Top Banner
Vandana Thathy 1 , 2 , Hisashi Fujioka 3 , Soren Gantt 1 , Ruth Nussenzweig 4 , Victor Nussenzweig 1 and Robert Me  nard 5 , 6 1 Department of Pathology, Michael Heidelberger Division of Immunology, New York University School of Medicine, New York, NY 10016, 2 Departments of Medicine and of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY 10461, 3 Institute of Pathology, Case Western Reserve University, Cleveland, OH 44106, 4 Department of Medical and Molecular Parasitology, New York University School of Medicine, New York, NY 10010, USA and 5 Unite  de Biologie et Ge Âne Âtique du Paludisme, Institut Pasteur, 75724 Paris Cedex 15, France 6 Corresponding author e-mail: [email protected] The sporozoite stage of the Plasmodium parasite is formed by budding from a multinucleate oocyst in the mosquito midgut. During their life, sporozoites must infect the salivary glands of the mosquito vector and the liver of the mammalian host; both events depend on the major sporozoite surface protein, the circum- sporozoite protein (CS). We previously reported that Plasmodium berghei oocysts in which the CS gene is inactivated do not form sporozoites. Here, we ana- lyzed the ultrastructure of P.berghei oocyst differenti- ation in the wild type, recombinants that do not produce or produce reduced amounts of CS, and cor- responding complemented clones. The results indicate that CS is essential for establishing polarity in the oocyst. The amounts of CS protein correlate with the extent of development of the inner membranes and associated microtubules underneath the oocyst outer membrane, which normally demarcate focal budding sites. This is a ®rst example of a protein controlling both morphogenesis and infectivity of a parasite stage. Keywords: budding/cell division/circumsporozoite protein/Plasmodium berghei/sporozoite Introduction Malaria transmission occurs when infective sporozoites are inoculated into a susceptible vertebrate host by a female mosquito during bloodfeeding. Sporozoites are unique amongst the invasive stages of Plasmodium in that they must invade one target organ in each host during their infectious process. In the mosquito, they invade the secretory cells of the salivary glands to enter the salivary ducts and, once injected into a mammalian host, they rapidly invade hepatocytes where they develop into exoerythrocytic forms. Plasmodium sporozoites have the classical structural features of invasive stages of apicomplexan parasites. They are crescent-shaped and polarized cells. Their anterior pole contains micronemes and rhoptries, secretory organelles that discharge their contents at the anterior tip of the parasite during attachment to, and penetration of host cells. Sporozoites are formed within oocysts, which are lodged between epithelial cells and the basal lamina in the mosquito midgut. The young oocyst, surrounded by a capsule, enlarges progressively as multiple mitotic nuclear divisions occur in the absence of cytokinesis. The multinucleate oocyst is then partitioned progressively as thousands of uninucleate sporozoites bud in successive waves from the plasma membrane (Terzakis et al., 1967; Vanderberg and Rhodin, 1967; Vanderberg et al., 1967; Sinden and Strong, 1978; Aikawa, 1988). The sporozoite is limited by a trimembranous pellicle. The outer membrane is derived from the oocyst plasma membrane, and closely apposed to it lies a double inner membrane. The two inner membranes form de novo underneath restricted areas of the oocyst plasma membrane at the sporozoite budding sites and progressively extend as budding proceeds (Dubremetz and Torpier, 1978). Closely underlying, and possibly connected to the inner mem- branes, is an asymmetrical framework of longitudinally arranged microtubules that maintain the form and rigidity of the sporozoite (Vanderberg et al., 1967; Aikawa, 1971; Sinden, 1978; Morrissette et al., 1997). The circumsporozoite protein (CS) is the major surface protein of Plasmodium sporozoites (Yoshida et al., 1980; Aikawa et al., 1981; Yoshida et al., 1981). CS is an ~350 residue protein, most probably anchored to the sporozoite outer membrane via a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor (Moran and Caras, 1994). CS is thought to have multiple important functions. Speci®c motifs in CS are involved in sporozoite binding to mosquito salivary glands (Sidjanski et al., 1997; de Lara Capurro et al., 2000), and in sporozoite attachment to heparan sulfate proteoglycans in the liver of the mammalian host (Cerami et al., 1992; Pancake et al., 1992; Frevert et al., 1993; Sinnis et al., 1994, 1996; Gantt et al., 1997; Pinzon-Ortiz et al., 2001). CS is probably also important for sporozoite gliding motility, a form of substrate-dependent cell locomotion characteristic of Apicomplexa. Indeed, CS is secreted at the sporozoite anterior pole, translocated along the sporozoite axis and released on the substrate at the sporozoite posterior pole (Stewart and Vanderberg, 1988). In addition, following sporozoite invasion of hepatocytes, the CS released in the host cell cytoplasm may inhibit protein synthesis by binding to ribosomes (Frevert et al., 1998). Disruption of the single-copy CS gene in Plasmodium berghei revealed yet another role for CS in the parasite life cycle, as mutants were incapable of generating sporozoites (Me Ânard et al., 1997). In the present study, we used P.berghei clones modi®ed at the CS locus and transmis- sion electron microscopy to study the role of CS in oocyst differentiation. Levels of circumsporozoite protein in the Plasmodium oocyst determine sporozoite morphology The EMBO Journal Vol. 21 No. 7 pp. 1586±1596, 2002 1586 ã European Molecular Biology Organization
11

Levels of circumsporozoite protein in the Plasmodium oocyst determine sporozoite morphology

Apr 21, 2023

Download

Documents

Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: Levels of circumsporozoite protein in the Plasmodium oocyst determine sporozoite morphology

������� �������� ������ �������������� ������ ���� ��������������� ��� ����������� ��� ��!��� "�#����$�%

��������� �� ��������� ������� ������������ ������� ���������� ��� ��� !�������� "����� �� �������� ��� ��� ��� �##�$� %��������� �� ������� �� �� ������������ ���������� &����� '����� (������ �� �������� )��*� �� �#+$��,�������� �� ��������� (��� -����� .������ !��������� (��������/� ++�#$� +�������� �� ������� �� ��������� ��������������� ��� !�������� "����� �� �������� ��� ��� � �� �##�#�!"& �� 0!���1 �� )������� �� 2�1�1��3�� �� ��������������� ������� 404%+ ���� (���* �0� 5����

$(���������� �������6���7 �����8�������9��

��� �������� ��� � �� ��� �������� ������� ������� �� ����� ���� � ������������ ������ � ���������� �� ��� ���� ���� ���� ��������� ��������� ��� ������� ����� �� ��� ������� ������ ������ ���� �� ��� �������� ����� ���� ������ �������� ��� ����� �������� ������� ������� ��� �������������� ������ � !"� #� ��������� �������� ������������ �� ��� ������� � $��� ��� �� ��� ���������� �� ��� ���� ���������� %���� $� �������� ��� �������������� �� ���� ��� ������ ������������� � ��� $�� ����� ����������� ���� �� ���������� �� ������� ������� ������� �� !� ��� ������������ ������������ ������� ��� ������� ���������� ! � �������� ��� ��������� ������� � ���������� ��� ������� �� ! ������ ��������� $�� ����&���� �� ����������� �� ��� ���� ��������� ������������ ����������� ���������� ��� ������ �������������� $��� �������� ��������� ����� ����� ����� ��� � � '��� �&����� �� � ������ ��������� ���� ������ ����� ��� �������� �� � ������� ��� ���������7 ������:���� �������:����������;����������:�� ���� �������:�����;����

&������ ����

������� ��������� ������ ��� �������� �����;�������� ��������� ��� � ����������� ���������� ���� �� ������ ��3���� ����� �����������9 "����;����� �����3�� ����� ��� ������� ������ �� �� ���� � �������� ��� ����� �� ������ ���� � ���� ���� ����� �������������� �������9 � ��� ��3����� ���� ����� ������������ ����� �� ��� �������� ����� �� ���� ��� ������������� ��� ��� �<����� ��� � ����� ����� ����������� ����� ����������� ����� ���� ������� ����*������������� ����9�� ���� �����;����� ���� ��� ��������� ����������

�������� �� ������� ������ �� ��������*� ���������9=��� ��� �������6������ �� ������;�� �����9 =����������� ���� ������ ������� �� ���������� ���������

��������� ���� ��������� ����� ������ �� ��� ������� ����� ��� �������� ����� �������� ��� �� ��������� ������ �����9 "����;����� ��� ����� ����� �������� �������� ������ ������ ���������� ����� �� ��� ����� ���� ���� ��3���� �����9 =�� ���� ������� ��������� �� ��������� ������� ������������� �� ������� ������ �������������� ����� � ��� ������ �� ���� �����9 =������������� ������ �� ��� ���������� ������������� ���������� �� ��������� �����;����� ��� � ��������������� ��� ��� ����� ����� >=��;� �� �� ��9� �?$4@A�������� �� .����� �?$4@ A�������� �� ��9� �?$4@"��� �� "����� �?4B@ &� ���� �?BBC9

=�� �����;���� �� ������ �� � ���������� ��������9=�� ����� ����� �� ������� ��� ��� ������ ����������� �� ������� ������� �� �� ���� � ������ ��������9 =�� ��� ��� ������ ��� �� ������������ ���������� ����� �� ��� ������ ����� ������� ��� �����;���� ������ ����� �� ������������� �*��� �������� �������� >�������; �� =������� �?4BC9 (��������������� �� �������� ������� �� ��� ��� �6������ �� � ���������� ������� �� ������������������� ����������� ���� ����� ��� ��� �� ���������� ��� �����;���� >A�������� �� ��9� �?$4@ &� ���� �?4�@"���� �?4B@ ����������� �� ��9� �??4C9

=�� ����������;���� ������ >("C �� ��� �<�� ������������� �� �� ���� �����;����� >������� �� ��9� �?B#@&� ��� �� ��9� �?B�@ ������� �� ��9� �?B�C9 (" �� � D,0#������� ������� ��� �������� ������� �� ��� �����;��������� ����� ��� � ��������������������������� >2 �C����� >���� �� (����� �??+C9 (" �� ������� �� ����������� ������� �������9 "����E� ����� � (" ���������� � �����;���� ����� �� ��3���� �������� �����>"��<�� � �� ��9� �??4@ �� F��� (������ �� ��9� %###C� ��� �����;���� �������� �� ������ ������� ������������� ��� ����� �� ��� ����� ���� >(���� �� ��9� �??%@ ��� � �� ��9� �??%@ 5������ �� ��9� �??,@ "��� �� ��9��??+� �??$@ 2��� �� ��9� �??4@ �;�6/���; �� ��9� %##�C9(" �� �������� ���� ������� ��� �����;���� �������������� � ��� �� ���������6������� ���� ���������������������� �� &�������*�9 ������ (" �� �������� ����� �����;���� ������� ����� ����������� ���� ��������;���� �*�� �� �������� � ��� ��������� �� ��������;���� ��������� ���� >"������ �� A����������?BBC9 � �������� �������� �����;���� ������ �������������� ��� (" �������� � ��� ���� ���� ���������� ������ ������ �������� �� ����� �� ��������>5������ �� ��9� �??BC9

��������� �� ��� �����6���� �� ��� � �� ���� ������� �������� ��� ������ ���� ��� (" � ��� �������� ���������� �� ����� ���� �������� �� �������� �����;�����>��1��� �� ��9� �??4C9 � ��� ������ ������ �� ������������ ����� ���E�� �� ��� �� ����� �� ������6��� ������� ��������� �� ����� ��� ���� �� (" � �������������������9

'�(�)� �* �� �+�,�������� ,������ ����� �������� �� �� �����+����,�������� +��,��)��

��� -"./ 0�����) ���� �� ��� � ��� ���� � ����

��� �������� ��������� ������� �������� ���

Page 2: Levels of circumsporozoite protein in the Plasmodium oocyst determine sporozoite morphology

����)��

��� ����� �� ��������� � ������������ ��� �������!��� ���������� �������� �� �������� ��������������� ��� ������� � ��3���� ������ ���� �����6������� ��������� 0 ���� ����� ��� �������� ��������9"����;����� ���� �� E�� ����� ������� �� ���� �#G�% ����6�������9 5����� � ����� ��� ������� �� �����;����������� ����� ������� �� �������� � ��������������� ��3����� �� ��������� ������� ���������9&� ������� ��������� >A�������� �� .����� �?$4@A�������� �� ��9� �?$4C� ��� ����� ���� ������ �� ���������� ���� >D,#G+# � � �������C ������ �� ������ ����� �� � ���� ������� >5����� �&C9 �������� ������ ������� ����� �� ���������� �6������ ������� � ����� �� H������ �������� ���������� �������� �� ��� ��������� �� ��� ����9 �������� ����������� ������ ��� ��� ����� ����� ����� �������������� �������� �� ���� �������� ��� ��� �������>5����� �&C9 =�� ������� ����� ���� ����� �������������� ��� ����� ����� �� �������� �������������

��� ��� ������ ��������� ������� ������� ���������������� ������ ����������� >5����� �)C9 "����;����� ������ ��� ��� ���������� ��������� � ���������� �����>5����� �(@ ��� A�������� �� ��9� �?$4C� �� ��������� E����� ����������� ����� ���� �� ���������� ���������>5����� ��C9

"����;���� ������ �� �������� � 5����� %9 =�� E�������� � ��� ������� ��� ��� ��6������� ���������������� ����� �� ��� ������ ����� ����� �� >�C ��������� ������� ������ ������ >���� �������� �� ����� ������C� ����� ��������� �������� � ������ �� �� H������ �� ���������� �������� �� �������� ����� >�������; �� =������� �?4BC@ ��>��C ����������� ���� ������ ������� ������� ��� ��������� >5����� %& �� )@ ��� ������ � 5����� �)C9=�� ��� ������ �� ����������� ��� ��6�*����� ��� ��� ����� >5����� %)C@ �������� ��� ��� �������

( � )� '������ ���������� �� ������ ��������� � ����6������������9 >*C & ����� ������ >��C � ��������� ����� ���������9=�� ������ �� ������ ��� ��3���� ������ >�C �� � �������6����������� >�����C� ����� ��������� ���� ��� ������� >��C9 "����������� >C ��� ������9 >+C =�� ������ ����� ����� ��� ����������� ��� ������� �� ��������� ��� ��� ������ ��������� ��������6�� ��� ������ ��� ������� ����������� >���C9 ��� ������ �������������� ������ ��� ����� ����� >������C �� ������������� �� �����;���� ������9 > C &� ����� ����� �������� >������C� ��������� ����� ����� �� ��� ������ ����� ��� �������6��� �������� �� ��� ����� �����;����� >�C� ����� ������� ���� E���9������ >C ��� ��� ������ �����;���� ���� >�C9 "����;����� ���� ���������� ��� >��C ��� ��� � �����6������9 >�C '��������� ��� ������������ ��� �� ���� ��������� ������ �����;����� >��C9 )���7 0 �9

( � ,� "����;���� ������ � ����6���� ��������9 >*C )����� ���������� ��� ����� ������� �� ��� ��� ������ >������C ������ ��������� ����� �����9 )��7 #90 �9 >+C 5���� �*����� �� ������ ������9 "������������ ����������� ��� ������� � �����6������ ��������� ����� ��� ��� ������ >������C9 )��7 #90 �9> C ��� ������ �� ����������� >�����C ����� ������ �������� �����;����9 & ������� >.�C �� ������� �� ��� ������ ���� �� ������� �� � ������ >C �� ��� ������ ��� ���9 )��7 #9+ �9>�C '������ ���� �� ��� ������ ����� ��������� �� ��� ��������9 =�������� �� �� ��� ������� ���� ����� ���� �� ��� ��� ��� ������ ��������� >�����C9 )��7 #9, �9 >-C (����6������ �� � �����;���� ��������� �������� �������� �� ��� �0 ������������� ����������� ��������6������ �� ��� ������9 =�� ����� ����� ��� ����� ���������� ���� ������ �����9 )��7 #90 �9 >(C F��������� ������ �� ��� �����6;���� �������� ����� ��� ����� ������ ��� ������ �� ����������� ����������9 )��7 #90 �9

1�� �+�,�������� ,������ ��� �,�������� !������

���

Page 3: Levels of circumsporozoite protein in the Plasmodium oocyst determine sporozoite morphology

�� ��������� �� �� ������ ���� �������� �� �� ���������������� �� ����� �����9 � �� ����� ��� ����������;���� �� ������ �� � �������� �������� ����������9�9 ��� ����� ����� �� ��� ��� ������� �� �������������� ���������� ��������� ���� ������������>5����� %(G5C9 � ��������� ���� ��������� ������� �� �0����������� �����;�� ����� ���6������ �� ��� ����������� ��� �����;���� ������ �� � �������� ���������� ���� ������ ����� �� ��� ��������� >5����� %'@ ���A�������� �� ��9� �?$4C9

&� ���������� ���� � ������ �� ���� ��������� ������� ������� >�������� �� ��9� �?B4� �?BB@ ������ �� ��9� �?BB@ &� ��� �� ��9� �??#C� (" �� E����������� �� ��� ������ ����� ����� ��� �� ������ ��������� ��� ��� �������� ����� �� ��� ���� �� ������>5����� ,C9 &� ����� ����������� ������� (" �� �������������� ���� ��� ����� ����� �� ���� �������� ������� ����� ���� ��� ����� ����� >5����� ,& �� )C9� �������� ��� ������ ����� �� (" ��� ���� � ����������� �� ���������� ���� ���������� ��������9 F����� ���������� ������� ��������9 &� ��� ����� �6���� �������� ��� ��� �������� (" ��������� ������������� ����� ����� �� �� ���������� � ���������� �� � ��� ����������� ����� >5����� ,(C9 -�������� ��� �������� ����� ����� �� (" ����� ��� ������������ �� ����������� �� �����;����� >5����� ,�C9

����������� �� �� ������� �������-� ���������� ���� �������� ���� �������� ������������� � ����� ��� ����6���� �� ��� ��� ��������� ����������� ���������� >��1��� �� ��9� �??4C9 =������ �� ��� >(" �C ����� �������� ������ ����� ��������� �� ����6���� �������� � ��������� ������� ���������� ��� �� ������� �����;�����9 /� �� ��� (" ������� (">6C�� ��� �*���� �� ��������� ���������������� >5����� +C9 �� ��������� � ������ ������ �������� �������� ������ ��� (" � ���� �� ��� ����6���� ��� �������� ���� ��� �# ����6�������9 ������ ������������� ������ ���������� ��� ��������� �� ����

��������� �� � ������� ������ �������9 =���� ���������������� ������ ��������� �� (" � �� ����6����������� ���� ��������9 >�C � ��� ����6����� ��� ��������� ��� ����� ��� �������� � ����� �������������� ����� >5������ �) �� %&C9 � �������� �(" � �������� ���� ������ �� ��� ����� ����� >D��� �#����6�������C �� ����������� �������;����� ������������� ���������� �� � ����� ������ ����� ��� ������������ � ������ ���� ��� ������� >5����� +&C9 >��C -����� ��� ����6���� ��� ������ ��� ������ ��� ���������������� �� ���� ����� �� ��� ����� ����� >��������� �����C� � (" � ������� ���� ���� �*������ ������� ��� ����� ������ �� ���3����� �������� �������� ��� ������ ��������� >5����� +)G�C9 �����6����� ����������� ���� ������ ���������� ���� ���������� ��� ������ � (" � ������� >5����� +(�� �C� �� ��� �������� ������ ��������� ����6�������� �� ������ ������������ ��� ��� �������� ��� ����� ����� ���� ������ � ����6���� ��(" � ������� >=���� �C9 >���C � ����� ������� �� ��� ��������� ����� ���������� �������� � (" � ������� �������3����� ������ �� ��� ��� ������� ������ ���������>5����� 0' �� 5C �� ������� >5����� 0� �� 2C9 �� ��������� �������� ������� ��� �������� ������ ���� ��������� � (" � ������� ���������� ������������������ � ����� ��� �� ��� ������ ������ �� �����6������� �� ���� ���������� �� ��� ������ ����������9

( � .� ���������� ���������� ������ (" �*������� � ����6���� �������� �������9 "������ �� ����6���� �������� ������� ���������� ������ �� ��������� ��� >&C �� >�C ���� ������ �������6(" ������� ��������� �������� �� ���6���� ��2 ��<�������� �0 ���� ���������9 >*C 2��� ��������� ��� ���������� ���� �������� ������ ����� �� ����� ������� �������� �� ��� ������� >�C ���� ����� ������� �� ���� �� ���� �������� ����� �� ��� ����� �6���� >������C9 )��7 #9B �9 >+C (" ������� �������� �� ��� ����������� ����� ��� �������� ����� ������ �������9 )��7 �90 �9> C (" ������� ������� �� ������� �� ��� ����� ����� ����������� ��� ������ �������9 )��7 #9B �9 >�C &� ����� ������� (" ��������� ������� �� ������ �����;�����9 )��7 �90 �9

( � /� '������ ���������� ������ ��� ��������� �� (" ��������9 ��� ������ �� ����������� ������� �������� ���������� �� ��� ������ ����� �����9 >*C '*����� ��������� �� ��������� >����������C ��� ������� ������ ��� ����� ����� ������� ������ �� ����� ����� ��������� ��� ��� ������ �������>�����C9 � ������@ �� ��3���� ����� ������9 )��7 0 �9>+C (������� ���� �� ��� ������ �� � �*������ ���� �� �������� ����� ���� ��� �� ��������� ��� ��� ������� >�C9 )��7%90 �9 > C =�� ����� ����� � ���������� ������ �� � �����������������������9 �� ������ �������9 )��7 #90 �9 >�C &����� ���� ��������6����� ����������� � �����6������9 )��7 #90 �9

�2����� �� ��2

����

Page 4: Levels of circumsporozoite protein in the Plasmodium oocyst determine sporozoite morphology

"��� ����� � ��������� ��� (" � ������� �*����� ������ ������ �������� ���� ��� ����� ������� ���������� �������� ������ ������� �����6���� ������ ���� �������� �����;����� >5����� 0C9 =���������� ���� ������ ������ �*������� >� ��� ����������������� 5����� 0& �� (C� �� �������� >����� ���������5����� 0�G2C ����� ����� �������� �� ��� �������������� �� ��������9 )����� ��� ��� ������� �� (" �������� ��� �������� ��������� >��� ���� ������ �� �������C �� � � �������� ���� ��� �������� �� ��� ���������������� ��� >5����� 0& �� )C9 =��� ��� � ������� ������6���� �������� � ����� �������� ����� ������ ��� �� �������� ������������ �� ��� ���������� ���������>5������ �(� �� %) �� (C9 .��� ����� ������� ������������� �� ���3����� ������� ������ ���� � (" �������� ���� ������ �� ��� �������� �������� ��������������� ����������� >5����� 0(C� ����� ���� ������������� �� ��� ��� ������� ������� �� � ����6���������;���� ���� >=���� �C9 "����3��� ����������� ������������ ��������� ��� ��� ��������� ���� �����6���� ��� �� ��������� � (" � �������� �� ������������������ ���� ��� ���3����� �� ��� ������� ��� �� ������������� �� � ������ >5����� 0� �� 2C9

=���� � (" � �������� ������ �� ����� ��� �� ������ ������;�� �� �� �����������9 ��� �������� ����������� ����� ������� � ������ ��� �� ������������ �� �*��������� �� ��� ���� ���� ���������� ���� � ������ ����� �� ���������9

������ �������������� �� �� ��� ������=� ������� ������� ����� �������� �� (" � ������� ������� �� ��� ��� �� (" �� �� � ������� ������ �� ������������ ������ �� ��������� � ����� ���� �� ��� ����� ��� ��� ��������� �� ����� �� ����� ���������9 5������� (" � ������������ ������� �������� ���� � ����6������6�������� ������������� ��������� ����������������� > ������ �C ���� ���� ���������� ���������� �("(�� >5����� $&C9 =��� ������ ���������� ��� -.??%�#6�������� ������������� ���������>�����C ��� �� � ���������� �� �� >5���� ��-������ �??4@ �� I���6-��� �� ��9� %###C� �� �������6���� �������� �� ������ ���� ��� ������ �� �9, ��� �� 0�6���������� ����� >!=.C �� +0# �� �� ��,�6!=.9 ����� �("(�� ��� �������� �� ��� ����������� ����� �� ������;���� �� � ��3�� ���� ������� $## ��������� �� ��� �� ����� ����9 &�� ����� �������� ��� ��������� ��������� �������� � 5����� $& �� ���� �5����� $) ��� �� �������������� ("(���9 =���� �������� ������� ������ �� ��� ������ ��������� � ���� ���� ��������� �� ������ �� ��� �� ��������� ���� ����

���� ������� ���� �� ��� ������9 =��� ���� ������������� ���� ������� ������ �� ��� �� ��������� ������� �� �� ��� ���� ��������� �� ��� �� �����9

("(��� ��������� ��������� �� ��������� ��3��6��� �������� ���� ����� �� ����� �����;�����9 ("��������� ��� �������� � ("(��� �����;����� ���6������ ��� ������� ��3���� ������ �� ��� �0 ����6������� �� ������ ���� ���� ���6(" ����������������9 =���� �����;����� �������� ����� �� ("������ �� ����6���� �����;����� >5����� $(C9 ������������*������ �������� ���� ��� ��������� �����;��������� ������ ������ �� ��������� ��� ������� ������������� ������� ��� � ����6���� �����;����� >������C9 "����;����� �� ��� ����6���� �� ������������������� ������� ��3���� �������� ����� �� �������*���� >�� ����C� �� ���H��������� ������������� ���6(" ��������� ��E��� ���� (" �*�������� ��������� �����;����� ��������� ��� ��3������������ ����� >5����� $�C9 "������� ���� �����;����� ���� ��� ���������� ������ ������ ���6����� ������� ��������� � ���� ����� ��������� �<����� >�� ����C��� ��� �������� ��������� ������������ ������ ������E��� �� "������ ���� ������� �� ����� ����� ��� ���*������� ��������>�C ��������� ��� ��� ��������� ������� >5����� $)� ��� ("(���6"� ���������C9 =��������������������� �� � �� ��� ��� ��� ���������� �� ���������� �� ���� ��������� �� (" ������ �� �������� �� ����� ��������� �����9 -� ������� ���� ��� ���������

����� 0� !������������� �� ��� ������ ��������� � ����6���� �� (" ����������

"����� ������ >C

��������� �=� �� �� /� �=� �� ��(>�����C >����������C >����� �� ����������C

-��� ���� ,� � , �% � #9, �, � �(" � ,% � $ �% � #9, �, � #9+

�=� ����������@ ��� ��� �����@ /�� ����� �����9

( � 1� '������ ���������� �� (" � ������� ������ ������������� � ��� ����������� ����� >&G(C �� � ��� ���������� ����6���� >�G2C9 >*C ������� ���� �� �� ���6�� � ����������9 )��7 , �9>+C & ������ ��� �*���� �������� �� ��� ���������� ��������������� �� ���� ��� ��� ����������� �����9 )��7 %90 �9 > C ��������� �� ����������� >������C �������� ��� ����������� ����� �� ��� ��� ����� �����9 )��7 #90 �9>�G2C (��������� ������ ���� ���� ��� ������ >������C������� ������� >� �� 2C �� ��������� >' �� 5C9 .�� �������@ � ������9)���7 %90 �9

1�� �+�,�������� ,������ ��� �,�������� !������

����

Page 5: Levels of circumsporozoite protein in the Plasmodium oocyst determine sporozoite morphology

�������� �� (" � ��������� �� ��� �����E����� �� ��� ��� �� ("9

����� ���� �� � !"#$% ������ � ����� ��������� �� ��=� ����;� ������� ��� ���� �� (" � ��������� �������6�� �� ��� ��� ������ �� �������� ����6�������� �� ���������� �������� ����� ���� ��������������� ����� �� (" �� ������� ��� ,�6!=. �� ��9(���� �� ��3����� �� �� ���������� � �������������;����� ���� �������� ������ ,� ��� >.����� �� ��9��??,C9 !�� � ��� �� ������� �������� ����� ���������� �� � ����� ���� �� �����3����� ����������������� ,� ��� �� ��� �� ���������� ��� ������������� ������������� ���������� BB �� ,,4 ����� ��� �� ���� ����>5����� 4&C9 =�� �<����� �� ��� �� ,� ��� ��� ���������D,## �� ���� ��� ���� ����� <��� ������� �� � �$ �� 2!6���� ����� >.����� �� ��9� �??,C9

-� �������� ��� �������� ����� > ��&%4#6� �� ��&%4#6%C � ����� ��� �� ��� ��� �������� �� %4# ���� ��� ,�6!=.9 =���� ����� ���� ������� � ��������

����������� �*������� �� ��������� ��������� ����� �� ����� � ����6���� �������� �� ������� ������� ��&%4# >5����� 4& �� )C9 =�� �������� ��3���� ����� ������ ������ �� ��������� ,$ �� �� �� ��� %4# ������� ��� ���� ����9 "������ ���� �������;���� ������������ ��� ��� ��&%4# ����� ��� � �������� ���������� ����� >���� � 5����� 4( ��� ���� ��&%4#6�C9 =��� ����� �������� ��� ��������� ���6������ �� ��� ��� �� ���� �� ��� ������� ������� ���������� � 5����� 4)9 "��� ��� ������� ������ ������� �������� ��� ��� ��� E��� ��������� �� ���� �� ��������� �� �*�������� ����� �������� �� ������ ����������� �� �����������9 =�� ������� ��������� �� ���E��� �� ���� � ��� ��&%4# ����� ��� ��E��� �� (.����E����� >5����� 45� ��� �C9 (���� �� ��3������� ��� �������� (. �������� ��E��� ���� ����*������� ���� �� �� ��� � ����6���� ��3���� �� ����������� �� %4# �� �� ��� ,�6!=.9�������� ������� ��3����� ���� ������� ���� ����

�� ��� ��� ��&%4# �����9 '*������ ��� ����������;����� �������� �� ���� �%G�0 ����6������� ����

( � 3� 2����� ����������� �� ��� (" � ���� �� ������������ �� ��� �� ��� ��� ��� ��������� �� �����9 >*C 2�� �������� �� ��� �� �� 6��� ����� >�� ���������C ���� ��� ������� ������ �("(�� ������;�� �� ��� ��3�� ���� ���� >IC ����� �� ����������9 =�� ��������� ������� �*������ �� ������ ��� ������ ��������� �� ���� �����9 =�� ��������� ��;�� >� �C �� ���������� ������� �������� ��� �������� �� ����6���� ����� ��& ���� !"�.A >'0C � ��� �� �� ��� �� ��� ��������� �� ����� ��� ����9 /�� ��*��� �� ����� ��3�����@ ���� ��*������������� ��������� �������� ����� � �������� ��������@ ���� ��*��� ��� ���� >�����C �������� ��������@ ��� ����� 0�6 �� ,�6!=.� ����@ ���� ����� �!(�? ������ ��3�����@ ������6������ ������� ������ ������ ��� ��� �������� ����� � �� ����� ����� ��3����� ���� �"������ �������;����9 >+C "������ ���� �������;���� �� !"�.A6�������� ����� ��& �� ����6���� �������� >-=C� (" � J(">6C�K� ����������� >("(���C �� ����� ������ �������� ��� � �����;����6������ ������� �� ("(��� �����;����� >("(���6"�C9 =�� ��� ���� ��� ������������������ ���� ��� ����� �� ������ � ������9 '���9� �������� ������ � ���@ �*��9� �*������ ������ � ������ ��������� ������ �� �� ��� ����� >49, �C �� ��� ��� ��������� �� ����� >�%9� �C@ L� �����6������� �� ��� ������ � ����� ���� ��3����� ��("(��9 > C -����� ���� ������� �� ����� �����;���� �*������ ��� ����6���� >��� �C �� ��������� >("(���� ��� %C ���������9"����;����� ���� ��������� ��� ������� � ��3���� ������ ��������� �� ��� �0 ����6�������9 (���� �*������ ��� D0 � �#, �����;����� ��� ������������� �������� �� "�"G &2' �� ���������� �� � ����� ���� ������ ���� ���6=.& ��������� ��������� >�6=.& C �� ���6(" ��6����� ��������� >�6("C9 >�C ������� ���H��������� ����� �� ("(��� �����;����� ��������� ��� ��� �������� ����� �� ������� ��3�������������� �� ��� �B ����6�������9 "����;����� ���� ���������;�� �� ������ ���� 5�=(6��<������� ���6(" ������� ���������9

�2����� �� ��2

����

Page 6: Levels of circumsporozoite protein in the Plasmodium oocyst determine sporozoite morphology

����;�� �� ������ ���� ���� ���6(" ���������95����� 4� ����� � ������������� �*������ ���� ����6���� �� ��&%4#6� ����� �����;����� ��������� �� �����, �� �0 ����6�������9 "����;����� � ���� ��&%4#����� ������������ ������� D0� ���� (" ������ �������6���� �����;�����9 =��� ����� �������� � ���� ������� ��� ++ �� 0+ �� ���� �� ("� ����� ��� ������� ���������� ��� ������� ������� �� ������������ ����������� ("� ������������ >������� �� ��9� �?B�C9 &� � ������� ������ �����;���� �*������ ��� ����6���� �� ��&%4#6������;����� ���� ������ ���� ��������� �������� �����������������6������� ������ ������ >=.& C� �6����� �����;���� ������ >5����� 4�C� �� ���� �� ����������� ����� �� =.& 9 =��������� ������� �������� ��&%4# �����;����� >�� ����� �� ��� �%� ��� �������� ���

���� ���� �� �� ������C �������� ����E����� ���� ("������ ��� ����� ����6���� �����������9

� !"#$% ������� ������ ��� ���� � �������� �&������ �� ��� ��� ���� ���� ����� ������ ��� � !"#$% ��� ������ � ���� ����� ������"����;���� ������� � ��� ��&%4#6� ���� ��� ��6��;�� �� ��������� ������� ��������� >5����� BC9 &����� �#G�% ����6�������� D�##M ����6���� ���������������� ��� ���� �������� ���� � 5������ � ��%� �� ��� (" � ������� ��������� ��� �������� ���������� 5������ + �� 09 &� ��� ��� ���� ����6�������� ��&%4#6� ������� ��������� �������� ���������9 -����� ������ �������� ������ ����6���� �� (" � ��������

( � 4� 2������� �� ��&%4# �� ��&+0# ����� �� �������� ���� ������� ��� �� ����6���� ����� �� ("� ������������9 >*C "������� ��������6���� �� ��� ����6���� >-=C �� ����� �� ������� ������� � ��&%4# �� � ��&+0#� ����� ������ ��� � ��� ����� �� ��� �� ,�6!=.� ����������� ����� ��� -= �� �����9 =�� �������� ������ � ��� �� ,�6!=. ���� ��� ,� ��� �� �� ���������� ������� ������ ���������� BB �� ,,4�������� ��� �� ���� ����9 =�� -= �� ��� ��� �������� ���� ������� � ��&%4# �� � ��&+0#� ����� �������� ��3����� ����� ��� ���������� �� ��� -= �� ����� ����� �� %4# �� +0# �� �� ��� ,�6!=.� ������������9 ������ ���� ������;�� �� � ��3�� �#�� ���� >&C ������� �� %0# ����� ��� 0� �� �� ��� �������� ��3����9 "����� ��*��� �������� ����� � ���������� ��������� ��������@ ���� ����� �)"I" ������ ��3�����@�� ������9 >+C "��������� �� ��� -= �� ����� ����� �� ��� �� �������� ���� �������� �� ��������� ��������� �� ������� � ��&%4# ��� ��&+0#9 =�� ��������� ��;�� >� �C �� ���������� ������� �������� ��� �������� ���� $� ��G!"�.A� $� ��G!"�.� �� �#�� ��� ����9 &��#��@ )� $� ��@ '�� !"�.�@ '0� !"�.A9 > C "������ �������;���� �� -= �������� >��� �C �� ��� ��&%4# ���� >��� %C� ��� �������� ����$� ��G!"�.A >���� � �� %C �� $� ��G!"�.� >���� , �� +C �� ���� � �� �����9 >�C -����� ���� ������� �� ����� �����;���� �*������ ������ -= �� ��&%4# > :%4#C ����������9 "����;����� ���� ��������� ��� ������� � ��3���� ������ �� ���� �, �� �0 ����6�������9 (���� �*6������ ��������� �� "�"G &2' �� ���������� �� � ����� ���� ������ ���� ���6(" >�6("C �� ���6=.& >�6=.& C ���������9 >-C "������ ��6�����;���� �� -= �������� >��� �C �� ��� ��&+0# ���� >��� %C� ��� �������� ���� �#�� >���� � �� %C �� $� ��G!"�.� >���� , �� +C ������ � �� �����9 >(C (. ����E����� �� ��� �*������� �� ���� � ��&%4# >��� �C �� ��&+0# >��� %C ��������� ���� ������ /�(" �� =4������ ���� ������� ��� ��� ����� �� ������� �� �� ��� ������ ��3����� ������������9 >2C -����� ���� ������� �� ����� �����;���� �*��������� -=� ��&%4# > :%4#C �� ��&+0# > :+0#C ���������9 "����;����� ���� ��������� ��� ������� � ��3���� ������ �� ��� �0 ����6���������� ����;�� �� � >�C9

1�� �+�,�������� ,������ ��� �,�������� !������

����

Page 7: Levels of circumsporozoite protein in the Plasmodium oocyst determine sporozoite morphology

D$#G4#M �� ������� ��� ���������� �������� ������ ������ �����9 � ��� ��&%4#6� �������� ��� ��� �6����� �������� ��������� �� ��� ������ ����� �6���� ���� ���� ���������� � ��;� ������ ��� ����� ������ ����6���� ������� �� ��� ����� ����������� ������� (" � ������� >������ 5������ B&� )� �� +C9 =�� ��������� � ��&%4#6� ������� ���� ���� ���������������� ����� � (" � �� ����6���� �������9 "����;������� �������� ����� �� ������� ���� ������ � ������� ����� ����� ��;�� �� ������ ����6���� �����;�����>5����� B' �� 5C �� ��� ��������� ������ ���� �(" � ������� >5����� 0C9 5��3������ � ��&%4#6��������� ��� ������� �� ����� ����� ������ �� ��������� ������ ��� ������� �� ����� ���� ��� �����6���� ����������� >������� ���������� ���� �6������ ���������� �� ����� ��� ��� ������ �������������@ ��� ����� � 5����� B5C9 �������� �������� �� ������� ����� ��� ��� ������ �� ��� ������������������� ���� ��� ���� �������� ��� ��������

����� ����� � ��&%4#6� �������� �� �� �� �������� �� ����� ����������� �������;���� �� ������������������ ������� �� � (" � �������9

���H��������� ������� �� ��&%4# ����������;����� ���� ���6(" ��������� �������� ���� ������� 0#M �� �����;����� � ���� ��&%4# ����� ��������� �� �������� ��;�� �� ������� � ������� �� ���������� �����6�� � ��������� �� ����6���� �����6;����� >5����� ?C9 &����*������ ���� �� ��� ������ ��&%4# �����;����� ���� ������� ��� ��� ����������# �6��� ����6���� �����;�����9 ��� ������������ ��&%4# �����;����� ���� �� ��������9 =��� ��� ������� ��3���� �������� ������ �� ���� �� ��� �������������� ����� �� �������� ���� �� ����� �����;������ ������ ���� �������� �� ��������� ��� ���� �������������� >�� ����C9

'�� ��� ������ ��������� �� � !"#$% ������� ��� �� ��� ��� ������ �� �� � �����=� ��������� ���� ��� ��������� ��������� �� ��� ��&%4# ����� ���� ��� �� ��� ��� ����� �� ("� ������������ � ������ �������� ����� ��&+0#� ���� ��������� ������ �� ���� ���� �� �������� ��� ��&%4#����� ��� ���� � ������� ������ >� ��&+0#C �������� �������� �� ��� �������� �� +0# �� �� ,�6!=.9 =���,�6!=. ��� �������� �� ���� ������ � ������ �("(����� ������� ��� 2=6���� ��3���� ������� D,0# ���������� �� ��� ���� ���� >��� 5����� 4&C9 ��&+0#����� ��������� ���� ������� ���� ������� � ����� ������ ������ ��&+0# ��������� �� ��� �� ����� >5����� 4)�� 'C� � ����� �*������� �� ��� ����6����� �� ������������ ����� �� +0# �� �� ,�6!=. >5����� 45C9

����� ����� �� ��&+0# �����;����� ���� ���6����� � ��3���� ������ >�� ����C9 -����� ����������� ������ ���� ���� �������� ����� �� (" �������� ����6���� �����;����� >5����� 42C9 !�� �*�������� ���H��������� ��������� ���� ���6(" ���6������� ��&+0# �� ����6���� �����;����� ������������������������ ������� ��;� �� ������ �9�9 N?#M ������� ������� D�# � ���� D� � ����� �������6�����������9 (������� �� ��������� ������� �� ���������������� �� ��&+0# �� ����6���� �����;����� ���������� ��� ����� ��� ������� � ����� ����6���� ��������>�� ����C9 =���� ������� ��������� ���� ��� ���������� ��&%4# ������� �� ��� �� ��� ��� ����� �� ("��������� �� �� �� � �������� ������ �� ��� ��&�������� �����9

( � 5� =�������� ������� ���������� ������ ������� �� ����6���� �� ��&%4# �������9 >*C 5���� ������� �� �*����� ����� ������ >�����C �������� ��� ����� ����� �� � �����6;���� ��� ���� � � ����6���� ������9 )��7 , �9 >+C � ��&%4#�������� ��� ������ >������C �������� ����� �� ��� ����� �6���� ���� ��� ������ ��� � ����6���� �������9 )��7 , �9 > C "����6;���� ���� ������� ������������ �� ��� ���������� ��������� � ����6���� �������9 )��7 �90 �9 >�C � ��&%4# �������� ������ ���������� �������� �� ��� ���������� ���������9 )��7 �90 �9 >-C (����6������� �� ����� ����� �����;������ ����� ��� �� �������� ��;���� ������9 )��7 �90 �9 >(C F��������� �� �����6������� �� �����6;������ ����� ��� �� �������� ��;�� �� ������9 ���� ��� ������� �� �������� ��������� �� � ����� ������ ������� � �� �� ��� �����6;����� >�����C �� ��� O����������P ��������� �� ��� �����;�������������9 )��7 �90 �9 >2 �� %C "���� ������� ���������� ������ ����6���� >2C �� ��&%4# >�C ����� �����;����� �������� ���������� ��3����� �� ��� �+ ����6�������9 ���� ��� ����������������� �� ��� ��&%4# �����;����9 )���7 % �9

( � 6� ���H��������� ������� �� ����6���� �� ��&%4# �����6;����� ��������� ��� ��� ������� �� ������� ��3����� �� ��� �0����6�������9 "����;����� ���� ���������;�� �� ������ ���� 5�=(6��<������� ���6(" ������� ���������9 ���� ��� ��������� � ��;��� ����� �� ��&%4# �����;����� �� ������� ���� ����6���� �����6;�����9

�2����� �� ��2

����

Page 8: Levels of circumsporozoite protein in the Plasmodium oocyst determine sporozoite morphology

3�� ������

(��� ������� � &�������*� �����;��� ��� � � �������� �� �������� �� �� ������� �� ��& ���������� �������� �������9 � ����� ���������� ������� ����� �� ���� ����� ��������� �� � ����� � ��� ������ ������ ������ ������ ��������� �������� ����� ��� ������� ����� ����� �� ��� �������� ����� ���� >�������� ������ ����;����C9 � �� ���� � ��� �������������� �������� �� �����;����� � � ������ ���������������� �������� ����� ������ �� ���������� �����>A�������� �� ��9� �?$4C9 ����� �� ������� ����������� ����������� �� �������� � ��� �� ���� �������� �����;���� ������ ����� � ��� (" ������� ���� �� �� � �����;���� ������� ������ �������� �� �����;��������������9

!�������������� ������� � ������ ��������*������ ���� ���� ���� ������ �� �������� �������������� �������;����9 .���� ���� ��������������� � �%���� � ���� ��������� ������� ��������������� ��� �� ���� �������;���� �� �������� �����E���� ������ >"��� �� ��9� %###C9 -��� ��������������� �������� �� � ��9 � ����� ����� �� ���&�������*�� ������������ ����� �������� �������������� ������ ����� ������ �� ��� ����� ������� ���3����� � � ������ ��� � ����� ������ ���������� � ��������:������ ���� ���� ���������� ����� ���������� ������ >=��;� �� �� ��9� �?$4@ A���������� .����� �?$4@ "��� �� "����� �?4B@ "��� ��=����� �??%C9 =��� � ����� ���� ������� � ������������ ������ �� �� ��� ��������� �� � ����������6�����;�� ����� >�=/(C� ����� �������� �� ���������������� �������� �� ��� ����� ����� �� �������� ����9 =��� ����� �� �������� �� � ������� ������G������� ������ �� �=/( �������� �� �������� �����>����� �� ��������� �??4C� ������� � ������������������ �� � ����� ���� ���������;�� �� ����� ����=/( ������� ��� ����9 =��� ������ �� ������ ������� �������� �������� ���������� ������������������� ��� ��������� ��� ������ ����� ������ �� ��������6��� �� >(������ �� "������ �??4@ I�������� ��9� �??B@ &���* �� ��9� �???C9

�������� ���� ������� ������� ��� ������ �� ������������� � ����� >�P����� �� ��9� �?44@ ������� �?B#@ ������ �� ������� �?B�@ "��� �� =����� �??%@ "����� ��9� %##�C9 "������������ ����������� ������� ��� ����=/(� �� �� ��� ����� ���� �� �������������������� ��� ���� ������ �� ��� ��� �� ����������������� �� ��� ������ �����9 &� ��� ����������� ����� �� �� ��� �� ���� ����� ��� ����� ���� >����6������ ��� �� ����������� ��������� ��� ������ �� ����=/(� ������� � ��� &�������*� !� ����@ .�������� )���� �?B+C� � ���� �� �� ����� �� ���������������� �� ��� ����� ����� ����� ��� �������������� � �����9 &������������ ��� ��� �����G���������� ������� �� �� ������ ��� �� �� �� ������ ���������� ����� �*������ ��� ��� ����� ���� �������9 ��� ���� �������� ��� ���� ������ �� �������������������� ���� �������� ��� ����� �� �����;���� ����>���;���� �� ��9� �?B?C �� �� ������� � ���� � ���������� ���� �� � ����� ����������� � ��� ����� ����9

=�� (" ������ �� E��� �*������� �� ��� ������ ���� ������ �� �� �������� ���� �� ��� �����

����� >�������� �� ��9� �?B4� �?BB@ ������ �� ��9��?BB@ &� ��� �� ��9� �??#@ ���� ��� C9 ����� �� ���� ������� ���������� ������ ��� ����� �� ��� (" �������������� �� ��� �������� �� ��� ������ �� �*����� �� ������ ������ �� ����������� �������� ��� ����������� �����9 � ��� (" � ����� ��� �������� ����������� �������� ��� ����� ����� �������� �����;���� ����������� ��� ��������� �������9 ���� ��&%4# ����� ����� �������� D0� ���� (" ��� �������6����� ��� ������ �� ����������� ���������*������ ����� �� ��� ������ ����� ������ �������;����� ���� �������9 � �������� �����;��������� ����� ������ �� ��� ��&+0# �� ��� �����6���� (" � ������ ����� ���� �������� ����6��������� �� ("9

A������ ������������ ���� �� ������� ������� ����(" ����� � �����E� ���� � ���������� ������� ��:���������� �� ��� ��� ������ �� �����������9'*������ ��������� �� ����� ���������� ��� ��� E���������;���� ������ �� ��� ��� �� ("9 �� �������� ���������� ���������� �� ��� ������ �� ������6����� � ��� (" � ���� ������ �������� ��������������� �� � ����� ����� ���� ��� �� �������� ��������� ��� ��� �������� ��� � � ��� ���� ����95���������� ��� ����� �� ��� �� (" ������ ������������� �*����� �� ��� ������ �� ������������������� ��� ����� ������ ��������� ���� ���6������� ��� �� ����� ����� �������� �� ��� ����������9 5������ �*������� �� 0� ���� (" ������������ ������ �� �*����� ���� ���� ���������������� ����� �� ��� (" � �� ����6���� ���������9=���� ���� ������� ���� (" �� ������� � � �����E������� ���� ������� �������� ������� ��:���������� �������� �� ��� ��� ������ �� ����6�������9

-��� ������ ��� ������������ �*����� �� ��� ����6������ � ����� �� ���������� ��� ������ � �������Q & E��� ���������� �� ���� ������������� ����6������� ��� ���� �� �������� �� �=/(� ���� ��� �� ���������� �9�9 ���� ��� �� (" ��������� ������� ������������������:�������;���� �������� �� ���� ������9�������� ����������� � �� ����� ���� ���������������� ���� ��� ����� �����9 � �������� ��������� ������ ��������� ����������� �� ��� ������������� ����������� �� ��� ��� ������ �� �������� ����� ���� ���� ���� ������ � ����� ����� ���� ����9 =��� ������ �������� ���� � �� ���������������� ��� ���� �������� �� ����� ����� �� ��������� �������;���� ������� � ������ �����9 &��������������� �� ���� ������� ���������� �������;���� ��� ����� ������� ��� �������� ��� ������9 ����������� �� (" ��� �� ������ ��6�������� �� ��������� �� ������������ �� ��� ������� �� �����6;����6�� � ���� ���� ������ ���������� ����� �����������9 &���� ��� ������� �� ��� �� ������� �������������� ������ ������� � ��� ���� ���� >�� ��� ����� ������������� �������;����C� ������ ������ � ���� ��� ("� ����� ������ ��� ���9 & ��� �� ��� ���������� ������� ���� (" �� ������� � �������� �������� ��������������9 � ���� ����� �����6���������� (" ������������� ������� �� �� ������������� �� � ������ ���� �� ������������ �� � ��� �� ������9 =�� ������� ������ ������ � (" � ������� ����� ������ ��� ��� �������� ��

1�� �+�,�������� ,������ ��� �,�������� !������

���!

Page 9: Levels of circumsporozoite protein in the Plasmodium oocyst determine sporozoite morphology

�������� ������� �� ��� ������ ����� �������� ��� ���������������� �� ��� �=/( �� ��� ����� �����9

=�� ����� �� ��� �����;���� ������ ��� ��� ���� ������� �� � ��� ��� �������� ���������� �������� ������9 � ���� ���� ������ �������� ������������� �� � ������� �� �������� ����� �������� �� �������� ��� �� ��� ���� �������9 � ��� ������ ������ ��������� ���� �� ����������� ��� � ������� ���� ����� ��������� �� ���� �� ������ �� ��������� �� ��������� ���� �� ��� �������� ���� ����� >(���� �???@ ���� �� )��������� %###���C9 � ���������� �������������� ������ ��� �*������ ����� �9�9 �*����������������� ����� �� ������� ���������� �������� ���������� ����� � ��� ������� ����� ������ �������>����� �� ������ �??$C9 � ��� �� ���� ������������� ����� ��� ��� ��� �� �� ��E�� �� �������� ������������ � ��� ��� �������� ������� ������ �� �� ������� ��� ����������� �����9 & ����� ���������� �� ���������� ���� ��� ������ ������ �� ��� ����� �6����� �� ��� ��������� ��������� �� ("9 &� (" ��������� �� 2 � ������� >���� �� (����� �??+C� ��� ��������� ����� ��������� �� ��� ����� ����� ������� �� ���� � ���� � ��������� ������ �� ������ �������� ������� ������� �� ����� ����� ����� �����(" �� ����� �� �������9 A����� ��� ������ �� � �������������� �� ������� � ����� ��� �� ������� ����������� � � ������� ���� ���� �� �������� �������� ������� � ���������� ������ ��������� �� ������� �����;������ �������9

=�� (" ������ �� �� ���� ��� ������� �� ����� ��������� ������� ����� ��� �������� ���� �����9 / ���������� �� �����;������ (" ����� ������� ����� � �����;����������������� ������� � ������� �� ��3���� ������������� �� ����� ������������ �� �������� ���� ������� �������� � ������� �� ��� ���� ���� ������>"������ �� A�������� �?BB@ (���� �� ��9� �??%@-������ �� ��9� �??%C9 (" ������� � ����� ����� �������� �����;����� �� ���� ������ ������ �������� ���� ���� ���� >5������ �� ��9� �??BC9 -� ���� ���� ���� ("�� �������� ��� �����;���� ������ ����� �������� �������;�� ������� �� ��� �����;���� ����� �����9 ("���� ������� ��� ������� �� ��� �����;���� ����� ��� ����� ����������� ��� ��� �*� �����9 =�� ������ �� ������������� �� ���������� �� ��� �����;���� �� ���� ��������� ��� �����;����� ���� ��� �*����� E� ��� ��������������� <�����9

"������)� ��� +������

�� �����=�� �������� ����� �� �������� ���� ���� � ���� �����7 � ����6��������������6��������� ���������6�������� ���� �� ��� �I$0 �����>��1��� �� ��9� �??4C� �� ��� ����������6�������� (" �� ������� (">6C� >(" �C ���� ������ � ����� ���� �� ��� ����������6�������� �������� ����� � ��� ������� ��� ��� ��� ������ ����>/.5C �� ��� �����6���� �� ��� >��1��� �� ��9� �??4C9

����� ���� �� �� ����� ������ ������� �������� ������� �()* ���� ����� �("(�� >5����� $&C� ���� ��� ��� ����������� �� (" ����������� ������ ��� ����� ��� H� �� �� %9% �� #900 � �� 0�6 ��,�6!=.� �� �������� ����� �� ������������ >�� I���6-��� �� ��9�%###C� �� � �������� ��3���� �������� �� � ����6���� �� �*���������������9 ����� �("(�� ��� ���������� �� ������� ��� ������ ���� �������� ��� �������� ����� �I$0 >'������� �� ��9� �?B$C ������

��� ���� /.5 >D� �C� �� �9, �� #9+0 � �� H� �� �� 0�6 �� ,�6!=.��������������� �������� ���� �� >��� '���� )������C� E���� � ���������� ���� !"�.�� ��� ������ ���9��9 �� >�� I���6-��� �� ��9�%###C ������� ��� ����� �������� �������� ��� ���� ����� E���� ��� �������� ���� !"�.�9 =� ������ ��������� ��������� ���("(�� ������� �� ��� ��������� �� ����� � (" � ��������� >������ ��9� �???C� D0# �� �� ��� ������ ��� ������;�� �� ��� ��3�� ���� ����������� D$## �� ������� �� ��� �� ����� ����9

����� ���� �� ������� �� !"#$% ��� �� !"+,%=�� ������� ������ � ��&%4# >5����� 4&C ������ ��� �������6���6�������� �������� ����� � ��� �*������� �� ��� �� 0�6>%9% �C �� ,�6 >#9+ �C !=.�� �� � �������� ��3���� >D�9% �C�������� �� ��� ������ ���� �� ��� ��� �� ��� E��� �� ������ ���������� �� #9%4 � �� �������� !=.9 & ��3�� �#�� ���� ������������ �� (. D%0# �� ��� ��� 0� �� �� ��� �� �������� ��3�������� ��� �������� ���������������7 )�"�% >����� 0�6�������������6��������������������������6,�� $� �� ���� ��������C� &H��& >��������0�6�����������������������������������6,�� �#�� ���� ��������C� &H��)>����� 0�6������������������������������6,�� �#�� ���� ��������C �����& >�������� 0�6��������������������������������������������6,��&��� ���� ��������C9 ����� � ��&+0# >5����� 4&C �� �������� �������� � ��&%4# �*���� ���� �� ������ #9+0 � �� �� ,� !=.� �������� ����� �� (. ��� �������� ����� �I$0 ����� ��& ���� ����������� ������7 /")&� >����� 0�6���������������������������6���6,�� $� �� ���� ��������C� ����� �������;�� ��� ��������� B4B ���� ������� �� �(",!=. >�������� 0�6����������������������6������������������������6,�� &��� ���� ��������C9 =�� ������� �������� ����� � � ��������� ��3���� �� �� ,�6!=. ��� �������� � ������������ �� ���� ������� >F�� �� ��9� �?B4C9 =�� (. ������� ����������� ��� � � (.6"����� &� "I>RC ����� ������ >"��������C�� ���� �� ������� ��� ���������� � ������ � ��&%4#9 =� �������E���� ��������� ��������� �� ��� ������� ������� �� ��� �� ������D0# �� �� � ��&%4# �� � ��&+0# ���� ������;�� ����� ��� ����� ��������� �� ��� (.6�������� �#�� ���� ����� �� ���������� >������ ��9� �???C9 =�� �#�� ���� ������ � ����� �������� ������� �� ��������� ����� ������ ��������� �� ��� �� �����9

�� ���� � ��������� ��� �������� �� ������������ ���� ������� ����;��� >D� � �#BC ���� �������� ��� �������6���� �� �������� ������� ���� ��������� �� �������������� ������������ ��������� >��1��� �� S���� �??4@ -����� �� ��9� �??4C9 5����� �������� �*������� � ��� (" � ���� �� �������� ���� �������� ���������� �� �� �� -.??%�# ��������� ���� �������� �������� ������� ��� ����� ���������� ���� ���� � ����� ������������� ������ -.??%�# >0 �: � �� ���� ������C� ������� %4G,# � ����� �<����� ����� �������������� ���������9 -.??%�# ��� �������� �� ����� S������>S������ �������������C �� �������� ����� �� � 0 �:� ������� ����������6�������� ����� > )"C ������� �#M ������������*���9

����� � ��� ������ ��� ��* ������� �� ��������� ���� ���������"������ ������� ��� �������� ���� ������ �� ��� �������� ������7 ��� ����� >#94 � ������G' �� ������ ������ �� ��� ����� ��3����C�� �������� ����� � ����� >�9% � '���G������� ������ ������C �� ������ ����� >#90$ � ��������� ��� ����� ����� ��3����C9 ��������� ������� ���� ����*���� >��2C6��!= �� ���� ������ �� ���������������� ��� �������� ���� (" � >.���� ���������)����������C9 "����E� ����E����� �� ��� E��� ��������� �� ��������� ����� ������� ����� ��������� �� ������ � ��&%4# ��� ��&+0# ��� �������� ���� ������ /�(" >����� 0�6�����������6�������������������6,�� ����� �������;�� �� ��� E��� �# ����� �� �� ������� ����� � ��� �������� �������C �� ����� =4 >�������� 0�6����������������������6,�� ����� �������;�� �� ��� ��������� �������)"I"C9

"������ �� �� ���� ����������� ��� ���������������� ������� ��3����� ���� ��� � ������� ����"������G������ ���� �� ��������� �� ������� ���� ����6�������9"����;���� ���������� ���� �������� ��� ��� ������� ��3������������� �� ����;�� �� ���������� ��������� >A��������� �?40@"���� �� ��9� �??4C9

�� ��� ����-� ������� �������� ���� ������� ������� �� �������� ���� �����;����� ������������� �� ���� �0G�B ����6������� ���6����� � ����� ������ �� E*������ %M ��������������� ��� ,# � �� ��� ����������9 "����;�����

�2����� �� ��2

���"

Page 10: Levels of circumsporozoite protein in the Plasmodium oocyst determine sporozoite morphology

���� ��� ���6�������� � )"G,M ����� ���� ����� >)"&C ���,# � �� ��� ���������� �������� �� �������� ���� H��������������������� >5�=(C6��<������ ���6(" ������� ������� ,���>������� �� ��9� �?B#C ��� � � �� ,4�( � � �����E�� ������9 &���� ����������� � )"� �����;����� ���� ����� � A���������� >A�����F�����������C �� �������;�� ���� � �� � ������� ���H������������������ �3������ ���� � $#� ��<������ >5����� $�C� �� � T����H�������� ��������� �3������ ���� � $,�:�9+# ��� ��������<������ >5����� BC9

.���� � ������� �� ��� ����� �������=�� �������� ����� �����;����� ���� ��������� � . �� ����������� ��� (������� ��� �������� �������� ��� ���� >.������������� )����������C ��� ������� ��������� � ��������������� ������ ���� �, �� �0 ����6�������� �� ������ ���� ������������9 (���� �*������ ���� �������� � "�" ����� ������9 ����� ������ ��� ��E�� ����� �� �����;����� ���� ������ ������ � "�" ����� ������ ������� �#M �6�������������� ��������� �#M "�"G������������� ���� >F����� �?4#C �� ���������� ��#9% � A�5 ������ >)��6.��C �� ��������������� �������9 =�������� ���� �������� �������� � ���� �� ������ �� +�( �� ��������� ���� ���6(" ������� ������� ,���� ������� �70### ����� �� ������� ��� � � �� ��� ����������9 =�� ������ ���������� ����� ���� � ���� ������ �� �������� ��� � � ���� ���������������*����� >�. C6��<������ ���� ���6���� ��2 > �����C� ��������7%# ### � ���� �� ������9 =�� ������ ���� ������� �� ������������� ���� �������;�� ���� ��� ������ ������������� >'(FC����� >&�����C �������� �� ��� ����������P� ����������9 =����� ���� ��� ����� ���� ����� �� ��� �������� ���� ���6=.& ��������� ��������� ������� �7%### � ���� �� ������� �������� ���������� ���� �. 6��<������ ���� ���6������ ��2 ������� �7%# ### ����� �� ������9 )��� ��������� ���� �������;�� ���� '(F9

' �������� ����� �� �� �������� ���� ������� >����6����� (" � �� ��&%4# �����C ������������ ��3���� ������ ���� E*�� ���� %90M �������������� � #9#0 ���������� ������ �� 49+ ���� +M ������� ��� % � �� ��� ����6E*�� ��M ���� �����*��� ��� � �9 &���� � ,# � �� ���" ���� ���� �M�3����� ����� �������� ��� ����� ���� ���������� � ������������������ �� ������ �� ������� � '�� B�%9 !������� ����������� ������ ���� %M ����� ������� � 0#M ������ �� ���� ������������ �� ��� �*���� � � T���� ('�?#% ������� ���������9

��������� �� �� �������� ���� ������� >����6���� �� ��&%4# ����C ������� �������3���� ������ ���� E*�� ���� �M ������������ #90M ����������6���� � #9� � ��������� ������ �� 49+9 5�*�� ������ ���� ����������������� �� ������� � F. -���� ���� > ����������� ��9�-�������� &C �� ��������� ���������� ��������� >&� ��� �� ��9��??#C9 =�� ������� ���� ���� �� � )" ������� #9#�M >�:�C =���6%# �� 0M >�:�C �6��� ��� �� > )=�C9 2���� ���� ��� �������� ���% � �� ��� ���������� ���� ��� ������ ���� ���6(" �������������� ,���� ������� �70## � )=�9 ����� ���� ���� �� )=����� ���� �� ������� �������9 &���� ������� ����� ���� �������� ���� � ���� �0 ����6��<������ ���� ���6���� ��2 >&����� F���"������C� ������� �7%# � )" ������� �M >�:�C )"& �� #9#�M >�:�C=���6%#� ����� ���� =���6%#� �� E*�� ���� �������������� ���������;� ��� ���� ���������9 "����� ���� ������ ���� ����� ������� ������ �������� �� ��� �*���� � � T���� ('�?#% ������� ���������9

������� ����� �� �� ������5��� ����� �����;����� ���� E*�� ���� %90M �������������� � #9#0 ���������� ������ �� 49+ ���� +M ������� ��� % � �� ��� ����6E*�� ��M ���� �����*��� ��� � �9 "����� ���� ���������� � ������ ���������������6���� ����� >)��;��� ( �#%# ��������6���� �����C �� ����� �� ���������9 "����� ���� ������ ���� ���� � � .�(6'� � .' �������������� �� ��� �*���� � � S'/F S"�6B+# ����� ����������������9

4 ����)����+����

-� ��� 5����� 5����� ����� S��� .����� ����� "���� .�1���=������;� �� S���� A�������� ��� �������� ��� ��������� ��S��65���U��� �������; �� ����� .��� ��� �� ������� ����������9

��*���� ��

&���*� 9� (���'9� ������������&9� ����'9� "����'9�9 �� )����I9>�???C ����������� ������ ��� ���� ������� ��� E��� ;������������� � ��� ������ ����� ��""���� �"� "��������� (� ���� $�����)//� ?44G?B49

&� �����9 >�?4�C �� ���� 7 ��� E� ��������� �� ������ ���������9!%�� ��������� .7� %B+G,%#9

&� �����9 >�?BBC 5�� ��������� �� ������ ��������� � ��� ������������� �� ���������9 � -����������-9�9 �� ��2�������9 >���C�)������* ���"���� ��� ��"��"� �+ )����������9 (��������F��������� ��� ��� � ��� A��9 �� ��9 ?4G�%?9

&� �����9� ���������9� �����;�����.9"9 �� �����;�����A9 >�?B�C=�� ���������� ����� �� ������� �����;����� >�� ���� �������C�� � ������������� �����9 (� , ������ ),3� %+?+G%+?09

&� �����9� &� ����(9=9� )�������F9�9� "��������9� (����������9�� )�������.9 >�??#C F�����;���� �� (" �� �6(" ������ ���� ��������� ������ �� �� ���� ������9 $���� -���� ������.������ 35� �$0G�4�9

(�������S9F9 �� "������=9 >�??4C ������������ ����� ��� ������������ � ����� ������� ����6������� ���������� ���� ��� ���������*9 (� ���� $����� ).5� $%?G$+�9

(�����(9� 5�������!9� "���� 9� =� ����)9� (����<�� 9� "������9S9 �������;�����A9 >�??%C =�� ����������� ���� �� ��� ��������������� ����� ����� ��������� ��� ��� ����������;���� ������ ���� ���� +��"����� �����;�����9 ����� 47� �#%�G�#,,9

(����S9 >�???C (��� �������� � �����9 ����� ���� ����� ���� $����� )1�,$0G,?�9

��I���6-����=959� 5���� ��9&9� =������A9� ��1����.9� ��"����� �.9�9� -������&9 9 �� S����(9S9 >%###C =�� ������������ �� ��� ������������� ��������� ������ ��3������ ��������������� �� ��� �� ���� ������� ����9 )��� $��"�� ���������� )73� �??G%�%9

��F���(��������9� (�����S9� )�������)9=9� ������I9�9� /����I9'9� .�����'9� I�������&9!9 �� S����&9&9 >%###C A����6�*���������������� �����6���� ������� ���� � �����;���� ������� ���������� ����� � �� ���� �������"�� 6������� ���� �������9� � (� ���� )��� ����� 3,� +%4G+,,9

������&9 �� ���������=9S9 >�??4C ����������� �������;����������� ����� ���� ����� ���� $����� ).� B,G��49

�������"9"9 >�?B#C & ���������������� ����� �� ��� ���*��� ����������� � ������� ,����� ��9 � �������� ���������� ����� �� �������� ������� >����������� ��������C9 (� ��������� 33�$#�G$�%9

�P������S9� ���������9 �� ������-9 >�?44C (��������� ����� ������������ ���������� � ��������9 ,��� (� ��������� 4� 0#0G0�B9

�������929 �� ������-9S9 >�??$C /����� �� ���� ��������9 ����� 5/�,,0G,++9

�������;�S959 �� =�������29 >�?4BC 5���;� �������� ����� �� ����������� �� � ������ �����;���� > ����;��� (�������C9 (� /�������"������ 3,� ?+G�#?9

'���������9S9� &�����9'9� =��S9 9� �����;�����A9 �� '���A9>�?B$C (���������;���� ������ �� �� ���� �������7 �������� �� �����E����� �� ��� �������� ��������9 )�������� $����� 3� ,?$0G,?4%9

5���� ��9&9 �� -������=9'9 >�??4C =���������� ���� ���������������� ��������� ������ ������ ��������� ��������� ��-.??%�# ��� ���� �� ������ ��� ������� �������� �� ��������9��"� &��� �"��� �"�� /��� 6/� �#?,�G�#?,$9

5�������!9� "���� 9� (�����(9� "����H���-9� =� ����)9 �������;�����A9 >�??,C ������� ����������;���� ������ ���� �������� ������� ������������ ���������� ���� ��� ������� ����� �������������9 (� !%�� )���� )44� �%B4G�%?B9

5�������!9� 2���� ���9.9� ������59!9� &�����9� "���������9�"���������"9� "�� �������9 �� (����<�� 9 >�??BC �����������������;���� ������ ������� ������ �������� � ����������9 !)$. (�� )4� ,B�$G,B%$9

2����"9�9� (����<�� 9� )���V9� '� ��S9�9 �� "���� 9 >�??4C (���������� �� � ���� ������ �� ��� ������ ����������;���� �������� ����������� �� ������� �� ��� ��������������6���������� �� �� �� ("A=(29 (� $���� ��� �� ,4,� �?%#0G�?%�,9

I��������9� .������I9 �� "����S9A9 >�??BC =�������� ������� ���������;���� �� ����������� �� ����� ����� ��������9 (� ���� $�����)/,� �B�G�?#9

F�����!9I9 >�?4#C (������� �� ���������� ������� ����� ���������� �� ��� ���� �� ������������� =+9 &������ ,,4� $B#G$B09

F���&9&9� �� �� (��;�A959� -�����S9&9� (����������9� ������-9F9 ��

1�� �+�,�������� ,������ ��� �,�������� !������

����

Page 11: Levels of circumsporozoite protein in the Plasmodium oocyst determine sporozoite morphology

��(������=959 >�?B4C "�������� �� ��� ��� ������ �������������;���� ������ �� �� ���� ������9 & ����� ���� ����*���� ���������� �����;���� �������9 (� $���� ��� �� ,3,�%?,4G%?+#9

��1����.9 �� S����(9S9 >�??4C 2�� �������� � ������ ���������9)������ ).� �+BG�049

��1����.9� "�����&9&9� (������(9� &���;�����.9� �� ��< ��9.9� S����(9S9� -������&9 9� �����;�����.9"9 �� �����;�����A9 >�??4C(���������;���� ������ �� ��3����� ��� ��������� �� �����������;����� � ��3������9 &������ .51� ,,$G,+#9

���;�����(9&9�9� '����'959� )�������F9�9 �� )�������.9F9 >�?B?C5���;�6�������� ������� � ��� ���������� �� �����;���� ���������� ��� ����� ������9 � � (� ���� )��� ����� /)� +??G0#,9

����� 9 �� (������9-9 >�??+C .�3������� ��� ������������6��������������� �������� ��� ������ ��� �� �������� ������ ����� �� ��������� �����;��9 (� ���� $����� ),1� ,,,G,+,9

�������������9"9� �������S9�9 �� .�����9"9 >�??4C "����������������������� ��������� ���� � ����������� �������� ������� ���� �����;�� �������� �%���� � ������9 (� ���� �"��� ))7� ,0G+%9

����������9� ������� 9�9� &� ����(9=9� (�������29�9� (������-9'9�� &� �����9 >�?B4C F�����;���� �� ����������;���� ������ ���� ���� ����� � ����� �������9 ,�+�"�� , ���� 11� %?%BG%?,%9

����������9� &� �����9� ������� 9�9� (�������29�9� (������-9'9�� (�������(9(9 >�?BBC �� ���� �������7 ����������� ������������;���� ������ � ����� ������� �� �������� ���������;�����9 !%�� ��������� 33� %4G,+9

�����&9� =������A9� )��������=9� "�����&9&9� �����;�����.9"9 ����1����.9 >�???C "����� ��������� �� ���6� ���������� ������� ���������9 )��� ����� $����� )6� %B?0G%?#%9

��� ��"9S9� �����29�9� ������ �"9 �� ������"9F9 >�??%C ������������;����� �� ����������;���� ������� ��� �����E����� �� ���������������<������9 (� ���� $����� ))4� �,0�G�,049

�������-9)9 �� �������"9"9 >�?B�C & �������������� ����� �� !� �������0����� � �*���������� ������� ������� ����9 (� ����1�����,5� ,#%G,#B9

�;�6/���;�(9� 5������S9� '� ��S9 �� "���� 9 >%##�C =�� ������� ��� ����������;���� ������ �� ���� ������� ������������ ����3����� ��� �� ���� �����;���� �������� �� ������ �����9 (� $������� �� ,43� %$4B+G%$4?�9

�������29� �����S959� A�������S9 9� ������������9.9� ��������=9����������S9�9 �� 2��;���9S9 >�?BBC ������� ������;���� ������������;���� ������ �� ��� ������ �������� �� ���� +��"����� ����� �������� � �������� ������� ������9 !���(� ���� $����� /3� �BG%+9

������9 �� )���������&9 >%###�C �����;���� �� ���� ������ � �����9�9 '���������� �� ������� �� �������� ������9 (� ���� �"��� )).�,$0G,409

������9 �� )���������&9 >%###�C �����;���� �� ���� ������ � �����9��9 =�� ���� �� ��� �������� ���� ����� �����9 (� ���� �"��� )).�04�G0B09

.��������929 �� )����.929 >�?B+C =�� ����� ��� �� �������������;�����7 � ��3�� ����������6�����;�� �����9 (� ���� �"��� 31��?,G%#49

.������A9� &���;�����.9 �� F������&9 >�??,C =�� ��������� ������ �������������;���� ����� �� �� ���� ������� �����;�������������� ������������� �����9 )��� $��"�� � ��������� 14��,4G�0#9

"�����9I9 �� =�����F929 >�??%C ��� ��������� ����� ������� ��� ��������7 ������ � �������� ����� >&�������*�C9 (� ���� �"���)7)� �#?G�%,9

"�����9I9� (������9F9� .�����9"9 �� =�����F929 >%###C������������� ��� �� ���� E������ ����� �������� ���� �������� ���� ������� � �%���� � ������9 (� ���� �"��� )).� �%+�G�%0+9

"�����9I9� .�����9"9 �� =�����F929 >%##�C ��& ���������� ���������� ���� ������ ��� �� ������� �� �� � ��� �����;�� �������� �%���� � ������9 )�"���� ,�+�"��� .� ,0�G,$%9

"��<�� ��"9 9� A���������S9 9 �� "���� 9 >�??4C �������� ��������������� ����� ���� ��������� ��� ����� � �� ��� ����������;���������� �� �� ���� +��"����� 9 )��� $��"�� � ��������� 67�,,G+�9

"����.9 >�?4BC (��� �������9 � S����.9I9 >��9C� ������ )������9&������ ����� ��� ��� � ��� ��9 B0G�$B9

"����.9'9 �� "�����I9 >�?4BC & ��������������� ����� �� ������������ ��������� �� �� ���� +��"����� � ���������� ����9 ���� �� ��"� ���� )��� ����� 4,� +44G+?�9

"���� 9� (����<�� 9� 5�����9� (�����)9=9� (�����(9 �������;�����A9 >�??+C "��������� �� �������� ���������� �� �����

��6���� �� ��� ������ ����������;���� ������9 (� !%�� )���� )57�%?4G,#$9

"���� 9� -������=9'9� )�������9.9� ���;�S9 �� �����;�����A9>�??$C .��� ����������� ������ ������ �����;���� ������ �������������9 (� !%�� )���� )5/� ?+0G?0+9

"��������9S9 �� A���������S9 9 >�?BBC ������� �����;����� ���������� ������ �� ����������;���� ������ ����� ������ �������9 (�����1����� .1� ,B?G,?,9

"�����&9&9� =������A9� 5�������!9� .�����I9S9� (�������&9������;�����A9� �����;�����.9"9 �� ��1����.9 >�??4C =.& ���������� ��� ������ ������� �� ���������� �� �� ���� �����;�����9 ����� 67� 0��G0%%9

=��;� ���S9&9� "���;��9 �� -����.9&9 >�?$4C =�� ����������� �� ����� ���� �������"�� ������ � ���� ������� ��3������9 (� ����$����� ./� ,��G,%$9

A���������S9 9 >�?40C ��������� �� ���������� �� ��� �� ���� ������� �����;����9 (� ��������� 3)� +,G0#9

A���������S9 �� .�����S9 >�?$4C ������������� �� ������ ������������ E� ��������� ����� ��������� ��������� ���� ���� �������9 (� ���� $����� .,� (4G(�#9

A���������S9� .�����S9 �� �������9 >�?$4C '������ ���������� �������������� ������� �� �����;���� ������� � �� ���� �������9(� ����1����� )/� B%G�#,9

-�������&9� =�������9� I�������&9!9 �� �������F9�9 >�??%C�� ���� �������"�� 7 ��������� �� ����������;���� ������������ �����;����� ��� ������ ��� �������� ����� �� �����������9 !%�� ��������� 41� ,#,G,#49

-������&9 9� =�����&9-9� �� ��< ��9.9 �� S����(9S9 >�??4C=��������� �� ������ ���������9 )������ ).� �,+G�+49

���������9� �����;�����.9"9� ����<� � 9� �����;�����A9 ��&� �����9 >�?B#C �������� �������� ���������� ����������������� ������ ��� �����;���� ����� �� ������ ��������9 �"���"��,74� 4�G4,9

���������9� ����<� � 9� �����;�����A9 �� �����;�����.9"9 >�?B�C)���������� �� �++� ��� ���������� ����� �� �����;����� ���� ���� �������9 (� !%�� )���� )1/� �%%0G�%,$9

��"����� (������ 234 53356 ������ ��� �""����� �������� 274 5335

�2����� �� ��2

���