L’immunofenotipo L’immunofenotipo leucocitario: utilità leucocitario: utilità diagnostica diagnostica Roberto Caporale Roberto Caporale Pistoia, 29 ottobre 2011 Pistoia, 29 ottobre 2011
Mar 18, 2016
L’immunofenotipo leucocitario: L’immunofenotipo leucocitario: utilità diagnosticautilità diagnostica
Roberto CaporaleRoberto Caporale
Pistoia, 29 ottobre 2011Pistoia, 29 ottobre 2011
Bernard Shoor & Leonard Herzenberg at Stanford with one of the original BD Flow Cytometers
1974 - Becton & Dickson, using FACS technology, introduced 1st commercial Flow (FACS-1)
Sistema FACSCanto IISistema FACSCanto II
BD Biosciences
Microscopia CitometriaMicroscopia Citometria in fluorescenza in fluorescenza
Citometria a Flusso (CFM)Citometria a Flusso (CFM)
La CFM consente l’analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse, misurandone le caratteristiche fisiche e/o biochimiche all’interno di un flusso laminare che interseca una sorgente di eccitazione
FOCALIZZAZIONEFOCALIZZAZIONE IDRODINAMICAIDRODINAMICA
campionecampionesheath fluidsheath fluid
LASERLASER
Diffrazione:proporzionale alle dimensioni della cellula rilevata lungo l’asse della luce incidente 0°
Rifrazione & Riflessione:proporzionale alla granularità cellulare e alla complessità rilevate a 90° rispetto la luce incidente.
Generazione dei segnali di “scatter”Generazione dei segnali di “scatter”
SSCSSC
FSCFSC
GRANULOCITIGRANULOCITI
MONOCITIMONOCITI
LINFOCITILINFOCITI
La combinazione dei due tipi di segnali permette di ottenere un particolare diagramma
di dispersione denominato
CITOGRAMMA
nel quale si possono evidenziare fino a 5 o 6 differenti popolazioni cellulari, in base
alle sole caratteristiche fisiche
Sottopopolazioni leucocitarie in sangue perifericoSottopopolazioni leucocitarie in sangue periferico -Citogramma --Citogramma -
LINFOCITILINFOCITI
MONOCITI
LINFOCITI
MONOCITI
NEUTROFILI
LINFOCITI
MONOCITI
NEUTROFILI
EOSINOFILI
LINFOCITI
MONOCITI
NEUTROFILI
EOSINOFILI
BASOFILI
VOLUME VOLUME
COM
PLES
SITA
’ CO
MPL
ESSI
TA’
ImmunofenotipizzazioneImmunofenotipizzazione cellularecellulare- definizione -- definizione -
Insieme di metodi diretti al riconoscimento, alla quantificazione ed alla localizzazione di strutture cellulari per mezzo di reagenti immunologici (anticorpi monoclonali).
PubblicazioniPubblicazioni
Crescita delle applicazioni diagnostiche in citometria a flusso
1st
123328 references (2010)
• Esperienza dell’operatore
• Valutazione delle prestazioni e della stabilità della strumentazione
• Controlli di qualità (IQC, VEQ, EQAS)
Requisiti per una buona Requisiti per una buona analisi citometricaanalisi citometrica
Riproducibilità dei parametri di fluorescenzaRiproducibilità dei parametri di fluorescenza
Linfoma Follicolare - diagnosiLinfoma Follicolare - diagnosi
Linfoma Follicolare - MMRLinfoma Follicolare - MMR
LiquidiLiquidi::
•Sangue periferico•Aspirati Midollari•Leucaferesi•Liquor•Liquidi cavitari
SolidiSolidi::
•Linfonodi•Biopsie•Agoaspirati
Materiali idonei per indagini in CFMMateriali idonei per indagini in CFM
Regole per una corretta analisi citometrica Regole per una corretta analisi citometrica in onco-ematologiain onco-ematologia
• Quesito diagnostico (dialogo con i clinici)• Caratteristiche del campione da analizzare• Scelta di adeguate combinazioni di anticorpi monoclonali• Regolazione dello strumento e “compensazione” delle
fluorescenze• Strategie di “gating” per il riconoscimento delle popolazioni
cellulari da analizzare• Integrazione con i laboratori di morfologia, citogenetica e
biologia molecolare• Formulazione di una risposta adeguata e conclusiva
Metodo di studio in citometria Metodo di studio in citometria
• Valutazione delle normali componenti cellulari del sangue midollare
• Valutazione dello stadio maturativo di tali componenti
• Dimostrazione della presenza nel campione di cellule anormali
• Eventuale dimostrazione della loro clonalità
• Evidenziazione di fenotipi peculiari allo scopo di identificare una determinata entità nosografica e/o utili per lasciare una traccia in corso di follow-up (MMR)
Espressione del CD45 nei leucocitiEspressione del CD45 nei leucociti
Sangue Periferico vs Sangue MidollareSangue Periferico vs Sangue Midollare
Sangueperiferico
Sanguemidollare
Maturazione Mieloide: SIDE SCATTERMaturazione Mieloide: SIDE SCATTER
MATURAZIONE MIELOIDE:MATURAZIONE MIELOIDE: granulocitopoiesigranulocitopoiesistem cell Blasto
mieloidepromieloc
itaMielo cita granulo
cita
CD66c
CD13
CD11bCD11a
CD66bCD11c
CD16CD64
Meta mielocita
CD34
CD33
CD15
stem cell Blasto mieloide
promonocita
Mono cita
CD13CD33
CD14CD11b
CD36CD64
MATURAZIONE MIELOIDEMATURAZIONE MIELOIDEmonocitopoiesimonocitopoiesi
CD34
0
100
PROMIELO MIELO METAMIELO GRAN
CD11bCD11b
CD1CD100
CD1CD166
CD64CD64
CD1CD133
MATURAZIONE MIELOIDE:MATURAZIONE MIELOIDE: variabili di espressione variabili di espressione
Interpretazione suInterpretazione su CD66bCD66b//CD11bCD11b
BM normale Sindrome mielodisplastica+ mature
immatureimmature
blocco maturativoblocco maturativoblastiblasti
Maturazione MieloideMaturazione MieloideInterpretazione su Interpretazione su CD66bCD66b//CD11bCD11b
CD16 CD16
CD15CD64
CD10
CD13
CD11
bCD
11b
Maturazione mieloide in BM normaleMaturazione mieloide in BM normale
R4
CD16 CD16
CD15CD64
CD10
CD13
CD11
bCD
11b
Maturazione mieloide in BM con MDSMaturazione mieloide in BM con MDS
Maturazione mieloide in BM con MDSMaturazione mieloide in BM con MDS
Maturazione monocitaria in BM con Maturazione monocitaria in BM con LMMCLMMC
Mean values of bone marrow leucocyte Mean values of bone marrow leucocyte populationspopulations
A. Santagostino
Cell count 34.5 x 106 cell/ml (SD 28.0)Erythroid 10.8% (SD 5.7)Lymphocytes 12.4% (SD 5.9)
CD3 61.4% (SD 15.1) CD4 29.3% (SD 11.3)CD8 30.8% (SD 13.1) NK 11.2% (SD 9.2)CD19 18.9% (SD 14.0)CD19+10+ 43.10% (SD28.6) CD19+20+ 45% (SD28.9)
Monocytes (CD14) 3.2% (SD 1.5)CD34+ cells 0.9% (SD 0.7)Whole myeloid serie 72.2% (SD 8.7)
Immature/blast 3.6% (SD 2.1)Promyelocytes 12.3% (SD 6.3)Myelo and metamyelo 28.4% (SD 11.4)band and mature 48.9% (SD 15.5)Eosinophils 1.9% (SD 1.5)
Plasmacells 0.4% (SD 0.3)
CD16 FITCCD16 FITC//CD13 PECD13 PE//CD34 PerCP-Cy5.5CD34 PerCP-Cy5.5//CD11b PE-Cy7CD11b PE-Cy7//CD117 APCCD117 APC//CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7
NORMALENORMALE
MDSMDS
Maturazione Mieloide: SIDE SCATTERMaturazione Mieloide: SIDE SCATTER
Stetler-Stevenson, Blood 2001
• Hypogranulation of PMN 84%• CD11b/CD16 abnormal 70%• CD13/CD16 abnormal 78%• CD64+ granulocytes 66%• CD10- granulocytes 11%• CD45-dim blasts 53%• CD56+ granulocytes 21%• CD56+ monocytes 33%• My-cells expressing non-My Ags 38%
MDS ABNORMALITIES BY FCMMDS ABNORMALITIES BY FCM
CD16 FITCCD16 FITC//CD13 PECD13 PE//CD34 PerCP-Cy5.5CD34 PerCP-Cy5.5//CD11b PE-Cy7CD11b PE-Cy7//CD56 APCCD56 APC//CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7
CD19
nuclearenucleareTdT
CD22citoplasmaticocµ
CD10CD20
CD34
stem cell Cellula pre-pre B
Cellula pre B
Cellula B
citoplasmaticoCD79a
SmIg
PROFILO ANTIGENCOPROFILO ANTIGENCO Maturazione linfoide BMaturazione linfoide B
Maturazione linfoide BMaturazione linfoide BCD20 FITCCD20 FITC//CD10 PECD10 PE//CD34 PerCP-Cy5.5CD34 PerCP-Cy5.5//CD38 PE-Cy7CD38 PE-Cy7//CD19 APCCD19 APC//CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7
Intensità di espressione nelle M. Intensità di espressione nelle M. LinfoproliferativeLinfoproliferative
MCLMCL
CLLCLL
CD22 FITCCD22 FITC//CD200 PECD200 PE/ / CD19 PerCP-Cy5.5CD19 PerCP-Cy5.5 / / CD5 PE-Cy7CD5 PE-Cy7/ / CD23 APCCD23 APC / /CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7
MCLMCL
CLLCLL
Intensità di espressione nelle M. Intensità di espressione nelle M. LinfoproliferativeLinfoproliferativeKappa FITCKappa FITC//Lambda PELambda PE/ / CD20 PerCP-CD20 PerCP-
Cy5.5Cy5.5 / / CD38 PE-Cy7CD38 PE-Cy7/ / CD19 APCCD19 APC / /CD45 CD45 APC-Cy7APC-Cy7
Presenza o assenza di marcatori nelle Presenza o assenza di marcatori nelle M. LinfoproliferativeM. Linfoproliferative
MCLMCL CLLCLL
Espressione di ZAP-70 nelle CLLEspressione di ZAP-70 nelle CLL
VALUTAZIONE HCLVALUTAZIONE HCLCD103 FITCCD103 FITC//CD11c PECD11c PE/ / CD20 PerCP-CD20 PerCP-
Cy5.5Cy5.5 / / CD25 PE-Cy7CD25 PE-Cy7/ / CD19 APCCD19 APC / /CD45 CD45 APC-Cy7APC-Cy7
VALUTAZIONE T-LDGLVALUTAZIONE T-LDGLCD57 FITCCD57 FITC//CD5 PECD5 PE/ / CD3 PerCP-Cy5.5CD3 PerCP-Cy5.5 / /
HLA-DR PE-Cy7HLA-DR PE-Cy7/ / CD8 APCCD8 APC / /CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7
ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NKCD158a E CD158b SULLE CELLULE NK
pattern atteso in una popolazione pattern atteso in una popolazione policlonalepoliclonale
CD158a
CD158b
ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SU CELLULE KIR+CD158a E CD158b SU CELLULE KIR+
pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità
CD158a
CD158a CD158a
CD158a
CD158b
CD158b
CD158b
CD158b
pattern compatibili con l’ipotesi di clonalitàpattern compatibili con l’ipotesi di clonalità
ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NK CD158a E CD158b SULLE CELLULE NK
pattern atteso in una popolazione policlonalepattern atteso in una popolazione policlonale
VALUTAZIONE PLASMACELLULEVALUTAZIONE PLASMACELLULE
CD19 CD138 CD38 CD56 FSC / SSC debole presente Brillante assente ↑↑ assente presente Ridotta presente ↑↑↑
PARAMETRI INDAGATI
plasmacellule normali
plasmacellule trasformate
IPOTESI DIAGNOSTICA
Immunofenotipo plasmacellule normali
Combinazione MoAb FITCFITC PEPE PerCP-Cy5.5PerCP-Cy5.5 PE-Cy7PE-Cy7 APCAPC APC-H7APC-H7 HV-450HV-450
1 CD138 CD117 CD20 CD38 CD56 CD45 CD19
Combinazione MoAb FITCFITC PEPE PerCP-Cy5.5PerCP-Cy5.5 PE-Cy7PE-Cy7 APCAPC APC-H7APC-H7 HV-450HV-450
1 CD138 CD117 CD20 CD38 CD56 CD45 CD19
Immunofenotipo plasmacellule trasformate
• CD19-CD56-• CD19-CD56+
Immunofenotipo plasmacellule trasformate
Plasma cells: normal vs clonal
Ocqueteau et al, AJP 152,1655,1998
Normal & reactive
CD45+
CD38 +++CD138 ++
CD56-
CD19+
CD117-
k & l(polyclonal)
CD20-
MGUS
CD45+/-
CD38 +++/++CD138 ++
CD56-/+
CD19-/+
CD117-
CD20-
k &/or l(monoclonal in a
proportion of PCs)
Clonal
CD56++
CD45-
CD38 ++CD138 ++
CD19-
CD117-/+
CD20-
k or l(monoclonal)
CD45+
CD38 +++CD138 ++
CD56-
CD19+
CD117-
CD20-
k & l(polyclonal)
Myeloma
CD56++
CD45-
CD38 ++CD138 ++
CD19-
CD117-/+
CD20-
k or l(monoclonal)
MM: dimostrazione di monoclonalità
IF1 IF2 IF3 IF4CD19 + + - -CD56 - - + -% PC <0.4 >0.4 NS NS
Immunofenotipi plasmacellulari
IF2 % PC=15% PC=15%
% PC=19%% PC=19%
% PC=5%% PC=5%
IF3
IF4
IF1
21%
5%
62%
12%
0%10%20%30%40%50%60%70%
IF1 IF2 IF3 IF4
CD45
CD117 CD56
CD38
fattori prognostici in CFMfattori prognostici in CFMCD20
CD20+ CD38dim CD45- CD56- CD117+IF1 / / / 18 /IF2 3 3 1IF3 9 13 5 31IF4 2 2 2 12 10
TOT IF 11 15 10 33 42
Nuovi targets per la terapia contro il Nuovi targets per la terapia contro il MMMM
SANGUE MIDOLLARE MM
SANGUE PERIFERICO MM
Presenza di PC-MM su Sangue periferico:
SANGUE PERIFERICO NORMALE
Malattia Minima ResiduaMalattia Minima ResiduaA
B
DIAGNOSI
MMR
Sensibilità strumentale = 1/10000
Utilità della citofluorimetria nel paziente affetto da MM:
• distingue tra plasmacellule normali, reattive e patologiche
• determina eventuali fattori prognostici
• identificare nuovi targets per la terapia contro il mieloma
• un’elevata sensibilità nel valutare la MMR
• possibilità di evidenziare PC-MM anche su sangue periferico
Conclusioni (I)
• L’analisi multiparametrica multicolore consente una L’analisi multiparametrica multicolore consente una maggiore opportunità di discriminare sottopopolazioni maggiore opportunità di discriminare sottopopolazioni cellulari.cellulari.
• E’ necessario applicare buone procedure di validazione E’ necessario applicare buone procedure di validazione strumentale e ottimizzare la scelta delle combinazioni dei strumentale e ottimizzare la scelta delle combinazioni dei reagenti.reagenti.
• L’elettronica digitale ha decisamente aiutato nella L’elettronica digitale ha decisamente aiutato nella esecuzione di analisi complesse fino a poco tempo fa esecuzione di analisi complesse fino a poco tempo fa impensabili.impensabili.
Conclusioni (II)