LOS CÓDIGOS DE BARRA DE ADN COMO …repository.udistrital.edu.co/bitstream/11349/4135/1...techniques to identify species are based on molecular characters using DNA barcoding. ...

1

LOS CÓDIGOS DE BARRA DE ADN COMO HERRAMIENTA EN LA IDENTIFICACIÓN

DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO Micropholis (Griseb.) Pierre (SAPOTACEAE).

MAESTRÍA EN MANEJO, USO Y CONSERVACIÓN DEL BOSQUE

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

SHIRLEY DAYANA SÁNCHEZ CALLEJAS

ROCIO CORTÉS BALLÉN Ph.D.

JAMES RICHARDSON Ph.D.

2016.

2

NOTA DE ACEPTACIÓN

___________________________________________

____________________________________________

____________________________________________

_____________________________________________

__________________________________

Director

__________________________________

Jurado

__________________________________

Jurado

BOGOTÁ D.C. Día ____ Mes ______ Año____

3

DEDICATORIA

Dedico este proyecto de investigación a mis padres quienes han sido motor y ejemplo de vida para

salir adelante, y a mis hermanos por su gran apoyo y compañía permanente. A mi directora de tesis

Rocio Cortés por sus aportes, recomendaciones, consejos y enseñanzas a lo largo de todo el proceso

de formación profesional y personal. A James por sus contribuciones y por el apoyo constante

durante el proceso de la investigación. A la Universidad Distrital Francisco José de Caldas por

brindarme la oportunidad de pertenecer a ella, y en general a todas aquellas personas que de manera

directa o indirecta hicieron parte de este gran logro.

4

TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN .......................................................................................................................................... 6

ABSTRACT ........................................................................................................................................ 7

INTRODUCCIÓN GENERAL ........................................................................................................... 9


DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO Micropholis (Griseb.) Pierre (SAPOTACEAE). ............... 13

RESUMEN ................................................................................................................................ 13

ABSTRACT .............................................................................................................................. 14

INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 14

MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................. 17

Muestreo ................................................................................................................................ 17

Extracción y amplificación de ADN ..................................................................................... 18

Análisis de datos.................................................................................................................... 19

RESULTADOS ......................................................................................................................... 20

Muestreo ................................................................................................................................ 20

Extracción y amplificación .................................................................................................... 20

Análisis de Neighbor-Joining ................................................................................................ 21

Análisis de máxima parsimonia ............................................................................................ 21

Análisis bayesiano ................................................................................................................. 23

Análisis de “barcoding gap” ................................................................................................. 23

DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 24

Utilidad de los códigos de barra de ADN en Micropholis .................................................... 24

Especies de Micropholis polifiléticas .................................................................................... 27

El “barcoding gap” en Micropholis ...................................................................................... 28

CONCLUSIONES .................................................................................................................... 29

5

AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................ 29

CONCLUSIONES GENERALES .................................................................................................... 30

RECOMENDACIONES ................................................................................................................... 32

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................. 33

6

RESUMEN

El género Micropholis de la familia Sapotaceae es diverso y ecológicamente importante en los

bosques húmedos de tierras bajas. En general, las especies son difíciles de identificar en ausencia de

caracteres reproductivos y en estados juveniles. Por consiguiente, se podría subestimar la

biodiversidad de los bosques donde crecen estas especies al desconocer con certeza su identidad, lo

que a su vez impide tomar decisiones con precisión en cuanto al manejo, uso y conservación de

dichos bosques. Actualmente, existen técnicas que permiten identificar las especies con base en

caracteres moleculares mediante el uso de los códigos de barra de ADN. El proyecto evaluó la

capacidad de los marcadores moleculares matK, ITS y rbcL en la diferenciación de las especies del

género Micropholis. Aunque la extracción de ADN de material fresco no presentó dificultades, la

extracción con base en material de herbario sí, por lo que se aumentó el esfuerzo de trabajo en el

laboratorio para la obtención de ADN. Los análisis de Neighbor-Joining, máxima parsimonia e

inferencia bayesiana evidenciaron el éxito de ITS2 como código de barras de ADN para la

identificación de las especies de Micropholis, logrando discriminar cerca del 70% de las especies

utilizadas en el estudio. Adicionalmente, la combinación de los marcadores moleculares del

cloroplasto con ITS2 logró identificar con la misma eficiencia las especies de Micropholis.

Teniendo en cuenta la riqueza de la flora del país, y además que la generación de datos moleculares

es cada vez menos costosa, se evidencia la necesidad de implementar técnicas como los códigos de

barra de ADN en la identificación de especies, lo que impactaría en áreas tales como los estudios

de evaluación de la biodiversidad, la identificación de especies de valor económico, o el control de

comercio ilegal, entre otros.

7

ABSTRACT

The genus Micropholis (Sapotaceae) is diverse and ecologically important in lowland tropical wet

forests. In general, species are difficult to identify in the absence of reproductive traits and in

juvenile stages. As a result we may underestimate the biodiversity of the forests where these species

grow that is an impediment to forest management and conservation decision making. Alternative

techniques to identify species are based on molecular characters using DNA barcoding. This study

assessed the ability of molecular markers ITS2, matK and rbcL in differentiating species of the

genus Micropholis. Although DNA extraction of fresh material has not presented difficulties,

extraction based on herbarium material itself, which has increased work effort in the laboratory to

obtain DNA. Maximum parsimony analysis, Neighbor-Joining and Bayesian inference showed the

success of ITS2 as barcode DNA to identify species Micropholis, achieving discriminating about

70% of the species used in the study. Additionally, the combination of molecular markers

chloroplast with ITS2 successfully identified with the same efficiency Micropholis species. Given

the richness of the flora of the country, and also the generation of molecular data is becoming less

expensive, it is evident the need to implement techniques such as barcodes DNA species

identification, which would impact areas such as studies of biodiversity assessment, identification

of species of economic value or control illegal trade, among others.

8

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Árbol construido por el método de Neighbor-Joining, utilizando las distancias de Kimura

2-parámetros con el marcador molecular ITS2. Los rectángulos verdes representan las especies

identificadas y los valores de bootstrap se presentan sobre las ramas. ............................................. 49

Figura 2. Porción del alineamiento múltiple de secuencias de M. guyanensis con el marcador

molecular ITS2. Los óvalos indican las posiciones variables informativas dentro de los individuos

de la especie en estudio. .................................................................................................................... 50

Figura 3. Porción del alineamiento múltiple de secuencias de algunas especies del género

Micropholis con el marcador molecular ITS2. Los óvalos indican las posiciones variables

informativas para el estudio. ............................................................................................................. 50

Figura 4. Análisis filogenético basado en el método de máxima parsimonia utilizando el marcador

molecular ITS2. Los cuadrados verdes indican los clados resueltos. Los puntos blancos indican las

homoplasias y los puntos negros indican las sinapomorfías. Las flechas indican los nodos que

colapsaron en el árbol de consenso estricto. Los valores de bootstrap se presentan sobre las ramas.

........................................................................................................................................................... 51

Figura 5. Análisis filogenético basado en el método de máxima parsimonia utilizando 20 secuencias

de nueve especies de Micropholis con los marcadores moleculares ITS2 (a), matK (b), rbcL (c) y las

combinaciones de los marcadores ITS2+matK (d), ITS2+rbcL (e), matK+rbcL (f) e

ITS2+matK+rbcL. Los puntos blancos indican las homoplasias y los puntos negros indican las

sinapomorfías. Los valores de bootstrap se presentan sobre las ramas. ............................................ 52

Figura 6. Árbol de máxima credibilidad (MCC) del análisis de inferencia bayesiana de la región

ribosomal nuclear ITS2. Los rectángulos verdes representan las especies identificadas. Los valores

de probabilidad posterior se muestran sobre las ramas. .................................................................... 53

Figura 7. Divergencia intraespecífica e interespecífica para el conjunto de datos estudiados con el

marcador molecular ITS2 (a), matK (b) y rbcL (c). .......................................................................... 54

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Marcadores moleculares, primers y programas utilizados en la amplificación de ADN de

Micropholis ....................................................................................................................................... 44

Tabla 2. Números de acceso de GenBank para las secuencias analizadas. *Especimen botánico

estéril. **Especimen botánico fértil. (COAH), espécimen botánico del Herbario Amazónico

Colombiano. ...................................................................................................................................... 44

Tabla 3. Resumen de la variabilidad de las secuencias en el análisis de máxima parsimonia para las

especies de Micropholis. ................................................................................................................... 48

9

INTRODUCCIÓN GENERAL

La identificación tradicional de especies ha sido realizada con base en caracteres morfológicos tales

como tamaño, forma, color, consistencia, cantidad y tipos, tanto de hojas como de flores, frutos,

corteza y semillas, entre otros. Sin embargo, la identificación basada en este tipo de caracteres

aunque es de gran utilidad, presenta cuatro limitaciones significativas que se deben considerar: la

plasticidad fenotípica y la variabilidad genética de los caracteres empleados para la identificación

de las especies, la existencia de taxones crípticos, la poca utilidad de las claves morfológicas en

algunos de los estados de desarrollo del individuo (e.g. plántulas) y la falta de especialistas en cada

uno de los grupos de interés (Hebert et al., 2003a; Palacio-López & Rodriguez-López, 2007; Chase

& Fay, 2009; Paz et al., 2011).

En primera instancia, se presenta una limitación en cuanto a la plasticidad fenotípica y la

variabilidad genética en los caracteres empleados para la identificación de especies (Paz et al.,

2011), es decir, los genotipos tienen la habilidad de producir diferentes fenotipos en respuesta a las

diversas condiciones ambientales que se presenten. La plasticidad fenotípica es uno de los medios

por los cuales las plantas pueden ajustar o modificar su morfología y fisiología con el fin de

adaptarse a la heterogeneidad ambiental (Palacio-López & Rodriguez-López, 2007). Por

consiguiente, estos tipos de variabilidad pueden llevar a identificaciones incorrectas.

Por otro lado, se pasa por alto los taxones morfológicamente crípticos que son comunes en muchos

grupos (Hebert et al., 2003a). Estos taxones, al ser inconspicuos o “invisibles” quedan por fuera en

los inventarios biológicos, generando subestimaciones en la biodiversidad. En tercer lugar, las

claves morfológicas establecidas son eficaces tan sólo para un estado especifico de la vida o

desarrollo del individuo, es decir, algunos caracteres morfológicos se presentan en el individuo en

determinado estado de desarrollo por lo que una clave sería tan solo útil para ese momento de

10

crecimiento. Finalmente el uso de las claves requiere de un alto nivel de conocimientos con el fin

último de no incurrir en diagnósticos erróneos (Chase & Fay, 2009).

De acuerdo a lo anteriormente mencionado y haciendo énfasis en que uno de los objetivos de las

ciencias biológicas, y en particular de la sistemática, ha sido la clasificación de los organismos con

base en caracteres morfológicos (Paiz-Medina & Huete-Pérez, 2008), y conociendo sus

limitaciones, se ha logrado avanzar en metodologías y herramientas que permitan una identificación

más precisa y donde se haga posible el establecimiento de diagnósticos confiables. Por

consiguiente, se tomarán decisiones adecuadas en cuanto a tráfico ilegal de especies protegidas o en

peligro de extinción, identificación de especies de gran valor económico, estudios de evaluación de

la biodiversidad y control de comercio ilegal, entre otros.

Por su parte, el género Micropholis de la familia Sapotaceae es de gran importancia económica por

presentar madera adecuada para ebanistería, pisos y artesanías, además de presentar látex utilizado

en la industria para la producción de goma de mascar (Vivas et al., 2014). Sin embargo, desde los

inicios de su clasificación ha sido objeto de discusión debido a que las especies presentan caracteres

morfológicos muy similares y a que no siempre se cuenta con caracteres reproductivos, hechos que

dificultan su identificación, así como la caracterización de usos potenciales (Pennington, 1990;

Vivas et al., 2014). Por consiguiente, se justifica la necesidad de implementar herramientas que

permitan realizar una identificación mucho más precisa de las especies del género Micropholis.

Los códigos de barra de ADN son secuencias cortas y estandarizadas que permiten la identificación

de las especies conocidas y a la vez el descubrimiento de especies desconocidas (Baker et al., 1996;

Hebert et al., 2003b; CBOL Plant Working Group, 2009; Gernandt, 2011). El gen cox1 resultó ser

un código de barras capaz de diferenciar especies en varios grupos de animales (Hebert et al.,

2003a; Smith et al., 2005). Por el contrario, en plantas no se ha encontrado un único marcador que

permita identificar las especies, por lo que se han generado debates en cuanto a que región o

regiones sirven para actuar como códigos de barra específicos en plantas ( Kress & Erickson, 2007;

11

Sass et al., 2007; CBOL Plant Working Group, 2009 ). Actualmente, se ha discutido acerca de qué

tanto es más difícil establecer códigos de barra en plantas en comparación con otros grupos

taxonómicos, por lo que se han desarrollado varios intentos por establecer los marcadores

moleculares que sirvan como códigos de barra de ADN en plantas. Por ejemplo, Kress et al (2005),

comprobaron que los marcadores moleculares ITS y trnH-psbA comprendían la mejor región de

ADN para utilizarse como códigos de barra, ya que se caracterizaron por tener una buena longitud,

una alta variación intraespecífica, permitían la utilización de iniciadores universales y eran fáciles

de amplificar. Del mismo modo, Lahaye et al (2008), evaluaron ocho regiones potenciales como

códigos de barras de ADN en angiospermas, donde se estableció nuevamente que trnH-psbA era la

región de ADN que permitía observar una mayor variación interespecífica seguida de matK, esto

permitió proponer a estas dos regiones como códigos de barra de ADN universales en plantas. En

este mismo sentido, Newmaster et al (2008), determinaron seis regiones codificantes y una no

codificante de ADN de cloroplasto para la obtención de códigos de barra para Compsoneura

(Myristicaceae), donde se demostró nuevamente que las regiones matK y trnH-psbA ofrecían una

alta resolución entre todas las especies de estudio. Con base en las experiencias anteriormente

mencionadas, el CBOL Plant Working Group, recomendaron el uso de las regiones de ADN del

cloroplasto matK y rbcL (CBOL Plant Working Group, 2009). Sin embargo, el código de barras de

ADN no ha sido útil para diferenciar las especies dentro de diferentes grupos de gimnospermas, por

ejemplo, Nicolalde-Morejón et al (2010), examinaron el desempeño de cuatro regiones codificantes

del cloroplasto como son matK, rbcL, rpoC1 y rpoB y tres regiones no codificantes atpF-atpH,

psbK-psbl y trnH-psbA y la región nuclear ITS para tres géneros de cícadas, donde encontraron que

rbcL tuvo gran éxito en la amplificación pero a su vez mostró una baja variación dentro de los

géneros de estudio, por su lado matK se descartó debido a la dificultad en la amplificación; en

cuanto a psbK-psbl resultó exitoso en la amplificación y con buenos niveles de variación, sin

embargo no funcionó en todos los grupos analizados. Por consiguiente, recientemente se han

propuesto marcadores moleculares alternativos como por ejemplo ITS ya que ha demostrado ser

12

capaz de discriminar entre especies en varios grupos de plantas (Group China.Plant.BOL et al.,

2011).

La implementación de códigos de barras de ADN ha desarrollado grandes expectativas ya que

facilita el levantamiento de la biodiversidad, determina especies crípticas y ha sido de gran utilidad

en estudios ecológicos, donde la identificación de material biológico en estados juveniles es un

impedimento en cuanto a la caracterización y composición florística del bosque de estudio

(González, 2009; Kress et al., 2010). Por otro lado, el uso de la técnica de códigos de barra de ADN

es de gran utilidad para la identificación de especies pertenecientes a taxones difícilmente

diagnosticables sobre la base de morfología, como también para grupos de organismos cuyos

problemas taxonómicos fundamentales han sido resueltos convenientemente por los especialistas

(Coissac et al., 2016; Divakar et al., 2016; Moon et al., 2016). Se estima que esta técnica

contribuirá a actualizar las colecciones biológicas y acelerará el inventario de la biodiversidad,

siempre de manera precisa y en menor tiempo (Newmaster et al., 2006; Lanteri, 2007).

De acuerdo a la dificultad en la identificación de las especies del género Micropholis y en general

de toda la familia Sapotaceae y teniendo en cuenta la utilidad de los códigos de barra de ADN como

herramienta para la identificación de taxones con morfologías muy similares, en el capítulo I se

podrá encontrar un artículo que hace referencia a la evaluación de la capacidad de los tres

marcadores moleculares propuestos como códigos de barra en plantas, para la discriminación de las

especies del género Micropholis.

13


DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO Micropholis (Griseb.) Pierre (SAPOTACEAE).

Dayana Sánchez-C. 1

James Edward Richardson2,3

Dayron Cárdenas4

Rocio Cortés-B.5

Palabras claves: biodiversidad, distancia genética, ITS2, matK, molecular, rbcL, taxonomía

Key words: biodiversity, ITS2, genetic distance, matK, molecular, rbcL, taxonomy.

RESUMEN

El género Micropholis (Sapotaceae) es diverso y ecológicamente importante en los bosques

húmedos de tierras bajas del Neotrópico. En general, las especies son difíciles de identificar en

ausencia de caracteres reproductivos y en estados juveniles. Por consiguiente, se podría subestimar

la biodiversidad de los bosques donde crecen, lo que a su vez podría impedir tomar decisiones

acertadas en cuanto al manejo, uso y conservación de estos bosques. Actualmente, existen técnicas

alternativas que permiten identificar las especies con base en caracteres moleculares usando los

códigos de barra de ADN. Nuestro objetivo fue evaluar la capacidad de los marcadores moleculares

ITS2, matK y rbcL en la identificación de 22 especies de Micropholis que tienen una distribución

pantropical. Los análisis de Neighbor-Joining, máxima parsimonia e inferencia bayesiana mostraron

que el marcador molecular con mejores resultados fue ITS2, con un 70% de eficiencia, en donde 15

de las 20 especies se pudieron identificar con esta región nuclear. Los dos marcadores del

cloroplasto no presentaron resultados óptimos para la determinación de las especies del género, por

lo que se propone a ITS2 como potencial código de barras para la identificación de las especies de

1 Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Bogotá, Colombia. [email protected]. Autor

encargado de la correspondencia.

2 Universidad del Rosario, programa de Biología. Bogotá, Colombia. [email protected]

3 Tropical Diversity Section Royal Botanic Garden Edinburgh. Edinburgh, UK. [email protected]

4 Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas SINCHI. Bogotá, Colombia. [email protected]

5 Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Bogotá, Colombia. [email protected]

mailto:[email protected]

14

Micropholis.

ABSTRACT

The genus Micropholis (Sapotaceae) is diverse and ecologically important in lowland tropical wet

neotropical forests. In general, species are difficult to identify in the absence of reproductive traits

and in juvenile stages. As a result we may underestimate the biodiversity of the forests where these

species grow that is an impediment to forest management and conservation decision making.

Alternative techniques to identify species are based on molecular characters using DNA barcoding.

This study assessed the ability of molecular markers ITS2, matK and rbcL in differentiating species

of the genus Micropholis. Neighbor-Joining analysis, maximum parsimony and Bayesian inference

showed that ITS2 was the best marker for species identification with an efficiency of 70% in

discriminating species, with sufficient interspecific and intraspecific divergence to identify 15 of the

20 species used in the analysis. The two additional chloroplast markers did not improve species

determination. Thus, we propose ITS2 as a potential bar code marker for identifying species in

Micropholis.

INTRODUCCIÓN

El género Micropholis comprende 38 especies que se encuentran ampliamente distribuidas en

Centroamérica, Suramérica y en las Islas del Caribe (Pennington, 1990). Sin embargo, la mayoría

de las especies se encuentran en las Guayanas, en el sur y centro de Venezuela, y en la región

Amazónica de Brasil, Perú y Colombia. Las especies de este género crecen en los bosques húmedos

de tierras bajas, aunque algunas especies, como por ejemplo M. crotonoides, crecen en bosques

montanos. En Colombia, el género se encuentra representado por 20 especies que pueden ser

árboles y arbustos de hojas simples, alternas y dísticas, que presentan látex blanco tanto en la

corteza como en las ramitas y peciolos (Piñeros, 2013). Muchas especies de Micropholis se

15

diferencian fácilmente de otras Sapotaceae por presentar hojas con venación secundaria

broquidódroma o eucamptodroma que se encuentran cercanas y uniformemente distribuidas y que

dan a la hoja una apariencia estriada, y por la cicatriz adaxial que se extiende a lo largo de la semilla

(Pennington, 1990).

La identificación de las especies de Micropholis se ha realizado tradicionalmente usando caracteres

morfológicos. Sin embargo, a pesar de ser indiscutiblemente útil, es una labor complicada en

muchos casos debido a que no siempre se cuenta con caracteres reproductivos como flores y/o

frutos que permitan realizar una identificación acertada (Vivas et al., 2014). La causa podría estar

relacionada con lo encontrado por Terra-Araujo et al., (2012), quienes observaron que las flores de

M. guyanensis son altamente efímeras y que persisten solo un día aproximadamente, fenómeno que

podría extrapolarse a otras especies del género y de la familia. Teniendo en cuenta que con base en

la identificación de las especies se estima la diversidad de los bosques, y se toman decisiones en

cuanto a su manejo, uso y conservación, es necesaria la implementación de herramientas

adicionales a los rasgos morfológicos, que permitan realizar identificaciones de manera precisa y

consistente, tales como la técnica de códigos de barra de ADN.

Desde hace aproximadamente dos décadas, los datos moleculares se han convertido en una

alternativa valiosa en la identificación de especies (Baker et al., 1996; Hebert et al., 2003a; Kress et

al., 2005) en la que se incluyen datos adicionales a los tradicionales morfológicos. Los códigos de

barra de ADN son secuencias cortas y estandarizadas que permiten la identificación de las especies

conocidas y a la vez el descubrimiento de especies desconocidas (Baker et al., 1996; Hebert et al.,

2003a; CBOL Plant Working Group, 2009; Gernandt et al., 2011; Gong et al., 2015; Divakar et al.,

2016). El gen cox1 resultó ser un código de barras capaz de diferenciar especies en varios grupos de

animales (Hebert et al., 2003b; Smith et al., 2005). Por el contrario, en plantas ha sido difícil

encontrar un único marcador que permita identificar las especies, y se han analizado diversas

regiones que funcionen como códigos de barra específicos en plantas (Kress & Erickson, 2007; Sass

16

et al., 2007; CBOL Plant Working Group, 2009; Coissac et al., 2016). En el 2009, el CBOL Plant

Working Group recomendó el uso de una región particular de los genes del cloroplasto matK y

rbcL, terminando parcialmente con esta discusión. Sin embargo, debido a que estos dos marcadores

han sido muy poco variables en algunos grupos de plantas (e.g. Orchidaceae, Asahina, 2010;

Cuéllar, 2011; Euphorbiaceae-Euphorbia, Aubriot et al., 2013; Lamiaceae, Christina & Annamalai,

2014; Leguminosae-Cassia, Purushothaman et al., 2014) se propuso el espaciador transcrito

interno ITS2 como una tercera región a considerar, ya que ha demostrado ser capaz de discriminar

entre especies en varios grupos de plantas (Group China.Plant.BOL et al., 2011; Hollingsworth et

al., 2011; Coissac et al., 2016).

Son pocos los estudios realizados en códigos de barra de ADN en la familia Sapotaceae y

particularmente en el género Micropholis. El primero fue realizado por González et al (2009),

quienes realizaron un inventario de todos los árboles a lo largo de dos hectáreas en un bosque

tropical de la Guayana Francesa, evaluando ocho marcadores moleculares (rbcLa, rpoC1, rpoB,

matK, ycf5, trnL, psbA-trnH, ITS), con el fin de examinar si los códigos de barra contribuían a

aumentar la calidad y minimizar los tiempos en la identificación de especies para los estudios de

biodiversidad en bosques tropicales. Los resultados mostraron que ITS y matK presentaron

dificultades en la secuenciación, y que ninguno de los marcadores logró una tasa de identificación

en las plantas mayor al 70%, sin embargo concluyeron que ITS podría ser un código de barras útil

para la identificación de especies estrechamente relacionadas en las familias Sapotaceae y

Lauraceae. En el 2010 Kress et al., utilizaron datos de matK, rbcL y trnH-psbA como herramienta

para la construcción de una filogenia en una comunidad de 300 árboles tropicales en Puerto Rico,

donde se incluyeron algunos géneros de la familia Sapotaceae como Chrysophyllum, Manilkara y

Micropholis. Los resultados mostraron que la combinación de los tres marcadores moleculares

permitió la diferenciación del 95% de las especies y el 96% de las familias, evidenciando así que los

códigos de barra de ADN son una herramienta útil para explorar la evolución de las diferentes

17

comunidades. Por otro lado, Baraloto et al (2012) evaluaron la utilidad de los rasgos funcionales y

las relaciones filogenéticas en la predicción de los procesos de construcción de algunas

comunidades de especies arbóreas que ocurren en la selva tropical de la Guayana Francesa como es

el caso de Micropholis, utilizando 17 rasgos funcionales y datos moleculares de dos marcadores del

cloroplasto (matK y rbcL). Los resultados mostraron que en promedio las especies se relacionan en

mayor medida por sus rasgos funcionales, es decir, confirman que los cambios en el medio

ambiente son la respuesta predominante en la construcción de las comunidades ricas en especies, y

no su similitud filogenética. Finalmente, en el 2014 Vivas et al., evaluaron la capacidad de los

códigos de barra en la identificación de especies de Sapotaceae, quienes incluyeron ocho géneros

de la familia y cuatro especies de Micropholis, demostrando que ITS resultó ser la mejor opción de

código de barras para facilitar la identificación de especies en esta familia.

Teniendo en cuenta que el muestreo de las especies de Micropholis ha sido muy poco representativo

en los estudios mencionados anteriormente, los principales objetivos de este estudio son: 1) evaluar

la capacidad de los marcadores moleculares matK, rbcL y ITS en la diferenciación de las especies

del género Micropholis (Sapotaceae) y 2) conformar una base de datos con códigos de barra de

ADN disponible en BOLD Systems de las especies de Micropholis estudiadas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo

Se muestrearon un total de 20 especies, en las que el número de individuos varió desde un individuo

hasta 19 individuos por especie. Se usaron un total de 147 secuencias de Micropholis, de las cuales

58 son originales y 89 fueron bajadas de GenBank. El trabajo de campo se centró en algunas

localidades de los Departamentos de Caquetá y Meta en Colombia. Los especímenes botánicos

fueron identificados mediante el uso de las claves taxonómicas de la serie Flora Neotrópica de la

18

familia Sapotaceae (Pennington, 1990) y a través de la comparación con los especímenes de

referencia de los herbarios COAH y UDBC. Las colecciones realizadas fueron procesadas y

depositadas en el Herbario Forestal UDBC.

Extracción y amplificación de ADN

La extracción de ADN se realizó siguiendo cuatro protocolos y técnicas de extracción en plantas. El

ADN del material de herbario se extrajo usando el protocolo de CTAB (Doyle & Doyle, 1990), con

algunas modificaciones menores en la preparación del buffer de lisis celular, ya que no solo

contenía CTAB2%, PVPP y 2- mercaptoetanol2%, sino que también se agregó NaCl 5M, EDTA 20

mM (PH=8) y Tris HCl 100 mM (PH=8), de acuerdo al protocolo del Laboratorio del Real Jardín

Botánico de Edimburgo (Clark & Hollingsworth, 2011). Adicionalmente, se dejaron las muestras en

isopropanol frío a -20 °C durante siete días para aumentar la cantidad de ADN que se precipita. La

extracción de ADN de material fresco se realizó siguiendo el protocolo de sales (Maniatis et al.,

1982), la técnica de Alexander (Alexander et al., 2007) y las instrucciones del fabricante del

DNeasy Plant Mini Kit de Qiagen.

La amplificación de las tres regiones analizadas se realizó utilizando los primers y programas que se

muestran en la tabla 1.

Para la amplificación de ITS2 de las muestras procedentes de material de herbario se realizaron

PCR’s anidadas (Nested PCR) con el fin de incrementar la sensibilidad y calidad de la detección del

ADN. El proceso consistió principalmente en dos fases de amplificación, cada una con distintos

pares de primers; primero se realizó una PCR con primers externos de ITS completo (ITS8P y

ITS5P) para amplificar una región de ADN más extensa, y luego se hizo una segunda PCR

utilizando un par de primers para amplificar la región específica de ITS2 (ITS2-S2f y ITS4) y

utilizando 1 µl de la primera PCR en vez de 1 µl de ADN.

19

Análisis de datos

La edición de las secuencias se realizó con ayuda de BioEdit V. 7.2.5 (Hall, 1999). La alineación de

las secuencias se efectuó a través de la plataforma del Instituto Bioinformático Europeo (EMBL-

EBI) bajo el alineamiento múltiple a través de la interfase de la herramienta Clustal Omega

(McWilliam et al., 2013). En la tabla 2 se muestran los números de acceso de las secuencias en

GenBank utilizadas en este estudio. Se utilizó PAUP (Swofford, 2003) para la construcción de las

matrices y análisis de Neighbor-Joining utilizando el modelo de dos parámetros de Kimura (K2P)

que asume que la tasa de transiciones puede no ser la misma que la tasa de transversiones, y que las

frecuencias de los cuatro nucleótidos son iguales (Kimura, 1980). Se evaluó el soporte de las ramas

con el método de bootstrap con un total de 1.000 réplicas. Para el análisis de máxima parsimonia se

utilizó la combinación de los software WinClada (Nixon, 2002) y NONA (Goloboff, 1996),

eliminando del análisis los caracteres no informativos, se realizó un análisis heurístico con 1.000

réplicas comenzando con cinco árboles por cada réplica, y con una estrategia de búsqueda de

Multiple TBR + TBR (mult “max”). Los demás criterios de establecieron por defecto.

Para el análisis de inferencia bayesiana, se utilizó el método bayesiano MCMC (Simulación Monte

Carlo mediante cadenas de Markov), tal como se aplica en MrBayes v. 3.2.2 (Ronquist et al., 2012),

con los modelos evolutivos generados para cada una de las particiones, aplicando diez millones de

generaciones, cuatro cadenas paralelas y con el primer 25% de generaciones descartadas como

burn-in. El modelo evolutivo que mejor se ajustó a los datos fue TIM2+G, el cual se estimó con

ayuda de jModelTest v. 2 (Darriba et al., 2012), utilizando el criterio de información de Akaike

(AIC). El árbol que se utilizó para el análisis correspondió al árbol de máxima credibilidad (MCC)

con un burn-in del 10% con ayuda del programa TreeAnnotator (Drummond et al., 2012). Los

análisis se realizaron en la plataforma CIPRES (Miller et al., 2010). Finalmente, se estimaron las

20

distancias inter e intraespecíficas para establecer la presencia de un barcoding gap en la muestra

analizada.

RESULTADOS

Muestreo

Se usaron un total de 147 secuencias de Micropholis de las cuales 39,45% son originales y 60,55%

fueron bajadas de GenBank. Las secuencias originales fueron obtenidas de material fresco

(82,75%) o de material botánico del Herbario COAH (17,25%). Teniendo en cuenta que los

resultados preliminares mostraron una baja variación en las secuencias de los marcadores

moleculares del cloroplasto (rbcL y matK), y una alta variación en el Espaciador transcrito interno

ITS2, se realizó un mayor esfuerzo en el laboratorio para la obtención de secuencias de este último

marcador molecular. Del total de las secuencias usadas, 74 correspondieron a ITS2 e incluyeron 20

especies; 33 correspondieron a matK e incluyeron 11 especies y 40 correspondieron a rbcL e

incluyeron 16 especies.

Extracción y amplificación

La técnica de extracción utilizando CTAB tuvo un éxito del 85% en las muestras procedentes de

material de herbario, mientras que las técnicas de sales, Alexander y el kit de Qiagen mostraron un

éxito del 100% para la extracción de las muestras procedentes de material fresco. Las

concentraciones obtenidas de ADN procedentes de material de herbario oscilaron entre 5 y 25

ng/µl, mientras que las concentraciones de ADN procedentes de material fresco oscilaron entre 6,8

y 37,5 ng/µl. El marcador molecular ITS2 se logró amplificar en el 100% de las muestras, esto

teniendo en cuenta el uso de la PCR anidada con el fin de aumentar la detección del ADN. Por el

contrario, con las regiones matK y rbcL se logró amplificar sólo un 35% de las muestras, todas

procedentes de material fresco.

21

Análisis de Neighbor-Joining

Una vez calculadas las distancias genéticas entre todos los taxones del estudio, se pudo determinar

el número de posiciones variables entre pares de secuencias, valores que se representaron

gráficamente en un árbol de Neighbor-Joining (Figura 1). Las distancias genéticas intraespecíficas

calculadas para las especies del género Micropholis utilizando el marcador molecular ITS2

oscilaron entre 0 y 0,10761, mientras que las distancias interespecíficas oscilaron entre 0 y 0,13769.

Estas distancias permitieron identificar las especies: M. brochidodroma, M. casiquiarensis, M.

cayennensis, M. crassipedicellata, M. crotonoides, M. gardneriana, M. gnaphaloclados, M.

longipedicellata, M. macrophylla, M. melinoniana, M. obscura, M. porphyrocarpa, M. splendens y

M. trunciflora, con valores de soporte de bootstrap mayores a 70%. Sin embargo, las especies: M.

egensis, M. guyanensis, M. humboldtiana, M. madeirensis y M. venulosa no se lograron discriminar

ya que conformaron grupos polifiléticos (Figura 2).

Los árboles de Neighbor-Joining basados en los marcadores del cloroplasto presentaron muy baja

resolución (árboles no mostrados). En el caso de matK, sólo se pudo identificar a M. gardneriana,

mientras que utilizando el marcador molecular rbcL no se pudo discriminar ninguna de las 16

especies estudiadas.

Análisis de máxima parsimonia

Los resultados del análisis de máxima parsimonia son muy similares al resultado encontrado con el

análisis de Neighbor-Joining, la diferencia está en que M. humboldtiana si conformó un grupo

monofilético en este análisis (Figura 4).

En la figura 3 se presenta una porción del alineamiento con el marcador molecular ITS2, en la cual

se pueden observar los sitios informativos para algunas especies. Este marcador molecular tiene el

más alto poder de discriminación entre las especies del género Micropholis con un 50% más de

22

sitios informativos con respecto a los otros dos marcadores moleculares del cloroplasto (Tabla 3).

En la figura 4 se presenta uno de los 164 árboles más parsimoniosos utilizando el marcador

molecular ITS2, en donde 15 especies resultaron ser monofiléticas, las cuales corresponden a M.

brochidodroma, M. casiquiarensis, M. cayennensis, M. crassipedicellata, M. crotonoides, M.

gardneriana, M. gnaphaloclados, M. humboldtiana, M. longipedicellata, M. macrophylla, M.

melinoniana, M. obscura, M. porphyrocarpa, M. splendens y M. trunciflora.

Los árboles obtenidos con los marcadores moleculares matK y rbcL obtuvieron muy poca

resolución debido al reducido número de sitios informativos (árboles no mostrados). Se puede

inferir que estas regiones no funcionan como códigos de barra de ADN para diferenciar las especies

del género Micropholis.

Al evaluar la capacidad de cada uno de los marcadores moleculares de manera individual y en sus

diferentes combinaciones (ITS2+matK, ITS2+rbcL, matK+rbcL e ITS2+matK+rbcL), se puede ver

que el poder discriminatorio para la identificación de especies es más alto utilizando la región de

ITS2 de manera individual, o utilizando la combinación de los marcadores moleculares ITS2+matK,

ITS2+rbcL y el multilocus ITS2+marK+rbcL, logrando identificar el 55,55% de las especies. Es

decir, cinco de las nueve especies utilizadas para el análisis. Los demás resultados utilizando los

marcadores moleculares del cloroplasto de manera individual, o su combinación matK+rbcL,

presentaron un porcentaje bajo para la discriminación de las especies de Micropholis (Figura 5).

Cabe anotar que en este análisis se utilizaron solamente 20 secuencias que corresponden a nueve (9)

especies (M. cayennensis, M. crassipedicellata, M. gardneriana, M. guyanensis, M.

gnaphaloclados, M. madeirensis, M. sp, M. splendens y M. venulosa) debido a que coincidían en

tener secuencias de los tres marcadores en las mismas muestras.

23

Análisis bayesiano

Los resultados del análisis bayesiano utilizando el marcador molecular ITS2 presentaron resultados

similares a los encontrados con el análisis de máxima parsimonia, al discriminar 15 de las 20

especies del género Micropholis. En la reconstrucción filogenética las 15 especies formaron grupos

monofiléticos con probabilidades mayores al 95% (Figura 6). Al igual que con los análisis de

Neighbor-Joining y máxima parsimonia, los marcadores moleculares del cloroplasto no permitieron

discriminar la gran mayoría de las especies de Micropholis utilizando el análisis bayesiano (árboles

no mostrados).

Análisis de “barcoding gap”

Al evaluar las diferencias que existen entre las distancias genéticas intraespecíficas e

interespecíficas con cada uno de los marcadores utilizados, se observó que existe una amplia

superposición entre los valores de divergencia intra e interespecífica (es decir, que no existe

“barcoding gap”). En el caso de ITS2, las distancias intraespecíficas oscilaron entre 0% y 10,76%

mientras que la divergencia entre especies resultó entre 0% y 13,76%. Con los marcadores

moleculares del cloroplasto se evidenció una mayor superposición entre los valores de divergencia

intraespecífica e interespecífica en comparación con ITS2, para matK los valores de divergencia

intraespecífica oscilaron entre 0% y 0,44% mientras que la divergencia entre especies resultó entre

0% y 0,959% y con rbcL la divergencia intraespecífica presentó valores entre 0% y 0,56% y

valores entre 0% y 0,766% para la divergencia interespecífica (Figura 7).

24

DISCUSIÓN

Utilidad de los códigos de barra de ADN en Micropholis

Los marcadores moleculares usados mostraron diferencias en cuanto a su utilidad para diferenciar

las especies de Micropholis. El espaciador transcrito interno ITS2 presentó un poder discriminatorio

mayor que los marcadores del cloroplasto ya que entre 14 y 15 especies, de las 20 analizadas,

formaron grupos monofiléticos. Kress et al (2005) obtuvieron también los mejores resultados con

ITS, y propusieron esta región como uno de los códigos de barra en Angiospermas, argumentando

sus altos niveles de divergencia inter-específica, la posibilidad de amplificarlo en dos fragmentos

más pequeños (ITS1 e ITS2), y su utilidad en muestras degradadas. Del mismo modo, Chen et al,

(2010), Gao et al (2010) y Li et al (2011) confirmaron el potencial de ITS2 como código de barras

universal, debido a su alta divergencia entre especies. En la familia Sapotaceae, ITS ha demostrado

su utilidad en discriminar especies, tal como en el estudio realizado por González et al (2009),

quienes señalan que a pesar de los problemas de amplificación, ITS podría ser útil en la

identificación de Sapotaceae. Igualmente, Vivas et al (2014), quienes evaluaron la utilidad de cuatro

marcadores moleculares, incluidos tres de los usados en nuestro estudio, en la identificación de 26

especies de Sapotaceae presentes en el Bosque Atlántico del Brasil, encontraron que ITS fue la

mejor opción para la identificación de especies de esta familia.

No sorprende que ITS resulte ser la mejor opción cuando se pretende discriminar especies

cercanamente emparentadas, teniendo en cuenta que ha sido uno de los marcadores más usados en

Sistemática desde los 90’s, cuando se incorporaron los datos moleculares en los análisis

filogenéticos (Hillis & Dixon, 1991; Baldwin, 1992). Además de ser muy variable, y tener herencia

bi-parental, ITS es fácil de amplificar debido a que existen cientos o miles de copias en el genoma,

su longitud es corta (ca. de 600 pb), y se han diseñado primers universales (White el al., 1990). La

alta variación inter-específica que posee ITS en general, y ITS2 en particular, es uno de los

25

requisitos para que una región funcione como código de barras; sin embargo, la naturaleza de este

espaciador tiene algunos riesgos que deben ser tomados en consideración. Teniendo en cuenta que

ITS2 es objeto de evolución concertada, fenómeno en el que las mutaciones que eventualmente

ocurren en algunas de los cientos de copias se homogenizan por diferentes mecanismos (Hillis &

Dixon, 1991; Álvarez & Wendel, 2003), es posible encontrar en el genoma de una especie varias

secuencias de ITS diferentes entre sí, debido por ejemplo, a eventos de duplicación de genes en la

historia evolutiva del linaje, o a la falta de una completa homogenización, por lo que no siempre las

secuencias que se obtienen experimentalmente en diferentes individuos de la misma especie, o en

diferentes especies, son ortólogas (Álvarez & Wendel, 2003). La clonación de los productos de

PCR obtenidos bajo diferentes condiciones de amplificación permitiría conocer las posibles

variantes que se presentan en un organismo, sin embargo, la clonación es una técnica que requiere

tiempo y recursos adicionales, con los que no siempre se cuenta. En este sentido, Song et al. (2012)

evaluaron el número de copias de ITS2 en 178 especies de plantas, evidenciando que de las 35

copias encontradas en promedio por especie, sólo tres constituyeron el 91%, las cuales permitieron

inferir relaciones filogenéticas y diferenciar especies. En la práctica, una forma de detectar variantes

de ITS amplificadas en la misma reacción, es la presencia de múltiples bandas al momento de

visualizar los resultados de la PCR. En nuestros resultados siempre obtuvimos bandas únicas, y

tuvimos como precaución usar siempre las mismas condiciones en la PCR, así como utilizar ADN a

una concentración muy baja. Aunque confiamos que las secuencias obtenidas corresponden a

secuencias ortólogas, consideramos que esta es una primera aproximación al uso de ITS como

código de barras en Micropholis.

Los marcadores moleculares del cloroplasto evaluados, matK y rbcL, mostraron un bajo poder

discriminatorio, logrando identificar cuatro especies y dos especies respectivamente, del total de las

especies analizadas. Aunque estas dos regiones fueron propuestas como los códigos de barra de

ADN centrales para la identificación de plantas (CBOL Plant Working Group, 2009), resultados

empíricos han demostrado que cuando se pretende diferenciar especies del mismo género, su éxito

26

varía de acuerdo al grupo de plantas en particular. Por ejemplo, mientras que en Helechos (Li et al.,

2011), matK y rbcL resultaron ser exitosos, en Cycadales (Sass et al., 2007; Nicolalde-Morejón et

al., 2010), Zingiberaceae (Shi et al., 2011) Lysimachia, Myrsinaceae (Zhang et al., 2012), Thymus,

Lamiaceae (Federici et al., 2013), y Sinosenecio, Asteraceae (Gong et al., 2015) no lo fueron. La

baja tasa de evolución del ADN del cloroplasto, debido principalmente a su herencia uni-parental,

podría explicar parcialmente su incapacidad para discriminar especies cercanamente emparentadas.

Sin embargo, es probable que cuando se examine la variabilidad de muchas más regiones del

cloroplasto, en muchos más taxones, se detecten marcadores útiles para servir como códigos de

barra en plantas, tal como lo observaron Dong et al. (2012) en diferentes familias de Angiospermas

o Kim et al. (2015) en cultivares de Panax ginseng. Teniendo en cuenta que el número de especies

de plantas con secuencias completas del genoma del cloroplasto es alto, 788 especies a la fecha, de

acuerdo a la base de datos de genomas del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse), y

que se estima que este número se incremente rápidamente gracias a las nuevas tecnologías de

secuenciación, la posibilidad de encontrar regiones del cloroplasto hiper-variables, que

adicionalmente sean fáciles de amplificar y secuenciar, es alta. En este sentido, existen varias

propuestas novedosas tales como los “ultra-barcoding” (Kane et al. (2012), los “specific-barcodes”

(Li et al., 2014), o los “extended barcodes” (Coissac et al., 2016) que permiten evaluar muchas

regiones del genoma simultáneamente.

Estos resultados ratifican el uso potencial de ITS2 como alternativa de código de barras en la

familia Sapotaceae y específicamente en el género Micropholis, debido a que es un fragmento más

corto y más fácil de secuenciar que ITS completo, en el que se encontraron muchos más sitios

informativos en comparación con los marcadores moleculares del cloroplasto matK y rbcL.

27

Especies de Micropholis polifiléticas

Los individuos evaluados de M. egensis, M. guyanensis, M. venulosa y M. madeirensis formaron

grupos polifiléticos en los tres análisis realizados. Las primeras tres especies coinciden en ser

ampliamente distribuidas, tener una amplitud ecológica considerable, y por consiguiente, tener una

variabilidad morfológica notoria (Pennington, 1990; Piñeros, 2013). La variabilidad morfológica se

evidencia al ver el gran número de sinónimos en su historia taxonómica (Pennington, 1990), y

permite entender la complejidad de su taxonomía. Si se considera adicionalmente que las flores en

M. guyanensis persisten por un solo día (Terra-Araujo et al., 2012), lo que podría ocurrir en otras

especies, y explicaría el bajo número de especímenes en los herbarios, los resultados obtenidos se

podrían deber a problemas en la clasificación, o en la identificación de estas especies.

No se puede descartar que en la historia evolutiva de Micropholis algunas especies puedan ser de

origen híbrido, o que hayan sido objeto de introgresión, donde especies de origen híbrido se

cruzaron de nuevo con las especies originales; o que las especies sean tan jóvenes, que no hayan

divergido lo suficiente de sus especies hermanas, lo que se conoce como sorteo incompleto de

linajes. Estos fenómenos podrían estar dentro de las posibles causas de las especies que aparecen en

los análisis como polifiléticas, y que se han considerado limitaciones de la técnica de Códigos de

Barra de ADN (Hollingsworth et al., 2011). Las especies para- o polifiléticas son más comunes de

lo que se suele discutir. Por ejemplo, Funk & Omland (2003) evaluaron este aspecto en más de

2000 especies de animales, encontrando especies no monofiléticas en el 23% de los casos. Si esto

ocurre en animales, donde la hibridación no es tan común, en plantas podría ser más frecuente. En

efecto, se han detectado muchos casos de especies no monofiléticas en plantas (e.g. Fazekas et al.,

2008; Pettengill & Neel, 2010; Arca et al., 2012). En la familia Sapotaceae hay evidencias sobre el

origen híbrido de algunas especies, como en el caso de Van-royena castanosperma (Swenson et al.,

2007), y de Chrysophyllum cuneifolium (Swenson et al., 2008), así como del posible origen híbrido

del clado Nesoluma (Smedmark & Anderberg, 2007). Es posible que en las especies de Micropholis

28

se presenten casos de origen híbrido o introgresión, considerando la incongruencia entre los

resultados obtenidos con ITS2 y matK (Figuras 5 a, b). Aunque las especies incluidas en la Figura 5

corresponden sólo a aquellos especímenes de los que se obtuvieron secuencias de los tres

marcadores, se puede ver que los cuatro especímenes de M. guyanensis conforman un grupo

monofilético al usar ITS2, mientras que con matK no ocurre esto. Tampoco se podría descartar la

posibilidad de la existencia de especies crípticas (Hebert et al., 2004b), ya que se puede ver cómo

diferentes individuos de M. guyanensis resultaron incluidos en diferentes clados sin correlación

geográfica (Figuras 1 y 4), y cómo presentan variación en las secuencias (Figura 2), variación que

también ha sido observada por M. González (comunicación personal).

El “barcoding gap” en Micropholis

Un concepto central de los códigos de barra de ADN es el de “barcoding gap”, de acuerdo al cual

el promedio de la distancia genética entre especies de un linaje debe ser mayor al promedio de la

distancia genética entre individuos de la misma especie (Herbert et al., 2004a; Meyer & Palau,

2015). En animales, Herbert et al. (2004a) propusieron que la diferencia entre estas dos distancias

fuera de un orden de magnitud de 10X, es decir que la distancia inter-específica debería ser 10

veces mayor que la distancia intra-especifica. Aunque en algunos grupos se encontró el barcoding

gap, (Herbert et al., 2003a, 2004a; Čandek & Kuntner, 2015; Eckert et al., 2015), en muchos

grupos no se detectó (e.g. Wiemers & Fiedler, 2007; Clement & Donoghue, 2012). Es más, algunos

autores han considerado que la presencia del “barcoding gap” es un artefacto debido a un muestreo

deficiente (Meyer & Paulay, 2005; Wiemers & Fiedler, 2007). Por ejemplo, Fazekas et al. (2009)

compararon la presencia del “barcoding gap” en animales y plantas, y lo detectaron en Viburnum,

aunque con base en un muestreo muy pequeño (tres especies); sin embargo, Clement & Donoghue

(2012) no encontraron el “barcoding gap” en éste género al evaluar más de 100 especies. Como se

puede observar en la Fig. 7, en Micropholis no se encontró una discontinuidad entre las distancias

intra- e inter-específicas, por el contrario, las distancias se traslapan. La ausencia del “barcoding

29

gap” se podría esperar en grupos producto de radiaciones rápidas, en linajes muy jóvenes, con tasas

de mutación muy bajas y generaciones muy largas. No tenemos evidencia de la historia evolutiva

del género, ni de su edad, pero teniendo en cuenta que las especies de Micropholis son

predominantemente árboles, en los que las tasas de mutación son bajas y las generaciones largas,

comparados con las hierbas (Petit & Hampe, 2006; Smith & Donoghue, 2008), se puede explicar el

traslape entre las distancias intra- e inter-específicas. Sin embargo, la ausencia del “barcoding gap”

no implica necesariamente la ineficacia de los códigos de barra, ya que hay métodos alternativos

para evaluar su utilidad, que no se basan en las distancias genéticas, como por ejemplo evaluando la

monofilia, como lo discutimos anteriormente.

CONCLUSIONES

Los Códigos de Barra de ADN constituyen una técnica promisoria para la identificación de especies

de Micropholis. De los tres marcadores evaluados, ITS resultó ser el más útil, al lograr discriminar

cerca del 70% de las especies analizadas, mientras que matK y rbcL no presentaron suficiente

variación, por lo que no se deben considerar al emplear esta técnica en la práctica. De las 20

especies analizadas, cuatro no conformaron grupos monofiléticos. Es probable que procesos de

hibridación o introgresión se hayan presentado en la historia evolutiva del género, aunque no se

descarta la presencia de especies cripticas. No se encontró el “barcoding gap” en Micropholis, con

ninguno de los marcadores evaluados. Es necesario explorar la utilidad de marcadores moleculares

adicionales que permitan discriminar la totalidad de las especies de este género de árboles

tropicales.

30

AGRADECIMIENTOS

A los funcionarios del Herbario Forestal (UDBC) y del Laboratorio de Biología Molecular de la

Universidad Distrital por su apoyo en el procesamiento del material vegetal y en la generación de

los datos moleculares. A los funcionarios del Herbario del Instituto SINCHI (COAH) por

permitirnos estudiar su colección. Al Real Jardín Botánico de Edimburgo por financiar las salidas

de campo, y a los funcionarios del Laboratorio de Biología Molecular por la secuenciación de las

muestras. Al Centro de Investigaciones y Desarrollo Científico de la Universidad Distrital (CIDC)

por el apoyo financiero para la compra de insumos y materiales indispensables para el desarrollo del

proyecto. A Paola Piñeros por su ayuda en la identificación de las especies. A Diana Trujillo y

Julieth Serrano por su ayuda en el laboratorio, y a los guías de campo Miguel Guerrero, Pedro

Rodríguez y Antonio Rodríguez por su valiosa colaboración.

31

CONCLUSIONES GENERALES

La región ribosomal nuclear ITS2 presentó los mejores resultados para la identificación de

las especies del género Micropholis (Sapotaceae) con un 50% más de sitios informativos en

comparación con los marcadores moleculares del cloroplasto matK y rbcL.

Los análisis de Neighbor-Joining, máxima parsimonia e inferencia bayesiana, presentaron

resultados muy similares en la identificación de las especies de Micropholis, utilizando el

marcador molecular ITS2.

Existen posibles procesos de hibridación, presencia de especies crípticas o identificaciones

taxonómicas erróneas en algunas especies de Micropholis, las cuales no fueron posibles de

identificar utilizando la técnica de los códigos de barra de ADN.

Los marcadores moleculares del cloroplasto matK y rbcL no resultaron ser buenos

candidatos como códigos de barra de ADN en la identificación de las especies del género

Micropholis de la familia Sapotaceae.

Los análisis de divergencia intraespecífica e interespecífica deben estar combinados con

análisis filogenéticos con el fin de tener mayor certeza de los resultados presentados por la

existencia o no de “barcoding gap”.

32

RECOMENDACIONES

Conformar una base de datos con los códigos de barra de ADN de las especies de

Micropholis con material procedente de especímenes tipo con el fin de tener certeza de la

identidad de las especies.

Aumentar el número de individuos de algunas especies de Micropholis, con el fin de

corroborar la eficiencia de los códigos de barra de ADN en la identificación de este género.

Realizar estudios morfológicos, ecológicos y moleculares que permitan corroborar la

existencia de especies cripticas o probables procesos de hibridación, en especies como M.

egensis, M. guyanensis, M. madeirensis y M. venulosa.

33

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alexander, P.J., Rajanikanth, Bacon, G. & Bailey, C. D. (2007). Recovery of plant DNA using a

reciprocating saw and silica-based columns. Molecular Ecology Notes, 1, 5-9.

Álvarez, I. & Wendel, J.F. (2003). Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference.

Molecular Phylogenetics and Evolution, 29, 417-434.

Arca, M., Hinsinger, D., Cruaud, C., Tillier, A., Bousquet, J. & Frascaria-Lacoste, N. (2012).

Deciduous Trees and the Application of Universal DNA Barcodes: A Case Study on the

Circumpolar Fraxinus. Plos One, 7(3): e34089. doi:10.1371/journal.pone.0034089.

Asahina, H., Shinozaki, J., Mazuda, K., Morimitsu, Y. & Satake, M. (2010). Identificatioon of

medicinal Dendrobium species by phylogenetic analyses using matk and rbcL sequences. Journal of

Natural Medicines, 64, 133-138.

Aubriot, X., Lowry, P., Cruaud, C., Couloux, A. & Haevermans, T. (2013). DNA barcoding in a

biodiversity hot spot: potential value for the identification of Malagasy Euphorbia L. listed in

CITES Appendices I and II. Molecular Ecology Resources, 13(1), 57-65.

Baker, C. S., Cipriano, F., & Palumbi, S. R. (1996). Molecular Genetic Identification of Whale

and Dolphin Products from Commercial Markets in Korea and Japan. Molecular ecology, 5, 671-

685.

Baldwin, B.G. (1992). Phylogenetic utility of the Internal Transcribed Spacers of nuclear ribosomal

DNA in plants: An example from compositae. Molecular Phylogenetics and Evolution 1, 3-16.

Baraloto, C., Hardy, O., Timothy, C., Dexter, K., Cruaud, C., Dunning, L., Gonzalez, M-A.,

Molino, J-F., Sabatier, D., Savolainen, V. & Chave, J. (2012). Using functional traits and

34

phylogenetic trees to examine the assembly of tropical tree communities. Journal of Ecology, 100,

690-701.

Candek, K. & Kuntner, M. (2015). DNA barcoding gap: reliable species identification over

morphological and geographical scales. Molecular Ecology Resources, 15(2), 268-277.

CBOL Plant Working Group & Janzen, D. (2009). A DNA barcode for land plants. Proceedings

of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106(31), 12794-12797.

Chase, M. W., & Fay, M. F. (2009). Barcoding of Plants and Fungi. Science, 325, 682-683.

Chen, S., Yao, H., Han, J., Liu, C., Song, J., Shi, L., Zhu, Y., Ma, X., Gao, T., Pang, X., Luo,

K., Lin, Y. & León, C. (2010). Validation of the ITS2 region as a novel DNA Barcode for

identifying medicinal plant species. PLoS ONE 5(1): e8613.

Christina, V.P.L. & Annamalai, A. (2014). Nucleotide based validation of Ocimum species by

evaluating three candidate barcodes of the chloroplast region. Molecular Ecology Resources, 14(1),

60-68.

Clark, A. & Hollingsworth, M. (2011). Molecular biology for phylogenetic and population genetic

studies – Volume I: from DNA extraction to sequencing. Royal Botanic Garden Edinburgh. 58 p.

Clement, W. & Donoghue, M. (2012). Barcoding success as a function of phylogenetic

relatedness inViburnum, a clade of woody angiosperms. BMC Evolutionary Biology, doi:

10.1186/1471-2148-12-73.

Coissac, E., Hollingsworth, P., Lavergne, S. & Taberlet, P. (2016). From barcodes to genome:

extending the concept of DNA barcoding. Molecular ecology, 25, 1423-1428.

Cuéllar, M. (2011). Código de barras genético de algunas orquídeas veracruzanas bajo riesgo de

extinción. Universidad Veracruzana, facultad de Biología. 70 p.

35

Cuenoud, P., Savolainen, V., & Chatrou, L.W. (2002) Molecular phylogenetics of

Caryophyllales based on nuclear 18S rDNA and plastid rbcL, atpB, and matK DNA sequences.

American Journal of Botany, 89, 132-144.

Darriba, D., Taboada, G.L., Doallo, R. & Posada, D. (2012). jModelTest 2: more models, new

heuristics and parallel computing. Nature Methods, 9(8), 772.

Divakar, P., Leavitt, S., Molina, M., Del-Prado, R., Lumbsch, T. & Crespo, A. (2016). A DNA

barcoding approach for identification of hidden diversity in Parmeliaceae (Ascomycota): Parmelia

sensu stricto as a case study. Botanical Journal of the Linnean Society, 180, 21-29.

Dong, W., Liu, J., Yu, J., Wang, L. & Zhou, S. (2012). Highly variable chloroplast markers for

evaluating plant phylogeny at low taxonomic levels and for DNA barcoding. Plos One, 7, 1-9

Doyle, J.J. & Doyle J.L. (1990) A rapid DNA isolation procedure for small quatities of fresh leaf

tissue. Phytochem Bull, 19, 11-15.

Drummond, A.J., Suchard, M.A., Xie, D. & Rambaut, A. (2012). Bayesian phylogenetics with

BEAUti and the BEAST 1.7 Molecular Biology and Evolution 29, 1969-1973.

Eckert, E., Fontaneto, D., Coci, M. & Callieri, C. (2015). Does a Barcoding Gap Exist in

Prokaryotes? Evidences from Species Delimitation in Cyanobacteria. Life, 5, 51-64.

Fazekas, A.J., Burgess, K.S. & Kesanakurti, P.R. (2008). multiple multilocus dna barcodes from

the plastid genome discriminate plant species equally well. PLOS One 7: e2802. Kress J, Erickson

DL (2007) A two-locus glob.

Fazekas, A.J., Kesanakurti, P., Burgess, K., Percy, D., Graham, S., Barrett, S., Newmaster, S.,

36

Federici, S., Galimberti, A., Bartolucci, F., Bruni, I., De mattia, F., Cortis, P. & Labra, M.

(2013). DNA barcoding to analyse taxonomically complex groups in plants: the case of Thymus

(Lamiaceae). Botanical Journal of the Linnean Society, 171(4), 687-699.

Funk, D. & Omland, K. (2003). Species-Level Paraphyly and Polyphyly: Frequency, Causes, and

Consequences, with Insights from Animal Mitochondrial DNA. Annual Review of Ecology,

Evolution, and Systematics, 34, 397-423.

Gao, T., Yao, H., Song, J., Liu, C., Zhu, Y., Ma, X., Pang, X., Xu, H. & Chen, S. (2010)

Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2.

Journal of Ethnopharmacology 130, 116–121.

Gernandt, D., Salazar, G., Vergara, F., Arias, S., Sosa V., García, A., Reyes, J. Cabrera, L. &

P. Rosas. (2011). Código de barras genético de cinco grupos críticos de la flora de México.

(Informe final SNIB-CONABIO, proyecto N°. GE021). México D. F.: Universidad Nacional

Autónoma de México, Instituto de Biología. Instituto de Ecología, A.C. 33 p.

Goloboff, P. (1996). Pee, Wee, NONA, SPA and Phast programs and documentation. Willi Hennig

Society Web site. http://www.vims.edu/-mes/hennig/hennig-html.

Gong, W., Liu, Y., Chen, J., Hong, Y. & Kong, H. (2015). DNA barcodes identify Chinese

medicinal plants and detect geographical patterns of Sinosenecio (Asteraceae). Journal of

systematics and Evolution, 54(1), 83-91.

González, J. A. (2009). El conocimiento sistemático de la biodiversidad y el impedimento

taxonómico. Evolución, 4, 19-32.

http://www.vims.edu/-mes/hennig/hennig-html

37

González, M. A., Baraloto, C., Engel, J., Mori, S.A., Pétronelli, P., Riéra, B., Roger, A.,

Thébaud, C. & Chave, J. (2009). Identification of Amazonian Trees With DNA Barcodes. Plos

One, 4(10): e7843.

Group China.Plant.BOL., Li De.-Zhu., Gao, L.-M., Li, H.-T., Wang, H., Ge, X.-J., Liu J.-Q.,

Chen, Z.-D., Zhou, S.-L., Chen, S.-L., Yang, J.-B., Fu, C.-X., Zeng, C.-X., Yan, H.-F., Zhu, Y.-

J., Sun, Y.-S., Chen, S.-Y., Zhao, L., Wang, K., Yang T. & Duan, G.-W. (2011). Comparative

analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated

into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108,

19641-19646.

Hall, T.A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis

program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser, 41, 95-98.

Hebert, P., Cywinska, A., Ball, S., & deWaard, J. (2003a). Biological identifications through

DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society Lond. B, 270, 313-321.

Hebert, P., Ratnasingham S., & deWaard, J. (2003b). Barcoding animal life: cytochrome c

oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings of the Royal Society

Lond. B, 270, 96-99.

Hebert, P., Stoeckle, M., Zemlak, T. & Francis, C. (2004a). Identification of Birds through DNA

Barcodes. Plos Biology, 2 (10).

Hebert, P., Penton, E., Burns, J., Janzen, D. & Hallwachs, W. (2004b). Ten species in one: DNA

barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator. PNAS,

101(41), 14812-14817.

38

Hillis, D. & Dixon, M. (1991). Ribosomal DNA: Molecular Evolution and Phylogenetic Inference.

The Quarterly Review of Biology, 66(4), 411-453.

Hollingsworth, P., Graham, S. &Little D. (2011). Choosing and Using a Plant DNA Barcode.

Plos One, 6(5), 1-13.

Kane, N., Sveinsson, S., Dempewolf, H., Yang, J-Y., Zhang, D., Engels, J. & Cronk, Q. (2012).

Ultra-barcoding in cacao (Theobroma spp., Malvaceae) using whole chloroplast genomes and

nuclear ribosomal DNA. American Journal of Botany, 99(2), 320-329.

Kim, Y.J., Jang, M.G., Zhu, L., Silva, J., Zhu, X., Sukweenadhi, J., Kwon, W.S., Yang, D.C. &

Zhang, D. (2015). Cytological characterization of anther development in Panax ginseng Meyer.

Protoplasma, doi: 10.1007/ s00709-015-0869-3. [Epub ahead of print].

Kimura, M. (1980). A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions

through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Ecology, 16, 111-120.

Kress, J., Wurdack, K., Zimmer, E., Weigt, L., & Janzen, D. (2005). Use of DNA barcodes to

identify flowering plants. Proceedings of the National Academy of sciences, 102, 8369-8374.

Kress W. & Erickson, D. (2007). A Two-Locus Global DNA Barcode for Land Plants: The

Coding rbcL Gene Complements the Non-Coding trnHpsbA Spacer Region. Plos One, 2(6), 1-10.

Kress, W., Erickson, D., Swenson, N., Thompson, J., Uriarte, M., & Zimmerman, J. (2010).

Advances in the Use of DNA Barcodes to Build a Community Phylogeny for Tropical Trees in a

Puerto Rican Forest Dynamics Plot. Plos One, 5.

Lahaye, R., van der Bank, M., Bogarin, D., Warner, J., Pupulin, F., Gigot, G., Savolainen, V.

(2008). DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots. Proceedings of the National Academy

of sciences, 105, 2923-2928.

39

Lanteri, A. (2007). Código de barras del ADN y sus posibles aplicaciones en el campo de la

Entomología. Revista de la Sociedad Entomológica, 66, 15-25.

Levin, R.A., Wagner, W.L. & Hoch, P.C. (2003) Family-level relationships of Onagraceae based

on chloroplast rbcL and ndhF data. American Journal of Botany, 90, 107-115 (modified from Soltis

P et al. (1992) Proceedings of National Academy of Sciences USA, 89, 449-451).

Li, D., Gao, L., Li, H., Wang, H., Ge, X., Liu, J., Chen, Z., Zhou, S., Chen, S., Yang, J., Fu, C.,

Zeng, C., Yan, H., Zhu, Y., Sun, Y., Chen, S., Zhao, L., Wang, K., Yang, T. & Duan G. (2011).

Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be

incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of

Sciences, 108(49), 19641-19646.

Li, F-W., Kuo, L-Y., Rothfels, C., Ebihara, A., Chiou, W-L., Windham, M. & Pryer, K.

(2011). rbcL and matK Earn Two Thumbs Up as the Core DNA Barcode for Ferns. Plos One, 6(10):

e26597. doi:10.1371/journal.pone.0026597.

Li, X., Yang, Y., Henry, R., Rossetto, M., Wang, Y. & Chen, S. (2014). Plan DNA barcoding:

from gene to genome. Biological Reviews, 90(1), 157-166.

McWilliam, H., Li, W., Uludag, M., Squizzato, S., Park, Y.M., Buso, N., Cowley, A.P. &

López, R. (2013). Analysis Tool Web Services from the EMBL-EBI. Nucleic acids research, (Web

Server issue):W597-600 doi:10.1093/nar/gkt376.

Meyer, C. & Paulay, G. (2005). DNA Barcoding: Error Rates Based on Comprehensive Sampling.

Plos Biology, 3(12): e422.

Moller, M., Quentin, C.B. & Cronk, Q.C.B. (1997). Origin and relationships of Saintpaulia

(Gesneriaceae) based on ribosomal DNA internal transcribed spacer (ITS) sequences. American

Journal of Botany 84(8), 956-965.

40

Moon, B. C., Kim, W. J. Ji, Y., Lee, Y. M., Kang, Y. M. &Choi, G. (2016). Molecular

identification of the traditional herbal medicines, Arisaematis Rhizoma and Pinelliae Tuber, and

common adulterants via universal DNA barcode sequences. Genetics and Molecular Research, 15

(1), 2-14.

Newmaster, S. G., Fazekas, A. J., & Ragupathy, S. (2006). DNA barcoding in land plants:

evaluation of rbcL in a multigene tiered approach. Canadian Journal of Botany, 84, 335-341.

Newmaster, S.G., Fazekas, A. J., Steeves, A. D. & Janovec, J. (2008). Testing candidate plant

barcode regions in the Myristicaceae. Molecular Ecology Resources, 8 (3), 480-490.

Nicolalde-Morejón, F., González-Astorga, J., Vergara-Silva, F. & Vovides, A. (2010).

Perspectivas sistemáticas de Zamia (Zamiaceae) en Megaméxico: de la taxonomía alfa a los códigos

de barra genéticos. Revista Mexicana de Biodiversidad, 82, 341-355.

Nixon, K. C. (2002). Winclada. Ithaca, NY, USA. Web site www.cladistics.com

Palacio-López, K., & Rodriguez-López, N. (2007). Phenotypic Plasticity in Lippia alba

(Verbenaceae) in Response to Water Availability in Two Light Environments. Acta Biológica

Colombiana, 12, 187-198.

Paiz-Medina, L., & Huete-Pérez, J. (2008). DNA Barcode, una alternativa para identificar

especies del Complejo Midas Cichlidae en Nicaragua (pp. 99-111). Managua, Nicaragua:

Universidad Centroamericana, Rotonda Ruben Dario.

Paz, A., González, M., & Crawford, A. (2011). Código de barras de la vida: Introducción y

perspectiva. Acta Biológica Colombiana, 16, 161-176.

Pennington, T. D. (1990). Sapotaceae. Flora Neotropica Monograph. New York Botanical Garden

Press, New York, 770 pp.

http://www.cladistics.com/

41

Penjor, T., Anai, T., Nagano, Y., Matsumoto, R., & Yamamoto, M. (2009). Phylogenetic

relationships of Citrus and its relatives based on rbcL gene sequences. Tree Genetics & Genomes, 6,

931-939.

Petit, R. & Hampe, A. (2006). Some Evolutionary Consequences of Being a Tree. Annual Review

of Ecology, Evolution, and Systematics, 37, 187-214.

Pettengill, J. & Neel, M. (2010). A sequential approach using genetic and morphological analyses

to test species status: The case of United States federally endangered Agalinis

acuta(Orobanchaceae). American Journal of Botany, 98(5), 859-871.

Piñeros, P. (2013). Sinopsis del género Micropholis (Sapotaceae) para Colombia. (Trabajo de

pregrado, Ingeniería Forestal). Bogotá: Universidad Distrital Francisco José de Caldas. 90 p.

Purushothaman, N., Newmaster, S.G., Ragupathy, S., Stalin, N., Suresh, D., Arunraj, D.R.,

Gnanasekaran, G., Vassou, S.L. & Parani, M. (2014). A tiered barcode authentication tool to

differentiate medicinal Cassia species in India.

Ronquist, F., Teslenko, M., Van der Mark, P., Ayres, D., Darling, A., Hohna, S., Larget, B.,

Suchard, M. & Huelsenbeck, J. (2012). MrBayes 3.2: Efficient Bayesian Phylogenetic Inference

and Model Choice Across a Large Model Space. Systematic Biology, 61(3), 539-542.

Sass C., Little, D., Stevenson D., & Specht D. (2007). DNA Barcoding in the Cycadales: Testing

the Potential of Proposed Barcoding Markers for Species Identification of Cycads. Plos One, 2(11),

1-9.

Shi, L., Zhang, J., Han, J-P., Song, J-Y., Yao, H., Zhu, Y-J., Li, J-C., Wang, Z-Z., Xiao, W.,

Lin, Y-L., Xie, C-X., Qian, Z-Z. & Chen, S-L. (2011). Testing the potential of proposed DNA

barcodes for species identification of Zingiberaceae. Journal of Systematics and Evolution, 49(3),

261-266.

42

Smedmark, J &Anderberg, A. (2007). Boreotropical migration explains hybridization between

geographically distant lineages in the pantropical clade Sideroxyleae (Sapotaceae). American

Journal of Botany. 94(9). 1491-1505.

Smith M., Fisher, B., & Hebert, P. (2005). DNA Barcoding for Effective Biodiversity Assessment

of a Hyperdiverse Arthropod Group: The Ants of Madagascar. Philosophical Transactions of the

Royal Society: Biological Sciences, 360, 1825-1834.

Smith, S. & Donoghue, M. (2008). Rates of Molecular Evolution Are Linked to Life History in

Flowering Plants. Science, 322, 86-89.

Song, J., Shi, L., Li, D., Sun, Y., Niu, Y., Chen, Z., Luo, H., Pang, X., Sun, Z., Liu, C., Lv, A.,

Deng, Y., Larson-Rabin, Z., Wilkinson, M. & Chen, S. (2012). Extensive pyrosequencing reveals

frequent intra-genomic variations of internal transcribed spacer regions of nuclear ribosomal DNA.

Plos One, 7(8), 1-12.

Swenson, U., Bartish, I. & Munzinger, J. (2007). Phylogeny, diagnostic characters and generic

limitation of Australasian Chrysophylloideae (Sapotaceae, Ericales): Evidence from ITS sequence

data and morphology. Cladistics, 23(3), 201-228.

Swenson, U., Richarson, J. & Bartish, I. (2008). Multigene-phylogeny of the pantropical

subfamily Chrysophylloideae (Sapotaceae): Evidence of generic poliphyly and extensive

morphological homoplasy. Cladistics, 24(6), 1006-1031.

Swofford, D.L. (2003). PAUP*. Phylogenetic analysis using parsimony (*and other methods),

Version 4.0b10. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts.

Terra-Araujo, M., Donisete de Faria, A., Lahoz da Silva Ribeiro, J. & Swenson, U. (2012).

Flower biology and subspecies concepts in Micropholis guyanensis (Sapotaceae): evidence of

ephemeral flowers in the familiy. Australian Systematic Botany, 25(5), 295-303.

43

Vivas, C., Souza R., Alves-Araújo, A., Alves, M., Mariano-Neto, E., Van den Berg, C. &

Amato, F. (2014). DNA barcoding in Atlantic Forest plants: What is the best marker for Sapotaceae

species identification?. Genetics and Molecular Biology, 37(4), 662-670.

White, T.J., Bruns, T., Lee, S. & Taylor, J. (1990) Amplification and direct sequencing of fungal

ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: a guide to methods and applications.

(Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, eds). Academic Press, New York, USA, 315–322.

Wiemers, M. &Fiedler, K. (2007). Does the DNA barcoding gap exist?- a case study in blue

butterflies (Lepidoptera:Lycaenidae). Frontiers in Zoology, 4(8).

Zhang, C.Y.; Wang, F.Y.; Yan, H.F.; Hao, G., Hu, C.M. & Ge, X.J. (2012). Testing DNA

barcoding in closely related groups of Lysimachia L. (Myrsinaceae). Molecular Ecology Resource

12, 98-108.

44

Tabla 1. Marcadores moleculares, primers y programas utilizados en la amplificación de ADN de Micropholis

NOMBRE PRIMER SECUENCIA 5`- 3` PROGRAMA REFERENCIA

matK-1

matK-390-f CGATCTATTCAT

TCAATATTTC 94°C por 1 min, 35 ciclos de 94°C por

30 seg, 50°C por 40 seg, 72°C por 40

seg, extensión final a 72°C por 5 min.

Cuenoud et al.,

2002. matK-1326-r

TCTAGCACACGA

AAGTCGAAGT

rbcL

rcbLa-f

ATGTCACCACAA

ACAGAGACTAAA

GC 94°C por 4 min, 35 ciclos de 94°C

por 30 seg, 55°C por 30 seg, 72°C

por 1 min, extensión final a 72°C por

10 min.

Levin, 2003.

rcbLajf634-r GAAACGGTCTCT

CCAACGCAT Fazekas, 2008.

ITS

ITS5P GGAAGGAGAAG

TCGTAACAAG 95°C por 2 min, 35 ciclos de 95°C por

20 seg, 50°C por 30 seg, 72°C por 90

seg, extensión final a 72°C por 7 min.

Moller et al., 1997.

ITS8P CACGCTTCTCCA

GACTACA

ITS2

ITS2-S2F ATGCGATACTTG

GTGTGAAT 94°C por 5 min, 35 ciclos de 94°C

por 30 seg, 56°C por 30 seg, 72°C

por 45 seg, extensión final a 72°C por

10 min.

Chen et al., 2010.

ITS4 TCCTCCGCTTATT

GATATGC White et al., 1990.

Tabla 2. Números de acceso de GenBank para las secuencias analizadas. *Especimen botánico estéril.

**Especimen botánico fértil. (COAH), espécimen botánico del Herbario Amazónico Colombiano.

Especie Voucher Marcador molecular

ITS2 MatK rbcL

M. brochidodroma T. D. Penn. JR-JH-1*

X

M. casiquiarensis Aubrév. JR-ED*

X

M. cayennensisT.D. Penn. NH200222 FJ037875.1

M. cayennensisT.D. Penn.

JQ626417.1

M. cayennensisT.D. Penn. NL110447

FJ514753.1

M. cayennensisT.D. Penn. NH200222

FJ514642.1


JQ625973.1

M. cayennensisT.D. Penn. NL110447

FJ038171.1


FJ038170.1

M. cayennensisT.D. Penn. JR-NH*

X

M. crassipedicellata (Mart. & Eichler ex Miq.) Pierre CV181 JQ434165.1

45



M. crassipedicellata (Mart. & Eichler ex Miq.) Pierre CV216

JQ413925.1


JQ413923.1


JQ413913.1


JQ413912.1


JQ413911.1


JQ413878.1


JQ413876.1


JQ413866.1


JQ413865.1


JQ413864.1

M. crotonoides (Pierre) Pierre CR50*

X

M. crotonoides (Pierre) Pierre ESR89*

X

M. crotonoides (Pierre) Pierre JRM24*

X

X

M. egensis (A. DC.) Pierre

DQ246681.1

M. egensis (A. DC.) Pierre NL110105 FJ037876.1

M. egensis (A. DC.) Pierre NL110105

JQ626069.1

M. egensis (A. DC.) Pierre JR1*

X


X


X

M. egensis (A. DC.) Pierre FAA2746*

X

M. garciniifolia (Pierre)

HM446713.2

M. garciniifolia (Pierre)

HM446833.1

M. gardneriana (A. DC.) Pierre CV215 JQ434161.1




M. gardneriana (A. DC.) Pierre CV215

JQ413917.1


JQ413915.1


JQ413910.1


JQ413909.1


JQ413870.1


JQ413868.1


JQ413863.1


JQ413862.1

M. gnaphaloclados (Mart.) Pierre CV51 JQ434162.1

M. gnaphaloclados (Mart.) Pierre CV51

JQ413918.1

M. gnaphaloclados (Mart.) Pierre CV51

JQ413871.1

M. guyanensis (A. DC.) Pierre CV24 JQ434168.1


M. guyanensis (A. DC.) Pierre ALCB110909 KF943856.1


46

M. guyanensis (A. DC.) Pierre

DQ246682.1

M. guyanensis (A. DC.) Pierre NL110516 FJ037878.1

M. guyanensis (A. DC.) Pierre NH200477 FJ037877.1


HM446714.1

M. guyanensis (A. DC.) Pierre 3107

JQ626512.1

M. guyanensis (A. DC.) Pierre ALCB110909

KF943852.1

M. guyanensis (A. DC.) Pierre CV24

JQ413922.1


JQ413921.1


JQ413920.1


JQ413919.1


KJ012681.1

M. guyanensis (A. DC.) Pierre NL110516

FJ514759.1

M. guyanensis (A. DC.) Pierre NH200477

FJ514663.1


FJ037937.1

M. guyanensis (A. DC.) Pierre P00610003

JQ626126.1

M. guyanensis (A. DC.) Pierre ALCB110909

KF943839.1


HM446834.1


KJ082435.1


FJ038173.1

M. guyanensis (A. DC.) Pierre NH200477

FJ038172.1


JQ413875.1


JQ413874.1


JQ413873.1


JQ413872.1

M. guyanensis (A. DC.) Pierre CR194*

X

M. guyanensis (A. DC.) Pierre RM93*

X

M. guyanensis (A. DC.) Pierre RM106*

X

M. guyanensis (A. DC.) Pierre FAA2684**

X

M. guyanensis (A. DC.) Pierre PP14*

X

M. guyanensis (A. DC.) Pierre JR1*

X


X


X


X

M. guyanensis (A. DC.) Pierre JR-JH*

X

M. guyanensis (A. DC.) Pierre JR-PA-08*

X

M. guyanensis (A. DC.) Pierre JR-GB*

X

M. humboldtiana (Roem. & Schult.) T. D. Penn. PU72 (COAH)*

X

M. humboldtiana (Roem. & Schult.) T. D. Penn. JN1015 (COAH)**

X

M. longipedicellata Aubrév NL110459 FJ037879.1

M. longipedicellata Aubrév NL110459

FJ514774.1

M. longipedicellata Aubrév M17116106

JQ625881.1

M. longipedicellata Aubrév JR-NL-1*

X

M. macrophylla (Krause) T. D. Penn. EP102 (COAH)**

X

47

M. madeirensis (Baehni) Aubrév. RC2869**

X X X

M. madeirensis (Baehni) Aubrév. MS3660 (COAH)*

X

M. madeirensis (Baehni) Aubrév. JR329*

X

M. melinoniana Pierre AME1999

(COAH)** X

M. melinoniana Pierre A110164

JQ625737.1

M. obscura T. D. Penn. P00610293 FJ037881.1

M. obscura T. D. Penn. NH200217 FJ037880.1

M. obscura T. D. Penn. P00610293

JQ626160.1

M. obscura T. D. Penn. JR1*

X

M. obscura T. D. Penn. JR2*

X

M. porphyrocarpa (Baehni) Monach. NH200696 FJ037883.1

M. porphyrocarpa (Baehni) Monach. NH200404 FJ037882.1

M. porphyrocarpa (Baehni) Monach. NH200404

JQ626009.1

M. porphyrocarpa (Baehni) Monach. JR1*

X

M. porphyrocarpa (Baehni) Monach. JR2*

X

M. sp AME737

(COAH)** X

M. sp AME799

(COAH)** X

M. sp DS22

** X

M. sp FAA2733

* X X X

M. splendens Gilly ex Aubrév. FAA2693*

X X X

M. trunciflora Ducke DC12266

(COAH)** X

M. venulosa (Mart. & Eichler) Pierre

DQ246683.1

M. venulosa (Mart. & Eichler) Pierre NL110297 FJ037885.1

M. venulosa (Mart. & Eichler) Pierre NL110260 FJ037884.1

M. venulosa (Mart. & Eichler) Pierre 3114

JQ626490.1

M. venulosa (Mart. & Eichler) Pierre NL110297

FJ514736.1


FJ514727.1


FJ037938.1


JQ626105.1

M. venulosa (Mart. & Eichler) Pierre NH200082

GQ428628.1


FJ038176.1


FJ038175.1

M. venulosa (Mart. & Eichler) Pierre AD8893

(COAH)** X

M. venulosa (Mart. & Eichler) Pierre PP74

** X

M. venulosa (Mart. & Eichler) Pierre JR-PA-14

* X

M. venulosa (Mart. & Eichler) Pierre JR1

* X


* X


* X

M. venulosa (Mart. & Eichler) Pierre FAA2704

* X X X

M. venulosa (Mart. & Eichler) Pierre JR-PA-09*

X

48

Pouteria laevigata (Mart.) Radlk.

JQ625817.2

Pouteria multiflora Pierre 118737331 KJ012732.1

Tabla 3. Resumen de la variabilidad de las secuencias en el análisis de máxima parsimonia para las especies

de Micropholis.

Marcador molecular

ITS2 matK rbcL

longitud alineada (pb) 333 692 540

sitios informativos 85 (51,60%) 7 (1,011%) 3 (0,55%)

Número de árboles 164 3 6

Longitud del árbol 169 7 4

Ci 69 100 75

Ri 93 100 85

49

Figura 1. Árbol construido por el método de Neighbor-Joining, utilizando las distancias de Kimura 2-

parámetros con el marcador molecular ITS2. Los rectángulos verdes representan las especies identificadas y

los valores de bootstrap se presentan sobre las ramas.

50

Figura 2. Porción del alineamiento múltiple de secuencias de M. guyanensis con el marcador molecular ITS2.

Los óvalos indican las posiciones variables informativas dentro de los individuos de la especie en estudio.

Figura 3. Porción del alineamiento múltiple de secuencias de algunas especies del género Micropholis con el

marcador molecular ITS2. Los óvalos indican las posiciones variables informativas para el estudio.

51

Figura 4. Análisis filogenético basado en el método de máxima parsimonia utilizando el marcador molecular

ITS2. Los cuadrados verdes indican los clados resueltos. Los puntos blancos indican las homoplasias y los

puntos negros indican las sinapomorfías. Las flechas indican los nodos que colapsaron en el árbol de consenso

estricto. Los valores de bootstrap se presentan sobre las ramas.

52

Figura 5. Análisis filogenético basado en el método de máxima parsimonia utilizando 20 secuencias de nueve

especies de Micropholis con los marcadores moleculares ITS2 (a), matK (b), rbcL (c) y las combinaciones de

los marcadores ITS2+matK (d), ITS2+rbcL (e), matK+rbcL (f) e ITS2+matK+rbcL. Los puntos blancos

indican las homoplasias y los puntos negros indican las sinapomorfías. Los valores de bootstrap se presentan

sobre las ramas.

53

Figura 6. Árbol de máxima credibilidad (MCC) del análisis de inferencia bayesiana de la región ribosomal

nuclear ITS2. Los rectángulos verdes representan las especies identificadas. Los valores de probabilidad

posterior se muestran sobre las ramas.

54

Figura 7. Divergencia intraespecífica e interespecífica para el conjunto de datos estudiados con el marcador

molecular ITS2 (a), matK (b) y rbcL (c).

LOS CÓDIGOS DE BARRA DE ADN COMO …repository.udistrital.edu.co/bitstream/11349/4135/1...techniques to identify species are based on molecular characters using DNA barcoding. ...

Documents