản mỏng pha

đảo RP-18 F254 (Merck). Silica gel pha thường cỡ hạt 230-400 mesh (0.040-0.063 mm)

và 70-200 mesh (0.063-0.200 mm). Silica gel pha đảo RP-18. Sắc ký lọc gel: Sephadex

LH-20 (GE Healthcare). Dung môi triển khai cột: n-hexane, CHCl3, EtOAc, BuOH,

MeOH được chưng cất lại trước khi sử dụng.

Thiết bị

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi bằng máy Bruker Avance 500 tại

Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy AV-600,

Bruker BioSpin Inc., Billerica, MA, USA, tại Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản.

Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy: SCIEX X500 QTOF tại

Viện Hóa học TPHCM và Viện Công nghệ Hóa học,Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam, Hà nội và máy MicroTOF, Bruker Daltonics Inc., Billerica,

MA, USA, tại Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản.

Phổ UV-Vis được đo trên máy Jasco V-730; Độ quay cực được đo trên thiết bị

ADP 440; Nhiệt độ nóng chảy được đo trên máy Stuart Scientific SMP3. Các

42

phân tích này đều được thực hiện tại Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên,

Đại học Cần Thơ.

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp điều chế 20 loại cao tổng

Đối với 20 mẫu thực vật, lấy 100 g bột nguyên liệu khô đã nghiền nhỏ của mỗi

loại, thực hiện quá trình ngâm dầm trực tiếp trong dung môi ethanol (5 lần × 24 giờ mỗi

lần). Dịch chiết ethanol được gộp chung lại và cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu

được các cao chiết ethanol tổng tương ứng.

Xác định hàm lượng tổng polyphenol và flavonoid

+ Hàm lượng tổng polyphenol có trong cao ethanol Cỏ sữa lá lớn được thực hiện

với thuốc thử Folin-Ciocalteu. Thí nghiệm được tiến hành theo Fu et al. (2011) và có

một số hiệu chỉnh [164] .

+ Hàm lượng flavonoid tổng trong cao ethanol Cỏ sữa lá lớn được xác định theo

phương pháp của Zhishen et al. (1999) và có một số hiệu chỉnh [165].

Phương pháp phân lập các hợp chất

+ Chiết ngâm: toàn thân Cỏ sữa lá lớn được thu hái tại huyện Phong Điền, TP

Cần Thơ, được sấy khô ở 40ºC, xay nhỏ và ngâm chiết với cồn 96% (thời gian 24 giờ/lần

chiết). Dịch chiết được cất loại dung môi bằng máy cô quay dưới áp suất kém Buchi R-

210 thu được cao chiết tổng. Từ cao chiết tổng tiến hành sắc ký cột nhanh lần lượt với

các dung môi n-hexane, ethyl acetate, n-butanol và methanol thu được các cao phân

đoạn tương ứng.

+ Sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Kieselgel

60 F254 (Merck), RP-18 F254 (Merck). Phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước

sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch vanilin/sulfuric acid 10%

được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.

+ Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột được tiến hành với các loại cột sắc ký có kích cỡ

khác nhau tùy lượng mẫu, với chất hấp phụ là silica gel pha thường có kích thước hạt

0.040-0.063 mm (240-430 mesh); pha đảo sử dụng loại RP-18 có cỡ hạt là 30-50 µm,

(Merck).

43

+ Làm sạch chất bằng cách kết tinh lại nhiều lần trong các dung môi tinh khiết

khác nhau.

Phương pháp xác định cấu trúc và định danh

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp phổ

tử ngoại (UV-Vis), phổ khối (ESI, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

(1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) đồng thời kết

hợp phân tích, so sánh với tài liệu tham khảo.

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

Hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus)

Nguồn cá thí nghiệm: Cá tra (50 ± 5 g/con) được chuyển về phòng thí nghiệm

từ trại giống ở Vĩnh Long. Cá khi đem về trại thực nghiệm được trữ trong bể composite

có sục khí liên tục, cho ăn bằng thức ăn công nghiệp theo nhu cầu của cá và thuần hóa

hai tuần trước khi tiến hành thí nghiệm. Trước khi bố trí thí nghiệm, cá được kiểm tra

ngẫu nhiên về hình dạng, kí sinh trùng, vi khuẩn.

Bố trí thí nghiệm: Tế bào bạch cầu (5×106 tế bào/mL) được thu từ thận và máu

ngoại vi cá tra dựa theo phương pháp của Boyum (1968) và Pierrard et al. (2012) [166,

167]. Ficoll Paque PLUS (1.077 g/mL, GE Healthcare, Uppsala, Sweden) được sử dụng

để phân lập tế bào bạch cầu. Tế bào thu được được nuôi trong môi trường L-15 (pH 7.4,

Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) có bổ sung 5% huyết thanh thai bò (fetal bovine

serum-FBS, Invitrogen), 1% Heples 20 mM và 1% kháng sinh streptomycin/penicillin

10 000 UI (Invitrogen) và nuôi ở 28ºC.

Thí nghiệm bao gồm các nghiệm thức được bổ sung cao chiết (tế bào bạch cầu

thu từ thận và từ máu ngoại vi được bổ sung các loại cao chiết tại 2 nồng độ 10 và 100

μg/mL) và 2 nghiệm thức đối chứng (tế bào bạch cầu thu từ thận và từ máu ngoại vi

được bổ sung DMSO 1%), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Sau 24 giờ bổ sung các cao

chiết, tế bào của các nghiệm thức được phá vỡ bằng 50 μL hỗn hợp dung dịch (Tris-HCl

50 mM, NaCl 150 mM, Triton 0.1%, PMSF 0.1 μg/mL), ly tâm 2000 vòng trong 10

phút. Phần dịch nổi phía trên được thu để phân tích các chỉ tiêu miễn dịch.

44

Xác định hoạt tính lysozyme

Dựng đường chuẩn lysozyme với các nồng độ 0, 2, 4, 8 và 16 μg/mL. Cho 30 μL

dung dịch tế bào bạch cầu từ các nồng độ pha loãng cho vào đĩa 96 giếng, tiếp theo cho

120 μL/giếng dịch Micrococcus lysodeikticus (Sigma, được pha loãng trong dung dịch

phosphate, pH 6.2). Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 27ºC và đo ở bước sóng 450 nm. Tất cả

các mẫu được đo liên tục trong khoảng từ 0 đến 30 phút cho đến khi hệ số hấp phụ không

thay đổi và ghi nhận giá trị này. Hoạt tính lysozyme được tính dựa vào đường chuẩn

lysozyme [168].

Xác định hoạt tính bổ thể

Hoạt tính bổ thể được phân tích theo phương pháp của Sunyer và Tort (1995) và

Milla et al. (2010) [169, 170]. 3% máu thỏ được pha loãng trong dung dịch veronal và

trộn với các độ pha loãng khác nhau của dung dịch tế bào. Mẫu được ủ ở 28oC trong

120 phút, mỗi 20 phút vortex 1 lần. Dùng pipette lấy 35 µL dịch nổi bên trên cho vào

mỗi giếng trong đĩa 96 giếng. Đọc kết quả bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng

405 nm để xác định hoạt tính bổ thể.

Tổng kháng thể

Lấy 20 µL dung dịch tế bào trộn với dung dịch polyethylene glycol 12% (PEG,

Sigma Aldrich), ủ trong vòng 2 giờ ở nhiệt độ phòng, kết hợp với quá trình lắc nhẹ

thường xuyên. Sau khi ly tâm 1000 vòng trong 10 phút, cho 5 µL dung dịch tế bào pha

loãng và không pha loãng vào cuvet có sẵn 1 mL dung dịch Bradford (đã được pha loãng

5 lần với nước cất). Tất cả mẫu được đo ở bước sóng 595 nm [171].

Hoạt tính kháng khuẩn của Cỏ sữa lá lớn

Khả năng kháng khuẩn của các mẫu thử và kháng sinh Vancomycin HCl và

Cefixim được tiến hành đối với năm chủng vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản: Aeromonas

hydrophila-N, Aeromonas dhakensis-D, Aeromonas hydrophila-D, Aeromonas

dhakensis-W, và Vibrio parahaemolyticus đươc cung câp tư Viện nghiên cứu nuôi trồng

thủy sản 2, thành phố Hồ Chí Minh.

45

Phương pháp tiến hành:

- Nho 100 µL dung dich khuân (1.5x106/mL) lên bề mặt môi trương LB đa khô,

trãi băng que trãi đên khi khô.

- Tiên hanh đuc 3-5 lô (môi lô co đương kınh 9 mm) trên môi đıa.

- Môi lô nho 50 µL mẫu thử hoăc khang sinh ơ cac nông đô khao sat. Mẫu đối

chứng được dùng là dung dịch DMSO 1% (tương ứng với nồng độ 0 ppm). Mỗi thí

nghiệm được lặp lại 3 lần.

- Sau khi mẫu thử hoăc khang sinh đa khuêch tan hoan toan trong agar, đăt cac

đıa petri đa thưc hiên trong tu u ơ 30oC trong 24 giơ.

- Quan sat va ghi nhân kêt qua băng cach đo đương kınh vong vô khuân (bao gôm

đương kınh lô va vung vi khuân không phat triên). Ranh giơi vung ưc chê đươc xac đinh

la vung không co khuân lac phat triên.

- Nông đô MIC đươc xac đinh ơ đıa môi trương ma ơ đo cac vi khuân bi ưc chê

phat triên, nên mât đô vi khuân giam hăn chı con 1-3 khuân lac phát triển. Ơ nông đô

thấp nhât, không co vi khuân phát triển thı kêt qua đươc ghi nhân la nho hơn hoăc băng

nông đô đo. Trong trương hơp đên nông đô cao nhât ma vân thây vi khuân phát triển thı

kêt qua đươc ghi nhân la lơn hơn nông đô đo [172].

Phương pháp đánh giá khả năng kháng oxi hóa

Khảo sát hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH

+ Nguyên tắc

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do bền trong dung môi

methanol, kém bền với ánh sáng. Dung dịch DPPH màu tím đạt cực đại hấp thu tại bước

sóng 517 nm và sản phẩm khử là DPPH-H (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine) có màu

vàng. Do đó độ hấp thu của nó giảm tương ứng khi nguyên tử N mang một điện tử lẻ

nhận một điện tử hoặc hydro từ các chất kháng oxi hóa (dung dịch DPPH từ màu tím

chuyển sang dạng không màu hoặc màu vàng nhạt) [Hình 2.1]. Tính chất này cho phép

tính toán lượng gốc tự do DPPH còn lại cũng như hoạt tính kháng oxi hóa của mẫu thử

dựa theo sự giảm độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 517 nm của hỗn hợp khi có và

không có mẫu thử [173].

46

Hình 2.1 Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH của chất kháng oxi hóa

Khả năng kháng oxi hóa của một chất được biểu hiện bằng giá trị IC50 - nồng độ

chất kháng oxi hóa để có thể ức chế 50% gốc tự do DPPH. Giá trị IC50 càng nhỏ, hoạt

tính kháng oxi hóa càng mạnh.

+ Phương pháp tiến hành

Hút V1 µL dung dịch vitamin C hoặc dung dịch mẫu thử thêm vào V2 µL

methanol (với V1 µL + V2 µL = 960 µL) cuối cùng thêm 40 µL dung dịch gốc tự do

DPPH nồng độ 1000 µg/mL và ủ trong tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Đo độ hấp

thu quang phổ ở bước sóng 517 nm. Mẫu trắng không có vitamin C hoặc chất thử. Toàn

bộ quá trình thí nghiệm được tránh sáng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị

trung bình.

Khảo sát hiệu quả trung hòa gốc tự do ABTS•+

+ Nguyên tắc

Hoạt tính kháng oxi hóa cũng có thể được tính toán dựa trên khả năng làm sạch

gốc tự do ABTS•+. Gốc tự do ABTS•+ được chuẩn bị bằng phản ứng oxi hóa ABTS (2,2-

azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) với tác nhân oxi hóa là potassium

persulfate. Gốc tự do ABTS•+ bền trong dung môi ethanol nhưng kém bền với ánh sáng

và có độ hấp thu quang phổ mạnh ở bước sóng 734 nm. Tương tự DPPH, khi được trung

hòa bằng cách nhận một điện tử hoặc 2,3 H• từ chất kháng oxi hóa, ABTS• chuyển về

dạng ABTS+ có độ hấp thu quang phổ không đáng kể ở bước sóng 734 nm [174, 175].

47

Hình 2.2 Phản ứng hình thành gốc tự do ABTS•

+ Phương pháp tiến hành

Dựng đường chuẩn kháng oxi hóa ABTS• của trolox.

Mẫu thử là dung dịch chất đối chứng hoặc các dung dịch cao chiết, chất phân lập

được pha loãng bằng methanol thành các nồng độ khác nhau, sau đó lấy 10 μL mẫu thử

với các nồng độ đã pha loãng cho vào các eppendorf chứa sẵn 990 μL dung dịch ABTS•,

thu được thể tích cuối là 1 mL. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ phòng trong 6 phút,

sau đó hỗn hợp được đo mật độ quang ở bước sóng 734 nm. Toàn bộ quy trình được

tránh sáng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình.

+ Xử lý kết quả

Hiệu suất kháng gốc tự do DPPH, ABTS• được tính theo công thức:

% ức chế

Trong đó: A là mật độ quang khi không có vitamin C, trolox hoặc các mẫu thử.

B là mật độ quang khi có vitamin C, trolox hoặc các mẫu thử.

Phương pháp đánh giá khả năng kháng oxi hóa trên tế bào MIN6

Tế bào MIN6 (Mouse Insulinoma 6) có nguồn gốc từ tế bào β tuyến tụy của chuột

đã được chuyển gen. Các dòng tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM có chứa

(A B).100

A

48

25 mM glucose, bổ sung 12% fetal bovine serum (FBS) cùng với 1% penicillin–

streptomycin và nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 37ºC, 5% CO2.

+ Khảo sát độc tính của cao chiết trên dòng tế bào MIN6

Tế bào MIN6 được nuôi trong môi trường DMEM khoảng từ 3 đến 5 ngày. Cấy

chuyển tế bào vào đĩa 96 giếng với mật độ 2x104 tế bào/mL (mỗi giếng 100 µL dung

dịch môi trường và có tế bào), ủ 24 giờ trong điều kiện 37ºC, 5% CO2. Sau đó loại bỏ

môi trường nuôi cấy, tế bào được rửa bằng dung dịch đệm Phosphate Buffer Saline

(PBS). Tế bào sau khi đã rửa với PBS thì được thêm vào 100 µL môi trường mới có

chứa các cao chiết (với các nồng độ khác nhau). Trong thí nghiệm này, DMSO 0.5%

được sử dụng như là nghiệm thức đối chứng. Mẫu được ủ tiếp trong 2 giờ. Môi trường

nuôi cấy được loại bỏ và được thêm vào 110 µL môi trường DMEM có WST-8 với tỷ

lệ là 10:1. Ủ trong khoảng 2 giờ ở điều kiện 37ºC và 5% CO2. Tỷ lệ tế bào sống sẽ được

xác định bằng cách đo mật độ quang với bước sóng là 450 nm [176, 177].

+ Khảo sát khả năng bảo vệ dòng tế bào MIN6 khỏi sự chết do H2O2 gây ra

100 µL tế bào trong môi trường DMEM có mật độ là 2x104 tế bào/mL được cấy

chuyển vào mỗi giếng trên đĩa 96 giếng. Ủ trong 24 giờ ở điều kiện 37ºC và 5% CO2.

Sau 24 giờ, môi trường ở các giếng được loại bỏ và thêm môi trường mới vào ủ 2 giờ

với các nghiệm thức sau:

Nghiệm thức 1: môi trường nuôi cấy DMEM + DMSO (0.5%)

Nghiệm thức 2: DMEM + DMSO (0.5%) + H2O2 0.4 mM

Nghiệm thức 3: DMEM + DMSO (0.5%) + H2O2 0.4 mM + vitamin E (0.2

mg/mL)

Nghiệm thức 4-7: DMEM + DMSO (0.5%) + H2O2 0.4 mM + các cao chiết hoặc

chất sạch phân lập được với những nồng độ khác nhau.

Sau 2 giờ ủ, môi trường được loại bỏ và thêm vào 110 µL môi trường DMEM có

WST-8 với tỷ lệ là 10:1. Ủ trong khoảng 2 giờ với điều kiện 37ºC và 5% CO2. Tỷ lệ tế

bào sống sẽ được xác định bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng là 450 nm [177].

Dưới sự xúc tác của enzyme dehydrogenase trong tế bào, WST-8 chuyển hóa thành sản

phẩm có màu cam (formazan) hòa tan trong môi trường nuôi cấy. Lượng thuốc nhuộm

formazan tạo ra trong tế bào tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống. Chất thử nghiệm càng

49

có khả năng bảo vệ tế bào khỏi quá trình stress oxi hóa do H2O2 gây ra khi phần trăm tế

bào sống sót càng cao so với mẫu đối chứng. Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm

bảo tính chính xác.

% tế bào sống sót = OD mẫu thử x 100% OD đối chứng

Trong đó:

- OD mẫu thử = OD 2 giờ - OD 0 giờ

- OD đối chứng = OD 2 giờ - OD 0 giờ

+ Thống kê và phân tích số liệu

Số liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm Minitab 16.0 và vẽ đồ thị bằng

phần mềm Microsoft Excel.

Hoạt tính bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi ER stress

Thapsigargin 2 µM được dùng để gây chết tế bào. Tác dụng của các cao chiết bảo

vệ tế bào khỏi sự chết được đánh giá bằng cách so sánh thống kê tỷ lệ sống của nhóm tế

bào được xử lý với thapsigargin sau đó xử lý thêm với cao chiết so với nhóm chỉ được

xử lý với thapsigargin. Tỷ lệ sống của tế bào được đánh giá bằng phương pháp so màu

dựa trên hoạt tính của enzyme dehydrogenase [178].

Phương pháp tiến hành:

100 µL tế bào trong môi trường DMEM có mật độ là 2x104 tế bào/mL/giếng được

nuôi cấy trên đĩa 96 giếng. Ủ trong 24 giờ ở điều kiện 37ºC và 5% CO2.

Sau 24 giờ, môi trường ở các giếng được loại bỏ, thêm môi trường mới và ủ tiếp

trong 24 giờ với các nghiệm thức sau:

Nghiệm thức 1: môi trường nuôi cấy DMEM

Nghiệm thức 2: DMEM + DMSO (0.5%)

Nghiệm thức 3: DMEM + DMSO (0.5%) + thapsigargin 2 µM

Nghiệm thức 4-7: DMEM + DMSO (0.5%) + thapsigargin 2 µM + các mẫu thử

với những nồng độ khác nhau.

Sau 24 giờ ủ, môi trường được loại bỏ và thêm vào 110 µL môi trường DMEM

có WST-8 với tỷ lệ là 10:1. Ủ trong khoảng 4 giờ ở điều kiện 37ºC và 5% CO2. Tỷ lệ tế

50

bào sống sẽ được xác định bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng là 450 nm. Các phép

thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác.

% tế bào sống sót = OD mẫu thử x 100% OD đối chứng

Trong đó:

- OD mẫu thử = OD 4 giờ - OD 0 giờ

- OD đối chứng = OD 4 giờ - OD 0 giờ

51

THỰC NGHIỆM

Sàng lọc các đối tượng nghiên cứu theo định hướng hoạt tính tăng cường hệ

miễn dịch trên cá tra

Dựa vào kết quả khảo sát kinh nghiệm dân gian trong các hộ nông dân nuôi trồng

thủy sản kết hợp với lược khảo tài liệu, 20 loài thực vật đã được thu hái từ các tỉnh của

vùng ĐBSCL và tiến hành sàng lọc hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra.

Từ 20 loài thực vật ban đầu, sau khi xử lý mẫu và điều chế các cao chiết, đã thu

được 20 loại cao ethanol tổng tương ứng. Hiệu suất điều chế của mỗi loại cao chiết được

trình bày trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1 Danh sách các cao chiết ethanol tổng thu được

STT Tên thực vật Tên khoa học của

mẫu thực vật

Địa điểm thu mẫu

Bộ phận

nghiên cứu

Hiệu suất điều chế cao

(%)

1 Dây vác Cayratia trifolia (L.) Domin

Sóc Trăng Phần trên mặt đất

7.51

2 Rau sam Portulaca oleracea L. Vĩnh Long Toàn cây 5.73

3 Tỏi Allium sativum L. Cần Thơ Củ 6.87

4 Húng quế Ocimum basilicum L. Cần Thơ Phần trên mặt đất

5.15

5 Bình bát nước

Annona reticulata L. Sóc Trăng Lá 13.71

6 Cỏ sữa lá lớn Euphorbia hirta L. Cần Thơ Toàn cây 8.38

7 Gừng Zingiber officinale Rosc.

Cần Thơ Củ 5.65

8 Rau má Centella asiatica (L.) Urb

Hậu Giang Toàn cây 5.41

9 Sài đất Wedelia chinensis (Osbeck) Merr.

Cần Thơ Toàn cây 5.76

10 Diệp hạ châu thân xanh

Phyllanthus amarus L.

Sóc Trăng Phần trên mặt đất

6.29

11 Sầu đâu Azadirachta indica A. Juss

Cần Thơ Lá 8.84

12 Ổi Psidium guajava L. Vĩnh Long Lá 10.41

13 Trầu không Piper betle L. Hậu Giang Lá 5.47

14 Mướp đắng Momordica charantia L.

Vĩnh Long Lá 5.98

15 Giấp cá Houttuynia cordata

Thunb. Vĩnh Long Phần trên

mặt đất 8.93

52

16 Mắc cỡ Mimosa pudica L. Cần Thơ Phần trên mặt đất

6.28

17 Tía tô Perilla frutescen (L.) Britt

Cần Thơ Phần trên mặt đất

5.42

18 Cỏ cứt lợn Ageratum conyzoides L.

Hậu Giang Phần trên mặt đất

8.40

19 Rau dệu Alternanthera sessilis (L.) A. DC


6.10

20 Cỏ mực Eclipta prostrata (L.) L.


5.07

Tất cả 20 cao chiết đều được thử hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra để

sàng lọc đối tượng nghiên cứu hóa thực vật tiếp theo. Dựa vào kết quả sàng lọc đạt được,

loài cây Cỏ sữa lá lớn hứa hẹn nhiều tiềm năng sẽ phân lập được các hợp chất có khả

năng tăng cường hệ miễn dịch cá tra, bổ sung dữ liệu về các loài dược liệu có tác dụng

hỗ trợ phòng và trị bệnh trên đối tượng nuôi trồng thủy sản. Vì vậy, đề tài đã chọn Cỏ

sữa lá lớn là đối tượng nghiên cứu tiếp theo về thành phần hóa học, đồng thời cũng khảo

sát thêm hoạt tính sinh học về khả năng kháng khuẩn, kháng oxi hóa và khả năng bảo

vệ tế bào của các cao phân đoạn và một số hợp chất sạch phân lập được từ loài cây này.

Chiết tách, phân lập các hợp chất từ Cỏ sữa lá lớn

Xử lý nguyên liệu và điều chế các cao phân đoạn

Toàn cây Cỏ sữa lá lớn sau khi thu về được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ từ 40-

45ºC. Mẫu sau khi khô được xay nhuyễn thành mẫu bột nguyên liệu (8 kg). Bột nguyên

liệu được cho vào trong các túi vải và ngâm trong ethanol 96%. Mẫu được ngâm 5 lần,

mỗi lần ngâm khoảng 24 giờ, dịch chiết từ các lần ngâm được gom lại, cô đuổi dung

môi thu được cao tổng ethanol (700 g). Từ cao tổng tiếp tục sắc ký cột nhanh lần lượt

với các dung môi: n-hexane, ethyl acetate, n-butanol và methanol thu được các cao phân

đoạn tương ứng: cao n-hexane (160 g), cao ethyl acetate (95 g), cao n-butanol (185 g)

và cao methanol (172 g).

Phân lập các hợp chất

Phân lập các hợp chất từ cao methanol

Cao methanol được tiến hành phân lập trên cột nhanh, rửa giải với hệ dung môi

EtOAc: MeOH với các tỉ lệ lần lượt là: 100:1, 50:1, 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1 và 0:100

thu được 08 phân đoạn tương ứng (ký hiệu từ ME 1 đến ME 8). Phân đoạn ME 4

53

(5.74 g) được tiếp tục sắc ký trên cột silica gel pha thường và rửa giải bởi hệ dung môi

EtOAc: MeOH với độ phân cực tăng dần từ 40:1 đến 0:100 thu được 16 phân đoạn (ME

4.1-16). Phân đoạn ME 4.13 (0.832 g) tiếp tục được tiến hành sắc ký trên cột silica gel

pha thường, hệ dung môi giải ly CHCl3: MeOH (5:1 đến 3:1 và 100% MeOH) thu được

07 phân đoạn (ME 4.13.1-7). Phân đoạn ME 4.13.3 (42 mg) được sắc ký trên cột silica

gel pha đảo, hệ dung môi giải ly MeOH: H2O (0:50 đến 100:0) thu được 08 phân đoạn

(ME 4.13.3.1-8). Phân đoạn ME 4.13.3.6 (9 mg) tiếp tục được sắc ký trên cột silica gel

pha đảo và rửa giải với MeOH: H2O (1:5), thu được hợp chất mới Eup16 (bột không

màu, 6 mg).

Phân đoạn ME 2 (30.40 g) được sắc ký trên cột silica gel pha thường, rửa giải bởi

hệ dung môi EtOAc: MeOH (50:1 đến 10:1) thu được 07 phân đoạn (ME 2.1-7). Phân

đoạn ME 2.6 (14.62 g) được tiếp tục sắc ký trên cột silica gel pha thường, dung môi giải

ly CHCl3: MeOH (8:1-3:1) thu được 08 phân đoạn (ME 2.6.1-8). Phân đoạn ME 2.6.6

(6.24 g) được sắc ký 2 lần trên cột Sephadex-20 (MeOH) và hợp chất Eup02 (40 mg,

bột màu vàng) thu được từ phân đoạn ME2.6.6.2.1.3 trên cột silica gel pha đảo với hệ

dung môi giải ly MeOH: H2O (1:2).

Phân đoạn ME 2.5 (12.5 g) được tiến hành sắc ký trên cột silica gel pha thường

với hệ dung môi CHCl3: MeOH (40:1-1:40) thu được được 7 phân đoạn (ME 2.5.1-7).

Phân đoạn ME 2.5.1 (356 mg) được sắc ký trên cột silica gel pha thường, rửa giải bởi

hệ dung môi CHCl3: MeOH (25:1) thu được Eup23 (6.2 mg, bột không màu). Phân đoạn

ME 2.5.4 (1.1 g) cũng được sắc ký trên cột silica gel pha thường và rửa giải bởi hệ dung

môi CHCl3: MeOH (7:3) thu được Eup11 (7.3 mg, bột màu trắng ngà).

Phân đoạn ME 5 (8.50 g) được tiến hành sắc ký trên cột silica gel pha thường

với hệ dung môi giải ly EtOAc: MeOH (40:1 đến 1:40), thu được 12 phân đoạn (ký hiệu

ME 5.1-12). Phân đoạn ME 5.7 (1.20 g) được tiếp tục tách với hệ dung môi EtOAc:

MeOH (20:1-1:20) thu được được 8 phân đoạn (ME 5.7.1-8). Phân đoạn ME 5.7.4 (254

mg) được sắc ký nhiều lần trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi hỗn hợp của

EtOAc và MeOH. Phân đoạn ME 5.7.4.3.2 (53 mg) được nạp trên cột silica gel pha đảo

với hệ dung môi MeOH: H2O (6:1) thu được hợp chất Eup18 (4 mg, bột màu vàng nhạt).

Quy trình chiết tách, phân lập các hợp chất từ cao methanol được tóm tắt bằng

các sơ đồ trong Hình 3.1 và Hình 3.2

54



55

Phân lập các hợp chất từ cao n-butanol

Sư dung phương phap săc ky côt nhanh đối với cao n-butanol, rưa giai bởi hê

dung môi EtOAc: MeOH (100:0, 50:1, 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1 va 100% MeOH) thu

đươc 07 phân đoan (BE 1-7).

Phân đoan BE 2 (26.50 g) đươc săc ky trên côt silica gel pha thương vơi hê dung

môi EtOAc: MeOH (50:1-0:100) thu đươc 09 phân đoan (BE 2.1-9). Phân đoạn BE 2.2

(11.32 g) đươc tách trên côt silica gel pha thương nhiều lần vơi hê dung môi CHCl3:

MeOH (8:1-1:1). Tinh chế phân đoạn BE 2.2.4.3 (2.69 g) trên cột silica gel pha đảo, hệ

dung môi rửa giải MeOH: H2O (1:3) và kết tinh lại trong MeOH thu được hợp chất

Eup01 (70 mg, bột màu vàng nhạt).

Phân đoạn BE 7 (6.95 g) được tiến hành sắc ký trên cột silica gel pha thường với

hệ dung môi giải ly EtOAc: MeOH (30:1-0:100) thu được 12 phân đoạn (BE 7.1-12).

Phân đoạn BE 7.8 (0.99 g) được tiếp tục tách trên cột silica gel pha thường, hệ dung môi

CHCl3: MeOH (20:1, 15:1, 10:1, 5:1) thu được 4 phân đoạn tương ứng từ BE 7.8.1-4.

Phân đoạn BE 7.8.4 (34 mg) được tách trên cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ

dung môi CHCl3: MeOH (8:1) thu được hợp chất Eup12 (7 mg, bột màu nâu).

Phân đoạn BE 7.11 (1.97 g) được tiến hành sắc ký trên cột silica gel pha thường,

với hệ dung môi CHCl3: MeOH (30:1-5:1) thu được được 07 phân đoạn (BE 7.11.1-7).

Phân đoạn BE 7.11.7 (68 mg) được tiếp tục sắc ký trên cột silica gel pha đảo, hệ dung

môi MeOH: H2O (1:2) thu được hợp chất Eup15 (16 mg, bột màu vàng).

Quy trình chiết tách, phân lập các hợp chất từ cao n-butanol được tóm tắt bằng

sơ đồ trong Hình 3.3.

Phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetate

Tiến hành sắc ký cao ethyl acetate trên cột nhanh và rửa giải với hệ dung môi n-

hexane: EtOAc (100:0-0:100) thu được 09 phân đoạn (EE 1-9).

Phân đoan EE 2 (7.67 g) đươc săc ky trên côt silica gel pha thương vơi hê dung

môi CHCl3: MeOH (100:0 đên 90:10) thu đươc 05 phân đoan (EE 2.1-5). Phân đoan EE

2.3 (0.041 g) tiếp tục đươc săc ky trên côt silica gel pha thương vơi hê dung môi n-

hexane: EtOAc (1:1) thu đươc hợp chất Eup19 (8 mg, tinh thể màu vàng).

56

Phân đoạn EE 5 (11.17g) được tiếp tục tách trên cột silica gel pha thường với hệ

dung môi CHCl3: MeOH (50:1-1:1) thu được 14 phân đoạn (EE 5.1-14). Phân đoạn EE

5.11 được tiếp tục sắc ký cột, rửa giải với hệ CHCl3: MeOH (10:1-1:1) thu được 07 phân

đoạn (EE 5.11.1-7). Hợp chất Eup08 (8 mg, bột màu vàng) và hợp chất Eup09 (10 mg,

bột màu vàng nhạt) được phân lập lần lượt từ các phân đoạn EE 5.11.5 và EE 5.11.6.

Tương tự, phân đoạn EE 6 (5.49 g) được nạp trên cột silica gel với hệ dung môi

CHCl3: MeOH (50:1-5:1) thu được 11 phân đoạn (E6.1-11). Tiếp tục thực hiện sắc ký

cột pha thường đối với phân đoạn EE 6.5 (340 mg), rửa giải với hệ dung môi CHCl3:

MeOH (10:1-1:1) được 08 phân đoạn (EE 6.5.1-8). Phân đoạn EE 6.5.6 được thực hiện

sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi MeOH: H2O (1:1) thu được hợp chất Eup10 (5 mg,

chất rắn vô định hình vàng nhạt).

Phân đoạn EE 6.4 (760 mg) được sắc ký trên cột pha thường với hệ dung môi n-

hexane: EtOAc (50:1-0:100) thu được 05 phân đoạn, tiến hành kết tinh lại nhiều lần tinh

thể thu được trong phân đoạn EE 6.4.2 với dung môi n-hexane thu được hợp chất Eup03

(15 mg, tinh thể hình kim không màu).

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất của cao chiết n-butanol từ Cỏ sữa lá lớn

57

Phân đoạn EE 7 (5.26 g) được sắc ký trên cột pha thường với hệ dung môi n-

hexane: EtOAc (1:1-0:100) thu được 12 phân đoạn (EE 7.1-12). Tiếp tục sắc ký cột phân

đoạn EE 7.7 (255 mg) với hỗn hợp dung môi CHCl3: MeOH (10:1-5:1) thu được 03

phân đoạn (EE 7.7.1-3). Hợp chất Eup13 (11 mg, chất rắn không màu) thu được từ phân

đoạn EE 7.7.2. Phân đoạn EE 7.10 (385 mg) tiếp tục được sắc ký trên cột pha thường,

hệ dung môi CHCl3: MeOH (40:1-10:1) thu được 07 phân đoạn (EE 7.10.1-7). Phân

đoạn EE 7.10.6 được tách trên cột pha đảo, hệ dung môi MeOH: H2O (1:1) thu được

hợp chất Eup14 (5 mg, chất rắn màu vàng).

Phân đoạn EE 8 (11.26 g) được sắc ký cột silica gel pha thường, hệ dung môi

n-hexane: EtOAc (7:3-3:7) thu được 05 phân đoạn, ký hiệu EE 8.1-5. Phân đoạn EE 8.1

được kết tinh lại nhiều lần trong ethanol thu được hợp chất Eup21 (8 mg, chất rắn màu

vàng). Tương tự, thu được 5 mg hợp chất Eup04 – bột màu vàng khi kết tinh lại nhiều

lần từ phân đoạn EE 8.4.

Phân đoạn EE 9 (4.9 g) được phân tích trên cột silica gel pha thường với hệ dung

môi rửa giải CHCl3: MeOH (30:1-1:1) thu được 07 phân đoạn (EE 9.1-7). Phân đoạn

EE 9.1 tiếp tục được phân tích trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi CHCl3:

MeOH (2:1-0:100) thu được 04 phân đoạn (EE.9.1.1-4). Kết tinh lại nhiều lần phân đoạn

EE 9.1.3 thu được hợp chất Eup05 (4 mg, tinh thể màu vàng).

Quy trình chiết tách, phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetate được tóm tắt bằng

các sơ đồ trong Hình 3.4 và Hình 3.5

Phân lập các hợp chất từ cao n-hexane

Sư dung phương phap săc ky côt nhanh đối với cao n-hexane, rưa giai vơi hê

dung môi n-hexane: EtOAc (100:0-0:100) thu đươc 08 phân đoan (HE 1-8).

Phân đoạn HE 3 (16.20 g) được tiến hành sắc ký trên cột silica gel pha thường

với hệ dung môi rửa giải n-hexane: EtOAc (50:1 đến 0:100) thu được 14 phân đoạn

(HE 3.1-14). Tiếp tục sắc ký cột pha thường trên phân đoạn HE 3.3 (4.32 g) với hệ dung

môi n-hexane: acetone (100:1). Phân đoạn HE 3.3.3 (1.12 g) được tách trên cột silica

gel pha thường, hệ dung môi n-hexane: EtOAc (50:1) thu được 04 phân đoạn và hợp

chất Eup06 (65 mg, bột không màu), Eup07 (8.0 mg, bột không màu), thu được lần lượt

từ phân đoạn HE 3.3.3.2 và HE 3.3.3.1.

58

Hình 3.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất của phân đoạn EE 2, 5, 6 từ cao ethyl acetate

Hình 3.5 Sơ đồ phân lập các hợp chất của phân đoạn EE 7, 8, 9 từ cao ethyl acetate

59

Phân đoan HE 4 (15.0 g) đươc săc ky trên côt silica gel pha thương vơi hê dung

môi n-hexane: EtOAc (30:1 đên 0:100) thu đươc 07 phân đoan (HE 4.1-7). Phân đoan

HE 4.4 (1.7 g) đươc săc ky côt silica gel pha thường vơi hê dung môi n-hexane: EtOAc

(10:1, 5:1 đên 3:1) thu đươc 03 phân đoan kı hiêu tư HE 4.4.1-3 và hợp chất Eup17 (25

mg, tinh thể hình kim không màu) phân lập được từ phân đoạn HE 4.4.2.

Thực hiện quá trình sắc ký cột pha thường với phân đoạn HE 5 (12.0 g), sử dụng

hệ dung môi n-hexane: EtOAc (20:1, 10:1, 5:1 và 100% MeOH) thu được 8 phân đoạn

(HE 5.1-8). Phân đoạn HE 5.5 (1.4 g) được rửa với dung môi n-hexane 100% và n-

hexane: EtOAc (20:1). Tiếp tục sắc ký cột silica gel pha thường phần chất rắn với hệ

dung môi là n-hexane và EtOAc thu được hợp chất Eup20 (25 mg, bột không màu).

Quy trình chiết tách, phân lập các hợp chất từ cao n-hexane được tóm tắt bằng sơ

đồ trong Hình 3.6

Hình 3.6 Sơ đồ phân lập các hợp chất của cao chiết n-hexane từ Cỏ sữa lá lớn

60

Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ Cỏ sữa lá lớn

Hợp chất Eup16 (chất mới)

Dạng bột không màu; [α]30 D = - 48.3 (c 0.05, MeOH); HR-MS [M+H]+ m/z =

413.1729 ứng với công thức C18H26D2NaO9 (lý thuyết 413.1757); [α]30 D = - 48.3 (c 0.05,

MeOH). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 5.53 (1H, td, 11.5 và 6.0 Hz, H-10);

5.47 (1H, td, 11.5 và 4.5 Hz, H-9); 4.31 (1H, d, 8.0 Hz, H-1); 3.92 (1H, m, H-12a); 3.88

(1H, m, H-6a); 3.71 (1H, dd, 12.0 và 5.5 Hz, H-6b); 3.61 (1H, dd, 17.0 và 7.0 Hz, H-

12b); 3.40 (1H, t, 9.5 Hz, H-3); 3.31 (1H, m, H-5); 3.30 (1H, t, 9.5 Hz, H-4); 3.22 (1H,

dd, 9.5 và 8.0 Hz, H-2); 2.63 (1H, dd, 14.0 và 4.5 Hz, H-2a); 2.46 (2H, m, H-8); 2.41

(2H, m, H-11); 2.34 (1H, m, H-5a); 2.33 (1H, m, H-3); 2.28 (1H, m, H-4a); 2.22 (1H,

dd, 14.0 và 9.0 Hz, H-2b); 2.10 (1H, dt, 8.5 và 2.5 Hz, H-5b); 2.00 (1H, dt, 10.0 và 5.5

Hz, H-7); 1.6 (1H, dt, 12.0 và 5.0 Hz, H-4b). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm):

222.8 (C-6); 182.0 (C-1); 129.3 (C-9); 128.6 (C-10); 104.3 (C-1); 78.1 (C-3); 77.9 (C-

5); 75.1 (C-2); 71.7 (C-4); 70.2 (C-12); 62.8 (C-6); 55.6 (C-7); 43.4 (C-2); 40.1 (C-

3); 38.7 (C-5); 29.1 (C-11); 28.4 (C-4); 26.5 (C-8).

Hợp chất Eup01

Dạng bột màu vàng nhạt; Nhiệt độ nóng chảy: 174-176ºC; CTPT: C21H20O11; Các

dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.3

Hợp chất Eup02

Dạng bột màu vàng; Nhiệt độ nóng chảy: 188-190ºC; Các dữ liệu phổ 1H-NMR

và 13C-NMR: xem Bảng 4.4

Hợp chất Eup03

Tinh thể hình kim không màu; Nhiệt độ nóng chảy: 190-192ºC

Các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.20

Hợp chất Eup04

Dạng bột vô định hình màu vàng; Nhiệt độ nóng chảy: 216-218ºC;


61

Hợp chất Eup05

Tinh thể màu vàng; Nhiệt độ nóng chảy: 176-178ºC; [α]30 D = + 20.7 (c 0.05,

MeOH); Các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.6

Hợp chất Eup06

Dạng bột vô định hình không màu; Nhiệt độ nóng chảy: 282-284ºC; [α]30 D = + 9.2

(c 0.1, CHCl3); Các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.17

Hợp chất Eup07

Dạng bột vô định hình không màu; Nhiệt độ nóng chảy: 238-240ºC; [α]30 D = +

12.3 (c 0.1, CHCl3); Các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.18

Hợp chất Eup08

Dạng bột màu vàng; Nhiệt độ nóng chảy: 303-305ºC; HR-ESI-MS, [M-H] m/z =

285.0347 ứng với CTPT C15H19O6 (lý thuyết: 285.0399).


Hợp chất Eup09

Dạng bột màu vàng nhạt; Nhiệt độ nóng chảy: 251-253ºC; HR-ESI-MS, [M-H]

m/z = 301.0388 ứng với CTPT C15H9O7 (lý thuyết: 301.0348).


Hợp chất Eup10

Chất rắn vô định hình màu vàng; Nhiệt độ nóng chảy: 160-162ºC; HR-ESI-MS,

[M-H] m/z =179.0614 ứng với CTPT C9H7O4 (lý thuyết: 179.0344).


Hợp chất Eup11

Dạng bột màu trắng ngà; Nhiệt độ nóng chảy: 175-177ºC; [α]30 D = + 25.7 (c 0.01,


Hợp chất Eup12

Dạng bột màu nâu; Nhiệt độ nóng chảy: 201-203ºC; Các dữ liệu phổ 1H-NMR và

13C-NMR: xem Bảng 4.15

62

Hợp chất Eup13

Chất rắn không màu; Nhiệt độ nóng chảy: 158-160ºC; Các dữ liệu phổ 1H-NMR


Hợp chất Eup14

Chất rắn màu vàng; Nhiệt độ nóng chảy: 177-179ºC; [α]30 D = - 94.0 (c 0.1,


Hợp chất Eup15

Dạng bột màu vàng; Nhiệt độ nóng chảy: 199-201ºC; Các dữ liệu phổ 1H-NMR


Hợp chất Eup17

Tinh thê hình kim không màu; Nhiệt độ nóng chảy: 197-199ºC; [α]30 D = + 36.9 (c

0.1, CHCl3); Các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.19

Hợp chất Eup18

Dạng bột màu vàng nhạt; [α]30 D = - 54.8 (c 0.1, MeOH); Các dữ liệu phổ 1H-

NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.23

Hợp chất Eup19

Tinh thê mau vang; Nhiệt độ nóng chảy: 210-212ºC; Các dữ liệu phổ 1H-NMR


Hợp chất Eup20

Dạng bột không màu; Nhiệt độ nóng chảy: 157-159ºC; [α]30 D = - 37.9 (c 0.1,

CHCl3); Các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.21

Hợp chất Eup21

Chất rắn màu vàng; Nhiệt độ nóng chảy: 189-191ºC; Các dữ liệu phổ 1H-NMR


Hợp chất Eup23

Dạng bột không màu; [α]30 D = - 77.5 (c 0.1, MeOH); Các dữ liệu phổ 1H-NMR


63

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả sàng lọc hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra của 20 cao chiết

* Ghi chú: sự khác biệt đáng kể so với đối chứng (DMSO 1%) (* p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01)

Ký hiệu: 1. Dây vác 2. Rau sam 3. Tỏi 4. Húng quế 5. Bình bát nước 6. Cỏ sữa lá lớn 7. Gừng 8. Rau má 9. Sài đất 10. Diệp hạ châu thân xanh 11. Sầu đâu 12. Ổi 13. Trầu không 14. Mướp đắng 15. Giấp cá 16. Mắc cỡ 17. Tía tô 18. Cỏ cứt lợn 19. Rau dệu 20. Cỏ mực

Hình 4.1 Ảnh hưởng của 20 cao chiết lên hoạt tính lysozyme của (A) tế bào máu và

(B) tế bào thận cá tra so với đối chứng DMSO

0

100

200

300

400

500

600

DMSO 18 11 5 3 19 8 1 6 20 15 14 16 4 10 13 17 12 2 9 7

A

10 µg/mL 100 µg/mL

****

** **** **

**

****

**

**

**

**

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

DMSO 18 11 5 3 19 8 1 6 20 15 14 16 4 10 13 17 12 2 9 7

B


**

**

***

**

**

**

*

**

**

**

**

**

**

*

64

Hình 4.2 Ảnh hưởng của 20 cao chiết lên hoạt tính bổ thể của (A) tế bào máu và


0

50

100

150

200

250

300

350

DMSO 18 11 5 3 19 8 1 6 20 15 14 16 4 10 13 17 12 2 9 7

A


**

**** **

****

**

**

******

0

50

100

150

200

250

300

350

DMSO 18 11 5 3 19 8 1 6 20 15 14 16 4 10 13 17 12 2 9 7

B


****

*

****

**

**

**

**

**

****

***

0

100

200

300

400

500

600

700

800

DMSO 18 11 5 3 19 8 1 6 20 15 14 16 4 10 13 17 12 2 9 7

A


**

**

**

**

****

**

**

**

****

**

**

**

***

** **

**

**

**

****

**

**

****

65

Hình 4.3 Ảnh hưởng của 20 cao chiết lên tổng kháng thể của (A) tế bào máu và


Bảng 4.1 Kết quả sàng lọc các chỉ tiêu miễn dịch trên cá tra của 20 cao chiết

STT Tên thực vật Nồng độ cao chiết (µg/mL)

Lysozyme Bổ thể Tổng kháng thể Tế bào

máu Tế bào

thận Tế bào

máu Tế bào

thận Tế bào

máu Tế bào

thận 6 Cỏ sữa lá lớn 10

100

**

**

** *

** *

** 10 Diệp hạ châu

thân xanh 10 100

** ** **

** ** **

**

7 Gừng 10 100

**

**

**

**

** **

**

11 Sầu đâu 10 100

** ** ** ** ** **

3 Tỏi 10 100

** ** ** ** ** **

**

12 Ổi 10 100

** **

** ** **

** **

13 Trầu không 10 100

** ** **

**

1 Dây vác 10 100

** ** ** **

*

2 Rau sam 10 100

**

**

** **

9 Sài đất 10 100

* **

* **

** **

**

14 Mướp đắng 10 100

** **

* **

**

**

19 Rau dệu 10 100

** ** ** *

** *

4 Húng quế 10 100

** **

* **

** **

** **

5 Bình bát nước 10 100

**

**

0

100

200

300

400

500

600

DMSO 18 11 5 3 19 8 1 6 20 15 14 16 4 10 13 17 12 2 9 7

B


****

*

** **

**

**

*** **

*

** ** **

**

**

**

**

**

66

8 Rau má 10 100

**

15 Giấp cá 10 100

**

16 Mắc cỡ 10 100

**

17 Tía tô 10 100

** ** ** **

** **

18 Cỏ cứt lợn 10 100

** ** **

20 Cỏ mực 10 100

** ** **

Ghi chú: Hoạt tính miễn dịch tăng đáng kể khi so sánh với đối chứng (100%) sau 24 giờ bổ sung cao chiết * p<0.05, ** p<0.01

Từ kết quả sàng lọc của 20 cao chiết (Bảng 4.1) trên tế bào bạch cầu thu từ máu

và từ thận cá tra đã cho thấy các cao chiết Cỏ sữa lá lớn, Diệp hạ châu thân xanh, Gừng,

Sầu đâu, Tỏi… có nhiều tiềm năng cải thiện đáng kể hệ miễn dịch trên cá tra khi so sánh

với mẫu đối chứng. Tế bào bạch cầu thu từ máu và từ thận đều tăng đồng thời cả ba chỉ

tiêu miễn dịch với thời gian tối ưu của thí nghiệm được chọn là 24 giờ, ở hai loại nồng

độ 10 và 100 µg/mL (Hình 4.1, Hình 4.2 và Hình 4.3).

Kết quả sàng lọc đã hứa hẹn nhiều tiềm năng to lớn của Cỏ sữa lá lớn trong việc

hỗ trợ tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra đặc biệt là tế bào bạch cầu thu từ thận. Ngoài

ra, Cỏ sữa lá lớn đã được nghiên cứu ở một số nước trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam

loài cây này chủ yếu mọc hoang, chưa được sử dụng nhiều trong ngành dược phẩm nước

ta. Mặc dù loài Cỏ sữa lá lớn có nhiều tác dụng chữa bệnh trong dân gian, nhiều hoạt

tính sinh học đáng quý lại dễ tìm kiếm nhưng còn rất ít công trình nghiên cứu ở Việt

Nam. Với những lý do trên, đề tài đã lựa chọn Cỏ sữa lá lớn để tiến hành nghiên cứu

thành phần hóa học, đồng thời đánh giá thêm một số hoạt tính sinh học của các cao phân

đoạn và một số hợp chất sạch phân lập được từ loài cây này.

Hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid toàn phần của Cỏ sữa lá lớn

Hàm lượng tổng polyphenol và flavonoid toàn phần được xác định theo phương

pháp đã mô tả trong mục 2.2.2 trang 41 cho kết quả như sau:

Cao chiết Hàm lượng polyphenol

(mg GAE/g cao)

Hàm lượng flavonoid

(mg QE/g cao)

Cao tổng Cỏ sữa lá lớn 140.85 ± 4.72 202.42 ± 10.25

67

Các hợp chất kháng oxi hóa tự nhiên như polyphenol, flavonoid có vai trò ngăn

chặn các tác động có hại của stress oxi hóa [179, 180]. Polyphenol là nhóm chất kháng

oxi hóa có khả năng ngăn chặn các chuỗi phản ứng dây chuyền bằng cách phản ứng trực

tiếp với gốc tự do tạo thành một gốc tự do mới bền hơn, hoặc cũng có thể tạo phức với

các ion kim loại chuyển tiếp vốn là xúc tác cho quá trình tạo gốc tự do [181]. Flavonoid

là một nhóm hợp chất kháng oxi hóa thuộc nhóm polyphenol, có hoạt tính kháng oxi

hóa mạnh nhờ sự có mặt của các nhóm hydroxyl nhân thơm [182, 183]. Vì vậy, việc

khảo sát hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid toàn phần là một trong những chỉ tiêu

quan trọng nhằm đánh giá khả năng kháng oxi hóa của một nguyên liệu. Kết quả đã cho

thấy hàm lượng tổng polyphenol và flavonoid toàn phần trong Cỏ sữa lá lớn chiếm hàm

lượng khá cao.

Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập

Từ loài Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.), đề tài đã phân lập được 22 hợp chất

sạch, trong đó có một hợp chất mới và bảy hợp chất lần đầu được phân lập từ loài cây

này. Cấu trúc của các hợp chất này đã được xác định dựa trên các phương pháp phổ

nghiệm hiện đại và được phân thành các nhóm hợp chất: hợp chất mới, nhóm hợp chất

flavonoid, nhóm hợp chất phenol, nhóm hợp chất triterpenoid, hợp chất diterpenoid, hợp

chất steroid và hợp chất khác.

Hợp chất Eup16 (chất mới)

Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD, phụ lục 1.1) cho thấy tín hiệu của một nối đôi

cấu hình Z tại H [5.53 (1H, td, J = 11.5 và 6.0 Hz)] và H [5.47 (1H, td, J = 11.5 và 4.5

Hz)], một nhóm oxymethylene tại [H 3.92 (1H, m); 3.71 (1H, dd; J = 12.0 và 5.5 Hz)],

bốn nhóm methylene liền kề nối đôi tại H [2.63 (dd; J = 14.0 và 4.5 Hz); 2.22 (dd; J =

14.0 và 9.0 Hz)]; [2.10 (dt, J = 8.5 và 2.5 Hz); 2.34 (m)]; 2.46 (m) và 2.41 (m). Ngoài ra

còn có tín hiệu đặc trưng của một gốc đường bao gồm tín hiệu proton anomer tại H

4.31, các proton oxymethine ở vùng H 3.22-3.40 và oxymethylene tại H [3.88 (m); 3.61

(dd, J = 17.0 và 7.0 Hz)].

Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) kết hợp với kỹ thuật DEPT và HMBC (phụ

lục 1.2, 1.3 và 1.4) cho thấy hợp chất Eup16 có 18 carbon, trong đó có 6 carbon của

phân tử đường glucose, 1 carbon –CH2– mang oxy tại C 70.2 (C-12), 2 carbon mang

68

nối đôi tại C [129.3 (C-9); 128.6 (C-10)], 5 carbon –CH2– tại C [43.4 (C-2); 38.7 (C-

5); 29.1 (C-11); 28.4 (C-4); 26.5 (C-8)], 2 carbon >CH– tại C [55.6 (C-7); 40.1 (C-3)],

1 carbon carbonyl tại C 222.8 (C-6) và 1 carbon carboxyl tại C 182.0.

Sự hiện diện của dây nhánh 5 carbon pent-1-ol-3-en-5-yl được xác nhận dựa vào

tương quan trên phổ COSY (phụ lục 1.6) giữa H-12 với H-11; H-11 với H-10; H-10 với

H-9 và H-9 với H-8. Vị trí nối đôi được xác định phải ở C-9 và C-10 dựa vào tương

quan COSY giữa 2 proton sp2 với H-11 và H-8. Ngoài ra các tương quan HMBC giữa

H-11 và H-8 với C-9 và C-10 giúp khẳng định lại vị trí của nối đôi olefin. Dựa vào giá

trị hằng số ghép spin của 2 proton olefin là 11.5 Hz và tín hiệu 2 carbon methylene gắn

trực tiếp vào nối đôi có độ dịch chuyển hóa học nhỏ hơn 30 ppm khẳng định nối đôi có

cấu hình Z [184]. Nhánh etanoic-2-yl (–CH2-COOH) được nhận ra dựa vào các tương

quan trên phổ HMBC giữa proton methylene [H 2.63 (dd, J = 14.0 và 4.5 Hz); 2.22 (dd,

J = 14.0 và 9.0 Hz), H-2] với carbon carboxyl tại C 182.0 (C-1).

Trên phổ HMBC còn xuất hiện các tương quan giữa H-3 H 2.33 (m) với C-4, C-

5; giữa H-4 [H 2.28 (m); 1.60 (dt, J = 12.0 và 5.0 Hz)] với C-3, C-5 và C-6; giữa H-5

[H 2.10 (dt, J = 8.5 và 2.5 Hz); 2.34 (m)] với C-3, C-4, C-6 và C-7. Đồng thời phổ

COSY cũng cho tương quan giữa các proton lân cận H-3 với H-7; H-3 với H-4 và H-4

với H-5. Điều này khẳng định sự tồn tại của một vòng cyclopentanone trong cấu trúc

của Eup16.

Tương quan HMBC qua lại lẫn nhau giữa vòng cyclopentanone tại C-7 [C

55.6/H 2.00 (dt, J = 10.0 và 5.5 Hz)] với dây nhánh pent-1-ol-3-en-5-yl tại C-8 [C

26.5/H 2.46 (m)] xác nhận dây nhánh pent-1-ol-3-en-5-yl gắn vào vòng cyclopentanone

tại vị trí C-7. Vị trí gắn của nhánh etanoic-2-yl vào khung sườn cyclopentanone tại vị trí

C-3 được khẳng định nhờ vào tương quan HMBC giữa H-2 với C-3, C-4 và C-7. Từ các

giá trị độ dịch chuyển hóa học của proton và carbon giúp khẳng định phân tử đường là

glucose. Hằng số ghép spin của proton anomer là 8.0 Hz cho biết glucose mang cấu hình

beta. Tương quan HMBC giữa proton anomer với C-12 và giữa H-12 với carbon anomer

chứng tỏ phân tử beta glucose gắn vào C-12 thông qua liên kết O-glucoside.

Các dữ liệu phổ NMR cho nhận định hợp chất Eup16 là một dẫn xuất 12-hydroxy

jasmonic acid (Hình 4.4). Phổ NOESY (phụ lục 1.7) không xuất hiện tương quan giữa

69

proton H-3 và proton H-7 chứng tỏ hai proton trên không gần nhau trong vòng

cyclopentanone. Do vậy cấu hình của C-3 và C-7 thuộc 1 trong hai cấu hình (1) và (2):

Trường hợp ghép trục-trục, hằng số J >7 Hz và thường có giá trị 9-10 Hz, ngược

lại nếu ghép xích đạo-xích đạo, hằng số ghép J<4 Hz và thường nhận giá trị 3 Hz. Do

hằng số ghép của H-7 là 10.0 và 5.5 Hz nên chứng tỏ H-7 và H-3 sẽ ghép theo kiểu trục-

trục. Lúc này cấu hình của H-7 và H-3 được xác định lần lượt là beta và alpha. Điều

này được khẳng định lại dựa trên việc so sánh độ dịch chuyển hóa học của C-3 và C-7

với các chất có cấu hình tương tự trong dung môi CD3OD [185, 186]. Độ quay cực của

Eup16 là [α]30 D = - 48.3 (c 0.05, MeOH), phù hợp với các nghiên cứu đã công bố [185,

187]. Như vậy cấu hình carbon C-3 và C-7 lần lượt là 3R và 7R. Kết luận này cũng hoàn

toàn phù hợp với cấu hình của các dẫn xuất của acid jasmonic được phân lập từ thiên

nhiên luôn có cấu hình R tại C-3.

Hình 4.4 Công thức cấu tạo của 12-hydroxy jasmonic acid

Hình 4.5 Các tương quan HMBC chính của hợp chất Eup16

Tín hiệu nhóm carboxyl của Eup16 xuất hiện tại δC 182.0 trên phổ HMBC trong

dung môi CD3OD. Theo tài liệu tham khảo, nhóm chức acid của 12-hydroxy jasmonic

acid sẽ xuất hiện trong vùng δC 176-177 (dung môi CD3OD) [185, 186, 188], điều này

khẳng định nhóm carboxyl phải thuộc gốc muối carboxylate. Ngoài ra, do ảnh hưởng

70

của nhóm carboxylate, carbon methylene kế cận có độ dịch chuyển hóa học dịch về vùng

trường thấp là δC 43.4 (so với δC 37-39 trong trường hợp nhóm acid) [185, 188].

Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 1.8) cho đỉnh ion giả phân tử tại [M+H]+ với

m/z = 413.1729 (tính toán cho công thức C18H26NaD2O9 là 413.1757), như vậy công

thức phân tử của Eup16 là C18H25NaD2O9. Điều này tái xác nhận sự hiện diện của

nguyên tử natri trong cấu trúc của Eup16. Nguyên nhân hai nguyên tử D thay cho 2

nguyên tử H trong Eup16 là hiện tượng thay thế H bằng D trong dung môi CD3OD,

thường xảy ra khi ghi phổ MS trên mẫu sau khi đã đo phổ NMR [189, 190]. Từ những

nhận định nêu trên, công thức phân tử của Eup16 là C18H27NaO9 và có cấu trúc hóa học

như (Hình 4.6). Đây là một chất mới (theo kết quả tra scifider ngày 22/11/2018 tại

trường Đại học Catholique de Louvain, Bỉ), được đặt tên là sodium β-D-glucopyranosyl

12-hydroxyjasmonate.

Hình 4.6 Công thức cấu tạo của hợp chất Eup16

Bảng 4.2 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup16 và số liệu tham khảo

Vị trí

Eup16

(CD3OD)

12-β-D-

Glucopyranosyloxy

jasmonic acid [188]

(CD3OD)

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

δC ppm

125 MHz

HMBC

(HC)

δC ppm

125 MHz

1 - 182.0 176.2

2 2.63 (dd, 14.0 và 4.5); 2.22 (dd, 14.0 và 9.0)

43.4 C-1, 3, 4, 7 38.6

3 2.33 (m) 40.1 C-4, 5 38.9

4 2.28 (m); 1.60 (dt, 12.0 và 5.0)

28.4 C-3, 5, 6 28.1

5 2.10 (dt, 8.5 và 2.5); 2.34 (m)

38.7 C-3, 4, 6, 7 39.7

71

6 - 222.8 222.1

7 2.00 (dt, 10.0 và 5.5) 55.6 C-3, 6, 8 55.0

8 2.46 (m) 26.5 C-3, 6, 7, 9, 10 26.2

9 5.47 (td, 11.5 và 4.5) 129.3 C-8 128.8

10 5.53 (td, 11.5 và 6.0) 128.6 C-8, 9, 11, 12 128.8

11 2.41 (m) 29.1 C-10, 12 28.9

12 3.92 (m); 3.71 (dd, 12.0 và 5.5)

70.2 C-10, 11, 1 70.1

Glucose

1 4.31 (d, 8.0) 104.3 C-12, 2 104.2

2 3.22 (dd, 9.5 và 8.0) 75.1 C-1, 3 74.9

3 3.40 (t, 9.5) 77.9 C-2, 4 77.7

4 3.30 (m) 71.7 C-3, 5 71.5

5 3.31 (m) 78.1 C-4, 6 77.9

6 3.88 (m); 3.61 (dd, 17.0 và 7.0)

62.8 C-4, 5

62.6

Các hợp chất flavonoid

Hợp chất Eup01: quercitrin

Hợp chất Eup01 thu được dưới dạng bột màu vàng nhạt.

Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD, phụ lục 2.1) xuất hiện tín hiệu của 5 proton

của 1 vòng thơm 4 lần thế ở vị trí 1, 2, 3, 5 tại H [6.23 (1H, s, H-6); 6.40 (1H, s, H-8)]

và 1 vòng thơm 3 lần thế ở vị trí 1, 3, 4 tại H [6.94 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5); 7.34 (1H,

d, J = 8.0 Hz, H-6); 7.36 (1H, s, H-2)], 3 proton nhóm methyl ở H 0.96 (3H, d, J = 6.0

Hz, H-6), 1 proton anomer ở H 5.38 (1H, s, H-1) cùng 4 tín hiệu proton oxymethine.

Từ những dữ liệu trên dự đoán hợp chất Eup01 có khung cơ bản là flavonol mang 4

nhóm –OH.

Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD, phụ lục 2.2) kết hợp với kỹ thuật DEPT (phụ

lục 2.3) cho thấy hợp chất Eup01 có 21 carbon, trong đó có 6 carbon của phân tử đường

rhamnose, 7 carbon sp2 bậc ba mang oxy tại C [165.9 (C-7); 163.2 (C-5); 158.6 (C-2);

159.3 (C-9); 146.4 (C-3); 149.8 (C-4) và 136.3 (C-3)]; 5 carbon sp2 bậc ba tại C [99.8

72

(C-6); 94.7 (C-8); 117.0 (C-2); 122.9 (C-6); 116.4 (C-5)]; 2 carbon sp2 bậc bốn tại C

[105.9 (C-10); 123.0 (C-1)] và 1 carbon carbonyl tại C 179.7.

Trên phổ HMBC (phụ lục 2.4), proton tại H 6.40 cho tương quan với bốn carbon

vòng thơm gồm 1 carbon bậc ba, 1 carbon bậc ba mang oxy và 2 carbon bậc bốn lần

lượt tại C [99.8, 165.9, 159.3 và 105.9] khẳng định bốn carbon trên lần lượt là C-6, C-

7, C-9 và C-10 và H 6.40 phải là H-8.

Proton tại H 6.23 cho tương quan HMBC với C 163.2; như vậy nhóm –OH thứ

2 của vòng benzene 4 lần thế phải gắn tại C 163.2. Tương quan HMBC giữa 2 proton

H-6 và H-8 với carbon bậc ba mang oxy tại C 163.2 giúp xác nhận đây là C-5.

Trong vòng benzene 3 lần thế tại vị trí 1, 3, 4; phổ HMBC cho thấy cả 3 proton

đều tương quan với carbon tại C 149.8. Điều này khẳng định đây phải là C-4. Tương

quan HMBC giữa proton tại H 7.36 (1H, s, H-2) với carbon bậc ba mang oxy tại C

146.4 khẳng định đây là C-3.

Phân tử đường rhamnose được nhận ra nhờ sự hiện diện của nhóm methyl tại C

17.7 và H 0.97 cùng các carbon sp3 mang oxy. Proton anomer xuất hiện tại H 5.38 với

dạng mũi đơn khẳng định cấu hình của rhamnose là alpha. Tương quan HMBC giữa

proton anomer với carbon tại C 136.3 (C-3) giúp xác nhận phân tử rhamnose gắn vào

khung flavonol tại C-3.

Dựa vào các kết quả phổ NMR đã phân tích và đối chiếu với tài liệu tham khảo

[191] cho phép định danh hợp chất Eup01 là quercitrin. Đây là một flavonoid phân lập

được từ nhiều loài thực vật trong thiên nhiên như Psidium guajava L., Pometia pinnata,

Zanthoxylum bungeanum cùng một số loài thực vật khác và có nhiều hoạt tính sinh học

đáng quý như kháng oxi hóa, kháng vi sinh vật, khả năng ức chế α-glucosidase [191-

194].

73


Vị trí Hợp chất Eup01 (CD3OD) Quercitrin (CD3OD) [191]

δH ppm (J, Hz) 500 MHz

C ppm 125 MHz


C ppm 125 MHz

2 158.6 159.3

3 136.3 136.2

4 179.7 179.7

5 163.2 163.2

6 6.23 (1H, s) 99.8 6.20 (1H, br s) 99.8

7 165.9 165.8

8 6.40 (1H, s) 94.7 6.36 (1H, br s) 94.7

9 159.3 158.5

10 105.9 105.9

1 123.0 123.0

2 7.36 (1H, s) 117.0 7.33 (1H, d, 1.5) 117.0

3 146.4 146.4

4 149.8 149.8

5 6.94 (1H, d, 8.0) 116.4 6.90 (1H, d, 8.3) 116.4

6 7.34 (1H, d, 8.0) 122.9 7.30 (1H, dd, 8.3 và 1.5) 122.9

1 5.38 (1H, s) 103.6 5.35 (1H, br s) 103.6

2 4.24 (1H, s) 72.0 4.21 (1H, br s) 72.0

3 3.77 (1H, d, 7.5) 72.2 3.74 (1H, dd, 9.3 và 2.9) 72.1

4 3.37 (1H, m) 73.3 3.30 (1H, m) 73.3

5 3.44 (1H, m) 71.9 3.41 (1H, m) 71.9

6 0.96 (3H, d, 6.0) 17.7 0.93 (3H, d, 5.9) 17.6

Hợp chất Eup02: rutin

Hợp chất Eup02 thu được dưới dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 190-

192ºC (MeOH).

Tương tự như ở hợp chất Eup01, các phổ NMR của hợp chất Eup02 cũng có

dạng phổ của một hợp chất flavonoid glycoside nhưng phần đường phức tạp hơn, bao

gồm hai cấu tử đường rhamnopyranosyl và glucopyranosyl. Trên phổ 1H-NMR (500

MHz, CD3OD, phụ lục 3.1) có sự xuất hiện hai tín hiệu mũi đôi của 2 proton thế meta

của vòng A tại δH [6.23 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-6), 6.42 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-8)] và ba

tín hiệu mũi đôi khác tại δH [7.66 (1H, dd, Jorto và meta = 8.5/2.0 Hz, H-2), 6.90 (1H, d,

74

Jorto = 8.5 Hz, H-5) và 7.69 (d, Jmeta = 2.0 Hz, H-6)] của vòng B thế 1, 3, 4; chứng tỏ

cấu trúc phần aglycon của hợp chất Eup02 là quercetin. Điều này có thể thấy rõ ràng

hơn khi trên phổ 13C-NMR và DEPT (125 MHz, CD3OD, phụ lục 3.2 và 3.3) xuất hiện

tín hiệu của 15 nguyên tử carbon của khung flavonoid, bao gồm 5 carbon nhóm =CH–

vùng thơm (δC nằm trong vùng từ 94.9 đến 123.6), 1 carbon của nhóm carbonyl (δC

179.4) và 9 carbon bậc bốn. Tín hiệu cộng hưởng của các nhóm >CH– nằm trong vùng

δH 3.33-3.83 trên phổ 1H-NMR và δC 68.6-78.2 trên phổ 13C-NMR cùng với sự xuất hiện

của 2 proton anomer tại δH 4.54 (1H, s) và δH 5.13 (1H, d, J = 7.5 Hz) và các tín hiệu

của nhóm methyl và methylene ở δC 17.9 và δC 68.6 trên phổ HSQC (phụ lục 3.4) cho

thấy trong cấu trúc của Eup02 có chứa hai gốc đường α-L-rhamnopyranosyl và β-D-

glucopyranosyl. Trên phổ HMBC (phụ lục 3.4) nhận thấy có sự tương quan giữa proton

anomer của cấu tử đường glucopyranosyl (δH 5.13) và carbon C-3 của khung flavonoid

(δC 135.6), điều này cho thấy gốc đường glucopyranosyl được gắn vào vị trí C-3 của

khung aglycon. Trên phổ HMBC cũng cho thấy tương quan giữa proton anomer của cấu

tử đường rhamnopyranosyl tại δH 4.54 (1H, s, H-1) với carbon C-6 (δC 68.6) của cấu

tử đường glucopyranosyl, tương tác giữa carbon C-1 của cấu tử đường

rhamnopyranosyl (δC 102.4) với proton H-6 của cấu tử đường glucopyranosyl tại δH

3.83 (1H, d, J = 10.5 và 1.0 Hz, H-6b), cho thấy 2 cấu tử đường này được nối với nhau

qua liên kết C-1 với C-6. Các dữ liệu phổ NMR trên tương ứng với công thức phân tử

C27H30O16. Kết hợp với tài liệu tham khảo[195], hợp chất Eup02 được xác định là rutin.

Hợp chất này có mặt trong nhiều loài thực vật như Galium tortumense, Bischofia

javanica, Phyllanthus niruri và được biết đến với phổ tác dụng sinh học rộng lớn đặc

biệt có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh [196-198].


Vị trí Hợp chất Eup02 (CD3OD) Rutin (CD3OD) [195]


C ppm 125 MHz


C ppm 100 MHz

2 158.5 158.5

3 135.6 135.6

4 179.4 179.4

5 163.0 162.5

6 6.23 (1H, d, 1.5) 100.0 6.20 (1H, d, 1.8) 99.9

75

7 166.2 166.0

8 6.42 (1H, d, 1.5) 94.9 6.39 (1H, d, 2.2) 94.8

9 159.4 159.3

10 105.6 105.6

1 123.1 123.1

2 7.66 (1H, dd, 8.5 và 2.0) 117.7 7.66 (1H, d, 1.8) 117.6

3 145.9 145.8

4 149.8 149.7

5 6.90 (1H, d, 8.5) 116.1 6.86 (1H, d, 8.0) 116.1

6 7.69 ( 1H, d, 2.0) 123.6 7.60 (1H, dd, 8.0 và 1.8) 123.5

1 5.13 (1H, d, 7.5) 104.7 5.09 (1H, d, 7.8) 104.7

2 3.43 (1H, m) 75.7 3.25-3.47 (1H, m) 75.7

3 3.41 (1H, m) 78.2 3.25-3.47 (1H, m) 77.2

4 3.33 (1H, m) 71.4 3.25-3.47 (1H, m) 71.4

5 3.46 (1H, m) 78.2 3.25-3.47 (1H, m) 78.1

6 3.65 (1H, d, 1.5)

3.83 (1H, dd, 10.5 và 1.0)

68.6 3.38 (1H, m)

3.80 (1H, d, 10.5)

68.6

1 4.54 (1H, s) 102.4 4.51 (1H, d, 1.8) 102.4

2 3.51 (1H, m) 72.1 3.63 (1H, dd, 3.5 và 1.5) 72.0

3 3.56 (1H, m) 72.2 3.53 (1H, dd, 9.5 và 3.5) 72.2

4 3.36 (1H, m) 73.9 3.28 (1H, m) 73.9

5 3.47 (1H, m) 69.7 3.44 (1H, m) 69.7

6 1.14 (3H, d, 6.0) 17.9 1.11 (3H, d, 6.0) 17.9

Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup01 và Eup02 được trình bày ở Hình 4.7.

Hình 4.7 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup01 và Eup02

76

Hợp chất Eup04: avicularin

Hợp chất Eup04 thu được dưới dạng bột màu vàng. Phổ 1H-NMR (500 MHz,

CD3OD, phụ lục 4.1) xuất hiện tín hiệu của một vòng benzene 4 lần thế tại vị trí 1, 2, 3,

5 tại H [6.41 (1H, s, H-8); 6.23 (1H, s, H-6)] và tín hiệu của vòng benzene 3 lần thế tại

vị trí 1, 3, 4 tại H [7.54 (1H, s, H-2); 7.51 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6) và 6.92 (1H, d, J =

8.5 Hz, H-5)]. Ngoài ra, còn có một mũi proton anomer H 5.49 và ba mũi proton ở

vùng trường cao H 3.52-4.35 được quy kết cho các proton của phần đường. Phổ 13C-

NMR (125 MHz, CD3OD, phụ lục 4.2) kết hợp với DEPT (phụ lục 4.3) cho 20 tín hiệu

carbon bao gồm 15 carbon của khung flavonol. Ở vùng từ trường thấp, tín hiệu tại c

180.0 được quy kết cho carbon bậc bốn của nhóm carbonyl >C=O. Tại C 109.6 là tín

hiệu đặc trưng cho carbon anomer –O–CH–O–. Ở vùng từ trường trung bình, các tín

hiệu tại C 60-90 được quy kết cho carbon của đường. Cụ thể: 3 tín hiệu tại C [88.1;

83.3; 78.7] được quy kết cho carbon bậc ba –CH–O–. Tín hiệu tại C 62.6 được quy kết

cho carbon methylene –CH2–O–.

Dựa vào giá trị J trong phần đường đều nhỏ và độ dịch chuyển hóa học của 13C,

có thể đề nghị phần đường là α-L-arabinofuranoside.

Từ các phân tích trên và so sánh với tài liệu tham khảo [199], hợp chất Eup04

được đề nghị là avicularin (quercetin-3-O--L-arabinofuranoside). Hợp chất này đã

được phân lập từ các loài Prunus spinosa L., Ceratonia siliqua L., Reynoutria

sachalinensis và một số loài thực vật khác [200, 201]. Song đây là lần đầu tiên hợp chất

được tìm thấy trong loài Cỏ sữa lá lớn và thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa tốt [202].


Vị trí Hợp chất Eup04 (CD3OD) Avicularin (CD3OD) [199]


C ppm 125 MHz


C ppm 100 MHz

2 158.6 159.3

3 134.9 134.9

4 180.0 180.0

5 163.1 163.0

6 6.23 (1H, d, 1.5) 99.9 6.23 (1H, s) 99.9

7 166.1 166.0

77

8 6.41 (1H, s) 94.8 6.41(1H, s) 94.8

9 159.4 158.5

10 105.6 105.6

1 123.0 123.1

2 7.54 (1H, s) 116.9 7.54 (1H, s) 116.4

3 146.4 146.3

4 149.9 149.8

5 6.92 (1H, d, 8.5) 116.5 6.92 (1H, d, 8.3) 116.8

6 7.51 (1H, d, 8.5) 123.1 7.51 (1H, d, 8.3) 123.0

1 5.49 (1H, s) 109.6 5.48 (1H, s) 109.5

2 4.35 (1H, d, 2.5) 83.3 4.35 (1H, d, 1.3) 83.3

3 3.89 (1H, t, 4.5) 78.7 3.93 (1H, m) 78.7

4 3.92 (1H, m) 88.1 3.95 (1H, dd, 8.3 và 3.8) 88.0

5 3.52 (2H, m) 62.6 3.55 (2H, m) 62.5

Hợp chất Eup05: astragalin

Hợp chất Eup05 thu được dưới dạng tinh thể màu vàng.

Trên phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD, phụ lục 5.1) của Eup05 xuất hiện cặp

tín hiệu mũi đôi tại δH 6.24 (d, J = 2.0 Hz) và δH 6.43 (d, J = 2.0 Hz) điển hình cho hai

proton ở vị trí C-6 và C-8 của vòng A của hợp chất flavonol. Cặp hai tín hiệu mũi đôi

khác tại δH 6.91 (d, J = 9.0 Hz) và δH 8.08 (d, J = 8.5 Hz) đặc trưng cho vòng thơm B

thế para. Tín hiệu proton anomer tại δH 5.27 (1H, d, J = 7.5 Hz) gợi ý trong Eup05 có

mặt 1 phần đường.

Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup04 và Eup05 được trình bày ở Hình 4.8

O

O

HO

OH

OH

OH

O

OOH

OHHO

2

36

78

9

510 4

1'

2'3'

4'

5'

6'

1''

2''

4''

5''

3''

Eup04: avicularin

O

OH

OH

O

OH

2

45

7

1'

1"

O OHOH

OHO

5'

3'

Eup05: astragalin

CH2OH6''


78

Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD, phụ lục 5.2) và DEPT (phụ lục 5.3) của

Eup05 xuất hiện tín hiệu của 21 nguyên tử carbon, trong đó có 6 tín hiệu tại δC [104.1

(C-1), 75.7 (C-2′′), 78.0 (C-3′′), 71.4 (C-4′′), 78.4 (C-5′′), 62.6 (C-6′′)] khẳng định sự

có mặt của phần đường glucose và tín hiệu của 15 nguyên tử carbon thuộc khung

flavonol có vòng B thế para. So sánh các dữ liệu phổ NMR của Eup05 với hợp chất

kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside thấy có sự phù hợp hoàn toàn [203]. Như vậy, có

thể nhận định hợp chất Eup05 là astragalin (kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside). Hợp

chất này có mặt phổ biến trong rất nhiều loài thực vật như Flaveria bidentis (L.) Kuntze,

Morus alba L., Acer truncatum, … [204-206] và thể hiện hoạt tính kháng viêm, kháng

oxi hóa tốt [205, 207].


Vị trí

Hợp chất Eup05 (CD3OD) Astragalin (CD3OD) [203]

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

δH ppm (J, Hz)

400 MHz

C ppm

100 MHz

2 163.1 162.8

3 135.5 135.7

4 179.6 179.5

5 161.6 161.5

6 6.24 (1H, d, 2.0) 99.9 6.22 (1H, s) 99.7

7 166.1 165.9

8 6.43 (1H, d, 2.0) 94.8 6.41 (1H, s) 94.9

9 159.1 159.2

10 105.8 105.7

1 122.8 122.6

2, 6 6.91 ( 2H, d, 9.0)

132.3 6.91 (2H, d, 8.5) 132.3

3, 5 8.08 (2H, d, 8.5) 116.1 8.07 (2H, d, 8.5) 116.1

4 158.5 158.5

Glucose

1 5.27 (1H, d, 7.5) 104.1 5.26 (1H, d, 7.2) 103.9

2 3.22 - 3.48 (4H, m) 75.7 3.46 (1H, dd, 10.4 và 3.6) 75.7

3 78.0 3.37 (1H, m) 77.9

79

4 71.4 3.24 (1H, m) 71.3

5 78.4 3.56 (1H, m) 78.4

6 3.70 (1H, dd, 12.0 và 2.3) 62.6 3.70 (2H, d, 11.5) 62.6

Hợp chất Eup08: luteolin

Hợp chất Eup08 tồn tại dưới dạng bột màu vàng. Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 6.3)

cho đỉnh ion giả phân tử [M-H] m/z = 285.0347 phù hợp với công thức phân tử C15H9O6

(lý thuyết: 285.0405)

Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, phụ lục 6.1) cho thấy sự xuất hiện của 6

proton vòng thơm phù hợp với phổ DEPT, thể hiện qua các tín hiệu đều xuất hiện ở

vùng trường thấp bao gồm: hai tín hiệu mũi đơn tại δH 6.44 (1H, s, H-8) và δH 6.19 (1H,

s, H-6) cho thấy vòng A có 2 proton ở vị trí meta. Tín hiệu mũi đơn H-3 ở δH 6.65 (1H,

s), các tín hiệu còn lại ở δH [6.90 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5); 7.40 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-

6); 7.39 (1H, s, H-2)] chứng tỏ vòng B có hai nhóm thế ở vị trí C-3 và C-4.

Phô 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, phụ lục 6.2) cho thấy sự xuất hiện tín hiệu

đặc trưng của hợp chất flavon bao gồm tín hiệu của 15 nguyên tử carbon, trong đó có 9

nguyên tử carbon bậc bốn và 6 nguyên tử carbon nhóm methine, tín hiệu của các nguyên

tử carbon này đều xuất hiện ở vùng trường thấp (δC > 95). Tín hiệu của 7 nguyên tử

carbon olefin mang oxy: 1 carbon nhóm carbonyl ở δC 182.1 (C-4), 6 nguyên tử carbon

bậc bốn ở δC [164.6 (C-2), 164.4 (C-7), 162.0 (C-5), 157.8 (C-9), 150.2 (C-4), 146.2

(C-3)]; ngoài ra còn có hai nguyên tử carbon bậc bốn khác ở 122.1 (C-1) và 104.2 (C-

10). Tín hiệu của 6 nhóm methine còn lại ở δC [119.4 (C-6), 116.5 (C-5), 113.9 (C-2),

103.4 (C-3), 99.3 (C-6) và 94.3 (C-8)].

Các dữ liệu phổ trên, cùng với việc so sánh với chất tham khảo trong tài liệu [208]

cho phép kết luận hợp chất Eup08 là luteolin. Cùng với các hợp chất flavonoid khác,

luteolin được xem là một trong những hợp chất quan trọng quyết định hoạt tính kháng

oxi hóa, kháng vi sinh vật, kháng ung thư. Hợp chất này cũng đã được phân lập từ nhiều

loài trước đó trong thiên nhiên [209].

80


Vị trí Hợp chất Eup08 (DMSO-d6) Luteolin (DMSO-d6) [208]


C ppm 150 MHz


C ppm 125 MHz

2 164.6 163.9

3 6.65 (1H, s) 103.4 6.67 (1H, s) 102.9

4 182.1 181.7

5 162.0 161.5

6 6.19 (1H, s) 99.3

6.19 (1H, d, 2.0) 98.9

7 164.4 164.2

8 6.44 (1H, s) 94.3 6.45 (1H, d, 2.0) 93.9

9 157.8 157.3

10 104.2 103.7

1 122.1 121.6

2 7.39 (1H, s) 113.9 7.42 (1H, m) 113.4

3 146.2 145.8

4 150.2 149.7

5 6.90 (1H, d, 8.4) 116.5 6.90 (1H, d, 8.0) 116.1

6 7.40 (1H, d, 8.4) 119.4 7.42 (1H, m) 119.0

5-OH 12.95 (1H, s) 12.98 (1H, s)

Hợp chất Eup09: quercetin

Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, phụ lục 7.1) của hợp chất Eup09 xuất hiện

các tín hiệu tại δH 6.88 (d, J = 9.0 Hz); 7.54 (d, J = 9.0 Hz) và 7.68 (s) gợi ý sự mặt của

hai nhóm thế vào vòng B ở vị trí C-3 và C-4. Trên phổ còn có sự hiện diện của hai tín

hiệu tại δH 6.19 (s) và δH 6.41 (s), là dấu hiệu nhận biết của một hợp chất flavonol.

Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, phụ lục 7.2) và DEPT (phụ lục 7.3) có tín

hiệu của 15 carbon, trong đó có tín hiệu δC 176.3 đặc trưng cho nhóm >C=O; năm nhóm

=CH– đặc trưng cho các =CH– nhân thơm ở δC [98.7 (C-6); 93.8 (C-8); 115.5 (C-2);

116.1 (C-5); 120.4 (C-6)]; 9 carbon bậc bốn, trong đó có sáu carbon bậc bốn kề nối đôi

và mang nhóm thế oxy tương ứng với các vị trí 2, 3, 5, 7, 9, 3, 4; tín hiệu carbon bậc

bốn có độ dịch chuyển tại δC 145.5; 147.3; 161.2; 164.4 đặc trưng cho dạng liên kết của

nhân thơm với nhóm –OH của các carbon C-3, C-4, C-5, C-7. Tại δC 103.5 và δC 122.4

là 2 tín hiệu đặc trưng cho carbon bậc bốn kề nối đôi >C= ứng với C-10 và C-1.

81

Dữ liệu phổ 1H-NMR kết hợp với phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất Eup09 có 5

nhóm =CH– thơm, đồng thời các nhóm thế vào vòng thơm là các nhóm –OH và 1 tín

hiệu của nhóm >C=O dự đoán được đây là đặc trưng cho hợp chất thuộc khung flavonol.

Phân tích các dữ kiện phổ NMR của Eup09 cùng với giá trị phổ HR-ESI-MS cho

đỉnh ion giả phân tử [M-H] m/z = 301.0388 (phụ lục 7.4) và kết hợp so sánh với các số

liệu phổ của hợp chất quercetin trong tài liệu công bố [210] thấy hoàn toàn phù hợp, từ

đó có thể kết luận hợp chất Eup09 là quercetin (3,3′,4′,5,7-pentahydroxyflavone). Hợp

chất này đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học đáng quý và tồn tại khá phổ

biến trong nhiều nguồn thực vật trong tự nhiên [211, 212].


Vị trí Hợp chất Eup09 (DMSO-d6) Quercetin (DMSO-d6) [210]


C ppm 150 MHz


C ppm 125 MHz

2 148.2 147.9

3 136.2 135.9

4 176.3 176.0

5 161.2 160.9

6 6.19 (1H, s) 98.7 6.17 (1H, d, 2.0) 98.4

7 164.4 164.1

8 6.41 (1H, s) 93.8 6.39 (1H, d, 2.0) 93.5

9 156.6 156.3

10 103.5 103.2

1 122.4 122.1

2 7.68 (1H, s) 115.5 7.66 (1H, d, 2.0) 115.2

3 145.5 145.2

4 147.3 147.0

5 6.88 (1H, d, 9.0) 116.1 6.87 (1H, d, 8.5) 115.8

6 7.54 (1H, d, 9.0) 120.4 7.53 (1H, dd, 8.0 và 2.0) 120.2

82

HO

OH O

O

OH

OH

Eup08: luteolin

O

OH

OH

OH

OOH

HO

Eup09: quercetin


Hợp chất Eup11: (+)-catechin

Hợp chất Eup11 thu được dưới dạng bột màu trắng ngà. Khác với các hợp chất

trên, phổ NMR của Eup11 gợi ý hợp chất này có cấu trúc dạng khung flavan-3-ol. Trên

phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD, phụ lục 8.1) có hai tín hiệu mũi đôi của hai proton

vòng thơm ghép cặp meta tại δH 5.95 (1H, d, J = 2.5 Hz); 5.88 (1H, d, J = 2.5 Hz) của

vòng A và ba tín hiệu mũi đôi khác đặc trưng cho ba proton vòng thơm B tại tại vị trí 1,

3, 4 tại δH 6.86 [(1H, d, Jmeta = 2.0 Hz, H-2); 6.79 (1H, d, Jorto = 8.0 Hz, H-5) và 6.74

(1H, dd, Jmeta và orto = 2.0/8.0 Hz, H-6)]. Ở phía trường cao hơn xuất hiện hai tín hiệu

cộng hưởng tại H 4.59 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-2) và H 4.01 (1H, m, H-3) đặc trưng cho

hai nhóm methine mang oxy; hai tín hiệu cộng hưởng tại H [2.89 (1H, dd, J = 16.0/5.5

Hz, H-4a); 2.55 (1H, dd, J = 16.0/8.5 Hz, H-4b)] thể hiện sự có mặt của một nhóm

methylene. Ngoài ra còn có các tín hiệu của 1 vòng benzene 4 lần thế tại 1, 2, 3, 5 ở δH

[5.95 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-8) và 5.88 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6)].

Tương ứng, trên phổ 13C-NMR và DEPT (phụ lục 8.2 và phụ lục 8.3) của Eup11

cho tín hiệu của 15 nguyên tử carbon, gồm 12 carbon của 2 vòng benzene, 2 carbon

nhóm oxymethine δC [82.9 (C-2) và 68.8 (C-3)] và 1 carbon methylene –CH2– tại [δC

28.5 (C-4)], không thấy xuất hiện nhóm carbonyl.

Trên phổ HMBC (phụ lục 8.4), proton methine ở δH 4.59 (1H, d, J = 8.0 Hz) cho

tương quan với 4 carbon vòng benzene gồm 2 carbon bậc ba ở δC 120.1 và δC 115.3, một

carbon bậc ba mang oxy ở δC 157.8 và 1 carbon bậc bốn ở δC 132.2 chứng tỏ proton này

phải là H-2, bốn carbon benzene lần lượt là C-6, C-2, C-9 và C-1. Ngoài ra, proton H-

2 còn cho tương quan HMBC với 1 carbon oxymethine ở δC 68.8 và một carbon

methylene ở δC 28.5 xác nhận hai carbon này lần lượt là C-3 và C-4. Proton H-4 cho

83

tương quan với 2 carbon bậc ba mang oxy ở δC 157.6 và δC 157.8 và một carbon bậc

bốn ở δC 100.9 khẳng định 3 carbon này lần lượt là C-5, C-9, và C-10.

Proton ở δH 5.95 (1H, d, J = 2.5 Hz) cho tương quan HMBC với C-9 chứng tỏ

proton này phải là H-8. Suy ra, proton ghép meta với H-8 ở δH 5.88 (1H, d, J = 2.0 Hz

là H-6. Proton H-6 ngoài tương quan với C-5, C-8, C-10 còn cho tương quan HMBC

với 1 carbon bậc ba mang oxy ở δC 156.9 nên carbon này là C-7. Proton vòng benzene

còn lại ở δH 6.79 (1H, d, J = 8.0 Hz) ghép ortho với H-6 chỉ có thể là H-5. Mặt khác,

proton H-6 cho tương quan với carbon bậc ba mang oxy ở δC 146.3 và proton H-2 cho

tương quan với carbon bậc ba mang oxy ở δC 146.2 trên phổ HMBC nên các carbon này

là C-4 và C-3. Phân tích hằng số ghép cặp J của proton H-2 ở H 4.59 (1H, d, J = 8.0

Hz) và hằng số ghép cặp của H-2 và H-3 là 3J2-3 = 8.0 Hz (ghép trục-trục), cho thấy 2

proton này phải nằm ở vị trí trục ứng với 1 trong 2 đồng phân:

(+)-catechin (-)-catechin

Từ những dữ liệu phổ nghiệm, kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo [213] hợp

chất Eup11 được đề nghị là catechin. Mặt khác, độ quay cực của Eup11 là [α]30 D + 25.7

(c 0.01, MeOH) phù hợp với tài liệu tham khảo [214], chứng tỏ hợp chất này là (+)-

catechin. Hợp chất này khá phổ biến trong tự nhiên với hoạt tính kháng oxi hóa mạnh

[215-217], nhưng đây là lần đầu tiên hợp chất được tìm thấy trong loài Cỏ sữa lá lớn.


Vị trí Hợp chất Eup11 (CD3OD) (+)-Catechin (CD3OD) [213]

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

HMBC

(H → C)

δH ppm (J, Hz)

400 MHz

C ppm

100 MHz

2 4.59 (d, 8.0) 82.9 C-3, 4, 9, 1',

2', 6'

4.58 (d, 6.7) 82.9

3 4.01 (m) 68.8 3.99 (m) 68.8

4 2.89 (dd, 5.5; 16.0)

2.55 (dd, 8.5; 16.0)

28.5 C-2, 3, 5, 9,

10

2.85 (dd, 5.5; 16.1)

2.52 (dd, 8.4; 16.1)

28.5

OHO

H

H

(S)

(R)

2

3

HO

HO

OH

OH

84

5 157.6 157.6

6 5.88 (d, 2.5) 95.5 C-5, 7, 8, 10 5.93 (d, 2.3) 96.3

7 157.8 157.8

8 5.95 (d, 2.5) 96.3 C-7, 9, 10 5.87 (d, 2.3) 95.6

9 156.9 156.9

10 100.9 100.9

1' 132.3 132.3

2' 6.86 (d, 2.0) 115.3 C-2, 4', 6' 6.85 (d, 2.0) 115.3

3' 146.3 146.3

4' 146.2 146.2

5' 6.79 (d, 8.0) 116.1 C-1', 3' 6.77 (d, 8.1) 116.2

6' 6.74 (dd, 2.0; 8.0) 120.1 C-2, 2', 4' 6.72 (dd, 2.0; 8.1) 120.1

Hợp chất Eup14: afzelin

Hợp chất Eup14 thu được dưới dạng chất rắn màu vàng. Dữ liệu phổ 1D-NMR,

2D-NMR cho thấy có sự giống nhau với các hợp chất Eup01 và Eup15 ở các tín hiệu

vòng thơm của khung flavonoid và các tín hiệu của đường α-L-rhamnopyranosyl. Phổ

1H-NMR hợp chất Eup14 (500 MHz, CD3OD, phụ lục 9.1) xuất hiện tín hiệu của 2

proton vòng thơm 4 lần thế tại δH [6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6); 6.39 (1H, d, J = 2.0

Hz, H-8)] của vòng A và bốn proton vòng thơm thế ở vị trí para tại δH [7.78 (2H, d, J =

8.25 Hz, H-2, H-6); 6.95 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-3, H-5)] của vòng C. Ngoài ra, tín hiệu

của phân tử đường cũng được xác định khi tín hiệu của một proton anomer xuất hiện tại

δH 5.39 (1H, d, J = 1.5 Hz), tín hiệu proton của nhóm methyl tại δH 0.94 (3H, d, J = 5.5

Hz) và các tín hiệu của các nhóm oxymethine xuất hiện tại vùng δH 3.34-4.24. Dữ liệu

phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD, phụ lục 9.2) phù hợp với dữ liệu phổ 1H-NMR khi

xuất hiện nhiều carbon thơm có gắn với nhóm hydroxyl, một nhóm carboxyl tại δC 179.6

(C-4), một nhóm methyl tại δC 17.7 (C-6). Xem xét trên phổ HMBC (phụ lục 9.3) thấy

có tương quan giữa proton anomer H-1 tại δH 5.39 với carbon C-3 tại δC 136.2, chứng

tỏ cấu tử đường được gắn vào vị trí C-3 của khung flavonoid.

85


Vị trí Hợp chất Eup14 (CD3OD) Afzelin (CD3OD) [218]

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

HMBC

(H → C)

δH ppm (J, Hz)

400 MHz

C ppm

100 MHz

2 158.6 158.6

3 136.2 136.2

4 179.6 179.4

5 163.2 163.2

6 6.22 (1H; d; 2.0) 99.9 C-5, 7, 8, 10 6.19 (2H; d; 2.44) 100.1

7 166.0 166.6

8 6.39 (1H; d; 2.0) 94.8 C-6, 7, 9, 10 6.36 (1H; d; 2.2) 94.9

9 159.3 159.2

10 105.9 105.7

1' 122.7 122.6

2, 6 7.78 (2H; d; 8.25) 131.9 C-3, 5, 2,

6, 4, 2 7.76 (2H; d; 8.76) 131.9

3, 5 6.95 (2H; d; 8.5) 116.5 C-3, 5, 4, 1 6.93 (2H; d; 8.88) 116.5

4' 161.6 161.6

1 5.39 (1H; d; 1.5) 103.5 C-3 5.36 (1H; d; 2.2) 103.5

2 4.24 (1H; dd; 3.5 và

1.5) 72.2

4.21 (1H; dd; 3.42

và 1.7) 72.1

3 3.73 (1H; dd; 9.0 và

3.5) 72.0 3.71 (1H; m) 72.0

4 3.34 (1H; m) 73.2 3.60 (1H; m) 73.2

5 3.34 (1H; m) 71.9 3.47 (1H; m) 71.9

6 0.94 (3H; d; 5.5) 17.7 0.91 (3H; d; 5.6) 17.7

Kết hợp với tài liệu tham khảo [218], hợp chất Eup14 tương ứng với công thức

phân tử C21H20O10 và được xác định là afzelin. Đây là một flavonoid phân lập được từ

nhiều loại thực vật trong thiên nhiên như loài Pinus koraiensis, Cornus macrophylla với

hoạt tính kháng khuẩn Pseudomonas aeruginosa hiệu quả, hay từ lá của loài Kalanchoe

tomentosa với khả năng gây độc tế bào trên dòng tế bào P-388 gây bệnh bạch cầu [218-

220].

86

Tương quan HMBC trong vòng B và vòng A của Eup14 được minh hoạ ở Hình

4.10 và Hình 4.11

O

OOH

HO

OH

2

4

63

1'

2'

6'

5'

4'3'

10

9

8

7

5

H

H

H

H

Hình 4.10 Tương quan HMBC trong vòng B của hợp chất Eup14

O

OO

HO

2

46

310

9

8

7

5H

H

H

Hình 4.11 Tương quan HMBC trong vòng A của hợp chất Eup14

Hợp chất Eup15: myricitrin

Hợp chất Eup15 thu được dưới dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy là 197-

199ºC (MeOH). Các phổ NMR của hợp chất Eup15 có dạng phổ của một hợp chất

flavonoid glycoside: hai tín hiệu mũi đôi đặc trưng cho 2 proton ghép meta tại δH [6.24

(1H, d, J = 2 Hz); 6.40 (1H, d, J = 2 Hz)] trên phổ 1H- NMR (500 MHz, CD3OD, phụ

lục 10.1) và tương ứng với tín hiệu của 2 nguyên tử carbon tại δC 99.8 và 94.7 trên phổ

HSQC (phụ lục 10.5), đặc trưng cho sự có mặt của hai proton ở vị trí 6 và 8 của vòng

A. Hơn nữa, trên phổ HSQC tín hiệu của 2 proton thơm khác tại δH 6.99 (2H, s, H-2,

H-6) tương quan với tín hiệu =CH– tại δC 109.6 có cường độ tích phân cao gấp đôi các

tín hiệu =CH– khác trên phổ HSQC tại δC 109.6 đặc trưng cho 2 proton ở vị trí C-2 và

C-6 của vòng B đã bị thế 4 vị trí. Ngoài ra, trên phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD, phụ

lục 10.2) có một tín hiệu carbon của nhóm carbonyl tại δC 179.6 (C-4). Các tín hiệu

proton nằm trong vùng δH 3.33-4.23 trên phổ 1H-NMR cùng với sự xuất hiện một tín

hiệu mũi đơn của proton anomer tại δH 5.36 (1H, s) và một tín hiệu mũi đôi của nhóm

methyl tại δH 1.00 (3H, d, J = 6.0 Hz) cho thấy sự có mặt của một cấu tử đường α-L-

rhamnopyranosyl. Mối tương tác giữa C-3 (δC 136.2) với proton anomer trên phổ

HMBC (phụ lục 10.4) chứng tỏ cấu tử đường được gắn vào khung flavonoid tại vị trí

87

C-3. Các dữ liệu phổ NMR phù hợp với công thức phân tử C21H20O12. Dựa vào các kết

quả phổ NMR đã phân tích và đối chiếu với tài liệu tham khảo [221] xác định hợp chất

Eup15 là myricitrin (myricetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside). Hợp chất này thể hiện

nhiều hoạt tính sinh học quan trọng như kháng oxi hóa, kháng viêm, khả năng bảo vệ

gan và cũng được phân lập trước đó từ nhiều loài thực vật như Myrcia splendens, Myrcia

palustris, Syzygium samarangense…[222-224].


Vị trí Hợp chất Eup15 (CD3OD) Myricitrin (CD3OD) [221]

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

2 159.3 159.2

3 136.2 136.2

4 179.6 179.5

5 163.2 163.1

6 6.24 (1H, d, 2.0) 99.8 6.17 (1H, d, 2.0) 100.3

7 166.8 167.4

8 6.40 (1H, d, 2.0) 94.7 6.32 (1H, d, 2.0) 95.0

9 158.4 158.6

10 105.6 105.5

1' 121.9 121.9

2, 6 6.99 (1H, s) 109.6 6.96 (1H, br s) 109.6

3, 5 146.9 146.9

4 137.9 138.0

1 5.36 (1H, s) 103.5 5.33 (1H, br s) 103.6

2 4.23 (1H, s) 71.8 4.24 (1H, br s) 71.9

3 3.81 (1H, dd, 9.3 và 3.3) 72.1 3.81 (1H, d, 7.5) 72.0

4 3.33 (1H, m) 73.3 3.36 (1H, m) 73.4

5 3.52 (1H, m) 72.0 3.54 (1H, m) 72.1

6 1.00 (3H, d, 6.0) 17.8 0.99 (3H, d, 6.5) 17.7

88

Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup11, Eup14 và Eup15 được trình bày ở Hình 4.12

OHO

OH

OH

2

5

6

7

89

10

1'

2'3' 4'

5'

6'

OH

OH

Eup11: (+)-catechin

O

OHHO

HOH3C

(Eup14: afzelin): R1 = R2 = H

(Eup15: myricitrin): R1 = R2 = OH

OHO

OH

R1

OH

O

2

45

6

7

89

10

1'

2'

3'4'

5'

6'

O

R2

Hình 4.12 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup11, Eup14 và Eup15

Hợp chất Eup19: hymenoxin

Phô 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, phụ lục 11.1) xuất hiện tín hiệu của 18

proton. Trong vùng từ trường thấp xuất hiện 1 tín hiệu proton của nhóm –OH kềm nối

tại δH 12.74 (s, 1H, 5-OH); 4 tín hiệu proton tại δH [7.68 (1H, dd, J = 9.0/2.0 Hz, H-6');

7.56 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'); 7.18 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-5') và 6.97 (1H, s, H-3)]. Ngoài

ra còn có tín hiệu mũi đơn của nhóm –OH ở vị trí 7 tại δH 10.45 (s), và ở vùng từ trường

cao hơn, tại δH 3.78-3.88 có 4 tín hiệu proton đặc trưng của 4 nhóm methoxy.

Phô 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, phụ lục 11.2) kết hợp với phổ DEPT (phụ

lục 11.3) xuất hiện tín hiệu 15 carbon của khung flavon (trong đó có δC từ 103.0 đến

182.3) và bốn nhóm methoxy (δC tư 55.7 đến 61.2) tương thích với phổ proton đã phân

tích.

Khung flavon gồm 1 carbon carbonyl tại δC 182.3 (C-4); 10 carbon bậc bốn khác

tại δC [123.0 (C-1'); 150.9 (C-3'); 149.0 (C-4'); 163.0 (C-2); 148.3 (C-5); 131.5 (C-6),

152.2 (C-7), 127.9 (C-8), 145.4 (C-9), 103.0 (C-10)]; ngoài ra còn 2 nhóm –OH gắn lần

lượt trên C-5 (148.3) và C-7 (152.2).

Trên phổ HMBC (phụ lục 11.4) nhận được các tương quan của proton tại δH 6.97

với các carbon tại δC 163.0 (C-2) và δC 182.3 (C-4); proton tại δH 12.74 với các carbon

tại δC 103.0 (C-10) và δC 131.5 (C-6) cũng chứng minh 2 proton này lần lượt là H-3 và

H-5. Ngoài ra, proton tai vong B chiu anh hương cua nhom methoxy nên tın hiêu dao

đông ơ vung tư trương thâp (δH tư 7.18 đên 7.56), proton tai δH 6.97 găn vơi C-3 tương

89

quan với nhom carbonyl nên dich chuyên vê vung trương thâp hơn so vơi bınh thương.

Nhóm proton tại δH 7.68 (H-6) tương quan với carbon tại δC 163.0 (C-2) của vòng C và

tại δC 149.0 (C-3) trên vòng B kế cạnh. Bên cạnh đó, proton tại δH 7.56 (1H, d, 2.0 Hz,

H-2) xuất hiện tương quan lần lượt với carbon tại δC 149.0 (C-3) và δC 119.8 (C-6).

Tư nhưng dư liêu trên, so sánh với tài liệu đã công bố [225] co thê xac đinh hơp

chât Eup19 la hymenoxin (5,7-dihydroxy-6,8,3',4'-tetramethoxyflavone). Hợp chất này

cũng đã được phân lập trước đó từ các loài Viguiera decurrens, V. rosei, V. hypargyrea,

Limnophila heterophylla và Hymenoxys scaposa với hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm

[225, 226]. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được tìm thấy trong loài Cỏ sữa lá lớn.


Vị trí Hợp chất Eup19 (DMSO-d6) Hymenoxin (DMSO-d6) [225]


C ppm 125 MHz


C ppm 125 MHz

2 163.0 163.0

3 6.97 (1H, s) 103.3 6.98 (s) 103.3

4 182.3 182.3

5 148.3 148.3

6 131.5 131.6

7 152.2 151.1

8 127.9 128.0

9 145.4 145.5

10 103.0 102.8

1 123.0 123.0

2 7.56 (1H, d, 2.0) 109.2 7.57 (d, 2.0) 109.2

3 149.0 149.0

4 150.9 152.1

5 7.18 (1H, d, 9.0) 111.9 7.18 (d, 8.0) 111.9

6 7.68 (dd, 9.0 và 2.0) 119.8 7.68 (dd, 2.8) 119.8

6-OMe 3.78 (s) 60.1 3.79 (s) 60.1

8-OMe 3.85 (s) 61.2 3.86 (s) 61.1

3′-OMe 3.88 (s) 55.7 3.89 (s) 55.7

4′-OMe 3.88 (s) 55.7 3.89 (s) 55.7

5-OH 12.74 (s) 12.76 (s)

90

Hợp chất Eup21: cynaroside

Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (phụ lục 12.1 và 12.2) cho thấy phần aglycon

của Eup21 có khung sườn dạng luteolin với 15 carbon.

Phổ 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, phụ lục 12.2) cho một tín hiệu đặc trưng tại

δC 99.9 – tín hiệu của carbon acetal C-1 của phân tử đường. Phổ DEPT 90 (phụ lục

12.3) xuất hiện 5 mũi ở các vị trí δC [73.0; 76.3; 69.5; 77.1; 60.6]; kết hợp với dữ liệu

phổ HMBC, HSQC và TOCSY (phụ lục 12.4, 12.5 và 12.6) cho biết đó là 5 nhóm

>CH–OH của gốc đường. Với độ dịch chuyển hóa học của các carbon vòng đường

C-1′′>C-5′′>C-3′′>C-2′′>C-4′′>C-6′′ cho biết đây là đường D-glucose kết hợp với tín

hiệu proton anomer có J = 7.2 Hz (ghép dạng trục-trục trên vòng đường của H-1′′ và H-

2′′) cho thấy đơn vị đường glucose có cấu hình β. Phổ HMBC cho thấy có sự tương tác

giữa proton H-1 với C-7 trong khung aglycon. Vậy trong phân tử Eup21 có 1 đơn vị

đường β-glucose gắn vào khung aglycon ở vị trí C-7.

Từ các dữ liệu phổ và so sánh với tài liệu đã công bố [227] giúp nhận danh được

hợp chất Eup21 là luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside (cynaroside). Hợp chất này thể

hiện hoạt tính kháng oxi hóa tốt, kháng khuẩn Salmonella typhimurium và Serratia

marcescens hiệu quả, được phân lập trước đó từ nhiều loài thực vật trong thiên nhiên

như Cynara scolymus L., Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm., Vitex agnus-castus L.

[228-230], song đây là lần đầu tiên hợp chất được tìm thấy trong loài Cỏ sữa lá lớn.

Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup19 và Eup21 được trình bày ở Hình 4.13

O

OMe

OMeOMe

HO

MeO

OH O

2

45

78

6

9

3'

4'

6'

1'

Eup19: hymenoxin

4

OH O

O

OH

OH

Eup21: cynaroside

2

7

5

1'

3'4'

1''

OHO

HOOH

O

OH


91


Vị trí Hợp chất Eup21 (CD3OD) Cynaroside (CD3OD) [227]

δH ppm (J, Hz)

600 MHz

C ppm

150 MHz

HMBC

(H → C)

δH ppm (J, Hz)

600 MHz

C ppm

150 MHz

2 164.4 164.6

3 6.61 (1H, s) 103.1 6.59 (1H, s) 103.0

4 181.8 181.9

5 161.1 161.1

6 6.50 (1H, d, 2.4) 99.5 C-5, 7, 8, 10 6.49 (1H, d, 2.2) 99.5

7 162.9 162.9

8 6.80 (1H, d, 2.4) 94.6 C-6, 7, 9, 10 6.78 (1H, d, 2.2) 94.7

9 156.9 157.0

10 105.3 105.3

1' 121.3 120.9

2' 7.41 (1H, d, 1.8) 113.5 C-2, 3', 4', 6' 7.39 (1H, d, 2.3) 113.3

3' 145.7 146.0

4' 149.8 150.6

5' 6.91 (1H, d, 8.4) 115.9 C- 1', 3', 4' 6.90 (1H, d, 8.3) 116.0

6' 7.42 (1H, dd, 8.4 và 1.8) 119.1 C-2, 1', 2', 4'

7.40 (1H, dd, 8.3 và 2.3)

119.3

1 5.07 (1H, d, 7.2) 99.9 C-7, 5' 5.06 (1H, d, 7.5) 99.8

2 3.50 (1H, m, 9.2 và 7.2)

73.0 3.50 (1H, m, 9.5 và 7.5)

73.1

3 3.50 (1H, m, 9.2 và 9.0)

76.3 3.50 (1H, m, 9.5 và 9.0)

76.4

4 3.41 (1H, t, 9.6 và 9.0)

69.5 3.41 (1H, t, 9.7 và 9.0)

69.5

5 3.55 (1H, m, 9.6; 6.0 và 2.4)

77.1 3.54 (1H, m, 9.7; 5.8 và 2.3)

77.1

6 3.93 (1H, dd, 12.0 và 2.4); 3.72 (1H, dd, 12.0 và 6.0)

60.6 3.94 (1H, dd, 12.0 và 2.3); 3.73 (1H, dd, 12.0 và 5.8)

60.6

92

Các hợp chất phenol

Hợp chất Eup10: caffeic acid

Hợp chất Eup10 tồn tại dưới dạng chất rắn vô định hình màu vàng. Phổ HR-ESI-

MS (phụ lục 14) cho tín hiệu ion giả phân tử [M-H] m/z = 179.0614 phù hợp với công

thức phân tử C9H7O4 (lý thuyết: 179.0350).

Dữ liệu phổ NMR (phụ lục 13) của hợp chất Eup10 xác nhận trong cấu trúc

Eup10 mang 1 vòng benzene 3 nhóm thế tại vị trí –1, 2, 4, một liên kết đôi cấu hình

trans và một nhóm carboxyl. Cấu hình trans của liên kết đôi được xác nhận bằng giá trị

J của proton olefin. Hai proton olefin cho tương quan HMBC với carbon carboxyl cho

thấy hợp chất mang nhánh (1E)-propenoyl-3-oic, và nhóm này được gắn vào vòng

benzene dựa trên tương quan trong phổ HMBC giữa proton olefin với carbon bậc bốn.

Phân tích chi tiết hằng số ghép của các proton vòng benzene ba nhóm thế và dựa trên độ

dịch chuyển hóa học của C-3 và C-4, các nhóm thế là các nhóm hydroxyl. Từ các phân

tích trên có thể kết luận hợp chất Eup10 là caffeic acid phù hợp với tài liệu công bố

[231]. Hợp chất này đã được chứng minh có hoạt tính kháng oxi hóa, tác dụng chống

tăng sinh tế bào ung thư và cũng hiện diện khá phổ biến từ các loài thực vật [232-234].


Vị trí Hợp chất Eup10 (DMSO-d6) Caffeic acid (DMSO-d6) [231]

δH ppm (J, Hz)

600 MHz

C ppm

150 MHz

δH ppm (J, Hz)

600 MHz

C ppm

150 MHz

1 126.2 125.7

2 7.02 (1H, s) 115.1 7.02 (1H, d, 1.8) 115.1

3 146.0 145.7

4 148.6 148.4

5 6.76 (1H, d, 8.4) 116.2 6.76 (1H, d, 7.8) 115.4

6 6.96 (1H, d, 8.4) 121.6 6.97 (1H, dd, 7.8 và 1.8) 121.4

7 7.41 (1H, d, 15.6) 145.0 7.43 (1H, d, 16.2) 144.9

8 6.17 (1H, d, 15.6) 115.6 6.18 (1H, d, 16.2) 115.8

9 168.3 168.0

93

Hợp chất Eup12: protocatechuic acid

Hợp chất Eup12 thu được dưới dạng bột màu nâu.

Các dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, acetone-d6, phụ lục 14.1) và 13C-NMR

(125 MHz, acetone-d6, phụ lục 14.2) cho biết Eup12 là một acid phenolic đơn giản.

Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất Eup12 có 7 carbon trong đó có 6 carbon vòng

thơm và 1 carbon của nhóm carboxyl tại δC 167.6 (C-7). Trong 6 carbon vòng thơm có

2 carbon bậc bốn gắn oxy tại δC 145.6 (C-3) và δC 150.7 (C-4).

Phổ 1H-NMR cho thấy ba tín hiệu proton của Eup12 xuất hiện tại δH [7.53 (1H,

d, J = 2.0 Hz, H-2); 6.90 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5) và 7.48 (1H, dd, J = 8.5/2.0 Hz, H-

6)].

Từ các dữ liệu phổ thu được có thể kết luận Eup12 có ba nhóm thế trong vòng

benzene trong đó có một nhóm carboxyl và hai nhóm hydroxyl, kết hợp tài liệu tham

khảo [235], có thể xác định Eup12 là protocatechuic acid. Hợp chất này đã được các

nhà khoa học Ấn Độ nghiên cứu về hoạt tính kháng oxi hóa, kháng vi sinh vật, kháng

ung thư và được phân lập từ Helianthemum sessiliflorum Pers., Cinnamomum

aromaticum, Hibiscus sabdariffa …[236, 237].


Vị trí Hợp chất Eup12 (acetone-d6) Protocatechuic acid (acetone-d6) [235]

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

δH ppm (J, Hz)

600 MHz

C ppm

150 MHz

1 123.1 123.2

2 7.53 (1H, d, 2.0) 117.5 7.53 (1H, d, 2.0) 117.6

3 145.6 145.5

4 150.7 150.6

5 6.90 (1H, d, 8.5) 115.7 6.90 (1H, d, 8.3) 115.8

6 7.48 (1H, dd, 8.5 và 2.0) 123.6 7.48 (1H, dd, 8.3 và 2.0) 123.7

7 167.6 167.7

94

Hợp chất Eup13: gallic acid

Hợp chất Eup13 thu được dưới dạng chất rắn không màu, nhiệt độ nóng chảy

237–239ºC (MeOH).

Trên phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD, phụ lục 15.1) xuất hiện duy nhất một tín

hiệu mũi đơn ở vùng thơm tại δH 7.08 (2H, s) cho thấy hợp chất Eup13 có chứa vòng

thơm 4 lần thế có trục đối xứng. Trên phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD, phụ lục 15.2)

xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 6 nguyên tử carbon thuộc vòng thơm bao gồm 2 nhóm

=CH– và 4 carbon bậc bốn, bên cạnh đó có một tín hiệu cộng hưởng của một nguyên tử

carbon thuộc nhóm carbonyl tại δC 170.6 (C-7). Tín hiệu cộng hưởng của =CH– tại δC

110.3 (C-2, C-6) và của carbon bậc bốn tại δC 146.4 (C-3, C-5) có cường độ tích phân

cao gấp đôi các tín hiệu cộng hưởng khác, điều này khẳng định lại hợp chất Eup13 chứa

một vòng thơm 4 lần thế có trục đối xứng, trong đó có một nhóm thế carboxyl. So sánh

dữ liệu phổ của hợp chất Eup13 với tài liệu tham khảo [238], cho phép kết luận hợp

chất Eup13 là gallic acid. Hợp chất này cũng đã được phân lập trước đó từ loài

Helianthemum sessiliflorum Pers., Leea rubra Blume ex Spreng và được nghiên cứu

khá nhiều về hoạt tính kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng ung thư [236,

239, 240].

HO

HO

Eup10: caffeic acid

COOH

HO

OH

OH

O

Eup12: protocatechuic acid

O

OH

OH

HO

HO

Eup13: gallic acid

Hình 4.14 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup10, Eup12 và Eup13


Vị trí Hợp chất Eup13 (CD3OD) Gallic acid (CD3OD) [238]

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

1 122.3 122.0

2 7.10 (1H, s ) 110.3 7.00 (1H, s ) 110.4

3 146.4 146.5

4 139.5 13 x9.7

95

5 146.4 146.5

6 7.10 (1H, s ) 110.3 7.00 (1H, s ) 110.4

7 COOH 170.6 170.5

Các hợp chất triterpenoid

Hợp chất Eup06: taraxerol

Hợp chất Eup06 thu được dưới dạng bột vô định hình không màu.

Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, phụ lục 16.1), H (ppm) của hợp chất Eup06

cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với sự hiện diện của 1 proton carbinol >CH-OH tại H

[3.19 (1H, dd, J = 10.5 và 3.5 Hz, H-3)], 1 proton olefin bậc ba =CH– tại H [5.53 (1H,

dd, J = 8.5 và 3.5 Hz, H-15)], 3 nhóm methine >CH– tại H [1.40 (1H, m, H-9); 0.96

(1H, m, H-18) và 0.78 (1H, dd, J = 11.5 và 2.5 Hz, H-5)], 8 nhóm methyl –CH3 ở H

0.80-1.09, và 10 nhóm methylene –CH2– ở H 0.80-2.10.

Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, phụ lục 16.2), C (ppm): cho thấy có hai tín

hiệu tại C 158.1; 116.9 lần lượt thuộc về liên kết đôi tại các vị trí C-14; C-15 và tín hiệu

cộng hưởng của một nhóm oxymethine tại C 79.0. Phổ DEPT (phụ lục 16.3) cho thấy

hợp chất Eup06 có 30 carbon trong đó có: 10 nhóm methylene (–CH2–), 5 nhóm methine

(–CH=), 8 nhóm methyl (–CH3) và 7 carbon bậc bốn.

Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và HSQC (phụ lục 16.5) cho phép dự đoán

Eup06 là một triterpen 5 vòng, có khung căn bản là taraxerane mang 1 liên kết đôi và 1

nhóm –OH. Các hằng số ghép spin của H-3 (J = 10.5 và 3.5 Hz) cho thấy nhóm hydroxyl

ở C-3 có cấu hình β.

Cấu trúc hợp chất Eup06 được xác nhận trên phổ HMBC (phụ lục 16.4) như sau:

+ Hai nhóm methyl C-29 và C-30 cho tương quan với nhau, đồng thời tương quan

với 1 carbon bậc bốn ở C 28.8 (C-20) và 2 carbon methylene ở C 35.1 (C-19) và C

33.7 (C-21).

+ Hai tín hiệu cộng hưởng của proton nhóm methyl H3-26 ở H 0.82 và H3-27 ở

H 1.09 cùng cho tương quan với carbon olefin bậc bốn ở C 158.1. Bên cạnh đó, proton

H3-26 có thêm tương quan với C-8 và carbon methine C-9; proton H3-27 có thêm tương

quan với carbon bậc bốn ở C-13, carbon methine ở C-18 và carbon methylene ở C-12.

96

Đồng thời, proton olefin ở H 5.53 cũng cho tương quan với 3 carbon bậc bốn C-8, C-

13 và carbon ở C-17 cho thấy nối đôi phải ở vị trí C-14 và C-15.

+ Proton methyl H3-28 ở H 0.91 cho tương quan với 4 carbon gồm 1 carbon bậc

bốn ở C-17, 1 carbon methine ở C-18 và 2 carbon methylene ở C-16 và C-22.

+ Proton methyl H3-25 ở H 0.92 cho tương quan với 1 carbon bậc bốn ở C-10, 2

carbon methine ở C-9 và C-5 và 1 carbon methylene ở C-1.

+ Hai nhóm methyl C-23 và C-24 cho tương quan với nhau, đồng thời cho tương

quan với 3 carbon ở C-4, C-5 và carbon carbinol ở C 79.1 khẳng định nhóm –OH gắn

vào carbon C-3.

Hình 4.15 Tương quan HMBC của hợp chất Eup06

Từ các biện luận trên kết hợp tài liệu tham khảo [241], đề nghị hợp chất Eup06

là taraxerol. Đây là hợp chất chiếm hàm lượng nhiều trong Cỏ sữa lá lớn, hợp chất này

đã được chứng minh có nhiều tiềm năng kháng ung thư, trị bệnh đái tháo đường và trước

đó cũng được phân lập từ nhiều loài thực vật trong tự nhiên [242-244].


Vị trí

Hợp chất Eup06 (CDCl3) Taraxerol (CDCl3) [241]

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

HMBC

(H → C)

δH ppm (J, Hz)

400 MHz

C ppm

100 MHz

1 1.63 (m); 0.97 (m) 37.7 C-3, 10 37.8

2 1.61 (m) 27.1 C-1, 3 27.2

3 3.19 (dd, 10.5 và 3.5) 79.1 3.19 (dd, 11.2 và 4.4)

79.1

4 38.7 39.0

5 0.78 (dd, 11.5 và 2.5) 55.5 C-3, 4, 23 55.6

6 1.62 (m); 1.47 (m) 18.8 C-10 18.8

97

7 2.03 (td, 12.5 và 3.0); 1.38 (m)

41.3 C-9 41.4

8 39.0 38.8

9 1.40 (m) 49.3 C-1, 10, 11, 25, 26

48.8

10 37.5 37.6

11 1.63 (m); 1.49 (m) 17.5 17.5

12 1.32 (m); 0.97 (m) 37.7 C-18 37.8

13 35.8 35.8

14 158.1 158.1

15 5.53 (dd, 8.5 và 3.5) 116.9 C-8, 13, 16, 17 5.53 (dd; 3.6 và 7.6 Hz)

116.9

16 1.91 (dd, 14.5 và 3.0); 1.58 (m)

36.7 C-14, 15 36.7

17 38.0 38.0

18 0.96 (m) 48.7 C-12, 13, 16, 17, 19, 20, 22, 27, 28

49.3

19 1.38 (m); 1.02 (m) 35.1 C-18, 21 35.2

20 28.8 28.8

21 1.62 (m); 1.54 (m) 33.7 C-17, 22, 30 33.7

22 1.38 (m); 1.27 (m) 33.1 C-16, 18, 28 33.1

23 0.97 (s) 28.0 C-3, 4, 5, 24 0.98 (s) 28.0

24 0.80 (s) 15.4 C-3, 4, 5, 23 0.80 (s) 15.5

25 0.92 (s) 15.4 C-1, 5, 9, 10 0.93 (s) 15.4

26 0.82 (s) 29.8 C-7, 8, 9, 14 0.82 (s) 29.9

27 1.09 (s) 25.9 C-12, 13, 14, 18 1.09 (s) 25.9

28 0.91 (s) 29.9 C-16, 17, 18, 22 0.91 (s) 29.9

29 0.95 (s) 33.3 C-19, 20, 21, 30 0.95 (s) 33.4

30 0.91 (s) 21.3 C-19, 20, 21, 29 0.91 (s) 21.3

Hợp chất Eup07: taraxerone

Tương tự như ở hợp chất Eup06, các phổ NMR của hợp chất Eup07 cũng có

dạng phổ của một hợp chất triterpen.

Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, phụ lục 17.1), δH (ppm): cho thấy 08 tín hiệu

của nhóm methyl tại δH [0.83 (3H, s, H-26); 0.91 (3H, s, H-30); 0.92 (3H, s, H-28); 0.96

(3H, s, H-29); 1.07 (3H, s, H-24); 1.08 (3H, s, H-25); 1.09 (3H, s, H-23); 1.14 (3H, s,

98

H-27)]. Độ dịch chuyển hóa học ở δH 5.56 (1H, dd, J = 8.5 và 3.5 Hz) là của proton của

nhóm =CH– tại C-15.

Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, phụ lục 17.2), δC (ppm): cho tín hiệu ở trường

rất yếu tương ứng với độ dịch chuyển hóa học tại C 217.5 đặc trưng cho carbon nhóm

carbonyl tại vị trí C-3.

Phổ DEPT (phụ lục 17.3) cho tín hiệu của 10 nhóm –CH2–, 04 nhóm –CH=, 08

nhóm –CH3 và 08 carbon bậc bốn. Như vậy, có thể kết luận rằng hợp chất này là một

triterpen.

Từ những phân tích dữ liệu phổ và so sánh với tài liệu tham khảo [245], cho phép

kết luận hợp chất Eup07 là taraxerone. Tương tự như hợp chất taraxerol, taraxerone

cũng được phân lập từ một số loài thực vật khác trong thiên nhiên và có nhiều hoạt tính

sinh học đáng quý như kháng oxi hóa. Ngoài ra, hợp chất này đã được nghiên cứu in

vitro cho thấy hoạt tính chống bệnh sốt đen do ký sinh trùng Leishmania donovani (AG

83) gây bệnh, hoạt tính chống lại thể hoạt động của ký sinh trùng Giardia lamblia và

hoạt tính chống khối u đối với dòng tế bào bạch cầu K562 [246-248].


Vị trí

Hợp chất Eup07 (CDCl3) Taraxerone (CDCl3) [245]

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

δH ppm (J, Hz)

400 MHz

C ppm

100 MHz

1 38.4 38.5

2 34.1 34.4

3 217.5 217.0

4 47.6 47.8

5 55.8 56.0

6 20.0 20.2

7 35.1 35.3

8 38.9 39.1

9 48.8 48.9

10 37.7 37.9

11 17.5 17.7

12 35.8 36.0

13 37.6 37.8

14 157.6 157.8

99

15 5.56 (1H, dd, 8.5 và 3.5) 117.2 5.56 (1H, dd, 8.0 và 3.0) 117.4

16 36.7 36.9

17 37.8 37.9

18 48.7 49.0

19 40.7 40.8

20 28.8 29.0

21 33.6 33.8

22 33.1 33.3

23 1.09 (s) 26.1 1.09 (s) 26.3

24 1.07 (s) 21.5 1.07 (s) 21.7

25 1.08 (s) 14.8 1.08 (s) 15.0

26 0.83 (s) 29.7 0.83 (s) 30.1

27 1.14 (s) 25.6 1.14 (s) 25.8

28 0.92 (s) 29.9 0.92 (s) 30.2

29 0.96 (s) 33.4 0.96 (s) 33.6

30 0.91 (s) 21.4 0.91 (s) 21.2

Hợp chất Eup17: cycloart-23-ene-3β,25-diol

Hợp chất Eup17 thu được dưới dạng tinh thể hình kim không màu.

Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, phụ lục 18.1) của hợp chất Eup17 cho các

tín hiệu cộng hưởng ứng với sự hiện diện của 1 proton carbinol >CH-OH tại δH [3.08

(1H, m, H-3)]; 2 proton olefin bậc ba =CH– tại δH [5.52 (1H, m, H-23), 5.50 (1H, m, H-

24)]; 4 proton >CH– [1.56 (1H, m, H-17); 1.52 (1H, m, H-8); δH 1.47 (1H, m, H-20);

1.31 (1H, m, H-5)]; 7 proton –CH3 ở δH [1.17 (2x3H, s, H-26, H-27); δH 0.95 (3H, s, H-

29); 0.89 (3H, s, H-18) ; 0.86 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-21); 0.87 (3H, s, H-28 ); 0.73 (3H,

s, H-30)]; 10 proton –CH2– bao gồm δH [0.52 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-19a); 0.29 (1H, d,

J = 4.0 Hz, H-19b)] và 9 proton còn lại ở δH 0.80-2.10.

Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, phụ lục 18.2) kết hợp với kỹ thuật DEPT

(phụ lục 18.3) của hợp chất Eup17 cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với 30 carbon bao

gồm 1 carbon carbinol >CH-OH ở vùng trường thấp [C 76.5 (C-3)]; 2 carbon olefin bậc

ba =CH– tại [C 123.0 (C-23); C 140.5 (C-24)]; 7 carbon methyl –CH3 tại C [29.9 (C-

26); 29.8 (C-27); 25.3 (C-30); 18.7 (C-18); 17.8 (C-28); 17.4 (C-21); 13.8 (C-29)]; 10

carbon methylene -CH2- tại C [38.2 (C-22); 34.8 (C-15); 32.2 (C-12); 31.2 (C-1); 29.9

(C-19); 28.8 (C-2); 27.2 (C-7); 25.7 (C-16); 25.2 (C-11); 20.3 (C-6)]; 4 carbon methine

100

>CH- tại C [51.1(C-17); 46.8 (C-8); 46.4 (C-5); 35.6 (C-20)] và 6 carbon bậc bốn tại

C [68.5 (C-25); 48.1 (C-14); 44.6 (C-13); 39.8 (C-4); 25.7 (C-10); 19.1 (C-9)].

Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và HSQC (phụ lục 18.5) cho phép dự đoán

Eup17 là hợp chất có khung căn bản là cycloartane mang 1 liên kết đôi và 2 nhóm –OH.

Cấu trúc hợp chất Eup17 được xác nhận trên phổ HMBC (phụ lục 18.4) như sau:

Hai nhóm methyl C-26 và C-27 cho tương quan với nhau [H3-26 ở H 1.17 với

C-27 ở C 29.8 và H3-27 ở H 1.17 với C-26 ở C 29.9], đồng thời tương quan với

1 carbon bậc bốn ở C 68.5 (C-25) và 1 carbon olefin ở C 140.5 (C-24) khẳng

định nhóm –OH gắn vào carbon C-25.

Hai tín hiệu cộng hưởng của proton nhóm methyl H3-30 ở H 0.73 và H3-29 ở H

0.95 cùng cho tương quan với carbon bậc bốn ở C 39.8 (C-4) và carbon methine

ở C 76.5 (C-3) khẳng định nhóm –OH gắn vào carbon C-3. Bên cạnh đó, proton

H3-30 có thêm tương quan với carbon bậc bốn ở C 25.7 (C-10), carbon methine

ở C 46.4 (C-5); proton H3-29 có thêm tương quan với 1 carbon methine ở C

46.4 (C-5), 1 carbon methylene ở C 28.8 (C-2). Đồng thời 2 proton olefin ở H

5.50 (H-24) và H 5.52 (H-23) cùng cho tương quan với carbon bậc bốn ở C 68.5

(C-25), carbon methylene ở C 38.2 (C-22) cho thấy nối đôi phải ở vị trí C-23 và

C-24.

Proton methyl H3-18 ở H 0.89 và H3-28 ở H 0.87 cùng cho tương quan với 2

carbon bậc bốn C-13, C-14 và 1 carbon methylene ở C-15. Ngoài ra, H3-18 ở H

0.89 có thêm tương quan với carbon methine ở C 35.6 (C-20), H3-28 ở H 0.87

có thêm tương quan với carbon methylene ở C 34.8 (C-15).

Proton methyl H3-21 ở H 0.86 cho tương quan với 1 carbon bậc bốn ở C 44.6

(C-13), 2 carbon methylene ở C 51.1 (C-17) và C 35.6 (C-20), 1 carbon

methylene ở C 38.2 (C-22).

101

Hình 4.16 Tương quan HMBC của hợp chất Eup17

Từ các biện luận trên kết hợp tài liệu tham khảo [249, 250], đề nghị hợp chất

Eup17 là cycloart-23-ene-3β,25-diol. Hợp chất này cũng đã được phân lập từ Euphorbia

schimperi C. Presl, Euphorbia Macrostegia và khảo nghiệm về độc tính tế bào ung thư:

MCF7, MDA-MB48 và MCF-7; hay được phân lập từ Ficus sansibarica với hoạt tính

kháng khuẩn hiệu quả [249-251]. Tuy hợp chất này tồn tại khá phổ biến trong thiên

nhiên, nhưng đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ loài Cỏ sữa lá lớn.


Vị trí

Hợp chất Eup17

(DMSO-d6)

Cycloart-23-ene-3β,25-diol

(CDCl3) [249]

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

HMBC

(H → C)

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

1 1.58 (m); 1.26 (m) 31.2 C-2, 3, 4, 6, 9, 10

32.0

2 1.74 (m); 1.57 (m) 28.8 C-5, 9, 10 30.4

3 3.08 (1H, m) 76.5 C-29,30 3.22 (1H, dd, 4.4; 11.2 Hz)

78.8

4 39.8 40.5

5 1.31 (1H, m) 46.4 C-2, 7, 8, 9, 10, 19

47.7

6 1.59 (m); 0.80 (m) 20.3 C-1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 19, 30

21.1

7 1.32 (m); 1.05 (m) 27.2 C-5, 8, 9, 19 28.1

8 1.52 (1H, m) 46.8 C-6, 9, 15, 18, 19, 28

48.0

9 19.1 20.0

10 25.7 26.1

102

11 1.90 (m); 1.15 (m) 25.2

C-1, 7, 9, 12, 13, 14, 18, 19

26.0

12 1.61 (2H, m) 32.2

C-8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18

32.8

13 44.6 45.3

14 48.1 48.8

15 1.30 (2H, m) 34.8 C-7, 8, 9, 18, 28 35.6

16 1.89 (m); 1.28 (m) 25.7 C-12, 13, 14, 18 26.4

17 1.56 (m) 51.1

C-11, 13, 14, 16, 18, 21, 28

52.0

18 0.89 (s) 18.7 C-13, 14, 15, 20 0.90 (s) 19.3

19 0.52 (d, 4.0) và 0.29 (d, 4.0)

29.9 C-1, 5, 8, 9, 10, 11

30.1

20 1.47 (1H, m) 35.6 C-14, 15, 18 36.4

21 0.86 (d, 6.5) 17.4 C-13, 17, 20, 22 0.79 (d; 6.4 Hz) 18.3

22 2.10 (m); 1.74 (m) 38.2 C-23, 24 39.1

23 5.52 (1H, m) 123.0 C-22, 25 4.96 (1H, m) 125.6

24 5.50 (1H, m) 140.5 C-22, 25 4.94 (1H, m) 139.3

25 68.5 70.8

26 1.17 (s) 29.9 C-24, 25, 27 1.27 (s) 29.9

27 1.17 (s) 29.8 C-24, 25, 26 1.26 (s) 29.9

28 0.87 (s) 17.8 C-8, 13, 14, 15 0.74 (s) 19.3

29 0.95 (s) 13.8 C-2, 3, 4, 5 0.90 (s) 14.0

30 0.73 (s) 25.3 C-3, 4, 5, 10 0.81 (s) 25.5

Hình 4.17 Công thức cấu tạo của hợp chất Eup06, Eup07 và Eup17

103

Hợp chất Eup03: 3β,7β,25-trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al

Hợp chất Eup03 tồn tại dưới dạng tinh thể hình kim không màu.

Từ dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD, phụ lục 19.1) và phổ 13C-NMR

(125 MHz, CD3OD, phụ lục 19.2) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 19.3) cho thấy Eup03

có 30 tín hiệu carbon trong đó có 7 nhóm methyl, 7 nhóm methylene, 4 nhóm methine,

4 carbon bậc bốn, 4 carbon olefin, 2 carbon bậc ba, 1 carbon bậc ba mang oxy tương tự

như khung triterpenoid của hợp chất Eup07 nhưng mang 2 liên kết đôi và 3 nhóm –OH.

Độ dịch chuyển hóa học của 2 nhóm methyl về phía trường thấp tại [δH 1.28 (3H, s, H-

27), δH 1.31 (3H, s, H-26) ] cho phép kết luận nhóm hydroxyl sẽ gắn vào C-25 [δC 71.2]

Ngoài ra, có một tín hiệu proton của nhóm aldehyde tại [δH 9.90 (1H, s)] và xuất

hiện một tín hiệu ở δC 209.7 nên cho phép dự đoán đây là tín hiệu của carbon nhóm

carbonyl (>C=O).

Từ các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT, kết hợp với tài liệu tham

khảo[252, 253], đề nghị cấu trúc hợp chất Eup03 là: 3β,7β,25-trihydroxycucurbita-

5,(23E)-dien-19-al. Hợp chất này cũng đã được phân lập từ loài Momordica charantia

L., Eucalyptus citriodora nhưng đây là lần đầu tìm thấy trong loài Cỏ sữa lá lớn và hợp

chất có nhiều tiềm năng trong việc phòng, chữa trị bệnh đái tháo đường [254-257].


Vị trí

Hợp chất Eup03

(CD3OD)

3β,7β,25-trihydroxycucurbita-5,(23E)-

dien-19-al (CD3OD) [253]

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

δH ppm (J, Hz)

400 MHz

C ppm

100 MHz

1 1.57 (m); 1.72 (m) 22.2 1.56 (m); 1.72 (m) 22.3

2 1.69 (m); 2.59 (m) 30.1 1.70 (m); 2.53 (m) 30.2

3 3.54 (br s) 66.9 3.54 (br s) 66.9

4 42.3 42.3

5 147.3 147.2

6 5.93 (d, 5.5) 124.0 5.90 (d, 6.4) 123.8

7 4.02 (d, 5.0) 77.1 3.99 (br d, 5.6) 77.0

8 51.1 51.3

104

9 51.1 50.8

10 37.7 2.53 (dd, 10.0 và 6.0) 37.6

11 1.61 (m); 2.20 (m) 23.3 1.6 (m); 2.23 (m) 23.3

12 1.31 (m); 1.40 (m) 30.1 1.31 (m); 1.39 (m) 29.9

13 46.6 46.6

14 50.8 50.8

15 1.38 (m); 1.40 (m) 35.7 1.38 (m); 1.40 (m) 35.7

16 1.10 (m); 1.97 (m) 28.5 1.16 (m); 1.98 (m) 28.6

17 1.48 (m) 51.3 1.49 (m) 51.1

18 0.84 (s) 15.4 0.86 (s) 15.4

19 9.90 (s) 209.7 9.87 (s) 209.4

20 1.54 (m) 37.6 9.75 (s) 37.6

21 0.97 (d, 5.5) 19.2 0.94 (d, 5.6) 19.3

22 1.75 (m); 2.18 (m) 40.3 1.75 (m); 2.16 (m) 40.3

23 5.60 (m) 125.8 5.57 (br s) 125.7

24 5.61 (m) 140.9 5.57 (br s) 140.7

25 71.2 71.1

26 1.31 (s) 30.0 1.25 (s) 30.1

27 1.28 (s) 29.8 1.25 (s) 29.8

28 1.27 (s) 26.0 1.24 (s) 26.0

29 1.10 (s) 27.8 1.07 (s) 27.8

30 0.84 (s) 18.8 0.81 (s) 18.8

Hợp chất steroid

Hợp chất Eup20: campesterol

Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, phụ lục 20.1) của hợp chất Eup20 cho các tín

hiệu tại δH 5.35 (1H, dd, J = 3.0 và 2.0 Hz, H-6); 3.54 (1H, tt, J = 11.0 và 5.0 Hz, H-3);

2.28 (1H, d, J = 7.0 Hz, H-4); 0.86 đến 2.31 (m, 20H, 10 x CH2 protons); 0.68 đến 1.08

(6 x CH3 cho H-18, 19, 21, 26, 27 và 28); 1.01 (3H, s, H-19); 0.93 (3H, d, J = 6.5 Hz,

H-21); 0.86 (3H, d, J = 7.5 Hz, H-26); 0.84 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-27); 0.82 (3H, d, J =

7.0 Hz, H-28); 0.68 (3H, s, H-18). Tại δH 3.54 cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với 1

105

proton carbinol >CH-OH và J = 11.0 Hz từ đó ta kết luận rằng nhóm –OH ở C-3 là β-

hydroxyl.

Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, phụ lục 20.2) cho các tín hiệu tại δC [140.8

(C-5), 121.7 (C-6) và 71.8 (C-3)], kết hợp cùng với kỹ thuật DEPT (phụ lục 20.3), cho

thấy chất Eup20 có 28 carbon trong đó có 6 carbon methyl –CH3, 10 carbon methylene

–CH2–, 9 carbon methine >CH– và 3 carbon bậc bốn.

Từ kết quả phổ 1H-NMR, 13C-NMR và kỹ thuật phổ DEPT, kết hợp với tài liệu

tham khảo [258] hợp chất Eup20 được xác định là 24(R)-methylcholesta-5-en-3β-ol

(campesterol). Trước đó, nhiều công trình nghiên cứu cũng đã cho biết hợp chất này

được phân lập các loài khác nhau trong tự nhiên như Wrightia tinctoria, Chrysanthemum

coronarium L., Portulaca oleracea L.,.. với hoạt tính kháng ung thư [259-261].


Vị trí

Hợp chất Eup20

(CDCl3)

Campesterol [258]

(CDCl3)

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

1 37.3 37.4

2 28.2 28.4

3 3.54 (dt, 11.0 và 5.0) 71.8 3.52 (dt, 11.0 và 3.9) 71.9

4 2.28 (d, 7.0) 42.3 2.28 (d, 7.3) 42.3

5 140.8 140.9

6 5.35 (dd, 3.0 và 2.0) 121.7 5.30 (m) 121.9

7 31.9 31.8

8 29.6 29.8

9 50.2 50.1

10 36.5 36.5

11 19.8 19.8

12 39.8 39.8

13 42.3 42.3

14 56.8 56.9

15 23.1 23.1

16 28.2 28.4

17 56.1 56.1

106

18 0.68 (s) 18.9 0.68 (s) 19.5

19 1.01 (s) 12.0 1.01 (s) 12.0

20 31.7 31.8

21 0.93 (d, 6.5) 19.4 0.92 (d, 6.6) 19.5

22 34.0 33.8

23 21.1 21.3

24 45.9 45.8

25 36.2 36.1

26 0.86 (d, 7.5) 18.8 0.81 (d, 7.2) 18.8

27 0.84 (d, 6.5) 19.1 0.84 (d, 7.2) 19.0

28 0.82 (d, 7.0) 24.3 0.80 (d, 7.0) 24.4

OH

HO

OHC

12

34 5

6

7

89

10

30 29

19 11

12

13

14

15

16

17

20

21 22

23

24

26

27

2518

28

OH

Eup03: 3,7,25-trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al

HO

H

H H

H

Eup20: campesterol

Hình 4.18 Công thức cấu tạo của hợp chất Eup03 và Eup20

Hợp chất diterpenoid

Hợp chất Eup23: 2β,16α,19-trihydroxy-ent-kaurane

Phổ 1H-NMR (500MHz, CD3OD, phụ lục 21.1), δH (ppm): xuất hiện tín hiệu của

34 proton. Trong vùng từ trường thấp xuất hiện tín hiệu proton của nhóm >CH– ở δH

3.87 gắn tại C-2 là do chịu ảnh hưởng của nhóm thế –OH. Vùng từ trường thấp xuất

hiện tín hiệu của 7 nhóm –CH2– ở δH [2.17; 2.15; 1.68; 1.64; 1.63; 1.88 và 1.55] đặc

trưng của vòng diterpenoid. Trong vùng từ trường cao xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm

–CH3 mũi đơn ở δH [1.34; 1.10 và 1.01]. Bên cạnh đó, proton xuất hiện tín hiệu tại δH

0.71 (1H, t, J = 11.5 Hz) chứng tỏ H nằm trên trục xích đạo mang cấu hình alpha, proton

còn lại mang cấu hình beta.

Phổ 13C-NMR (125MHz, CD3OD, phụ lục 21.2), δC (ppm) kết hợp với kỹ thuật

DEPT (phụ lục 21.3) cho thấy hợp chất Eup23 có 20 tín hiệu carbon, trong đó có 4

nhóm >CH–, 9 nhóm –CH2– , 3 nhóm –CH3 và 4 carbon bậc bốn đặc trưng cho khung

diterpenoid. Bên cạnh đó, dựa vào tín hiệu của 3 nhóm >CH– lần lượt tại δC [57.6 (C-

5), 58.6 (C-9) và 49.5 (C-13)] cùng với ba carbon bậc bốn tại δC [41.5 (C-4), 46.3 (C-8)

107

và 41.9 (C-10)] chứng tỏ hợp chất thuộc khung ent-kaurene của diterpenoid. Ngoài ra,

tín hiệu C của C-16 (79.8); C-2 (65.0) và C-19 (65.7) xuất hiện ở vùng từ trường thấp là

do chịu ảnh hưởng của nhóm thế –OH.

Trên phô HMBC (phụ lục 21.4) nhân đươc cac tương quan cua proton tại δH 3.63

với carbon tại δC 28.1 (C-18) và nằm gần với nhóm –OH nên có xu hướng dịch chuyển

về vùng từ trường thấp hơn. Bên cạnh đó, proton tại vị trí δH 1.10 gắn trên C-20 (δC

19.9) tương quan với các carbon tại δC [50.5 (C-1); 41.9 (C-10), 58.6 (C-9)]. Proton tại

δH 1.55 tương quan lần lượt với các carbon tại δC [46.3 (C-8); 58.6 (C-9); 79.8 (C-16)].


Vị trí

Hợp chất Eup23

(CD3OD )

2β,16α,19-trihydroxy-ent-kaurane [111]

(CD3OD)

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

1α 2.17 (m) 50.5 2.17 (m) 50.5

1β 0.71 (1H, t, 11.5) 0.68 (t, 11.2)

2 3.87 (1H, m) 65.0 3.87 (m) 65.0

3α 2.15 (m) 45.4 2.13 (m) 46.3

3β 0.84 (t, 12.0) 0.82 (t, 11.0)

4 41.5 41.3

5β 0.94 (d, 10.5) 57.6 0.93 (d, 10.8) 57.6

6 1.68 (m) 21.3 1.68 (m) 21.3

7α 1.64 (m) 43.5 1.64 (m) 43.5

7β 1.47 (m) 1.45 (m)

8 46.3 46.3

9β 1.07 (d, 6.0) 58.6 1.05 (d, 4.8) 58.5

10 41.9 41.9

11 1.64 (m) 19.3 1.64 (m) 19.3

12 1.64 (m) 27.8 1.63 (m) 27.7

13 1.85 (m) 49.5 1.83 (br s) 49.0

14α 1.88 (d, 11.5) 38.4 1.87 (d, 11.6) 38.4

14β 1.60 (m) 1.60 (m)

15 1.55 (s) 58.5 1.54 (s) 58.5

16 79.8 79.7

108

17 1.34 (s) 24.4 1.33 (s) 24.4

18 1.01 (s) 28.1 0.99 (s) 28.1

19a 3.63 (d, 11.5) 65.7 3.62 (d, 11.2) 65.7

19b 3.33 (d, 11.5) 3.32 (d, 11.2)

20 1.10 (s) 19.9 1.08 (s) 19.9


[111] hoàn toàn phù hợp, cho phép định danh hợp chất Eup23 là 2β,16α,19-trihydroxy-

ent-kaurane. Trước đó, nhiều nhà nghiên cứu cũng đã phân lập được hợp chất này từ E.

hirta [88, 111, 262].

Hợp chất khác

Hợp chất Eup18: 1-O-benzyl-rutinoside

Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD, phụ lục 22.1) xuất hiện các tín hiệu của một

vòng benzene một lần thế tại H [7.44 (d, J = 7.5 Hz, H-2, 6); 7.35 (dd, J = 8.0 và 7.0

Hz, H-3, 5); 7.30 (m, H-4)]; một nhóm thế β-D-glucosyl tại H [4.36 (d, J = 8.0 Hz, H-

1); 3.28 (dd, J = 8.5 và 8.0 Hz, H-2); 3.33 (m, H-3); 3.33 (m, H-4); 3.40 (m, H-5);

3.67 (m, H-6a); 4.02 (dd, J = 11.0 và 1.5 Hz, H-6b)] và một gốc rhamnosyl tại H [4.81

(overlap, H-1); 3.90 (m, H-2); 3.70 (m, H-3); 3.40 (m, H-4); 3.70 (m, H-5); 1.29

(d, J = 6.0 Hz, H-6)]. Ngoài ra, các tín hiệu ở H 4.67 (d, J = 11.5 Hz) và H 4.90 (d, J

= 11.5 Hz) có thể được gán cho các proton methylene H-7, do đó chứng tỏ vòng thơm

của hợp chất là hệ thống benzylic. Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD, phụ lục 22.2) cho

thấy các tín hiệu ở C 138.9; 129.3 (mũi nhân đôi); 129.4 (mũi nhân đôi); 128.8 và 71.8,

phù hợp với sự hiện diện của vòng benzylic một nhóm thế.

Phổ HMBC (phụ lục 22.4) cho thấy mối tương quan dài giữa H-6 và C-1; giữa

H-1 với C-6 và giữa H-7 với C-1 của hợp chất glucosyl và C-2/C-6 của vòng thơm

giúp xác nhận phân tử glucose gắn vào khung benzyl tại C-7 và phân tử đường rhamnose

gắn vào phần đường glucose tại C-6.


[263] cho phép định danh hợp chất Eup18 là 1-O-benzyl-rutinoside. Hợp chất này được

tìm thấy khá phổ biến trong các loài thực vật như Coussarea hydrangeifolia, Thalictrum

109

Ramosum, Gomphrena celoisiodes, Idesia polycarpa…nhưng đây là lần đầu tìm thấy

trong loài Cỏ sữa lá lớn [263-266].

HO

OH

OH1

2

3 45

10

67

89

1112

13

14

15

1617

18 19

20

Eup23: 2 ,16 ,19-trihydroxy-ent-kaurane

Hình 4.19 Công thức cấu tạo của hợp chất Eup23 và Eup18


Vị trí

Hợp chất Eup18

(CD3OD)

1-O-benzyl-rutinoside

(CD3OD) [267]

δH ppm (J, Hz)

500 MHz

C ppm

125 MHz

HMBC

(H → C)

δH ppm (J, Hz)

400 MHz

C ppm

100 MHz

1 138.9 138.7

2, 6 7.44 (2H, d, 7.5) 129.3 C-5 7.42 (2H, d, 7.3) 128.8

3, 5 7.35 (2H, dd, 8.0 và 7.0)

129.4 C-2, 4 7.33 (2H, dd, 7.7 và 7.3)

128.8

4 7.30 (1H, m ) 128.8 C-3, 5 7.28 (1H, d, 7.3) 128.3

7 4.67 (1H, d, 11.5)

4.90 (1H, d, 11.5)

71.8 C-1, 6, 2, 1 4.64 (1H, d, 11.8), 4.87 (1H, d, 11.8)

71.4

1 4.36 (1H, d, 8.0) 103.2 4.32 (1H, d, 7.9) 103.0

2 3.28 (1H, dd, 8.5 và 8.0)

75.1 C-1, 3, 4 3.24 (1H, dd, 8.5 và 7.9)

75.0

3 3.33 (1H, m) 78.1 C-4 3.70-3.20 (1H, m) 77.9

4 3.33 (1H, m) 71.8 3.70-3.20 (1H, m) 71.3

5 3.40 (1H, m) 77.0 C-4 3.70-3.20 (1H, m) 77.4

6 3.67 (1H, m), 4.02 (1H, dd, 11.0 và 1.5)

68.2 C-5, 1 3.64 (1H, dd, 11.3 và 5.9), 3.99 (1H, dd, 11.7 và 1.7)

67.6

1 4.81 (1H, overlap) 102.3 C-5, 6 4.81 (1H, d, 1.7) 102.1

2 3.90 (1H, m) 72.3 C-4, 3 3.86 (1H, dd, 3.1 và 1.7)

72.2

3 3.70 (1H, m) 72.4 C-4 3.68 (1H, m) 71.1

110

4 3.40 (1H, m) 74.1 C-5 3.34 (1H, overlap) 73.7

5 3.70 (1H, m) 69.9 C-4 3.67 (1H, m) 71.1

6 1.29 (3H, d, 6.0) 18.1 C-4, 5 1.27 (3H, d, 6.2) 17.9

Như vậy, từ toàn cây Cỏ sữa lá lớn được thu hái tại thành phố Cần Thơ đề tài đã

phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 22 hợp chất (Bảng 4.24).

Bảng 4.24 Tổng hợp các hợp chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn

Chất mới

Các hợp chất thuộc nhóm flavonoid

111

Các hợp chất thuộc nhóm phenol

Hợp chất diterpenoid

112

Các hợp chất thuộc nhóm triterpenoid

Hợp chất steroid

Hợp chất khác

Kết quả đánh giá hoạt tính tăng cường miễn dịch

Tế bào bạch cầu phân lập từ thận cá tra, được nuôi trong môi trường L-15 có bổ

sung cao chiết Cỏ sữa lá lớn ở 2 nồng độ 10 µg/mL và 100 µg/mL và bổ sung chất sạch

phân lập được ở 2 nồng độ 10 µg/mL và 50 µg/mL. Sau 24 giờ bổ sung mẫu thử, tiến

113

hành phân tích các chỉ tiêu: lysozyme, bổ thể, tổng kháng thể so với đối chứng để đánh

giá ảnh hưởng của Cỏ sữa lá lớn lên đáp ứng miễn dịch của tế bào bạch cầu cá tra.

Kết quả phân tích (Hình 4.20) cho thấy các nghiệm thức sau 24 giờ bổ sung cao

tổng, cao MeOH và cao n-hexane của Cỏ sữa lá lớn, tại nồng độ 100 µg/mL hoạt tính

lysozyme tăng cao đáng kể so với đối chứng. Trong đó, tăng cao nhất ở nghiệm thức bổ

sung cao MeOH (tăng khoảng hơn 2 lần so với đối chứng) và khác biệt có ý nghĩa thống

kê so với nghiệm thức đối chứng (p<0.01), điều này cho thấy tác động tích cực của cao

chiết Cỏ sữa lá lớn đến hoạt tính lysozyme của tế bào bạch cầu cá tra. Ngoài ra, cao

EtOAc và cao BuOH cũng làm tăng đáng kể hoạt tính lysozyme tại nồng độ thấp (10

µg/mL) trên tế bào bạch cầu thận cá tra. Tại nồng độ 10 µg/mL, quercitrin đã làm tăng

đáng kể hoạt tính lysozyme; trong khi taraxerol và rutin tuy cũng có làm gia tăng hoạt

tính này nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng.

Hình 4.20 Hoạt tính lysozyme của tế bào bạch cầu cá tra

0

50

100

150

200

250

Đối chứng Cao tổng Cao MeOH Cao hexane Cao EtOAc Cao BuOH Quercitrin Taraxerol Rutin

Hàm

lượ

ng

lyso

zym

e so

vớ

i đố

i ch

ứn

g

100 µg/mL 10 µg/mL 50 µg/mL

**

** **

***

**

*

114

Hình 4.21 Hoạt tính bổ thể của tế bào bạch cầu cá tra

Hình 4.22 Hoạt tính tổng kháng thể của tế bào bạch cầu cá tra

Hoạt tính bổ thể của tế bào bạch cầu thận (Hình 4.21) tăng rõ rệt khi bổ sung cao

EtOAc, cao BuOH và rutin ở nồng độ 10 µg/mL (p<0.01).

Từ kết quả thể hiện ở (Hình 4.22) sau 24 giờ bổ sung các cao chiết hay chất sạch

phân lập được, hàm lượng tổng kháng thể của các nghiệm thức bổ sung cao tổng, cao

MeOH và cao BuOH của Cỏ sữa lá lớn đều khác biệt rõ rệt và có ý nghĩa thống kê so

với nghiệm thức đối chứng. Trong đó, hàm lượng tổng kháng thể ở nghiệm thức bổ sung

10 µg/mL cao BuOH đã tăng 2.0 lần so với đối chứng. Hàm lượng tổng kháng thể đã

tăng đáng kể ở nghiệm thức bổ sung cao tổng, cao MeOH và cao hexane ở nồng độ 100

0

50

100

150

200

250


Hàm

lượ

ng

tổn

g kh

áng

thể

so v

ới đ

ối c

hứ

ng


**** **

*

0

100

200

300

400

500

600


Hàm

lượ

ng

bổ

th

ể so

vớ

i đố

i ch

ứn

g


** **

** **

*

**

* *

115

µg/mL. Tuy nhiên, các chất phân lập khảo nghiệm đều không có tác dụng tăng cường

nhiều hoạt tính tổng kháng thể sau 24 giờ bổ sung vào tế bào bạch cầu thận cá tra.

Nhiều nghiên cứu khoa học cũng đã tiến hành bổ sung dược thảo trong đó có Cỏ

sữa lá lớn vào thức ăn nhằm tăng cường miễn dịch cho thủy sản [268, 269]. Tuy nhiên,

chưa có nhiều nghiên cứu ảnh hưởng của dược thảo lên đáp ứng miễn dịch của tế bào

bạch cầu cá. Đây là lần đầu tiên Cỏ sữa lá lớn được chứng minh có khả năng tăng cường

hoạt tính lysozyme, hoạt tính bổ thể và làm tăng hàm lượng tổng kháng thể. Điều này

chứng minh tiềm năng to lớn của Cỏ sữa lá lớn trong việc hỗ trợ tăng cường hệ miễn

dịch trên cá tra.

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của Cỏ sữa lá lớn được được khảo sát bằng phương pháp

khuếch tán qua giếng thạch và được đánh giá qua đường kính vòng vô khuẩn và nông

đô ưc chê tôi thiêu (MIC).

Qua kết quả từ Bảng 4.25, Bảng 4.26 và Bảng 4.27 cho thấy tất cả các mẫu khảo

sát đều có khả năng kháng khuẩn đối với năm chủng vi khuẩn ở các nồng độ khảo sát

ngoại trừ cao n-hexane (0.3125 mg/mL) đối với khuẩn Aeromonas dhakensis-W (MIC

= 625 µg/mL). Khi nồng độ cao chiết càng tăng thì đường kính vòng vô khuẩn càng

tăng. Đồng thời, sự thay đổi kích thước vòng vô khuẩn khác biệt có ý nghĩa thống kê ở

các nồng độ được khảo sát. Do đó, khi tăng nồng độ cao chiết mẫu thử lên cao hơn có

thể sẽ tạo ra các vòng vô khuẩn có đường kính còn lớn hơn nữa. Trong năm chủng vi

khuẩn bị ức chế, cao chiết EtOAc cho hiệu quả ức chế khuẩn Aeromonas dhakensis-D.

và V.parahaemolyticus cao nhất (MIC = 18 µg/mL) và rutin, taraxerol lại cho hiệu quả

ức chế khuẩn Aeromonas hydrophila-N mạnh nhất (MIC = 1.5 µg/mL), tạo được vòng

vô khuẩn lớn nhất ở tất cả các nồng độ so với các chủng vi khuẩn khác.

Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila-D có mức độ nhạy cảm khác nhau với

từng loại cao chiết, chất phân lập và kháng sinh. Cao EtOAc có khả năng ức chế mạnh

vi khuẩn A. hydrophila –D với đường kính vòng vô khuẩn 22.80 mm ở nồng độ 5 mg/mL

và có giá trị MIC = 39 µg/mL. Đường kính vòng vô khuẩn của cao n-hexane tăng không

đáng kể từ 9.13 ở nồng độ 0.3125 mg/mL lên 13.63 mm ở nồng độ 5 mg/mL. Rutin thể

hiện khả năng kháng khuẩn A. hydrophila-D mạnh với đường kính vòng vô khuẩn tăng

116

nhanh từ 13.60 đến 29.33 trong khoảng nồng độ khảo sát. Kháng sinh cefixim có khả

năng kháng chủng vi khuẩn A. hydrophila-D mạnh hơn các cao chiết và chất phân lập

từ Cỏ sữa lá lớn với giá trị MIC = 1.0 µg/mL. Kháng sinh vancomycin HCl có khả năng

kháng chủng vi khuẩn A. hydrophila-D, cho đường kính vòng vô khuẩn tăng từ 9.33 mm

đến 19.00 mm trong khoảng nồng độ từ 4 đến 64 µg/mL và giá trị MIC = 4.0 µg/mL.

Như vậy, có thể thấy rutin phân lập từ Cỏ sữa lá lớn (MIC = 2.0 µg/mL) có khả năng

kháng chủng vi khuẩn A. hydrophila-D cao hơn kháng sinh vancomycin HCl ở tất cả

các nồng độ được khảo sát.

Cao tổng, các cao phân đoạn và chất phân lập khảo sát đều có hoạt tính kháng

chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila-N. Cao EtOAc có khả năng kháng A.

hydrophila-N mạnh hơn cao MeOH thể hiện qua đường kính vòng vô khuẩn của cao

EtOAc tăng đáng kể từ 13.73 lên 23.20 mm với giá trị MIC = 78 µg/mL. Khả năng

kháng A. hydrophila-N của kháng sinh cefixim (MIC = 1.0 µg/mL) mạnh hơn các chất

phân lập. Tuy nhiên, kháng sinh Vancomycin HCl lại có đường kính vòng vô khuẩn nhỏ

hơn taraxerol ở tất cả các nồng độ khảo sát.

Cao n-butanol có khả năng kháng Aeromonas dhakensis-W cao nhất trong tất cả

các loại cao chiết được khảo sát với giá trị MIC = 18 µg/mL. Hiệu quả kháng A.

Dhakensis-W của các loại cao chiết tăng dần theo thứ tự: n-hexane, MeOH, BuOH và

EtOAc tại nồng độ 5 mg/mL. Kháng sinh Vancomycin HCl cho đường kính vòng vô

khuẩn tăng dần từ 14.33±0.58 mm ở nồng độ 4.0 µg/mL lên 20.67±2.52 mm ở nồng độ

64 µg/mL và có giá trị MIC = 2.0 µg/mL. Trong khi đó, kháng sinh cefixim không thể

ức chế được chủng vi khuẩn này ở nồng độ 4.0 µg/mL.

Cao BuOH và MeOH đều có khả năng ức chế Aeromonas dhakensis-D tương

đương nhau và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Cao EtOAc có khả năng kháng A.

dhakensis-D mạnh hơn cả với giá trị MIC = 18 µg/mL. Trong trường hợp này, kháng

sinh Vancomycin HCl có khả năng kháng chủng vi khuẩn A. dhakensis-D ở tất cả các

nồng độ được khảo sát (MIC = 2.0 µg/mL). Tuy nhiên, kháng sinh cefixim không thể

ức chế được chủng vi khuẩn này ở khoảng nồng độ 4-16 µg/mL.

Đối với khuẩn Vibrio parahaemolyticus: cao EtOAc, taraxerol và kháng sinh

Vancomycin HCl ức chế hiệu quả chủng vi khuẩn này với giá trị MIC lần lượt là 18.0;

117

2.0 và 3.0 µg/mL. Trong trường hợp này, chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

không nhạy cảm với kháng sinh cefixim.

Các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, Aeromonas hydrophila và

Aeromonas dhakensis được biết đến là những tác nhân phổ biến gây ra bệnh gan thận

mủ và xuất huyết trên cá da trơn [270]. Nhiều loại kháng sinh đã được sử dụng trong

việc điều trị bệnh do các chủng vi khuẩn này gây ra. Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng

cho thấy việc sử dụng kháng sinh thường xuyên đã làm cho các chủng vi khuẩn này có

hiện tượng kháng thuốc [271-273]. Nghiêm trọng hơn, vi khuẩn còn gây hiện tượng

truyền kháng cho các vi khuẩn gây bệnh cho người và sự tồn dư kháng sinh trong sản

phẩm gây độc và gây dị ứng cho người cũng như hạn chế việc xuất khẩu thủy sản [274].

Một nghiên cứu của Atefeh Sheikhlar và cộng sự [269] cho thấy cao MeOH Cỏ

sữa lá lớn có khả năng kháng chủng vi khuẩn A. hydrophila mạnh thể hiện qua đường

kính vòng vô khuẩn là 22.41±3.3 mm tại nồng độ 0.07 mg/mL và nồng độ ức chế tối

thiểu của cao này là 70 µg/mL. Nhiều công trình nghiên cứu khác cũng đã cho thấy tiềm

năng kháng khuẩn của Cỏ sữa lá lớn nhưng chủ yếu là các chủng vi khuẩn gây bệnh trên

người, nghiên cứu này tập trung vào các chủng vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản.

Bảng 4.25 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết

Cao chiết Vi khuẩn

Đường kính vòng vô khuẩn (mm) ở các nồng độ cao chiết

khác nhau (mg/mL)

0.3125 0.625 1.250 2.500 5.000

Cao tổng

A. hydrophila –N 14.37E±0.19 15.50D±0.09 16.33C±0.35 17,40B±0,20 19,60A±0,30

A. dhakensis –D 15.17E±0.15 15.83D±0.06 16.53C±0.25 17.53B±0.15 18.13A±0.25

A. hydrophila –D 13.43E±0.21 14.37C±0.21 15.40C±0.20 15.93B±0.15 16.43A±0.23

A. dhakensis –W 14.43E±0.21 15.43C±0.21 16.67C±0.15 17.47B±0.31 18.70A±0.27

V. parahaemolyticus 13.37E±0.15 14.47C±0.15 15.53C±0.38 16.77B±0.06 17.50A±0.30

Methanol

A. hydrophila –N 10.87E ±0.12 12.50D±0.10 13.90C±0.20 14.73B ±0.21 16.37A ±0.35

A. dhakensis –D 11.23E ±0.21 12.27D±0.15 16.87C±0.15 17.73B ±0.15 21.27A ±0.23

A. hydrophila –D 11.27E ±0.25 13.27D ±0.12 14.80C±0.10 15.43B ±0.15 16.80A ±0.10

A. dhakensis –W 12.03E ±0.25 12.80D ±0.10 13.70C±0.10 15.50B ±0.27 18.23A ±0.21

V. parahaemolyticus 13.77E ±0.15 14.50D±0.20 16.53C±0.23 17.33B ±0.15 20.20A ±0.27

n-hexane

A. hydrophila –N 11.30E ±0.30 12.17 C±0.21 12.50C±0.20 13.17B ±0.21 13.80A ±0.10

A. dhakensis –D 12.23E ±0.21 14.33D±0.15 16.20 C±0.20 17.33B ±0.15 19.23A ±0.21

A. hydrophila –D 9.13E ±0.15 10.30D±0.10 11.43C±0.25 12.60B ±0.27 13.63A ±0.21

118

A. dhakensis –W 0.00E ±0.00 9.70D±0.17 10.27C±0.25 11.63B ±0.15 13.47A ±0.25

V. parahaemolyticus 11.23E ±0.21 13.20D±0.20 13.83C±0.06 14.53B ±0.31 16.20A ±0.17

Ethyl

acetate

A. hydrophila –N 13.73E ±0.21 14.33D±0.15 16.53C±0.47 18.23B ±0.21 23.20A ±0.27



A. dhakensis –W 12.40 E ±0.36 13.60D±0.17 16.47C±0.21 17.63B ±0.38 21.23A ±0.21

V.

parahaemolyticus

16.43E ±0.23 17.53D±0.23 19.53 C±0.15 20.30B ±0.20 21.23A ±0.21

n-butanol

A. hydrophila –N 12.33E ±0.31 13.67D±0.15 14.47 C±0.15 17.43B ±0.40 21.23A ±0.21



A. dhakensis –W 16.23E ±0.21 17.47D±0.06 18.30 C±0.27 19.30B ±0.30 21.23A±0.32

V. parahaemolyticus 14.30E ±0.30 15.57D±0.15 16.60 C±0.17 17.20B ±0.20 18.47A±0.41

Kết quả cho thấy cao EtOAc có khả năng kháng chủng vi khuẩn Aeromonas

dhakensis-D hiệu quả với giá trị MIC = 18 µg/mL và đường kính vòng vô khuẩn đạt

được 16.33 ±0.58 (0.3125 mg/mL) và 24.63 ±0.15 mm (5 mg/mL). Ngoài ra, tại nồng

độ 64 µg/mL, đường kính vòng vô khuẩn đạt được 29.33±0.35 mm cho rutin đối với

khuẩn A. hydrophila-D (MIC = 2.0 µg/mL), cao hơn cả kháng sinh Vancomycin HCl

(19.00±3.61 mm) với giá trị MIC đạt được là 4.0 µg/mL.

Bảng 4.26 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của chất phân lập và kháng sinh đối chứng

Mẫu thử Vi khuẩn

Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các chất phân lập ở các

nồng độ khác nhau (µg/mL)

4 8 16 32 64

Rutin

A. hydrophila –N 14.33E±0.35 15.47D±0.21 16.47C±0.25 17.83B±0.31 19.33A±0.15


A. hydrophila –D 13.60E±0.17 14.37D±0.21 16.37C±0.31 23.30B±0.27 29.33A±0.35

A. dhakensis –W 10.27E±0.15 10.73D±0.15 11.37C±0.15 12.03B±0.25 12.67A±0.15

V. parahaemolyticus 10.23E±0.21 11.40D±0.10 12.40C±0.10 16.47B±0.40 18.43A±0.40

Quercitrin

A. hydrophila –N 11.53E±0,15 12.53D±0,21 13.57C±0,12 14.63B±0,15 15.57A±0,25

A. dhakensis –D 10.60E±0,10 10.87D±0,06 11.33C±0,15 11.83B±0,06 12.57A±0,15

A. hydrophila –D 11.67E±0,25 13.57D±0,21 15.43C±0,23 17.03B±0,32 18.13A±0,32

A. dhakensis –W 12.50E±0,20 13.50D±0,10 14.50C±0,30 20.90B±0,27 22.27A±0,25

V. parahaemolyticus 10.17E±0,15 10.83D±0,06 11.47C±0,25 13.30B±0,27 14.53A±0,21

Taraxerol

A. hydrophila –N 19.27E±0.15 19.93D±0.15 22.07C±0.35 23.03B±0.32 24.50A±0.44


A. hydrophila –D 10.23E±0.21 10.80D±0.10 11.27C±0.15 13.43B±0.21 14.30A±0.30

119

A. dhakensis –W 10.30E±0.10 10.83D±0.15 11.60C±0.10 12.53B±0.15 13.47A±0.25

V. parahaemolyticus 13.43E±0.21 14.40D±0.27 15.40C±0.27 17.23B±0.21 18.57A±0.12

Cefixim

A. hydrophila –N 22.33C±0.58 23.00C±1.00 26.67B±2.31 30.67A±1.53 31.67A±0.58

A. dhakensis –D - - - 9.67B±0.58 14.33A±0.58

A. hydrophila –D 33.00D±1,000 36.00C±1.00 37.33BC±1.52 39.33AB±1.16 42.00A±2,65

A. dhakensis –W - - 9.33BC±0.58 10.00B±0.00 15.00A±1.00

V. parahaemolyticus - - - 10.00B±0.00 12.67A±0.58

Vancomy-

cin HCl

A. hydrophila –N 13.33 D ±0.58 18.67 C±0.58 19.67 B ±1.16 21.33 AB±1.53 22.33 A±0.58

A. dhakensis –D 16.33C±1.53 18.00BC±1.00 18.67ABC±0.58 19.33AB±0.58 20.67A±2.52

A. hydrophila –D 9.33B±0.58 10.33B±0.58 15.33A±2.52 16.33A±3,51 19.00A±3.61

A. dhakensis –W 14.33D±0.58 16.33C±0.58 16.67C±0.58 19.33B±0.58 20.67A±1.15

V. parahaemolyticus 11.7C±1,16 14.3B±0,58 15.3AB±1,16 16.0A B±1.0 17.30A±1.53

Ghi chú: Các giá trị có các chữ cái theo sau khác nhau trong cùng một hàng thì khác biệt có ý nghĩa

thống kê ở mức 5%.

Bảng 4.27 Kết quả MIC của các mẫu thử

Mẫu thử

Giá trị MIC (µg/mL)

A. hydrophila –N

A. dhakensis –D

A. hydrophila –D

A. dhakensis –W

V.parahaemolyticus

Cao tổng 156 78 312 156 312

Cao MeOH 312 312 312 156 156

Cao n-hexane 312 156 312 625 312

Cao EtOAc 78 18 39 78 18

Cao BuOH 78 78 78 18 39

Rutin 2.5 3.0 2.0 3.0 3.0

Quercitrin 3.0 4.0 3.0 3.0 2.0

Taraxerol 1.5 3.0 2.5 2.5 2.0

Cefixim 1.0 32 1.0 16 32

Vancomycin- HCl

3.0 2.0 4.0 2.0 3.0

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa

Hoạt tính kháng oxi hóa theo phương pháp DPPH và ABTS•+

Giá trị IC50 của các cao chiết và chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn ở từng

phương pháp và so sánh với các chất chuẩn là Vitamin C, Trolox được trình bày trong

(Bảng 4.28).

120

Bảng 4.28 Hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH và ABTS•+ của các mẫu thử

Mẫu thử IC50 (g/mL)

DPPH ABTS•+

Cao tổng ethanol 20.65 3.12 13.93 2.18

Cao n-hexane 96.82 5.65 71.82 5.39

Cao ethyl acetate 62.93 4.17 49.34 3.62

Cao n-butanol 11.43 1.28 11.59 1.69

Cao methanol 12.69 2.35 14.70 2.25

Rutin 6.43 1.03 7.57 0.85

Quercitrin 5.32 0.87 6.92 0.62

Đối chứng dương

Vitamin C 3.66 0.28 -

Trolox - 2.90 0.03

Kết quả cho thấy quercitrin và rutin (IC50 = 5.32 và 6.43 µg/mL) trung hòa gốc

tự do DPPH tương đương Vitamin C (IC50 = 4.39 µg/mL). Cao BuOH và MeOH có khả

năng trung hòa gốc tự do DPPH cao với IC50 lần lượt là 11.43 và 12.69 µg/mL; chỉ kém

Vitamin C 2.6 và 2.9 lần.

Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS•+ của quercitrin và rutin (IC50 = 6.92 và 7.57

µg/mL) thấp hơn so với chứng dương Trolox (IC50 = 2.90 µg/mL). Cao BuOH có khả

năng trung hòa gốc tự do ABTS•+ kém Trolox khoảng 4 lần.

Kết quả đánh giá khả năng kháng oxi hóa trên tế bào MIN6

Khảo sát độc tính của các cao chiết trên dòng tế bào MIN6

Dòng tế bào MIN6 được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung thêm 12%

FBS, Streptomycin và Penicilin (1:1), 1% L-Glutamine trong điều kiện 37ºC và 5% CO2.

Sự phát triển của tế bào được xác định bằng cách quan sát dưới kính hiển vi. Mật độ tế

bào được kiểm tra bằng cách đếm trong buồng đếm hồng cầu. Kết quả số lượng tế bào

phù hợp cho các thí nghiệm nghiên cứu in vitro từ 3 đến 4 ngày nuôi cấy.

Thí nghiệm khảo sát khả năng gây độc của các cao chiết thực hiện trên dòng tế

bào MIN6 dựa trên phương pháp xác định mật độ tế bào sống bằng CCK8 assay. Thí

nghiệm được lặp lại 05 lần với nghiệm thức có tế bào và môi trường nuôi cấy DMEM

là nghiệm thức đối chứng. Kết quả phần trăm tế bào sống được trình bày ở (Bảng 4.29).

121

Từ kết quả thí nghiệm trên, cho thấy tỷ lệ phần trăm tế bào sống ở nghiệm

thức tế bào được nuôi cấy trong môi trường có DMSO 0.5% có sự khác biệt

không có ý nghĩa về mặt thống kê đối với nghiệm thức đối chứng là môi trường bình

thường DMEM. Kết quả này cho thấy DMSO ở nồng độ 0.5% không có độc tính đối

với dòng tế bào MIN6. Ở các nghiệm thức môi trường nuôi cấy có cao chiết với những

nồng độ khác nhau đều có mật độ tế bào sống khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống

kê đối với nghiệm thức đối chứng chỉ có môi trường DMEM. Kết quả này cho thấy các

mẫu cao chiết ở các nồng độ khảo sát (0.01-10.00 mg/mL) không có độc tính đối với tế

bào MIN6.

Bảng 4.29 Khả năng gây độc tế bào của Cỏ sữa lá lớn

Nghiệm thức Tế bào sống sót (%)

DMEM

DMEM + DMSO 0.5%

DMEM + cao chiết 0.01 mg/mL




100a ± 0.0

96.48a ± 7.85

97.94a ± 10.99

99.50a ± 11.27

98.95a ± 8.40

102.77a ± 11.61

Ghi chú: Mỗi nghiệm thức lặp lại 5 lần. Các số liệu có cùng mẫu tự theo sau (tính theo cột) thì

không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.

Khả năng kháng oxi hóa trên tế bào MIN6

+ Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khả năng tồn tại của tế bào MIN6

Các ảnh hưởng của hydrogen peroxide đến tế bào MIN6 đã được nghiên cứu với

nhiều nồng độ khác nhau. Kết quả cho thấy khi xử lý với 0.1-0.5 mM H2O2 trong hai

giờ đã gây chết tế bào đáng kể so với đối chứng và số tế bào sống phụ thuộc vào nồng

độ H2O2 (Hình 4.23). Trên cơ sở kết quả đã đạt được và một số báo cáo trước đây [275,

276], nồng độ H2O2 0.4 mM (gây chết 51% tế bào) đã được chọn cho các thí nghiệm

tiếp theo.

122

Ghi chú: so với đối chứng *p < 0.05

Hình 4.23 Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến tế bào MIN6

+ Hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6 của các cao chiết

Ở nghiệm thức tế bào được nuôi cấy trong môi trường có H2O2 0.4 mM và bổ

sung các cao chiết, phần trăm tế bào sống cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiệm

thức môi trường nuôi cấy chỉ có H2O2. Việc bổ sung các cao chiết đã cải thiện đáng kể

số lượng tế bào sống so với các mẫu môi trường nuôi cấy chỉ có H2O2, ngoại trừ cao

n-hexane ở nồng độ 0.01 mg/mL (Hình 4.24). Ở nghiệm thức môi trường có chứa cao

EtOAc hiệu quả bảo vệ tế bào mạnh nhất và kết quả cho thấy khả năng tồn tại của tế bào

là 81% ở nồng độ 0.1 mg/mL so với đối chứng dương vitamin E (84% ở 0.2 mg/mL).

Cao tổng cho hiệu quả bảo vệ tế bào cao nhất là 78% ở nồng độ 1.0 mg/mL, trong khi

nghiệm thức xử lý với cao MeOH và cao BuOH cho thấy khả năng bảo vệ tế bào tương

đối tốt và cao n-hexane kém hiệu quả nhất.

+ Hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6 của sáu chất phân lập

Ba hợp chất chiếm hàm lượng cao đã được phân lập từ Cỏ sữa lá lớn đó là: rutin,

quercitrin và taraxerol. Ngoài ra, các hợp chất luteolin, quercetin và caffeic acid cũng

đã phân lập từ loài này và nhiều công trình công bố đã cho thấy khả năng kháng oxi hóa

tốt của chúng nên đề tài đã tiến hành thử nghiệm hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6 của sáu

hợp chất phân lập được là rutin, quercitrin, taraxerol, luteolin, quercetin và caffeic acid.

Kết quả cho thấy cả sáu hợp chất khảo sát đều có khả năng bảo vệ tế bào MIN6

khỏi sự chết do H2O2 gây ra trong khoảng nồng độ từ 1.0 đến 1000 µg/mL (Hình 4.25

và Hình 4.26) với các mức độ khác nhau. Quercitrin (10 µg/mL) và rutin (100 µg/mL)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Đối chứng 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Tế b

ào t

ồn

tại

(%

)

H2O2 (mM)

*

**

**

123

có khả năng bảo vệ tế bào khá mạnh, tương ứng với 65% và 70% tế bào tồn tại (so với

49% tế bào sống sót khi không được xử lý với các mẫu thử).

Ghi chú: so với đối chứng *p < 0.05; so với H2O2 #p < 0.05

Hình 4.24 Ảnh hưởng của cao chiết đến khả năng bảo vệ tế bào MIN6 do H2O2 gây ra

Taraxerol không có hiệu quả bảo vệ tế bào tại nồng độ 100 µg/mL và chỉ có tác

động tại nồng độ 1000 µg/mL với khả năng bảo vệ tế bào là 61%. Quercetin và luteolin

ở nồng độ 100 µg/mL có tác dụng bảo vệ tế bào mạnh nhất khi so sánh với Vitamin E

(0.2 mg/mL, 84%). Quercetin và luteolin có tác dụng tốt nhất ở 100 µg/mL (tương ứng

với 82% và 78% tế bào sống sót), trong khi các hợp chất khác cũng thể hiện khả năng

bảo vệ tế bào nhưng kém hiệu quả hơn.

Ghi chú: so với đối chứng * p < 0.05; so với H2O2 # p < 0.05

Hình 4.25 Ảnh hưởng của rutin, quercitrin, taraxerol đến khả năng bảo vệ tế bào MIN6 do

H2O2 gây ra

124

Nhiều kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước cũng đã khẳng định hoạt tính

kháng oxi hóa của Cỏ sữa lá lớn nhưng phần lớn đánh giá theo mô hình DPPH hay

ABTS•+. Lần đầu tiên hoạt tính kháng oxi hóa của Cỏ sữa lá lớn đã được tiến hành trên

dòng tế bào β tụy tạng MIN6 với mô hình dùng H2O2 gây stress oxi hóa, sau đó theo dõi

khả năng bảo vệ tế bào của các cao chiết và một số hợp chất sạch phân lập được. Kết

quả cho thấy cao EtOAc và quercetin cho hiệu quả bảo vệ tế bào cao nhất trước stress

oxi hóa gây ra bởi H2O2.

Oxi hóa là quá trình không thể thiếu đối với sinh vật hiếu khí. Các nghiên cứu

khoa học chứng tỏ rằng oxi vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa học. Đồng thời

với các quá trình đó, oxi tạo ra các chất trung gian là các gốc tự do, co hoat tınh cao,

kem bên vưng va đươc goi chung là dạng oxi hoạt động (ROS). Sự sản sinh ra nhiều

dạng oxi hoạt động được loại bỏ bằng các chất kháng oxi hóa tự nhiên. Stress oxi hóa là

hiện tượng mất cân bằng giữa việc sinh ra gốc tự do và hoạt tính bắt gốc tự do trong cơ

thể sinh vật do ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài hay bên trong cơ thể [277]. Stress

oxi hóa được xem là nguyên nhân dẫn đến nhiều căn bệnh hiểm nghèo khác như tim

mạch, alzheimer, lão hóa sớm, suy yêu hê thông miên dich... Do vậy, xu hướng nghiên

cứu gốc tự do và các chất kháng oxi hóa ngày càng được chú trọng trong lĩnh vực y,

dược nhăm phat hiên nhưng chât kháng oxi hoa mang lai nhưng tac dung tôt co lơi cho

sưc khoe con ngươi, trong đó chất kháng oxi hóa có nguồn gốc thiên nhiên hiện nay

được nhiều quốc gia, nhiều nhà khoa học quan tâm do đặc tính ít độc, dễ hấp phụ đối

với cơ thể và ít gây ra các phản ứng phụ [277, 278].

Các kết quả đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của đề tài trên thử nghiệm DPPH,

ABTS•+ và tế bào MIN6 đã củng cố thêm các nhận định trước đây về hoạt tính này của

Cỏ sữa lá lớn, đồng thời còn phát hiện thêm khả năng bảo vệ tế bào β tụy tạng MIN6

trước tác nhân oxi hóa H2O2.

125

Ghi chú: so với đối chứng *p < 0.05; so với H2O2 #p < 0.05

Hình 4.26 Ảnh hưởng của luteolin, quercetin, caffeic acid đến khả năng bảo vệ MIN6 do

H2O2 gây ra

Khả năng bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi ER stress

ER stress là một trong những nguyên nhân chính gây ra bệnh đái tháo đường và

thapsigargin (TG) được sử dụng phổ biến để nghiên cứu ER stress của tế bào [279-281].

Từ kết quả thí nghiệm trên (Hình 4.27), khi tế bào được nuôi cấy trong môi trường

DMEM có bổ sung TG (2 µM) trong 24 giờ thì mật độ tế bào (40%) thấp hơn khi tế bào

được nuôi trong môi trường bình thường DMEM (100%).

Ở nghiệm thức tế bào được nuôi cấy trong môi trường có TG và các mẫu thử,

phần trăm tế bào sống cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức môi trường nuôi

cấy chỉ có TG (Hình 4.27, Hình 4.28 và Hình 4.29). Cụ thể ở nghiệm thức môi trường

có chứa cao chiết MeOH Cỏ sữa lá lớn (0.1 mg/mL) số tế bào sống đạt 69%, cao hơn so

với môi trường chỉ có TG (40%). Một số hợp chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn (1.0 -

1000 µg/mL) được thử nghiệm đều có khả năng bảo vệ tế bào MIN6 khi bị TG gây ER

stress dẫn đến chết tế bào. Hiệu quả bảo vệ tế bào cao nhất được quan sát đối với

quercitrin (78%, 10 µg/mL). Đối với rutin và taraxerol, hiệu quả bảo vệ tế bào đạt được

cao nhất là 70% và 64% tại nồng độ 100 µg/mL. Tùy thuộc vào nồng độ (1.0-1000

µg/mL), phần trăm tế bào sống sót của nhóm được bổ sung luteolin và quercetin dao

động tương ứng từ 66% đến 69%, và từ 62% đến 70%. Như vậy, quercetin và luteolin

đã chứng minh được tác dụng bảo vệ tế bào MIN6 và cho thấy hiệu quả tối đa của chúng

ở nồng độ 10 µg/mL và caffeic acid cũng cho thấy sự bảo vệ tế bào cao nhất (68%) ở

nồng độ này.

126

Ghi chú: so với đối chứng *p < 0.05; so với TG #p < 0.05

Hình 4.27 Ảnh hưởng của cao chiết đến khả năng bảo vệ tế bào MIN6 do TG gây ra



do TG gây ra

Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh do rối loạn chuyển hóa carbohydrate với đặc trưng

là tăng glucose mạn tính. Tình trạng tăng glucose máu mạn tính chịu chi phối của nhiều

nguyên nhân khác nhau. Mạng nội chất (ER) là cơ quan chức năng chịu trách nhiệm về

gấp cuộn protein, lưu trữ canxi và tổng hợp lipid. ER stress đóng vai trò quan trọng trong

sinh bệnh học của ĐTĐ, góp phần làm chết tế bào tuyến tụy và kháng insulin ở bệnh

ĐTĐ type 2. Trong bệnh ĐTĐ type 2, tính kháng insulin mạn tính và sự suy giảm dần

chức năng của các tế bào tuyến tụy β-cell dẫn đến sự chết tế bào và rối loạn chức năng.

127

Do đó, việc bảo tồn chức năng của các tế bào tuyến tụy β-cell là một trong những mục

tiêu cần thiết để điều trị bệnh ĐTĐ type 2 [279, 280].


Hình 4.29 Ảnh hưởng của luteolin, quercetin, caffeic acid đến khả năng bảo vệ tế bào MIN6

do TG gây ra

Các nghiên cứu trước đây cho các kết quả khả quan về tiềm năng chữa bệnh ĐTĐ

của Cỏ sữa lá lớn [80, 178, 282]. Lần đầu tiên đề tài nghiên cứu về ảnh hưởng của các

cao chiết và một số hợp chất sạch phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn với mô hình sử dụng

tế bào β tụy tạng MIN6 bị gây chết bởi TG. Các kết quả thí nghiệm này cho thấy Cỏ sữa

lá lớn có khả năng bảo vệ các tế bào MIN6 trước TG, là ứng viên tiềm năng trong việc

nghiên cứu thảo dược có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường.

* Nhận xét chung:

Các kết quả phân tích về hóa học cho thấy Cỏ sữa lá lớn thu hái tại thành phố

Cần Thơ cũng thừa hưởng các đặc điểm hóa thực vật của các loài thuộc chi Euphorbia

với các lớp chất chính là flavonoid, triterpenoid; trong đó rutin, quercitrin, taraxerol

chiếm hàm lượng cao. Nhờ vậy chúng có đặc tính kháng khuẩn, kháng viêm, kháng dị

ứng, chống virus và ung thư, giúp cơ thể chống lại các tổn thương do sự oxi hóa và các

gốc tự do một cách hữu hiệu. Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy

cơ tử vong do các bệnh lý tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ

tim, xơ vữa động mạch,… Mỗi một loại flavonoid đều mang lại những lợi ích riêng,

nhưng chúng thường hoạt động hỗ trợ nhau và phổ tác dụng chồng chéo lên nhau.

Từ kết quả đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy: các cao chiết và một số hợp chất

phân lập được từ cây Cỏ sữa lá lớn thể hiện tốt hoạt tính kháng oxi hóa ở các mức độ

128

khác nhau, đặc biệt là khả năng tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra và ức chế một số vi

khuẩn gây bệnh trên cá.

Nuôi trồng thủy sản đang từng bước trở thành ngành kinh tế quan trọng của nước

ta. Trong đó, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được xem là một trong những đối

tượng nuôi chủ lực ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Tuy nhiên, trong những năm gần

đây, nghề nuôi cá tra phát triển quá nhanh, không theo quy hoạch nên bệnh trên cá tra

nuôi hiện nay xảy ra ngày càng nhiều và phức tạp, gây thiệt hại đáng kể. Kháng sinh và

hóa chất đã được sử dụng để phòng và trị bệnh, nhưng lại đưa đến hiện tượng kháng

thuốc. Nghiêm trọng hơn, sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm gây độc, ảnh hưởng sức

khỏe cho người và cũng là rào cản cho các doanh nghiệp Việt Nam trong xuất khẩu thủy

sản. Do đó, khuynh hướng chung hiện nay là nghiên cứu tìm ra những thảo dược thân

thiện thay thế kháng sinh, tăng cường hệ miễn dịch cho cá. Với cách tiếp cận như trên,

kết quả của các nghiên cứu trên đây đã mở ra tiềm năng cho Cỏ sữa lá lớn Việt Nam

nhằm có thể tạo ra các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, sử dụng thảo dược nhằm

thay thế kháng sinh, tăng cường miễn dịch cho thủy sản nhằm nâng cao chất lượng nuôi

trồng thủy sản ở nước ta.

129

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Từ toàn cây của Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) thu hái tại thành phố Cần Thơ

đề tài đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học một hợp chất mới là sodium β-D-

glucopyranosyl 12-hydroxyjasmonate (Eup16) cùng 21 hợp chất đã biết bao gồm: 11

hợp chất thuộc nhóm flavonoid: quercitrin (Eup01), rutin (Eup02), avicularin (Eup04),

astragalin (Eup05), luteolin (Eup08), quercetin (Eup09), (+)-catechin (Eup11), afzelin

(Eup14), myricitrin (Eup15), hymenoxin (Eup19) và cynaroside (Eup21); ba hợp chất

phenol: caffeic acid (Eup10), protocatechuic acid (Eup12) và gallic acid (Eup13); bốn

hợp chất nhóm triterpenoid: taraxerol (Eup06), taraxerone (Eup07), 3β,7β,25-

trihydroxy cucurbita-5,(23E)-dien-19-al (Eup03) và cycloart-23-ene-3β,25-diol

(Eup17); một hợp chất steroid: campesterol (Eup20); một hợp chất diterpen: 2β,16α,19-

trihydroxy-ent-kaurane (Eup23) cùng với một hợp chất khác: 1-O-benzyl-rutinoside

(Eup18). Trong đó, có bảy hợp chất lần đầu được phân lập từ loài này, đó là: avicularin

(Eup04), (+)-catechin (Eup11), hymenoxin (Eup19), cynaroside (Eup21), 3β,7β,25-

trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al (Eup03), cycloart-23-ene-3β,25-diol (Eup17)

và 1-O-benzyl-rutinoside (Eup18).

Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy:

Cao chiết Cỏ sữa lá lớn có khả năng tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra thông

qua việc gia tăng hoạt tính lysozyme, bổ thể và tổng kháng thể.

Hợp chất Eup02 (rutin) thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn A. hydrophila-D tốt

với giá trị đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất là 29.33 ±0.35 mm tại nồng độ 64

µg/mL và hợp chất Eup06 (taraxerol) đạt 24.50±0.44 mm đối với khuẩn A.

hydrophila-N cũng tại nồng độ 64 µg/mL.

Hợp chất Eup01 (quercitrin) và Eup02 (rutin) thể hiện hiệu quả trung hòa gốc tự

do DPPH và ABTS•+ cao với giá trị IC50 tương ứng là 5.32; 6.43 và 6.92; 7.57

µg/mL khi so sánh với chất đối chứng dương vitamin C (3.66 µg/mL) và trolox

(2.90 µg/mL). Khả năng kháng oxi hóa còn được khảo nghiệm qua khả năng bảo

vệ tế bào β tụy tạng MIN6 trên mô hình sử dụng H2O2 gây chết tế bào và so sánh

với đối chứng dương là vitamin E (0.2 mg/mL), kết quả cho thấy cao EtOAc (0.1

130

mg/mL) và hợp chất Eup09 (quercetin) với nồng độ 100 µg/mL cho hiệu quả bảo

vệ tế bào mạnh nhất với % tế bào sống sót lần lượt là 81% và 82% đối chiếu với

49% tế bào sống sót khi không có mẫu thử.

Cỏ sữa lá lớn có khả năng bảo vệ tế bào MIN6 chống lại sự chết do thapsigargin

gây ra, trong đó hiệu quả bảo vệ tế bào cao nhất là cao MeOH và hợp chất Eup01

(quercitrin) với tỉ lệ tế bào sống sót đạt lần lượt là 69% và 78%; cao hơn so với

môi trường chỉ có thapsigargin (40% tế bào sống sót).

2. Kiến nghị

Từ các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Cỏ

sữa lá lớn đã cho thấy có nhiều hợp chất flavonoid (11/22 chất) được phân lập cùng với

sự ứng dụng sinh học đa dạng, tiềm năng của loài cây này. Tuy nhiên hiện nay Cỏ sữa

lá lớn vẫn chưa được ứng dụng và khai thác nhiều ở Việt Nam. Vì vậy, cần thêm các

nghiên cứu sinh học và dược học để khẳng định thêm giá trị khoa học của loài cây này,

góp phần trong việc tạo ra các sản phẩm phục vụ cuộc sống, đặc biệt là trong thủy sản.

3. Những đóng góp mới của luận án

Lần đầu tiên cây Cỏ sữa lá lớn ở Việt Nam được nghiên cứu khá toàn diện về

thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, kết quả cho thấy ngoài các thành phần hóa

thực vật đặc trưng cho chi và loài, loài Euphorbia hirta L. ở Cần Thơ cũng xuất hiện

hợp chất có cấu trúc riêng (Eup16 - hợp chất mới). Điều này cho thấy tuy thuộc cùng

một loài Euphorbia hirta L., với con đường sinh tổng hợp gần như giống nhau, nhưng

do sự thay đổi về điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng nên giữa các loài mọc ở những nơi khác

nhau vẫn có sự sai biệt nhỏ về thành phần hóa học. Đó chính là điều thú vị của các hợp

chất thiên nhiên, góp phần tạo nên sự đa dạng và phong phú về cấu trúc hóa học của các

hợp chất thứ cấp, thông qua đó giúp các nhà khoa học có cơ hội phát hiện thêm và đánh

giá các hoạt tính mới của chúng.

Từ toàn cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) thu hái tại thành phố Cần Thơ,

cho thấy trong 22 hợp chất sạch phân lập được có một hợp chất mới và bảy hợp chất lần

đầu tiên được phân lập từ loài cây này.

Lần đầu tiên thử nghiệm hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra; hoạt tính

kháng khuẩn gây bệnh trên thủy sản; hoạt tính kháng oxi hóa bằng các phương pháp hóa

131

học thường quy như DPPH, ABTS•+. Lần đầu tiên đề tài đã khảo sát hoạt tính kháng oxi

hóa trên dòng tế bào β tụy tạng MIN6 với mô hình dùng H2O2 gây stress oxi hóa và dùng

thapsigargin gây ER stress, để đánh giá khả năng bảo vệ tế bào của các cao chiết và một

số hợp chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn. Các kết quả này góp phần cung cấp thêm

cơ sở khoa học cho các nghiên cứu sâu hơn để khai thác các giá trị gia tăng của Cỏ sữa

lá lớn ứng dụng trong y dược và nuôi trồng thủy sản.

132

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

1. Le Thi Bach, Le Tien Dung, Joëlle Quetin-Leclercq, Patrick Kestemont, Marie-

Louise Scippo, Nguyen Thanh Phuong, Nguyen Le Anh Dao, Nguyen Trong

Tuan, Le Thi Tuyet Nhi và Bui Thi Buu Hue, The flavonoid isolation và

antioxidant activity of Euphorbia hirta L. extracts, Vietnam Journal of chemistry,

2017, 55 (5E3,4), 568-573.

2. Le Thi Bach, Le Tien Dung, Nguyen Quoc Chau Thanh, Nguyen Trong Tuan,

Nguyen Thanh Phuong, Patrick Kestemont, Joëlle Quetin-Leclercq và Bui Thi

Buu Hue, Antioxidative activity of some medicial plants in the Mekong delta of

Vietnam via protection of pancreatic MIN6 β-cells against hydrogen peroxide-

induced apoptosis, Journal of Analytical Sciences, 2018, 23 (2), 190-197.

3. Le Thi Bach, Le Tien Dung, Nguyen Trong Tuan, Nguyen Thanh Phuong, Joëlle

Quetin-Leclercq và Bui Thi Buu Hue, Protective effect of pancreatic β-cells

MIN6 by some medicinal plants in the Mekong Delta, Vietnam Journal of

chemistry, 2018, 56 (5), 636-640.

4. Le Thi Bach, Le Tien Dung, Nguyen Trong Tuan, Nguyen Quoc Chau Thanh,

Joëlle Quetin-Leclercq và Bui Thi Buu Hue, The protective effect of some

extracts và isolated compounds from Euphorbia hirta on pancreatic β-cells

MIN6, Vietnam Journal of Science và Technology, 2018, 56 (4A), 163-170.

5. Le Thi Bach, Le Tien Dung, Nguyen Trong Tuan, Nguyen Thanh Phuong, Joëlle

Quetin-Leclercq và Bui Thi Buu Hue, Antioxidant activity against hydrogen

peroxide-induced cytotoxicity of Euphorbia hirta L., AIP Proceeding

(SCOPUS), 2018, 2049 (000318), 1-6.

6. Le Thi Bach, Le Tien Dung, Mai Van Hieu, Do Cong Minh, Tong Thanh Danh

và Bui Thi Buu Hue, Chemical investigation of Euphorbia hirta L., Vietnam

Journal of chemistry, 2019, 57 (4e3,4), 327-332.

7. Le Thi Bach, Bui Thi Buu Hue, Nguyen Thu Thu Tram, Do Nguyen Anh Thu,

và Le Tien Dung, Chemical constituents from n-hexane và ethyl acetate extracts

of Euphorbia hirta L. grown in Vietnam, IOP Conference Series: Materials

Science và Engineering, 2020, 736 022083.

133

8. Le Thi Bach, Nguyen Trong Tuan, Tran Chi Linh, Đong Ngoc Bich Ngan,

Huynh Thị Ngọc Anh, Huynh Thi Ngoc Hong và Bui Thi Buu Hue. Investigation

of bioactivities from Euphorbia hirta L. extract, Journal of Analytical Sciences,

2020, 25 (2), 41-45.

9. Truong Quynh Nhu, Bui Thi Bich Hang, Le Thi Bach, Bui Thi Buu Hue, Joëlle

Quetin-Leclercq, Marie-Louise Scippo, Nguyen Thanh Phuong và Patrick

Kestemont, Plant extract-based diets differently modulate immune responses và

resistance to bacterial infection in striped catfish (Pangasianodon

hypophthalmus), Fish và Shellfish Immunology, 2019, 92, 913-924.

10. Truong Quynh Nhu, Bui Thi Bich Hang, Anais Vinikas, Le Thi Bach, Bui Thi

Buu Hue, Do Thi Thanh Huong, Joëlle Quetin-Leclercq, Marie-Louise Scippo,

Nguyen Thanh Phuong và Patrick Kestemont, Screening of immuno-modulatory

potential of different herbal plant extracts using striped catfish (Pangasianodon

hypophthalmus) leukocyte-based in vitro tests, Fish và Shellfish Immunology,

2019, 93, 296–307.

134

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyen Nghia Thin, Taxonomy of Euphorbiaceae in Vietnam, 2007, Vietnam National

University Publishers.

2. G. L. Webster, The saga of the spurges: a review of classification and relationships in the

Euphorbiales, Botanical Journal of the Linnean Society, 1987, 94 (1-2), 3-46.

3. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, 2012, Nhà xuất bản Y học.

4. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam tập 2, 2003, Nhà xuất bản Trẻ.

5. Y. Da Song, H. Qiu Xia, Y. Yong Ping, L. Ke Chun and L. Xiao Li, Chemical constituents

of Euphorbia tibetica and their biological activities of Strobilanthes crispus L., Chinese Journal

of Natural Medicines, 2014, 12 (1), 38-42.

6. S. Shadi, H. Saeidi, M. Ghanadian, M. R. Rahimnejad, M. Aghaei, S. M. Ayatollahi and M.

I. Choudhary, New macrocyclic diterpenes from Euphorbia connata Boiss. with cytotoxic

activities on human breast cancer cell lines, Natural Product Research, 2015, 29 (7), 607-614.

7. Q. Shi, Y. W. Sun and D. Meng, Phytochemical and cytotoxic studies on the roots of

Euphorbia fischeriana, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2017, 27 (2), 266-270.

8. Q.-G. Ma, W.-Z. Liu, X.-Y. Wu, T.-X. Zhou and G.-W. Qin, Diterpenoids from Euphorbia

fischeriana, Phytochemistry, 1997, 44 (4), 663-666.

9. W.-J. Yuan, G.-P. Yang, J.-H. Zhang, Y. Zhang, D.-Z. Chen, S.-L. Li, Y.-T. Di and X.-J.

Hao, Three new diterpenes with cytotoxic activity from the roots of Euphorbia ebracteolata

Hayata, Phytochemistry Letters, 2016, 18, 176-179.

10. S. Yang, H. Lu and Y. Zhang, Bioassay-guided separation of anti-tumor components from

Euphorbia kansui by means of two-dimensional preparative high performance liquid

chromatography and real-time cell analysis, Analytical Sciences, 2016, 32 (5), 581-586.

11. C. Valente, M. Pedro, J. R. Ascenso, P. M. Abreu, M. S. J. Nascimento and M.-J. U.

Ferreira, Euphopubescenol and euphopubescene, two new jatrophane polyesters, and lathyrane-

type diterpenes from Euphorbia pubescens, Planta Medica, 2004, 70 (03), 244-249.

12. B. Deng, S. Z. Mu, J. X. Zhang and X. J. Hao, New diterpenoids from the roots of

Euphorbia ebracteolata Hayata, Natural Product Research, 2010, 24 (16), 1503-1509.

13. A. Vasas, E. Sulyok, D. Redei, P. Forgo, P. Szabo, I. Zupko, A. Berenyi, J. Molnar and J.

Hohmann, Jatrophane diterpenes from Euphorbia esula as antiproliferative agents and potent

135

chemosensitizers to overcome multidrug resistance, Journal of Natural Medicines, 2011, 74

(6), 1453-1461.

14. L. Liu, J. Meng, S. Wu, X. Li, X. Zhao and R. Tan, New macrocyclic diterpenoids from

Euphorbia esula, Planta medica, 2002, 68 (03), 244-248.

15. D. Redei, N. Kusz, M. Szabo, G. Pinke, I. Zupko and J. Hohmann, First phytochemical

investigation of secondary metabolites of Euphorbia davidii Subils. and antiproliferative

activity of its extracts, Acta Biologica Hungarica 2015, 66 (4), 464-467.

16. J. Hohmann, J. Molnár, D. Rédei, F. Evanics, P. Forgo, A. Kálmán, G. Argay and P. Szabó,

Discovery and biological evaluation of a new family of potent modulators of multidrug

resistance: reversal of multidrug resistance of mouse lymphoma cells by new natural jatrophane

diterpenoids isolated from Euphorbia species, Journal of Medicinal Chemistry, 2002, 45 (12),

2425-2431.

17. D. Rédei, K. Boros, P. Forgo, J. Molnár, Z. Kele, I. Pálinkó, G. Pinke and J. Hohmann,

Diterpene constituents of Euphorbia exigua L. and multidrug resistance reversing activity of

the isolated diterpenes, Chemistry and Biodiversity, 2015, 12 (8), 1214-1221.

18. N. Duarte, N. Gyémánt, P. M. Abreu, J. Molnár and M. J. U. Ferreira, New macrocyclic

lathyrane diterpenes, from Euphorbia lagascae, as inhibitors of multidrug resistance of tumour

cells, Planta medica, 2006, 72 (02), 162-168.

19. H. W. Tao, X. J. Hao, P. P. Liu and W. M. Zhu, Cytotoxic macrocyclic diterpenoids from

Euphorbia helioscopia, Archives of Pharmacal Research, 2008, 31 (12), 1547-1551.

20. R. Rozimamat, N. Kehrimen, J. Gao, H. R. Ma and H. A. Aisa, Two new triterpenes from

Euphorbia alatavica, Journal of Asian Natural Products Research 2017, 19 (10), 966-973.

21. F. Cateni, J. Zilic, G. Falsone, G. Scialino and E. Banfi, New cerebrosides from Euphorbia

peplis L.: antimicrobial activity evaluation, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2003,

13 (24), 4345-4350.

22. A. A. El-Bassuony, Antibacterial activity of new polyester diterpenes from Euphorbia

guyoniana, Asian Journal of Chemistry, 2007, 19 (6), 4553-4560.

23. M. Ramezani, J. Behravan, M. Arab and S. A. Farzad, Antiviral activity of Euphorbia

helioscopia extracts, Journal of Biological Sciences, 2008, 8 (4), 809-813.

24. L. Avila, M. Perez, G. Sanchez-Duffhues, R. Hernández-Galán, E. Muñoz, F. Cabezas, W.

Quiñones, F. Torres and F. Echeverri, Effects of diterpenes from latex of Euphorbia lactea and

136

Euphorbia laurifolia on human immunodeficiency virus type 1 reactivation, Phytochemistry,

2010, 71 (2-3), 243-248.

25. Y. Tian, W. Xu, C. Zhu, S. Lin, Y. Li, L. Xiong, S. Wang, L. Wang, Y. Yang and Y. Guo,

Lathyrane diterpenoids from the roots of Euphorbia micractina and their biological activities,

Journal of Natural Products, 2011, 74 (5), 1221-1229.

26. L. M. Bedoya, N. Márquez, N. Martínez, S. Gutiérrez-Eisman, A. Álvarez, M. A. Calzado,

J. M. Rojas, G. Appendino, E. Muñoz and J. Alcamí, SJ23B, a jatrophane diterpene activates

classical PKCs and displays strong activity against HIV in vitro, Biochemical Pharmacology,

2009, 77 (6), 965-978.

27. A. Karimi, M. Mohammadi-Kamalabadi, M. Rafieian-Kopaei and L. Amjad, Determination

of antioxidant activity, phenolic contents and antiviral potential of methanol extract of

Euphorbia spinidens Bornm (Euphorbiaceae), Tropical Journal of Pharmaceutical Research,

2016, 15 (4), 759-764.

28. J. Xu, Y. Guo, C. Xie, Y. Li, J. Gao, T. Zhang, W. Hou, L. Fang and L. Gui, Bioactive

myrsinol diterpenoids from the roots of Euphorbia prolifera, Journal of Natural Products,

2011, 74 (10), 2224-2230.

29. J. Xu, D. Jin, P. Guo, C. Xie, L. Fang and Y. Guo, Three new myrsinol diterpenes from

Euphorbia prolifera and their neuroprotective activities, Molecules, 2012, 17 (8), 9520-9528.

30. E. Barile, E. Fattorusso, A. Ialenti, A. Ianaro and V. Lanzotti, Paraliane and pepluane

diterpenes as anti-inflammatory agents: first insights in structure–activity relationships,

Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2007, 17 (15), 4196-4200.

31. J. S. Chang, S. W. Lee, M. H. Park, M. S. Kim, B. I. Hudson, S.-J. Park, W. S. Lee and M.-

C. Rho, Kansuinine A and Kansuinine B from Euphorbia kansui L. inhibit IL-6-induced Stat3

activation, Planta Medica, 2010, 76 (14), 1544-1549.

32. M. Ghannadian, A. Akhavan, O. Abdalla, A. Ayatollahi, M. Mohammadi-Kamalabadi and

H. Ghazanfari, Triterpenes from Euphorbia spinidens with immunomodulatory activity,

Research in Pharmaceutical Sciences, 2013, 8 (3), 205-210.

33. K. Gaur, A. Rana, L. Chauhan, C. Sharma, R. Nema and M. Kori, Investigation of

immunomodulatory potential of Euphorbia neriifolia Linn. Against betamethasone induced

immunosuppression, International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical Research,

2009, 2 (1), 8-11.

137

34. G. R. Battu, S. R. Ethadi, G. V. Priya, K. S. Priya, K. Chandrika, A. V. Rao and S. O.

Reddy, Evaluation of antioxidant and anti-inflammatory activity of Euphorbia heyneana

Spreng, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2011, 1 (2), S191-S194.

35. A. Barla, M. Öztürk, Ş. Kültür and S. Öksüz, Screening of antioxidant activity of three

Euphorbia species from Turkey, Fitoterapia, 2007, 78 (6), 423-425.

36. H. Nazemiyeh, E. M. Kazemi, K. Zare, M. Jodari, L. Nahar and S. D. Sarker, Free radical

scavengers from the aerial parts of Euphorbia petiolata, Journal of Natural Medicines, 2010,

64 (2), 187-190.

37. M. Mansuri and V. Patel, Anti-diabetic potential of Euphorbia neriifolia Linn. Alloxan

Induced Diabetic Rats, Journal of Pharmacy Research, 2012, 5 (5), 2571-2573.

38. G. R. Parmar, K. Pundarikakshudu and R. Balaraman, Antidiabetic and antihyperlipidemic

activity of Euphorbia thymifolia L. extracts on streptozotocin-nicotinamide induced type 2

diabetic rats, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 2017, 7 (08), 078-084.

39. S. N. Liu, D. Huang, S. L. Morris-Natschke, H. Ma, Z. H. Liu, N. P. Seeram, J. Xu, K. H.

Lee and Q. Gu, Euphomilones A and B, ent-rosane diterpenoids with 7/5/6 and 5/7/6 Skeletons

from Euphorbia milii, Organic Letters, 2016, 18 (23), 6132-6135.

40. Y. Kuang, S. Y. Fu, F. Wang, F. C. Ren, D. F. Yang, S. X. Yang and Y. Gao, Two new ent-

atisane diterpenoids from the whole plants of Euphorbia wallichii, Natural Product Research,

2017, 31 (7), 849-852.

41. B. N. Su, E. J. Park, Z. H. Mbwambo, B. D. Santarsiero, A. D. Mesecar, H. H. Fong, J. M.

Pezzuto and A. D. Kinghorn, New chemical constituents of Euphorbia quinquecostata and

absolute configuration assignment by a convenient mosher ester procedure carried out in NMR

tubes, Journal of Natural Products, 2002, 65 (9), 1278-1282.

42. C. Valente, M. J. Ferreira, P. M. Abreu, N. Gyémánt, K. Ugocsai, J. Hohmann and J.

Molnár, Pubescenes, jatrophane diterpenes, from Euphorbia pubescens, with multidrug

resistance reversing activity on mouse lymphoma cells, Planta Medica, 2004, 70 (01), 81-84.

43. D. Geng, L. J. Weng, Y. Y. Han and X. Yang, Chemical Constituents from Euphorbia

helioscopia, Advanced Materials Research, 2011, 396, 1337-1340.

44. Y.-Q. Chi, L. Wang, W.-B. Ouyang, Y.-T. Ma, M.-M. Yu, Z. Zang, Y. Zhao, S.-X. Huang

and Y. Zhao, A New Myrinsol Diterpenoid Ester from Euphorbia dracunculoides, Chemistry

of Natural Compounds, 2016, 52 (6), 1041-1043.

138

45. J. Y. Tsai, D. Redei, P. Forgo, Y. Li, A. Vasas, J. Hohmann and C. C. Wu, Isolation of

phorbol esters from Euphorbia grandicornis and evaluation of protein kinase C- and human

platelet-activating effects of Euphorbiaceae diterpenes, Journal of Natural Medicines, 2016, 79

(10), 2658-2666.

46. F. Dal Piaz, M. B. Vera Saltos, S. Franceschelli, G. Forte, S. Marzocco, T. Tuccinardi, G.

Poli, S. Nejad Ebrahimi, M. Hamburger, N. De Tommasi and A. Braca, Drug affinity responsive

target stability (DARTS) identifies Laurifolioside as a new clathrin heavy chain modulator,

Journal of Natural Medicines, 2016, 79 (10), 2681-2692.

47. H. M. Shi, I. D. Williams, H. H. Y. Sung, H. X. Zhu, N. Y. Ip and Z. D. Min, Cytotoxic

diterpenoids from the roots of Euphorbia ebracteolata, Planta medica, 2005, 71 (04), 349-354.

48. E. Sulyok, A. Vasas, D. Rédei, P. Forgo, Z. Kele, G. Pinke and J. Hohmann, New

premyrsinane-type diterpene polyesters from Euphorbia falcata, Tetrahedron, 2011, 67 (38),

7289-7293.

49. J. Jakupovic, T. Morgenstern, M. Bittner and M. Silva, Diterpenes from Euphorbia peplus,

Phytochemistry, 1998, 47 (8), 1601-1609.

50. J. A. Marco, J. F. Sanz-Cervera, A. Yuste, J. Jakupovic and J. Lex, Terracinolides A and

B, two bishomoditerpene lactones with a novel carbon framework from Euphorbia terracina,

The Journal of Organic Chemistry, 1996, 61 (5), 1707-1709.

51. S. Öksüz, F. Gürek, L.-z. Lin, R. R. Gil, J. M. Pezzuto and G. A. Cordell, Aleppicatines A

and B from Euphorbia aleppica, Phytochemistry, 1996, 42 (2), 473-478.

52. J. Hohmann, P. Forgo, D. Csupor and G. Schlosser, Isolation and structure determination

of new jatrophane diterpenoids from Euphorbia platyphyllos L., Helvetica Chimica Acta, 2003,

86 (10), 3386-3393.

53. Cầm Thị Ính, Nguyễn Thị Hồng Vân, Phạm Minh Quân, Trần Thị Quỳnh Trang, Trịnh Anh

Viên, Nguyễn Thị thủy và Đỗ Thị Thảo, Diterpenoid mới được phân lập từ cây thuốc giấu

Euphorbia tithymaloides (P.), Vietnam Journal of Chemistry, 2016, 54 (3), 274-279.

54. S. Öksuz, A. Ulubelen, A. Barla and W. Voelter, Terpenoids and aromatic compounds from

Euphorbia heteradena, Turkish Journal of Chemistry, 2002, 26 (4), 457-464.

55. P. Li, Z. X. Feng, D. Ye, W. Huan, W. Da Gang and L. X. Dong, Chemical constituents

from the whole plant of Euphorbia altotibetic, Helvetica Chimica Acta, 2003, 86 (7), 2525-

2532.

139

56. Z. Q. Yin, C. L. Fan, W. C. Ye, R. W. Jiang, C. T. Che, T. C. Mak, S. X. Zhao and X. S.

Yao, Acetophenone derivatives and sesquiterpene from Euphorbia ebracteolata, Planta

medica, 2005, 71 (10), 979-982.

57. G. M. Fu, B. Y. Yu and D. N. Zhu, Two novel phloroglucinol derivatives from Euphorbia

ebracteolata Hayata, Journal of Asian Natural Products Research 2006, 8 (1-2), 149-153.

58. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung

Đàm và Vũ Ngọc Lộ, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, 2004, Nhà xuất bản Khoa

học và Kỹ thuật.

59. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, 2007, Nhà xuất bản Y học.

60. Võ Văn Chi, Từ điển thực vật thông dụng, 2003, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

61. S. Kumar, R. Malhotra and D. Kumar, Euphorbia hirta: Its chemistry, traditional and

medicinal uses, and pharmacological activities, Pharmacognosy Reviews, 2010, 4 (7), 58.

62. B. Joshi, The magical herb “Euphorbia hirta L.” An important traditional therapeutic herb

for wart disease among the Vangujjars of forest near Kashipur, Uttarakhand, New York Science

Journal, 2011, 4 (2), 96-97.

63. J. Wong, Y. Chen, S. Chakravarthi, J. Judson, L. Raj and H. Er, The effects of Euphorbia

hirta on the ultrastructure of the murine liver, kidney and aorta, Experimental and Therapeutic

Medicine, 2013, 6 (5), 1247-1250.

64. M. Rahmatullah, M. A. H. Mollik, A. A. Azam, M. R. Islam, M. A. M. Chowdhury, R.

Jahan, M. H. Chowdhury and T. Rahman, Ethnobotanical survey of the Santal tribe residing in

Thakurgaon district, Bangladesh, American-Eurasian Journal of Sustainable Agriculture,

2009, 889-899.

65. S. L. A. Kadir, H. Yaakob and R. M. Zulkifli, Potential anti-dengue medicinal plants: a

review, Journal of Natural Medicines, 2013, 67 (4), 677-689.

66. Lê Thị Thanh Hương, Hà Văn Quân, Đoàn Văn Vệ và Nguyễn Trung Thành, Điều tra cây

thuốc và kinh nghiệm sử dụng cây thuốc của đồng bào dân tộc Tày ở xã Văn An, huyện Văn

Quan, tỉnh Lạng Sơn, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 2015,

31 (4), 45-55.

67. V. Pratheepa and N. Sukumaran, Effect of Euphorbia hirta plant leaf extract on

immunostimulant response of Aeromonas hydrophila infected Cyprinus carpio, PeerJ, 2014,

2, 1-17.

140

68. K. V. Ramesh and K. Padmavathi, Assessment of immunomodulatory activity of Euphorbia

hirta L., Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2010, 72 (5), 621-625.

69. S. F. Ahmad, B. Khan, S. Bani, A. Kaul, P. Sultan, S. A. Ali, N. Satti, S. A. Bakheet, S. M.

Attia and K. M. Zoheir, Immunosuppressive effects of Euphorbia hirta in experimental

animals, Inflammopharmacology, 2013, 21 (2), 161-168.

70. S. Perumal, R. Mahmud, S. Pillai, W. C. Lee and S. Ramanathan, Antimicrobial activity

and cytotoxicity evaluation of Euphorbia hirta L. extracts from Malaysia, Apcbee Procedia,

2012, 2, 80-85.

71. M. A. Rajeh, Z. Zuraini, S. Sasidharan, L. Y. Latha and S. Amutha, Assessment of

Euphorbia hirta L. leaf, flower, stem and root extracts for their antibacterial and antifungal

activity and brine shrimp lethality, Molecules, 2010, 15 (9), 6008-6018.

72. G. Singh and P. Kumar, Phytochemical study and screening for antimicrobial activity of

flavonoids of Euphorbia hirta, International Journal of Applied and Basic Medical Research,

2013, 3 (2), 111-116.

73. Cao Huy Bình, Phạm Bá Hạnh, Nguyễn Ngọc Cầu, Nguyễn Thu Hằng và Đỗ Thị Hà, Phân

lập, xác định cấu trúc và đánh giá tác dụng chống oxy hóa của một số flavonoid từ Cỏ sữa lá

lớn (Euphorbia hirta L.), Tạp chí Dược học, 56 (2), 48-52.

74. N. K. Sharma, S. Dey and R. Prasad, In vitro antioxidant potential evaluation of Euphorbia

hirta L., Pharmacologyonline, 2007, 1, 91-98.

75. A. A. Basma, Z. Zakaria, L. Y. Latha and S. Sasidharan, Antioxidant activity and

phytochemical screening of the methanol extracts of Euphorbia hirta L., Asian Pacific Journal

of Tropical Medicine, 2011, 4 (5), 386-390.

76. N. Sharma, K. W. Samarakoon, R. Gyawali, Y. H. Park, S. J. Lee, S. J. Oh, T. H. Lee and

D. K. Jeong, Evaluation of the antioxidant, anti-inflammatory, and anticancer activities of

Euphorbia hirta ethanolic extract, Molecules, 2014, 19 (9), 14567-81.

77. M. F. Shih, Y. D. Cheng, C. R. Shen and J. Y. Cherng, A molecular pharmacology study

into the anti-inflammatory actions of Euphorbia hirta L. on the LPS-induced RAW 264.7 cells

through selective iNOS protein inhibition, Journal of Natural Medicines, 2010, 64 (3), 330-

335.

78. R. Widharna, A. Soemardji, K. Wirasutisna and L. Kardono, Anti diabetes mellitus activity

in vivo of ethanolic extract and ethyl acetate fraction of Euphorbia hirta L. herb, International

Journal of Pharmacology, 2010, 6 (3), 231-240.

141

79. P. Tamboli, P. Patil, V. Patil and S. Surana, Hypoglycemic and anti diabetic effect of

ethanolic extract of Euphorbia hirta Linn, RC Patel Institute of Pharmaceutical Education and

Research, Shirpur, India, 2008, 1, 159-164.

80. S. Kumar and D. Kumar, Evaluation of antidiabetic activity of Euphorbia hirta Linn. in

streptozotocin induced diabetic mice, Indian Journal of Natural Products and Resources, 2010,

1 (2), 200-203.

81. S. K. Rashmi and D. Kumar, Antidiabetic effect of Euphorbia hirta leaves in alloxan

induced diabetic mice, Pharmacologyonline, 2010, 1, 61-69.

82. Nguyễn Mạnh Thắng, Nguyễn Công Khẩn, Trương Tuyết Mai, Trương Hoàng Kiên và

Phạm Thị Nguyệt Hằng, Nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường thực nghiệm và tính an

toàn của cao chiết nước cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.), Tạp chí Dược học, 57 (9), 51-53.

83. Đặng Thúy Hồng, Nghiên cứu đặc tính sinh dược học của Cỏ sữa lá lớn, Trường Đại học

Sư phạm Hà nội, 2013, Luận văn cao học.

84. S. B. Patil and C. Magdum, Phytochemical investigation and antitumour activity of

Euphorbia hirta Linn, European Journal of Experimental Biology, 2011, 1, 51-56.

85. H. R. Katti, P. Singh, A. Ramkishan, V. M. Chandrashekhar, C. Sowmya and M. A. Panji,

Anti-inflammatory activity of Matricaria recutita L. against acute and chronic inflammatory

models, Science, Technology and Arts Research Journal, 2014, 3 (1), 01-08.

86. J. Galvez, A. Zarzuelo, M. Crespo, M. Lorente, M. Ocete and J. Jimenez, Antidiarrhoeic

activity of Euphorbia hirta extract and isolation of an active flavonoid constituent, Planta

Medica, 1993, 59 (04), 333-336.

87. D. S. Loh, H. M. Er and Y. S. Chen, Mutagenic and antimutagenic activities of aqueous

and methanol extracts of Euphorbia hirta, Journal of Ethnopharmacology, 2009, 126 (3), 406-

414.

88. E.-T. Li, K.-H. Liu, M.-H. Zang, X.-L. Zhang, H.-Q. Jiang, H.-L. Zhou, D.-Y. Wang, J.-G.

Liu, Y.-L. Hu and Y. Wu, Chemical constituents from Euphorbia hirta, Biochemical

Systematics and Ecology, 2015, 62, 204-207.

89. Y. Wu, W. Qu, D. Geng, J.-Y. Liang and Y.-L. Luo, Phenols and flavonoids from the aerial

part of Euphorbia hirta, Chinese Journal of Natural Medicines, 2012, 10 (1), 40-42.

90. D. Geng, L. J. Weng, Y. Y. Han and X. Yang, Chemical constituents from Euphorbia

helioscopia, Advanced Materials Research, 2012, 396, 1337-1340.

142

91. F. Zhan, Y. Lu, W. Kamil and K. Ablajan, Chemical constituents of Euphorbia sororia

from Xinjiang, Chemistry of Natural Compounds, 2015, 51 (3), 561-562.

92. K. Nurmuhammat, R. Rushangul and A. Hajiakber, Chemical constituents from the dregs

of Euphorbia alatavica, Chinese Traditional Patent Medicine, 2018, 40 (5), 1113-1115.

93. W. Zhang, G. Yang, Q. Li, X. Zhang and W. Ye, Studies on chemical constituents of

Euphorbia sororia, China Journal of Chinese Materia Medica, 2006, 31 (20), 1694-1696.

94. R.-B. An, J.-W. Kwon, T.-O. Kwon, W.-T. Chung, H.-S. Lee and Y.-C. Kim, Chemical

constituents from the whole plants of Euphorbia supina Rafin, Korean Journal of

Pharmacognosy, 2007, 38 (3), 291-295.

95. A. R. Abdel-Monem, E. Abdel-Sattar, F. M. Harraz and F. Petereit, Chemical investigation

of Euphorbia schimperi C. Presl, Records of Natural Products, 2008, 2 (2), 39-45.

96. P. Devendar, K. S. Srinivas, J. K. Kumar, T. S. Kumar, S. Bhagel and K. Sastry,

Phytochemical investigation, antioxidant and antifungal activities of rhizomes of Euphorbia

fusiformis, Pharmacognosy Journal, 2014, 6 (4), 78-82.

97. O. Ekpo and E. Pretorius, Asthma, Euphorbia hirta and its anti-inflammatory properties,

South African Journal of Science, 2007, 103 (5-6), 201-203.

98. V. Anjaneyulu and K. Ravi, Terpenoids from Euphorbia antiquorum, Phytochemistry,

1989, 28 (6), 1695-1697.

99. E. M. Lima, J. M. Medeiros and L. B. Davin, Pentacyclic triterpenes from Euphorbia

stygiana, Phytochemistry, 2003, 63 (4), 421-425.

100. Phan Minh Giang, Đỗ Ngọc Cương, Nguyễn Thị Điệp và Phan Tống Sơn, Nghiên cứu các

thành phần hóa học của cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L., Euphorbiaceae). Tạp chí Hóa

học, 2012, 50 (4), 440-443.

101. Y. Aynehchi, M. Mojtabaii and K. Yazdizadeh, Chemical examination of Euphorbia

myrsinitis Linn, Journal of Pharmaceutical Sciences, 1972, 61 (2), 292-293.

102. V. Anju, A. Singh, G. Shilpa, B. Kumar, S. Priya, B. Sabulal and K. Rameshkumar,

Terpenes and biological activities of Euphorbia tortilis, Letters in Organic Chemistry, 2018,

15 (3), 221-225.

103. M. Abu-Sayeed, M. A. Ali, P. Bhattacharjee, A. Islam, G. Astaq, M. Khan and S. Yeasmin,

Biological evaluation of extracts and triterpenoids of Euphorbia hirta, Pakistan Journal of

Scientific and Industrial Research, 2005, 48 (2), 122-125.

143

104. C. Y. Ragasa and K. B. Cornelio, Triterpenes from Euphorbia hirta and their cytotoxicity,

Chinese Journal of Natural Medicines, 2013, 11 (5), 528-533.

105. H. J. Yu, C. C. Shen, H. M. Yi, T. H. Chen, M. L. Hsueh, C. C. Lin and M. J. Don,

Euphorbiane: A novel triterpenoid with an unprecedented skeleton from Euphorbia tirucalli,

Journal of the Chinese Chemical Society, 2013, 60 (2), 191-194.

106. Y. Huang, H. Aisa and M. Isaev, Isoprenoids of Euphorbia sororia. I. Triterpenoids,

Chemistry of Natural Compounds, 2009, 45 (6), 921-924.

107. T. Ogunnusi, B. Oso and O. Dosumu, Isolation and antibacterial activity of triterpenes

from Euphorbia kamerunica Pax, International Journal of Biological and Chemical Sciences,

2010, 4 (1), 158-167.

108. L. Wang, G.-q. Xiao, Y. Wang, Z. Zang and Y. Zhao, Chemical constituents from

Euphorbia tirucalli, Natural Product Research and Development, 2014, 26, 1961-1964.

109. J. L. Bretón, J. Castañeda, B. M. Fraga and A. González, Latex de las Euphorbias

canarias. XXI. Triterpenos de la E, segetalis L, Anales de la Real Sociedad Espanola de Fisica

y Quimica, 1970, 213-216.

110. Z.-J. Jia, J.-G. Shi and L. Yang, Ent-kaurane diterpenoids from Euphorbia wangii, Journal

of Natural Products, 1994, 57 (6), 811-816.

111. S. Yan, D. Ye, Y. Wang, Y. Zhao, J. Pu, X. Du, L. Luo and Y. Zhao, Ent-kaurane

diterpenoids from Euphorbia hirta, Records of Natural Products, 2011, 5 (4), 247-253.

112. B. B. Zhang, Q. Jiang, Z. X. Liao, C. Liu and S. J. Liu, New cytotoxic triterpenoids from

the aerial parts of Euphorbia sieboldiana, Helvetica Chimica Acta, 2013, 96 (7), 1281-1289.

113. T. Liu, Q. Liang, N.-N. Xiong, L.-F. Dai, J.-M. Wang, X.-H. Ji and W.-H. Xu, A new ent-

kaurane diterpene from Euphorbia stracheyi Boiss, Natural Product Research 2017, 31 (2),

233-238.

114. N. Duarte, C. Ramalhete, A. Varga, J. Molnar and M.-J. U. Ferreira, Multidrug resistance

modulation and apoptosis induction of cancer cells by terpenic compounds isolated from

Euphorbia species, Anticancer Research, 2009, 29 (11), 4467-4472.

115. D.-S. Yang, Q.-X. He, Y.-P. Yang, K.-C. LIU and X.-L. LI, Chemical constituents of

Euphorbia tibetica and their biological activities, Chinese Journal of Natural Medicines, 2014,

12 (1), 38-42.

144

116. Y. Masamoto, H. Ando, Y. Murata, Y. Shimoishi, M. Tada and K. Takahata, Mushroom

tyrosinase inhibitory activity of esculetin isolated from seeds of Euphorbia lathyris L.,

Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2003, 67 (3), 631-634.

117. J. Wang, Y. Wang, T. Li, H. Wang, M. Zhao and S. Zhang, Study on the chemical

constituents from fresh roots of Euphorbia fischeriana, Journal of Chinese Medicinal

Materials, 2010, 33 (9), 1406-1409.

118. Z.-G. Yang, L.-N. Jia, Y. Shen, A. Ohmura and S. Kitanaka, Inhibitory effects of

constituents from Euphorbia lunulata on differentiation of 3T3-L1 cells and nitric oxide

production in RAW264. 7 cells, Molecules, 2011, 16 (10), 8305-8318.

119. R. Liu and L. Kong, The chemical constituents of Euphorbia maculata L., Journal of

Plant Resources and Environment, 2001, 10 (1), 60-61.

120. L. Wang, M.-M. Yu, Y.-Q. Chi, W.-B. Ouyang, Z. Zang and Y. Zhao, Chemical

constituents of Euphorbia dracunculoides, China Journal of Chinese Materia Medica, 2014,

39 (20), 3969-3973.

121. H. Wang, M. Zhao and S.-j. Zhang, Chemical constituents from the Euphorbia antiquorum

L., Journal of Qiqihar University 2013, 4 (1), 21-27.

122. D.-y. Liu, X.-f. Shi, Z.-y. Wang, Q.-h. Ma, B. Fan, W. Shen and G.-j. Zhu, Anticancer

constituents of ethyl acetate extract from Euphorbia helioscopia, Chemistry of Natural

Compounds, 2015, 51 (5), 969-971.

123. W. Xu, M.-j. Li, Y.-t. Lu, R.-z. Zhang, S.-h. Xu and Y. Zhao, Isolation and identification

of chemical constituents from Euphorbia tirucalli L., Chinese Journal of Medicinal Chemistry,

2016, 10 (6), 9-15.

124. H. Uchida, K. Ohyama, M. Suzuki, H. Yamashita, T. Muranaka and K. Ohyama,

Triterpenoid levels are reduced during Euphorbia tirucalli L. callus formation, Plant

Biotechnology, 2010, 27 (1), 105-109.

125. V. Di Stefano, R. Pitonzo and D. Schillaci, Chemical constituents and antiproliferative

activity of Euphorbia bivonae, Chemistry of Natural Compounds, 2011, 47 (4), 660-663.

126. Y. Liu, N. Murakami, H. Ji, P. Abreu and S. Zhang, Antimalarial flavonol glycosides from

Euphorbia hirta, Pharmaceutical Biology, 2008, 45 (4), 278-281.

127. S. Kumar, R. Malhotra and D. Kumar, Euphorbia hirta: Its chemistry, traditional and

medicinal uses, and pharmacological activities, Pharmacognosy Reviews, 2010, 4 (7), 58-61.

145

128. M. A. Sheliya, B. Rayhana, A. Ali, K. K. Pillai, V. Aeri, M. Sharma and S. R. Mir,

Inhibition of alpha-glucosidase by new prenylated flavonoids from Euphorbia hirta L. herb,

Journal of Ethnopharmacology, 2015, 176, 1-8.

129. N. T. K. Tran, L. T. Le, N. T. Y. Nguyen, M. T. Tran and Q. Le Tran, Investigation of

bioative compounds from the ethyl acetate extract of Euphorbia hirta Linn, Science and

Technology Development Journal-Natural Sciences, 2017, 1 (T5), 95-101.

130. R. Rakhimov, N. Abdulladzhanova and F. Kamaev, Phenolic compounds from Euphorbia

canescens and E. franchetii, Chemistry of Natural Compounds, 2011, 47 (2), 286-287.

131. S. Ahmed, R. Mothana, M. Yousaf and A. Al-Rehaily, Activity guided isolation of

chemical constituents from the biologically active methanol extract of Euphorbia schimperi C.

Presl, Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia, 2017, 31 (3), 471-479.

132. X. Shi, X. Du and L. Kong, Studies on chemical constituents in roots of Euphorbia

soongarica, China Journal of Chinese Materia Medica, 2006, 31 (18), 1503-1506.

133. A. Nugroho, T.-J. Rhim, M.-Y. Choi, J. S. Choi, Y.-C. Kim, M.-S. Kim and H.-J. Park,

Simultaneous analysis and peroxynitrite-scavenging activity of galloylated flavonoid

glycosides and ellagic acid in Euphorbia supina, Archives of Pharmacal Research, 2014, 37

(7), 890-898.

134. G. Li, J.-H. Kim, G. Shen, J. Lee, H.-K. Lee and S.-R. Oh, Anticomplement activity of

compounds isolated from the roots of Euphorbia kansui, Journal of the Korean Society for

Applied Biological Chemistry, 2011, 54 (2), 159-162.

135. E. Amin, A. Moawad and H. Hassan, Biologically-guided isolation of leishmanicidal

secondary metabolites from Euphorbia peplus L., Saudi Pharmaceutical Journal, 2017, 25 (2),

236-240.

136. M. Shaaban, M. Ali, M. F. Tala, A. Hamed and A. Z. Hassan, Ecological and

phytochemical studies on Euphorbia retusa (Forssk.) from Egyptian habitat, Journal of

Analytical Methods in Chemistry, 2018, 2018, 1-10.

137. M. Martínez Vázquez, T. O. Ramírez Apan, M. E. Lazcano and R. Bye, Anti-

inflammatory active compounds from the n-hexane extract of Euphorbia hirta, Journal of the

Mexican Chemical Society, 1999, 43 (3-4), 103-105.

138. R. Tanaka and S. Matsunaga, Triterpene constituents from Euphorbia supina,

Phytochemistry, 1988, 27 (11), 3579-3584.

146

139. R. Tanaka, T. Ida, Y. Takaoka, S. Kita, W. Kamisako and S. Matsunaga, 3, 4-seco-oleana-

4 (23), 18-dien-3-oic acid and other triterpenes from Euphorbia chamaesyce, Phytochemistry,

1994, 36 (1), 129-132.

140. R. Rozimamat, N. Kehrimen and H. A. Aisa, New compound from Euphorbia alatavica

Boiss, Natural Product Research and Development, 2019, 33 (3), 380-385.

141. T. Yoshida, O. Namba, L. Chen and T. Okuda, Euphorbin E, a hydrolyzable tannin dimer

of highly oxidized structure, from Euphorbia hirta L., Chemical and Pharmaceutical Bulletin,

1990, 38 (4), 1113-1115.

142. E. Wellington, D. Peters and E. Onyeike, Chemical composition of phytochemicals and

essential oil of Euphorbia heterophylla, International Journal of Advanced Research and

Publications, 2019, 3 (11), 78-85.

143. F.-R. Chang, C.-T. Yen, M. Ei-Shazly, W.-H. Lin, M.-H. Yen, K.-H. Lin and Y.-C. Wu,

Anti-human coronavirus (anti-HCoV) triterpenoids from the leaves of Euphorbia neriifolia,

Natural Product Communications, 2012, 7 (11), 1415-1417.

144. N. T. M. Lệ, D. T. Huy, T. T. L. Minh và V. T. T. Oanh, Phân lập và đặc điểm của các

hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ cây Giao (Euphorbia tirucalli), Tạp chí Khoa học Công

nghệ và Thực phẩm, 2019, 18 (1), 3-12.

145. X. Liu, W. Ye, B. Yu, S. Zhao, H. Wu and C. Che, Two new flavonol glycosides from

Gymnema sylvestre and Euphorbia ebracteolata, Carbohydrate Research, 2004, 339 (4), 891-

895.

146. L. Zhang, C. Wang, Q. Meng, Q. Tian, Y. Niu and W. Niu, Phytochemicals of Euphorbia

lathyris L. and their antioxidant activities, Molecules, 2017, 22 (8), 1-12.

147. T. Yoshida, Y. Amakura, Y. Z. Liu and T. Okuda, Tannins and related polyphenols of

Euphorbiaceous plants. XI. Three new hydrolyzable tannins and a polyphenol glucoside from

Euphorbia humifusa, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1994, 42 (9), 1803-1807.

148. A.-H. Wang, X.-K. Huo, L. Feng, C.-P. Sun, S. Deng, H.-L. Zhang, B.-J. Zhang, X.-C.

Ma, J.-M. Jia and C. Wang, Phenolic glycosides and monoterpenoids from the roots of

Euphorbia ebracteolata and their bioactivities, Fitoterapia, 2017, 121, 175-182.

149. F. J. Evans and R. J. Schmidt, Two new toxins from the latex of Euphorbia poisonii,

Phytochemistry, 1976, 15 (2), 333-335.

150. U. V. Mallavadhani and K. Narasimhan, Two novel butanol rhamnosides from an Indian

traditional herb, Euphorbia hirta, Natural Product Research, 2009, 23 (7), 644-651.

147

151. Y. Nomoto, S. Sugimoto, K. Matsunami and H. Otsuka, Hirtionosides A–C, gallates of

megastigmane glucosides, 3-hydroxyoctanoic acid glucosides and a phenylpropanoid glucoside

from the whole plants of Euphorbia hirta, Journal of Natural Medicines, 2013, 67 (2), 350-

358.

152. S. Perumal, R. Mahmud and S. Ramanathan, Anti-infective potential of caffeic acid and

epicatechin 3-gallate isolated from methanol extract of Euphorbia hirta (L.) against

Pseudomonas aeruginosa, Natural Product Research, 2015, 29 (18), 1766-1769.

153. M. M. Madany and A. M. Saleh, Phytotoxicity of Euphorbia helioscopia L. on Triticum

aestivum L. and Pisum sativum L., Annals of Agricultural Sciences, 2015, 60 (1), 141-151.

154. W.-S. Feng, L. Gao, X.-K. Zheng and Y.-Z. Wang, Polyphenols of Euphorbia helioscopia,

Chinese Journal of Natural Medicines, 2009, 7 (1), 37-39.

155. A. A. Ali, H. M. Sayed, S. R. Ibrahim and A. M. Zaher, Chemical constituents,

antimicrobial, analgesic, antipyretic and anti-inflammatory activities of Euphorbia peplus L.,

Phytopharmacology, 2013, 4 (1), 69-80.

156. S. M. Chi, Y. Wang, Y. Zhao, J. X. Pu, X. Du, J. P. Liu, J. H. Wang, Y. G. Chen and Y.

Zhao, A new cyclopentanone derivative from Euphorbia hirta, Chemistry of Natural

Compounds, 2012, 48 (4), 577-579.

157. Z.-N. Yang, B.-J. Su, Y.-Q. Wang, H.-B. Liao, Z.-F. Chen and D. Liang, Isolation,

absolute configuration, and biological activities of chebulic acid and brevifolincarboxylic acid

derivatives from Euphorbia hirta, Journal of Natural Products, 2020, 1-11.

158. Y.-J. Hsieh, C.-J. Chang, C.-F. Wan, C.-P. Chen, Y.-H. Chiu, Y.-L. Leu and K.-C. Peng,

Euphorbia formosana root extract induces apoptosis by caspase-dependent cell death via fas

and mitochondrial pathway in THP-1 human leukemic cells, Molecules, 2013, 18 (2), 1949-

1962.

159. Z. Z. Y. Z. Zhi, Phenols from Euphorbia humifusa, Article in Chinese, 2010, 35 (5), 613-

615.

160. Z. Z. Y. Z. Zhi, Studies on chemical constituents in roots of Euphorbia soongarica, Article

in Chinese, 2006, 31 (18), 1503-1506.

161. B. T. T. Luyen, Tai, B.H., Thao, N.P., Eun, K.J., Cha, J.Y., Xin, M.J., Lee, Y.M. and Kim,

Y.H., Anti-inflammatory components of Euphorbia humifusa Willd., Bioorganic and

Medicinal Chemistry Letters, 2014, 24 (8), 1895-1900.

148

162. Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, Giáo trình Miễn dịch học động vật thuỷ

sản, 2007, Khoa Thủy sản- Trường Đại học Cần Thơ.

163. Lê Huy Kim, Bài giảng Miễn dịch học thú y, 1998, Khoa Nông nghiệp-Đại học Cần Thơ.

164. L. Fu, B.-T. Xu, X.-R. Xu, R.-Y. Gan, Y. Zhang, E.-Q. Xia and H.-B. Li, Antioxidant

capacities and total phenolic contents of 62 fruits, Food Chemistry, 2011, 129 (2), 345-350.

165. J. Zhishen, T. Mengcheng and W. Jianming, The determination of flavonoid contents in

mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals, Food Chemistry, 1999, 64 (4),

555-559.

166. A. Böyum, Isolation of leucocytes from human blood. A two-phase system for removal

of red cells with methylcellulose as erythrocyte-aggregating agent, Scandinavian Journal of

Clinical and Laboratory Investigation. Supplementum, 1968, 97, 9-29.

167. M.-A. Pierrard, P. Kestemont, E. Delaive, M. Dieu, M. Raes and F. Silvestre, Malachite

green toxicity assessed on Asian catfish primary cultures of peripheral blood mononuclear cells

by a proteomic analysis, Aquatic Toxicology, 2012, 114, 142-152.

168. A. E. Ellis, Lysozyme assays, Techniques in Fish Immunology, 1990, 1, 101-103.

169. S. Milla, C. Mathieu, N. Wang, S. Lambert, S. Nadzialek, S. Massart, E. Henrotte, J.

Douxfils, C. Mélard and S. Mandiki, Spleen immune status is affected after acute handling

stress but not regulated by cortisol in Eurasian perch, Perca fluviatilis, Fish and Shellfish

Immunology, 2010, 28 (5-6), 931-941.

170. J. O. Sunyer and L. Tort, Natural hemolytic and bactericidal activities of sea bream Sparus

aurata serum are effected by the alternative complement pathway, Veterinary Immunology and

Immunopathology, 1995, 45 (3-4), 333-345.

171. A. Siwicki and D. Anderson, An easy spectrophotometric assay for determining total

protein and immunoglobulin levels in fish sera: correlation to fish health, Tech Fish Immunol,

1993, 3, 23-30.

172. H. Jahangirian, M. J. Haron, M. H. Shah, Y. Abdollahi, M. Rezayi and N. Vafaei, Well

diffusion method for evaluation of antibacterial activity of copper phenyl fatty hydroxamate

synthesized from canola and palm kernel oils, Digest Journal of Nanomaterials and

Biostructures 2013, 8, 1263-1270.

173. T. C. Shekhar and G. Anju, Antioxidant activity by DPPH radical scavenging method of

Ageratum conyzoides Linn. leaves, American Journal of Ethnomedicine, 2014, 1 (4), 244-249.

149

174. R. Re, N. Pellegrini, A. Proteggente, A. Pannala, M. Yang and C. Rice-Evans, Antioxidant

activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay, Free Radical Biology

and Medicine, 1999, 26 (9-10), 1231-1237.

175. N. Nenadis, L.-F. Wang, M. Tsimidou and H.-Y. Zhang, Estimation of scavenging activity

of phenolic compounds using the ABTS•+ assay, Journal of Agricultural and Food Chemistry,

2004, 52 (15), 4669-4674.

176. A. T. NK, R. L. Londonkar and H. B. Nayaka, Cytotoxicity and hepatoprotective attributes

of methanolic extract of Rumex vesicarius L., Biological Research, 2015, 48 (1), 19-30.

177. J. S. Lee, Y. R. Kim, J. M. Park, S.-J. Ha, Y. E. Kim, N. I. Baek and E. K. Hong, Mulberry

fruit extract protects pancreatic β-cells against hydrogen peroxide-induced apoptosis via

antioxidative activity, Molecules, 2014, 19 (7), 8904-8915.

178. S. P. Subramanian, S. Bhuvaneshwari and G. S. Prasath, Antidiabetic and antioxidant

potentials of Euphorbia hirta leaves extract studied in streptozotocin-induced experimental

diabetes in rats, General Physiology and Biophysics, 2011, 30 (3), 278-285.

179. A. Scalbert, I. T. Johnson and M. Saltmarsh, Polyphenols: antioxidants and beyond, The

American Journal of Clinical Nutrition, 2005, 81 (1), 215-217.

180. B. C. Johnson, Clinical perspectives on the health effects of Moringa oleifera: A

promising adjunct for balanced nutrition and better health, KOS Health Publications August,

2005, 1-5.

181. S. Petti and C. Scully, Polyphenols, oral health and disease: A review, Journal of

Dentistry, 2009, 37 (6), 413-423.

182. W. Bors, W. Heller, C. Michel and M. Saran, Radical chemistry of flavonoid antioxidants,

Springer, 1990, 165-170.

183. H. Shi and N. Noguchi, Introducing natural antioxidants, Elsevier, 2001, 147-158.

184. S. S. Kang, J. S. Kim, K. H. Son, H. P. KIM and H. W. Chang, Cyclooxygenase-2

inhibitory cerebrosides from Phytolaccae radix, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2001,

49 (3), 321-323.

185. T. Fujita, K. Terato and M. Nakayama, Two jasmonoid glucosides and a phenylvaleric

acid glucoside from Perilla frutescens, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 1996, 60

(4), 732-735.

150

186. A. Husain, A. Ahmad and P. K. Agrawal, (-)-Jasmonic acid, a phytotoxic substance from

Botryodiplodia theobromae: characterization by NMR spectroscopic methods, Journal of

Natural Products, 1993, 56 (11), 2008-2011.

187. W. Dathe, H. Rönsch, A. Preiss, W. Schade, G. Sembdner and K. Schreiber, Endogenous

plant hormones of the broad bean, Vicia faba L.(-)-jasmonic acid, a plant growth inhibitor in

pericarp, Planta, 1981, 153 (6), 530-535.

188. X. Xu, H. Xie and X. Wei, Jasmonoid glucosides, sesquiterpenes and coumarins from the

fruit of Clausena lansium, LWT-Food Science and Technology, 2014, 59 (1), 65-69.

189. T. Acter, Y. Cho, S. Kim, A. Ahmed, B. Kim and S. Kim, Optimization and application

of APCI hydrogen–deuterium exchange mass spectrometry (HDX MS) for the speciation of

nitrogen compounds, Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2015, 26 (9),

1522-1531.

190. K. A. Brown and D. J. Wilson, Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass

spectrometry: data analysis and interpretation, Analyst, 2017, 142 (16), 2874-2886.

191. B.-J. Park, T. Matsuta, T. Kanazawa, C.-H. Park, K.-J. Chang and M. Onjo, Phenolic

compounds from the leaves of Psidium guajava II. Quercetin and its glycosides, Chemistry of

Natural Compounds, 2012, 48 (3), 477-479.

192. F. Utari, A. Itam, S. Syafrizayanti, W. H. Putri, M. Ninomiya, M. Koketsu, K. Tanaka and

M. Efdi, Isolation of flavonol rhamnosides from Pometia pinnata leaves and investigation of

α-glucosidase inhibitory activity of flavonol derivatives, Journal of Applied Pharmaceutical

Science, 2019, 9 (08), 053-065.

193. Y. Zhang, D. Wang, L. Yang, D. Zhou and J. Zhang, Purification and characterization of

flavonoids from the leaves of Zanthoxylum bungeanum and correlation between their structure

and antioxidant activity, PloS one, 2014, 9 (8), 1-10.

194. F. Farhadi, B. Khameneh, M. Iranshahi and M. Iranshahy, Antibacterial activity of

flavonoids and their structure–activity relationship: An update review, Phytotherapy Research,

2019, 33 (1), 13-40.

195. Z. Güvenalp, N. Kilic, C. Kazaz, Y. Kaya and L. Ö. Demırezer, Chemical constituents of

Galium tortumense, Turkish Journal of Chemistry, 2006, 30 (4), 515-523.

196. N. T. Mai, Các hợp chất phenolic phân lập từ lá cây nhội Bischofia javanica (Blume),

Vietnam Journal of Chemistry, 2017, 55 (1), 91-95.

151

197. J. Yang, J. Guo and J. Yuan, In vitro antioxidant properties of rutin, LWT-Food Science

and Technology, 2008, 41 (6), 1060-1066.

198. D. Rusmana, R. Wahyudianingsih, M. Elisabeth, B. Balqis, M. Maesaroh and W.

Widowati, Antioxidant activity of Phyllanthus niruri extract, rutin and quercetin, The

Indonesian Biomedical Journal, 2017, 9 (2), 84-90.

199. A. Dawidar, M. Abdel-Mogib, M. El-Naggar and M. Mostafa, Isolation and

characterization of Polygonum equisetiforme flavonoids and their acaricidal activity against

Tetranychus urticae Koch, Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical

Sciences, 2014, 5 (4), 140-148.

200. M. Olszewska and M. Wolbis, Flavonoids from the flowers of Prunus spinosa L, Acta

Poloniae Pharmaceutica, 2001, 58 (5), 367-372.

201. A. Gohar, S. Gedara and H. Baraka, New acylated flavonol glycoside from Ceratonia

siliqua L. seeds, The Journal of Medicinal Plants Research, 2009, 3 (5), 424-428.

202. X. Zhang, P. T. Thuong, W. Jin, N. D. Su, K. Bae and S. S. Kang, Antioxidant activity of

anthraquinones and flavonoids from flower of Reynoutria sachalinensis, Archives of

Pharmacal Research, 2005, 28 (1), 22-27.

203. F. Ghavam-Haghi and M. Sadeghi Dinani, Isolation and identification of astragalin and

2-methoxy tyrosol from the bulbs of Allium paradoxum, Journal of Herbmed Pharmacology,

2017, 6 (3), 114-118.

204. Y. Wei, Q. Xie, D. Fisher and I. A. Sutherland, Separation of patuletin-3-O-glucoside,

astragalin, quercetin, kaempferol and isorhamnetin from Flaveria bidentis (L.) Kuntze by

elution-pump-out high-performance counter-current chromatography, Journal of

Chromatography A, 2011, 1218 (36), 6206-6211.

205. J. Choi, H. J. Kang, S. Z. Kim, T. O. Kwon, S.-I. Jeong and S. I. Jang, Antioxidant effect

of astragalin isolated from the leaves of Morus alba L. against free radical-induced oxidative

hemolysis of human red blood cells, Archives of Pharmacal Research, 2013, 36 (7), 912-917.

206. A. Riaz, A. Rasul, G. Hussain, M. K. Zahoor, F. Jabeen, Z. Subhani, T. Younis, M. Ali, I.

Sarfraz and Z. Selamoglu, Astragalin: a bioactive phytochemical with potential therapeutic

activities, Advances in Pharmacological Sciences, 2018, 2018, 1-15.

207. L. W. Soromou, N. Chen, L. Jiang, M. Huo, M. Wei, X. Chu, F. M. Millimouno, H. Feng,

Y. Sidime and X. Deng, Astragalin attenuates lipopolysaccharide-induced inflammatory

152

responses by down-regulating NF-κB signaling pathway, Biochemical and Biophysical

Research Communications, 2012, 419 (2), 256-261.

208. M. A. A. Alwahsh, M. Khairuddean and W. K. Chong, Chemical constituents and

antioxidant activity of Teucrium barbeyanum Aschers, Records of Natural Products, 2015, 9

(1), 159-163.

209. M. López-Lázaro, Distribution and biological activities of the flavonoid luteolin, Mini

Reviews in Medicinal Chemistry, 2009, 9 (1), 31-59.

210. H. Liu, Y. Mou, J. Zhao, J. Wang, L. Zhou, M. Wang, D. Wang, J. Han, Z. Yu and F.

Yang, Flavonoids from Halostachys caspica and their antimicrobial and antioxidant activities,

Molecules, 2010, 15 (11), 7933-7945.

211. W. Wang, C. Sun, L. Mao, P. Ma, F. Liu, J. Yang and Y. Gao, The biological activities,

chemical stability, metabolism and delivery systems of quercetin: A review, Trends in Food

Science and Technology, 2016, 56, 21-38.

212. K. Ali, M. Iqbal, H. A. Korthout, F. Maltese, A. M. Fortes, M. S. Pais, R. Verpoorte and

Y. H. Choi, NMR spectroscopy and chemometrics as a tool for anti-TNFα activity screening in

crude extracts of grapes and other berries, Metabolomics, 2012, 8 (6), 1148-1161.

213. F. Khallouki, R. Haubner, W. Hull, G. Erben, B. Spiegelhalder, H. Bartsch and R. Owen,

Isolation, purification and identification of ellagic acid derivatives, catechins, and procyanidins

from the root bark of Anisophyllea dichostyla R. Br, Food and Chemical Toxicology, 2007, 45

(3), 472-485.

214. P. K. Sharma, M. He, J. Jurayj, D.-M. Gou, R. Lombardy, L. J. Romanczy and H.

Schroeter, Enantioselctive syntheses of sulfur analogues of flavan-3-ols, Molecules, 2010, 15

(8), 5595-5619.

215. A. M. Mendoza-Wilson and D. Glossman-Mitnik, Theoretical study of the molecular

properties and chemical reactivity of (+)-catechin and (−)-epicatechin related to their

antioxidant ability, Journal of Molecular Structure: THEOCHEM, 2006, 761 (1-3), 97-106.

216. M. Rajagopala, T. D. Bradshawb, K. T. Jinc and C. Wiartc, Anticancer constituents from

Canarium patentinervium Miq., Asian Journal of Pharmacognosy, 2018, 2 (1), 13-20.

217. J. E. Kim, S. S. Kim, C.-G. Hyun and N. H. Lee, Antioxidative chemical constituents from

the stems of Cleyera japonica Thunberg, International Journal of Pharmacology 2012, 8 (5),

410-415.

153

218. S. Y. Lee, Y.-J. So, M. S. Shin, J. Y. Cho and J. Lee, Antibacterial effects of afzelin

isolated from Cornus macrophylla on Pseudomonas aeruginosa, a leading cause of illness in

immunocompromised individuals, Molecules, 2014, 19 (3), 3173-3180.

219. L. S. Aisyah, Y. F. Yun, E. Julaeha, T. Herlina, A. Zainuddin, W. Hermawan, U.

Supratman and H. Hayashi, Flavonoids from the fresh leaves of Kalanchoe tomentosa

(Crassulaceae), Open Chemistry Journal, 2015, 2 (1), 36-39.

220. D. G. Lee, M. J. Ryu, S. Cho, H. S. Chung and S. Lee, Identification of afzelin and

quercitrin from Pinus koraiensis and their contents in genus pinus using HPLC/UV analysis,

Natural Product Sciences, 2014, 20 (3), 206-210.

221. N. H. T. Phan, N. T. D. Thuan, N. Van Duy, P. T. M. Huong, N. X. Cuong, N. H. Nam,

N. Van Thanh and C. Van Minh, Flavonoids isolated from Dipterocarpus obtusifolius, Vietnam

Journal of Chemistry, 2015, 53 (2e), 131-136.

222. R. Domitrović, K. Rashed, O. Cvijanović, S. Vladimir-Knežević, M. Škoda and A. Višnić,

Myricitrin exhibits antioxidant, anti-inflammatory and antifibrotic activity in carbon

tetrachloride-intoxicated mice, Chemico-Biological Interactions, 2015, 230, 21-29.

223. H. H. Moresco, M. Pereira, L. C. Bretanha, G. A. Micke, M. G. Pizzolatti and I. M.

Brighente, Myricitrin as the main constituent of two species of Myrcia, Journal of Applied

Pharmaceutical Science, 2014, 4 (2), 1-7.

224. M. Sobeh, G. Petruk, S. Osman, M. A. El Raey, P. Imbimbo, D. M. Monti and M. Wink,

Isolation of myricitrin and 3, 5-di-O-methyl gossypetin from Syzygium samarangense and

evaluation of their Involvement in protecting keratinocytes against oxidative stress via

activation of the Nrf-2 pathway, Molecules, 2019, 24 (9), 1-14.

225. E. Wollenweber, M. Dörr, J. N. Roitman and E. Schilling, External flavonoids of three

species of Viguiera, section Hypargyrea (Asteraceae), Zeitschrift für Naturforschung C, 1995,

50 (7-8), 588-590.

226. D. Gorai, S. K. Jash and R. K. Singh, Chemical and pharmacological aspects of

Limnophila heterophylla (Scrophulariaceae): an overview, International Journal of

Pharmaceutical Sciences Review and Research, 2014, 25 (2), 100-102.

227. V. Francisco, A. Figueirinha, G. Costa, J. Liberal, M. C. Lopes, C. García-Rodríguez, C.

F. Geraldes, M. T. Cruz and M. T. Batista, Chemical characterization and anti-inflammatory

activity of luteolin glycosides isolated from lemongrass, Journal of Functional Foods, 2014,

10, 436-443.

154

228. M. Wang, J. E. Simon, I. F. Aviles, K. He, Q.-Y. Zheng and Y. Tadmor, Analysis of

antioxidative phenolic compounds in artichoke (Cynara scolymus L.), Journal of Agricultural

and Food Chemistry, 2003, 51 (3), 601-608.

229. A. Sahu, G. Ghosh and G. Rath, Identification and molecular docking studies of bioactive

principles from Alphonsea madraspatana Bedd. against Uropathogens, Current

Pharmaceutical Biotechnology, 2020, 613-625.

230. A. Kuruüzüm-Uz, Z. Güvenalp, K. Ströch, L. Ö. Demirezer and A. Zeeck, Antioxidant

potency of flavonoids from Vitex agnus-castus L. growing in Turkey, Fabad Journal of

Pharmaceutical Sciences, 2008, 33, 11-16.

231. G. Shi, M. Xu, W. Duan, L. Fang, W. Liu, X. Wang and Y. Zhang, Chemical constituents

from Trichosanthis pericarpium, Asian Journal of Chemistry, 2014, 26 (15), 4624-4630.

232. Y. Sato, S. Itagaki, T. Kurokawa, J. Ogura, M. Kobayashi, T. Hirano, M. Sugawara and

K. Iseki, In vitro and in vivo antioxidant properties of chlorogenic acid and caffeic acid,

International Journal Of Pharmaceutics, 2011, 403 (1-2), 136-138.

233. C.-H. Jeong, H. R. Jeong, G. N. Choi, D.-O. Kim, U. Lee and H. J. Heo, Neuroprotective

and anti-oxidant effects of caffeic acid isolated from Erigeron annuus leaf, Chinese medicine,

2011, 6 (1), 25-30.

234. J.-C. Ye, M.-W. Hsiao, C.-H. Hsieh, W.-C. Wu, Y.-C. Hung and W.-C. Chang, Analysis

of caffeic acid extraction from Ocimum gratissimum Linn. by high performance liquid

chromatography and its effects on a cervical cancer cell line, Taiwanese Journal of Obstetrics

and Gynecology, 2010, 49 (3), 266-271.

235. L. A. L. da Silva, L. G. Faqueti, F. H. Reginatto, A. D. C. dos Santos, A. Barison and M.

W. Biavatti, Phytochemical analysis of Vernonanthura tweedieana and a validated UPLC-PDA

method for the quantification of eriodictyol, Revista Brasileira de Farmacognosia, 2015, 25

(4), 375-381.

236. S. Kakkar and S. Bais, A review on protocatechuic acid and its pharmacological potential,

ISRN Pharmacology, 2014, 2014, 1-9.

237. I. Benabdelaziz, H. Haba, C. Lavaud, D. Harakat and M. Benkhaled, Lignans and other

constituents from Helianthemum sessiliflorum Pers., Records of Natural Products, 2015, 9 (3),

342-348.

155

238. P. N. Khanh, H. V. Đuc, T. T. Huong, V. T. Ha, D. T. Van, Y. H. Kim and N. M. Cuong,

Phenolic compounds from Callistemon citrinus leaves and stems, Vietnam Journal of Science

and Technology, 2016, 54 (2), 190-197.

239. V. Đ. Lợi, P. G. Lam, H. V. Hùng and N. T. Phương, Chiết xuất, phân lập một số hợp chất

từ lá cây gối hạc (Leea rubra Blume ex Spreng.), VNU Journal of Science: Medical and

Pharmaceutical Sciences, 2016, 32 (1), 12-17.

240. N. Kahkeshani, F. Farzaei, M. Fotouhi, S. S. Alavi, R. Bahramsoltani, R. Naseri, S.

Momtaz, Z. Abbasabadi, R. Rahimi and M. H. Farzaei, Pharmacological effects of gallic acid

in health and diseases: A mechanistic review, Iranian Journal of Basic Medical Sciences, 2019,

22 (3), 225-237.

241. Y. C. Koay, K. C. Wong, H. Osman, I. Eldeen and M. Z. Asmawi, Chemical constituents

and biological activities of Strobilanthes crispus L, Records of Natural Products, 2013, 7 (1),

59-64.

242. S. S. Swain, K. K. Rout and P. K. Chand, Production of triterpenoid anti-cancer compound

taraxerol in agrobacterium-transformed root cultures of Butterfly pea (Clitoria ternatea L.),

Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 168 (3), 487-503.

243. R. Khanra, N. Bhattacharjee, T. K. Dua, A. Nandy, A. Saha, J. Kalita, P. Manna and S.

Dewanjee, Taraxerol, a pentacyclic triterpenoid, from Abroma augusta leaf attenuates diabetic

nephropathy in type 2 diabetic rats, Biomedicine and Pharmacotherapy, 2017, 94, 726-741.

244. K. Sharma and R. Zafar, Occurrence of taraxerol and taraxasterol in medicinal plants,

Pharmacognosy Reviews, 2015, 9 (17), 19-23.

245. A. Jamal, W. Yaacob and L. B. Din, Triterpenes from the root bark of Phyllanthus

columnaris, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 2009, 3 (2), 1428-1431.

246. E. K. Mo, B. H. Han, S. M. Kim, S. A. Yang, S. K. Kang, C. J. Oh, R. Kim, C. G. Kim,

H. J. Kang and C. K. Sung, Identification of d-friedoolean-13-en-3-one (Taraxerone) as an

antioxidant compound from sedom (Sedum sarmentosum), Food Science and Biotechnology,

2012, 21 (2), 485-489.

247. B. Moulisha, M. N. Bikash, P. Partha, G. A. Kumar, B. Sukdeb and H. P. Kanti, In vitro

anti-leishmanial and anti-tumour activities of a pentacyclic triterpenoid compound isolated

from the fruits of Dregea volubilis Benth Asclepiadaceae, Tropical Journal of Pharmaceutical

Research, 2009, 8 (2), 127-131.

156

248. I. Hernández-Chávez, L. W. Torres-Tapia, P. Simá-Polanco, R. Cedillo-Rivera, R. Moo-

Puc and S. R. Peraza-Sánchez, Antigiardial activity of Cupania dentata bark and its

constituents, Journal of the Mexican Chemical Society, 2012, 56 (2), 105-108.

249. S. Baniadam, M. R. Rahiminejad, M. Ghannadian, H. Saeidi, A. M. Ayatollahi and M.

Aghaei, Cycloartane triterpenoids from Euphorbia macrostegia with their cytotoxicity against

MDA-MB48 and MCF-7 cancer cell lines, Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 2014,

13 (1), 135-141.

250. G. V. Awolola, N. A. Koorbanally, H. Chenia, F. O. Shode and H. Baijnath, Antibacterial

and anti-biofilm activity of flavonoids and triterpenes isolated from the extracts of Ficus

sansibarica Warb. subsp. sansibarica (Moraceae) extracts, African Journal of Traditional,

Complementary and Alternative Medicines, 2014, 11 (3), 124-131.

251. A. R. Abdel-Monem, E. Abdel-Sattar, F. M. Harraz and F. Petereit, Chemical

investigation of Euphorbia schimperi C. Presl, Records of Natural Products, 2008, 2 (2),

252. M. O. Fatope, Y. Takeda, H. Yamashita, H. Okabe and T. Yamauchi, New cucurbitane

triterpenoids from Momordica charantia, Journal of Natural Products, 1990, 53 (6), 1491-

1497.

253. C. Y.-f. L. Wen, W. Nan, C. Mo-yao and F. Jia, Chemical constituents from leaves of

Momordica charantia, Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2012, 43 (9), 1712-1715.

254. S. Hu, Y. H. Wang, B. Avula, M. Wang and I. A. Khan, Separation of cucurbitane

triterpenoids from bitter melon drinks and determination of partition coefficients using vortex‐

assisted dispersive liquid‐phase microextraction followed by UHPLC analysis, Journal of

Separation Science, 2017, 40 (10), 2238-2245.

255. J. Singh, E. Cumming, G. Manoharan, H. Kalasz and E. Adeghate, Suppl 2: Medicinal

chemistry of the anti-diabetic effects of Momordica charantia: active constituents and modes

of actions, The Open Medicinal Chemistry Journal, 2011, 5, 70-77.

256. C.-I. Chang, C.-H. Chou, M.-H. Liao, T.-M. Chen, C.-H. Cheng, R. Anggriani, C.-P. Tsai,

H.-I. Tseng and H.-L. Cheng, Bitter melon triterpenes work as insulin sensitizers and insulin

substitutes in insulin-resistant cells, Journal of Functional Foods, 2015, 13, 214-224.

257. Y. He, Q. Shang and L. Tian, A new triterpenoid and potential anticancer cytotoxic activity

of isolated compounds from the roots of Eucalyptus citriodora, Journal of Chemical Research,

2015, 39 (2), 70-72.

157

258. W. A. Musa, S. Duengo and A. K. Kilo, Campesterol compound from methanol fraction

of Brotowali (Tinospora crispa) stem bark, National Seminar on Chemistry 2019 (SNK-19),

2019,

259. P. Jain and S. Bari, Isolation of lupeol, stigmasterol and campesterol from petroleum ether

extract of woody stem of Wrightia tinctoria, Asian Journal of Plant Sciences, 2010, 9 (3), 163-

167.

260. J. Acedo, C. Reyes and E. B. Rodriguez, Health-promoting lipids from Purslane

(Portulaca oleracea L.): isolation, characterization, quantification and in vivo assay for

angiogenic activity, Philippine Agricultural Scientist, 2012, 95, 327-34.

261. J. M. Choi, E. O. Lee, H. J. Lee, K. H. Kim, K. S. Ahn, B. S. Shim, N. I. Kim, M. C. Song,

N. I. Baek and S. H. Kim, Identification of campesterol from Chrysanthemum coronarium L.

and its antiangiogenic activities, Phytotherapy Research, 2007, 21 (10), 954-959.

262. M. A. B. Nyeem, M. S. Haque, M. Akramuzzaman, R. Siddika, S. Sultana and B. Islam,

Euphorbia hirta Linn. A wonderful miracle plant of mediterranean region: A review, Journal

of Medicinal Plants Studies, 2017, 5 (3), 170-175.

263. L. Hamerski, M. D. Bomm, D. H. S. Silva, M. C. M. Young, M. Furlan, M. N. Eberlin, I.

Castro-Gamboa, A. J. Cavalheiro and V. da Silva Bolzani, Phenylpropanoid glucosides from

leaves of Coussarea hydrangeifolia (Rubiaceae), Phytochemistry, 2005, 66 (16), 1927-1932.

264. F. Meng, C. Yuan, W. Wang, X. Huang and X. Zhang, Chemical constituents from

Thalictrum ramosum, Journal of Alternative, Complementary and Integrative Medicine, 2017,

3 (043), 1-4.

265. D. T. Trang, B. H. Tai, P. H. Yen, D. T. H. Yen, N. X. Nhiem and P. V. Kiem, Study on

water soluble constituents from Gomphrena celoisiodes, Vietnam Journal of Chemistry, 2019,

57 (2), 229-233.

266. M. Lee, H. H. Lee, J.-K. Lee, S.-K. Ye, S. H. Kim and S. H. Sung, Anti-adipogenic activity

of compounds isolated from Idesia polycarpa on 3T3-L1 cells, Bioorganic and Medicinal

Chemistry Letters, 2013, 23 (11), 3170-3174.

267. A. Douros, D. Hadjipavlou-Litina, K. Nikolaou and H. Skaltsa, The occurrence of

flavonoids and related compounds in Cedrus brevifolia A. Henry ex Elwes & A. Henry needles.

Inhibitory potencies on lipoxygenase, linoleic acid lipid peroxidation and antioxidant activity,

Plants, 2018, 7 (1), 1-12.

158

268. T. Citarasu, V. Sivaram, G. Immanuel, N. Rout and V. Murugan, Influence of selected

Indian immunostimulant herbs against white spot syndrome virus (WSSV) infection in black

tiger shrimp, Penaeus monodon with reference to haematological, biochemical and

immunological changes, Fish and Shellfish Immunology, 2006, 21 (4), 372-384.

269. A. Sheikhlar, G. Y. Meng, R. Alimon, N. Romano and M. Ebrahimi, Dietary Euphorbia

hirta extract improved the resistance of sharptooth catfish Clarias gariepinus to Aeromonas

hydrophila, Journal of Aquatic Animal Health, 2017, 29 (4), 225-235.

270. Tu Thanh Dung, Nguyen Thi Nhu Ngoc, Nguyen Quoc Thinh, Dang Thuy Mai Thy,

Nguyen Anh Tuan, A. Shinn and M. Crumlish, Common diseases of Pangasius catfish farmed

in Viet Nam, Global Aquaculture Advocate, 2008, 11 (4), 77-78.

271. G. Vivekanandhan, K. Savithamani, A. Hatha and P. Lakshmanaperumalsamy, Antibiotic

resistance of Aeromonas hydrophila isolated from marketed fish and prawn of South India,

International Journal of Food Microbiology, 2002, 76 (1-2), 165-168.

272. L. Guz and A. Kozinska, Antibiotic susceptibility of Aeromonas hydrophila and A. sobria

isolated from farmed carp (Cyprinus carpio L.), Bulletin-Veterinary Institute in Pulawy, 2004,

48, 391-395.

273. Quách Văn Cao Thi, Từ Thanh Dung và Đặng Phạm Hòa Hiệp, Hiện trạng kháng thuốc

kháng sinh trên hai loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên

cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) ở Đồng bằng sông Cửu Long, Can Tho University,

Journal of Science 2014, 2, 7-14.

274. Huỳnh Kim Diệu, Hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh trên cá của một số cây thuốc nam ở

Đồng bằng sông Cửu Long, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 2010, 15, 222-229.

275. H. B. Hyun, S. Shrestha, K. H. Boo and S. K. Cho, Evaluation of antioxidant potential of

ethyl acetate fraction of Rosmarinus officinalis L. and its major components, Journal of the

Korean Society for Applied Biological Chemistry, 2015, 58 (5), 715-722.

276. J. Lee, Y. Kim, J. Park, S.-J. Ha, N. Baek and E. Hong, Mulberry fruit extract protects

pancreatic β-cells against hydrogen peroxide-induced apoptosis via antioxidative activity,

Molecules, 2014, 19 (7), 8904-8915.

277. I. Laher, Systems biology of free radicals and antioxidants, Springer, 2014.

278. D.-P. Xu, Y. Li, X. Meng, T. Zhou, Y. Zhou, J. Zheng, J.-J. Zhang and H.-B. Li, Natural

antioxidants in foods and medicinal plants: Extraction, assessment and resources, International

Journal of Molecular Sciences, 2017, 18 (1), 1-32.

159

279. A. E. Butler, J. Janson, S. Bonner-Weir, R. Ritzel, R. A. Rizza and P. C. Butler, β-cell

deficit and increased β-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes, Diabetes, 2003, 52 (1),

102-110.

280. A. Vetere, A. Choudhary, S. M. Burns and B. K. Wagner, Targeting the pancreatic β-cell

to treat diabetes, Nature Reviews Drug Discovery, 2014, 13 (4), 278-289.

281. M. Liu, M. Xue, X.-R. Wang, T.-Q. Tao, F.-F. Xu, X.-H. Liu and D.-Z. Shi, Panax

quinquefolium saponin attenuates cardiomyocyte apoptosis induced by thapsigargin through

inhibition of endoplasmic reticulum stress, Journal of Geriatric Cardiology, 2015, 12 (5), 540-

546.

282. A. K. Maurya, S. Tripathi, Z. Ahmed and R. K. Sahu, Antidiabetic and antihyperlipidemic

effect of Euphorbia hirta in streptozotocin induced diabetic rats, Der Pharmacia Lettre, 2012,

4 (2), 703-707.

160

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Các phổ của hợp chất Eup16 (sodium β-D-glucopyranosyl 12

hydroxyjasmonate)

Phụ lục 1.1a Phổ 1H-NMR (500MHz, CD3OD) của hợp chất Eup16

161

Phụ lục 2.1b Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất Eup16

162

Phụ lục 1.1c Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất Eup16

163

Phụ lục 1.1d Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất Eup16

164

Phụ lục 1.2a Phổ 13C-NMR (125MHz, CD3OD) của hợp chất Eup16

165

Phụ lục 1.2b Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất Eup16

166

Phụ lục 1.3a Phổ DEPT của hợp chất Eup16

167

Phụ lục 1.3b Phổ DEPT giãn của hợp chất Eup16

168

Phụ lục 1.4a Phổ HMBC của hợp chất Eup16

169

Phụ lục 1.4b Phổ HMBC giãn của hợp chất Eup16

170

Phụ lục 1.4c Phổ HMBC giãn của hợp chất Eup16

171

Phụ lục 1.4d Phổ HMBC giãn của hợp chất Eup16

172

Phụ lục1.4e Phổ HMBC giãn của hợp chất Eup16

173

Phụ lục 1.5a Phổ HSQC của hợp chất Eup16

174

Phụ lục 1.5b Phổ HSQC giãn của hợp chất Eup16

175

Phụ lục 1.5c Phổ HSQC giãn của hợp chất Eup16

176

Phụ lục 1.5d Phổ HSQC giãn của hợp chất Eup16

177

Phụ lục 1.6a Phổ COSY của hợp chất Eup16

178

Phụ lục 1.6b Phổ COSY giãn của hợp chất Eup16

179

Phụ lục 1.6c Phổ COSY giãn của hợp chất Eup16

180

Phụ lục 1.6d Phổ COSY giãn của hợp chất Eup16

181

Phụ lục 1.7a Phổ NOESY của hợp chất Eup16

182

Phụ lục 1.7b Phổ NOESY giãn của hợp chất Eup16

183

Phụ lục 1.7c Phổ NOESY giãn của hợp chất Eup16

184

Phụ lục 1.7d Phổ NOESY giãn của hợp chất Eup16

185

Phụ lục 1.8 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất Eup16

186

Phụ lục 2: Các phổ của hợp chất Eup01 (quercitrin)



187



188



189

Phụ lục 2.2c Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất Eup01


190



191



192


Phụ lục 2.4e Phổ HMBC giãn của hợp chất Eup01

193



194



195

Phụ lục 3: Các phổ của hợp chất Eup02 (rutin)



196



197



198



199



200



201



202


Phụ lục 4: Các phổ của hợp chất Eup04 (avicularin)


203



204



205



206

Phụ lục 5: Các phổ của hợp chất Eup05 (astragalin)



207



208



209


Phụ lục 6: Các phổ của hợp chất Eup08 (luteolin)

Phụ lục 6.1 Phổ 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6) của hợp chất Eup08

210

Phụ lục 6.2 Phổ 1H-NMR giãn (600MHz, DMSO-d6) của hợp chất Eup08

Phụ lục 6.3 Phổ 13C-NMR (150MHz, DMSO-d6) của hợp chất Eup08

211

Phụ lục 6.4 Phổ DEPT của hợp chất Eup08


212

Phụ lục 7: Các phổ của hợp chất Eup09 (quercetin)


Phụ lục 7.2 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất Eup09

213

Phụ lục 7.3 Phổ 13C-NMR (150MHz, DMSO-d6) của hợp chất Eup09


214


Phụ lục 8: Các phổ của hợp chất Eup11 (catechin)


215



216



217



218



219


220




221


Phụ lục 9: Các phổ của hợp chất Eup14 (afzelin)


222



223



224



225



226



227

Phụ lục 9.4 Phổ HSQC của hợp chất Eup14

Phụ lục 10: Các phổ của hợp chất Eup15 (myricitrin)


228



229



230



231



232



233



234


Phụ lục 11: Các phổ của hợp chất Eup19 (hymenoxin)

Phụ lục 11.1a Phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) của hợp chất Eup19

235



236

Phụ lục 11.2a Phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6) của hợp chất Eup19


237



238



239



240



241

Phụ lục 11.5 Phổ HSQC giãn của hợp chất Eup19

Phụ lục 12: Các phổ của hợp chất Eup21 (cynaroside)


242


Phụ lục 12.2 Phổ 13C-NMR (150MHz, CD3OD) của hợp chất Eup21

243



244



245


Phụ lục 12.6 Phổ TOCSY của hợp chất Eup21

246

Phụ lục 13: Các phổ của hợp chất Eup10 (caffeic acid)



247



248



249


Phụ lục 14: Các phổ của hợp chất Eup12 (protocatechuic acid)

Phụ lục 14.1a Phổ 1H-NMR (500MHz, acetone-d6) của hợp chất Eup12

250


Phụ lục 14.2a Phổ 13C-NMR (150MHz, acetone-d6) của hợp chất Eup12

251


Phụ lục 15: Các phổ của hợp chất Eup13 (gallic acid)


252


Phụ lục 15.2 Phổ 13C-NMR (125MHz, CD3OD) của hợp chất Eup13

253

Phụ lục 16: Các phổ của hợp chất Eup06 (taraxerol)

Phụ lục 16.1a Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3) của hợp chất Eup06


254


Phụ lục 16.2a Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3) của hợp chất Eup06

255



256



257



258



259



260


Phụ lục 17: Các phổ của hợp chất Eup07 (taraxerone)


261



262



263



264


Phụ lục 18: Các phổ của hợp chất Eup17 (cycloart -23-ene-3β,25-diol)

Phụ lục 18.1a Phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) của hợp chất Eup17

265



266



267



268


269




270



271



272


Phụ lục 18.6a Phổ (+) HR-ESI-MS của hợp chất Eup17

273

Phụ lục 18.6a Phổ (-) HR-ESI-MS của hợp chất Eup17

Phụ lục 19: Các phổ của hợp chất Eup03 (3β,7β,25-trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien-

19-al)


274



275



276



277


Phụ lục 20: Các phổ của hợp chất Eup20 (campesterol)


278



279



280



281


Phụ lục 21: Các phổ của hợp chất Eup23 (2β,16α,19-trihydroxy-ent-kaurane)


282



283



284



285


286




287



288



289


Phụ lục 22: Các phổ của hợp chất Eup18 (1-O-benzyl-rutinoside)


290



291



292



293



294



295



296



297


LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Documents