Dirección General de Epidemiología Instituto de Diagnóstico y referencia Epidemiológicos “Dr. Manuel Martínez Báez” lineamientos de laboratorio para la vigilancia epidemiológica de la carga viral y subpoblaciones linfocitarias en individuos infectados por el vih
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Dirección General de Epidemiología
Instituto de Diagnóstico y referencia Epidemiológicos“Dr. Manuel Martínez Báez”
lineamientos de laboratorio para la vigilanciaepidemiológica de la carga viral y
subpoblaciones linfocitarias enindividuos infectados por el vih
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Versión No.01 InDRE-RNLSP
LINEAMIENTOS DE LABORATORIO PARA LA VIGILANCIA
EPIDEMIOLÓGICA DE LA CARGA VIRAL Y SUBPOBLACIONES
LINFOCITARIAS EN INDIVIDUOS INFECTADOS POR EL VIH
DGE-InDRE-RNLSP
2015
Fotografía de la portada propiedad de HKS Arquitectos
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Versión No.01 InDRE-RNLSP
PRIMERA EDICIÓN, 2015
CARGA VIRAL Y SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS–RNLSP
ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE
CONFORMAN EL GRUPO TÉCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMITÉ NACIONAL DE
11. NMX-CC-9001 IMNC-2008, Sistemas de gestión de la calidad-Requisitos. DOF:
12/12/2008, imnc.org.mx
12. Lineamientos para los Programas de Evaluación Externa del Desempeño de la Red
Nacional de Laboratorios de Salud Pública DGE-InDRE-RNLSP, 2014.
13. Manual para la toma, envío y recepción de muestras para diagnóstico. DGE-InDRE-
RNLSP, 2014.
14. Lineamientos de la Evaluación del Desempeño “Caminando a la Excelencia”,
México, DGE-InDRE-RNLSP, 2014.
15. Lineamientos del Sistema de Reconocimiento a la Competencia Técnica de
Laboratorios que apoyan a la Vigilancia Epidemiológica. DGE-InDRE-RNLSP,
2014.
16. Lineamientos para la Gestión de Riesgo Biológico. DGE-InDRE-RNLSP, 2014.
DEFINICIONES OPERATIVAS
Sida: es la etapa final de una infección causada por un virus que tiene una duración de
varios años; por lo que en la actualidad se considera que es una infección crónica. A partir
del momento que una persona se infecta por el virus que causa el Sida, tarda en promedio
10 años para que se desarrollen las manifestaciones de la enfermedad conocida como
Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida, SIDA.
Portador asintomático del VIH: Persona que se encuentra infectada por el virus de la
inmunodeficiencia humana, pero que todavía no ha desarrollado manifestaciones de la
enfermedad.
Determinación cuantitativa de carga viral en plasma: Es el número de partículas virales
contenidas en un volumen determinado de plasma o suero. Se expresa como número de
copias del virus/mL. Existen técnicas comerciales disponibles como RT-PCR (Amplicor,
Roche), NASBA, y Nuclisens (Organon), bDNA (Quantiplex, Chiron), Digene
(Omnichen). Ha sido demostrado, que la carga viral es un marcador que pronostica el
riesgo de progresión de la enfermedad, y sirve para medir la respuesta a la terapia
antirretroviral.
Cuenta de linfocitos T CD4+: La cuenta de linfocitos T CD4+ nos permite conocer el
deterioro que ha sufrido el sistema inmune a causa del VIH, generalmente el número de
estas células disminuye conforme avanza el deterioro del sistema inmune (progresión de la
enfermedad). Los valores normales de los linfocitos T CD4+ van de 750 a 1200
células/mL, el límite superior puede variar de acuerdo al método de laboratorio utilizado.
Una cuenta igual o menor a 200 células/mL se considera como definitoria de SIDA
independientemente de la presencia de otras manifestaciones.
Las actividades de salud, y dentro de ellas los servicios del Consejo Nacional para
Prevención y Control del Sida (CONASIDA), constituyen una de las materias objeto de la
actualización normativa, la NOM-010-SSA2-2010, Para la prevención y control de la
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infección por VIH, aglutina los puntos de vista, propuestas y resultados de investigaciones
que diversos organismos, tanto gubernamentales como no gubernamentales y privados han
efectuado en varios ámbitos para la prevención y control de la enfermedad.
Básicamente la NOM-010-SSA2-2010 enumera las definiciones y especificación de
términos, disposiciones generales, medidas de prevención y de control; asimismo, describe
una bibliografía básica y la concordancia que tiene con otras normas a nivel internacional,
para efectos de la NOM-010-SSA2-2010 se entenderá por:
OMS: Organización Mundial de la Salud.
CONASIDA: Consejo Nacional de Prevención y Control del SIDA.
VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Humana, incluye al VIH-1 y al VIH-2.
OBJETIVO GENERAL
Establecer los procedimientos para la aplicación del algoritmo de diagnóstico por
laboratorio para la cuantificación de la carga viral y subpoblaciones linfocitarias en
individuos infectados con el VIH-1 y establecer el manejo adecuado de la información
generada por laboratorio, a través de la RNLSP, en apoyo a la Vigilancia Epidemiológica
de la infección.
DETERMINACIÓN POR LABORATORIO DE LA CARGA VIRAL Y DE
SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS CD4, CD8 y CD3
Cuantificación de la carga viral: Las muestras de sangre para la determinación de carga
viral deberán tomarse cuando el paciente cumpla con un ayuno mínimo de 10 horas. Se
debe de utilizar un tubo con EDTA como anticoagulante, ser transportadas a una
temperatura de entre 2 y 25 °C y centrifugarse dentro de las primeras 6 horas siguientes a
su recolección.
El volumen de sangre solicitado es de 5.0 mL, pero en caso de enviar el plasma ya separado
el volumen mínimo será de 1.2 mL.
Una vez separado el plasma de preferencia deberá congelarse, pero puede almacenarse
máximo un día a temperatura ambiente (18 a 25 °C) o a una temperatura de entre 2 y 8 °C
por 5 días.
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Los tubos con las muestras deberán estar perfectamente etiquetados, sellados, y sin que
exista evidencia de derrames.
La determinación por lo general se realiza en plasma, aunque puede hacerse en otros
líquidos y tejidos.
En todas las técnicas para la cuantificación de la carga viral es necesario trabajar con
moléculas de RNA viral, las cuales son muy inestables, por lo que la toma de la muestra,
las condiciones de transporte, de almacenamiento y de procesamiento son fundamentales
para la obtención de resultados confiables.
Las variaciones de la carga viral se expresan en forma de un logaritmo de base o poder 10.
Por ejemplo, si en una primera determinación se encuentra 100,000 partículas del virus/mL,
entonces la disminución de 1 log, es igual a la disminución de 90% del número de copias,
es decir, una disminución a 10,000 copias/mL. La disminución de 2 log, es igual a la
disminución de 99% del número de copias, es decir, una disminución a 1,000 copias/mL.
La disminución de 3 log es igual a la disminución de 99.9% del número de copias, es decir,
a 100 copias/mL. Cambios de más de 0.5 log son considerados como significativos.
Cuantificación de subpoblaciones de Linfocitos CD4, CD8 y CD3. Las muestras de
sangre para la determinación de subpoblaciones de linfocitos CD4, CD8 y CD3 deben de
tomarse cuando el paciente cumpla con un ayuno mínimo de 10 horas. Se debe de
recolectar en un tubo con EDTA como anticoagulante, y transportarse a una temperatura
entre 18 y 25 °C, así como no tener más de 24 horas de haberse obtenido. El volumen de
sangre solicitado es de 5 mL.
En los casos de pacientes que requieran tanto la determinación de carga viral como de
subpoblación de linfocitos CD4, CD8 y CD3 se debe de enviar dos tubos con muestra
sanguínea que cumplan las especificaciones descritas en los párrafos anteriores.
El recuento de linfocitos CD4 tiene limitaciones de orden biológico y analítico que hay que
conocer para no cometer errores en su interpretación: Entre las de orden biológico están las
variaciones debidas a la edad, grupo étnico, momento del día en que se realiza la extracción
de la sangre, la estación del año, la influencia de infecciones concomitantes o el uso de
tratamientos. Entre las de orden analítico, están las relaciones con la variabilidad de los
resultados entre los laboratorios: la temperatura de la muestra, tiempo transcurrido entre la
extracción y el análisis; tipo de anticoagulante, reactivo e instrumento utilizado. Por último,
la variabilidad del número total de leucocitos, las proporciones de linfocitos/total de
leucocitos y linfocitos CD4+/total de linfocitos, influyen sobre la cifra absoluta de
linfocitos CD4+
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ALGORITMO DIAGNÓSTICO
Figura 1. Algoritmo para la cuantificación de la carga viral del VIH
ALGORITMO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE SUBPOBALCIÓN DE
LINFOCITOS CD4, CD8, CD3
Muestra de sangre total obtenida en tubo con EDTA
Centrifugar a 3500 rpm durante 15 minutos
Obtener el plasma, envasar y congelar a -70 °C
Realizar carga viral por la técnica de RT-PCR en tiempo real
Sensibilidad del método 40–10, 000, 000 de Copias de
ARN/mL)
RESULTADO DEL TÍTULO
1. CARGA NO DETECTADA: el valor Ct
obtenido para HIV-1 está por arriba del
límite del ensayo o no se ha obtenido un
valor Ct para HIV-1.
2. < 4.00E+01copias/mL: Las copias/mL
calculadas están por debajo del límite de
detección del ensayo.
3. ≥4.00E+1copias/mL y ≤ 1.00E+07
copias/mL: Los resultados calculados
superiores o iguales a 40 Copias/mL e
inferiores o iguales a 1.00E+07 copias/mL
se encuentran dentro del intervalo lineal
del ensayo.
4. >1.00E+07 copias/mL: Las copias/mL
calculadas están por encima del intervalo
del ensayo
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
1. Reportar como copias/mL de ARN del VIH-1 no detectado.
2. Reportar con ARN del HIV-1 detectado,
menos de 40 copias/mL.
3. Reportar como resultados calculados dentro del intervalo lineal del ensayo.
4. Reportar como más de 1.00E+07
copias/mL del ARN del HIV-1. NOTA: Si se desea obtener un resultado cuantitativo, debe diluirse la muestra original con plasma humano negativo para HIV-1 y repetirse la prueba, multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución.
Se reporta No. Copias de ARN/mL)
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Figura 2. Algoritmo para la cuantificación de linfocitos CD4, CD8, CD3
Muestra de sangre total obtenida en tubo con EDTA
Agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente
Mezclar 20 µL del anticuerpo monoclonal triple anti CD4, antiCD8 y anti CD3 + 100 µL de sangre
Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente y en la obscuridad
Preparar la muestra (lisa, estabiliza y fija)
Leer a las muestras, el número de células CD4, CD8, CD3 y % de cada subpoblación
en el citómetro de flujo
Reportar el número de células/µL de CD4, CD8 y relaciones CD4/CD8,
CD4/CD3 y CD8/CD3
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Captura de datos y resultados
La captura de los datos se realiza en bitácoras de registro donde se concentran todos los
datos generados en el laboratorio, posteriormente los resultados se incorporan a la
plataforma “INFOLABW” y finalmente se liberan por parte del jefe de laboratorio.
ESTÁNDARES DE CALIDAD
Cuantificación de carga viral
Indicador de oportunidad
Cumplir con la emisión de los resultados de diagnóstico en 16 días en por lo menos el 90%
de las muestras recibidas = resultados de diagnósticos informados en 16 días/número de
muestras recibidas para diagnóstico X 100.
Indicador de confiabilidad
Cumplir con el 90% o más del Programa de Evaluación Externa del Desempeño (PEED)
para este diagnóstico = paneles aprobados con el 90% o más/paneles recibidos X 100.
Cuantificación de linfocitos
Indicador de oportunidad
Cumplir con las emisión de los resultados de diagnóstico en tres días en por lo menos el
90% de las muestras recibidas = resultados de diagnósticos informados en 3 días/número de
muestras recibidas para diagnóstico X 100.
Indicador de confiabilidad
Cumplir con el 90% o más del PEED para este diagnóstico = paneles aprobados con el 90%
o más/paneles recibidos X 100.
PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO
El PEED como tal no aplica para la Red Nacional de Laboratorios Estatales de Salud
Pública. Sin embargo, actualmente se cuenta con un programa de evaluación externa en el
cual participa el laboratorio de carga viral del InDRE y el laboratorio de referencia
internacional “CARPERMOR” para la cuantificación de subpoblación de linfocitos CD4,
CD8 y CD3; y un programa de evaluación externa en el cual participa el laboratorio de
carga viral del InDRE y el laboratorio de genética molecular para la cuantificación de la
carga viral de VIH.
El programa consiste en enviar un panel de 5 muestras de sangre total con EDTA como
anticoagulante cada 4 meses (cuatrimestral). El InDRE realiza el primer y tercer envío de
los paneles al laboratorio de referencia internacional “CARPERMOR” y genética
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molecular, mientras que estos últimos proporcionan las muestras de los paneles segundo y
cuarto que se envían al InDRE.
Posterior al análisis de las muestras, se realiza el análisis estadístico en el cual se debe dar
cumplimiento al indicador de confiabilidad que es del 90%.
Criterios para la liberación del diagnóstico
Carga viral
En cada corrida de muestras se debe incluir un control negativo, un control positivo bajo
para VIH-1 y un control positivo alto para VIH-1. La corrida de muestras es válida y se
elabora el informe de resultados si no aparece alguna notificación que invalide los
controles.
1. Control negativo
El control negativo (-) debe dar un resultado “Target not detected” lo que se
interpreta como carga viral no detectable o que la carga está por debajo del límite de
detección del método. Si el resultado obtenido para el control negativo lleva
asociado el aviso “Invalid” (no válido), toda la corrida es inválida y debe de
repetirse.
2. Controles positivos
El intervalo asignado tanto para el control positivo bajo como para el control
positivo alto es específico para cada lote de reactivo; está incluido en los códigos de
barras de los casetes de reactivo para la prueba.
Los valores de copias del ARN del HIV-1/mL obtenido para los controles positivos
deben estar dentro de los respectivos intervalos asignados. Si uno o ambas controles
positivos tienen el aviso de no válido, toda la corrida es inválida y debe de repetirse.
Cuantificación de subpoblación de linfocitos CD4, CD8 Y CD3
1. Se utiliza el FLOW CHECK para determinar el buen funcionamiento del equipo con
respecto al sistema hidráulico y óptico ya que permite ajustar el canal de lectura y
determinar si los voltajes son los adecuados.
2. Se utiliza el INMUNO-TROL como un control interno que valida el ensayo. Es una
muestra de sangre total con valores conocidos, de manera que se toma como
referencia de las poblaciones linfocitarias CD4, CD8 y CD3 por lo que cualquier
desviación de los datos reportados en la técnica del INMUNOTROL se toma como
un desajuste del equipo.
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Obtener valores de las poblaciones linfocitarias CD4, CD8 y CD3 dentro del rango
estipulado en la técnica del INMUNO-TROL, brinda la certeza de que los valores
obtenidos en el análisis de las muestras son reales.
Banco de material biológico
Con el objetivo de mantener el banco de material biológico, que sirva para la realización de
los paneles de eficiencia, así como la obtención de controles de referencia, o para estudios
que permitan la implementación de nuevas técnicas de diagnóstico, actualmente se cuenta
en el laboratorio de carga viral del InDRE con el banco de muestras que son conservadas en
congelación, y que provienen de los diferentes LESP y de instituciones públicas y privadas
del país.
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
El laboratorio de carga viral participa en el curso anual de Bases y fundamentos de los
métodos de diagnóstico por el laboratorio para infecciones de transmisión sexual.
Cronograma de actividades
Actividad Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Sep Oct Nov Dic
Curso teórico-práctico XX
Envío del primer panel a los
laboratorios CARPERMOR
y genética molecular
XX
Recepción de resultados del
panel en el INDRE XX
Envío de resultados a los
laboratorios CARPERMOR
y genética molecular
XX
Envío del segundo panel a
los laboratorios
CARPERMOR y genética
molecular
XX
Recepción de resultados del
panel en el InDRE XX
Envío de resultados a los
laboratorios CARPERMOR
y genética molecular
XX
Nota: Si alguna de las fechas corresponde a un día no laborable, la actividad se realizará el
siguiente día hábil.
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BIBLIOGRAFÍA
1. Palmer S, Wiegand AP, Maldarelli F, Bazmi H, et al. new real-time reverse
transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human
immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma J Clin Microbiol. 2003; 41:4531-
4536.
2. Kuritzkes DR. Quantification of human immunodeficiency virus type 1 by reverse