UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES EN SCIENCES DE LA VIE Option : BIOTECHNOLOGIE- MICROBIOLOGIE Présenté le par RANDRIANOFIDINA Mbolasitraka Andriampenomanana Maître ès Sciences Soutenu publiquement le 02 novembre 2012 devant la commission d’examen composée de : Président : Professeur ANDRIANARISOA Blandine Examinateurs : Professeur RAZANAMPARANY Julia Louisette Docteur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina Rapporteurs : Docteur RAMAMONJISOA Daniel Docteur BAOHANTA Rondro Harinisainana Les exopolysaccharides des bactéries associées au tube digestif des termites et leurs implications dans le phénomène d’agrégation du sol
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Les exopolysaccharides des bactéries associées au tube ...
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UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE
MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES EN SCIENCES DE LA VIE
Option : BIOTECHNOLOGIE- MICROBIOLOGIE
Présenté le
par
RANDRIANOFIDINA Mbolasitraka Andriampenomanana
Maître ès Sciences
Soutenu publiquement le 02 novembre 2012 devant la commission d’examen composée de :
Président : Professeur ANDRIANARISOA Blandine
Examinateurs : Professeur RAZANAMPARANY Julia Louisette
Docteur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina
Rapporteurs : Docteur RAMAMONJISOA Daniel Docteur BAOHANTA Rondro Harinisainana
Les exopolysaccharides des bactéries associées au tube digestif des termites et leurs
implications dans le phénomène d’agrégation du sol
Et quoi que vous fassiez, en parole ou en
œuvre, faites tout au nom du Seigneur
Jésus, en rendant par lui des actions de
grâce à Dieu le Père.
Je dédie ce mémoire à :
Mes parents, en témoignage de leur sacrifice, soutien et patience durant mes études
Mes frères et leur famille pour leur soutien et affection
Soafara, pour ta sympathie, tes encouragements et conseils
Qu’ils trouvent dans cet ouvrage le fruit de tant d’années de sacrifices et de
dévouements.
Aussi, un ENORME MERCI à vous tous pour votre soutien sans faille.
Remerciements
Le présent travail est le fruit d’une collaboration étroite entre le
Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement du CNRE (Centre
National de Recherche sur l’Environnement) et le Laboratoire de
Biotechnologie-Microbiologie (Département de Biochimie Fondamentale et
Appliquée) de la Faculté des Sciences d’Antananarivo. Nous tenons à
exprimer nos vifs et sincères remerciements :
Au Docteur RAKOTO RANOROMALALA Danielle Aurore Doll, Chef
du Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée de la Faculté des
Sciences et au Professeur JEANNODA Victor, Responsable de la formation
en Troisième Cycle au sein du département, de nous avoir donné la
permission de soutenir ce mémoire.
Aux Professeurs RAVELONANDRO Pierre et REJO-FIENENA
Félicitée, Directeurs successifs du Centre National de Recherches sur
l’Environnement, qui nous ont accueillis dans leurs laboratoires pour la
réalisation de nos travaux.
Au Professeur ANDRIANARISOA Blandine, de l’Université
d’Antananarivo, qui, malgré ses multiples occupations et responsabilités a
bien voulu nous accorder son attention et sa précieuse assistance et nous
faire l'honneur de présider le jury de ce mémoire.
Au Professeur RAZANAMPARANY Julia Louisette et au Docteur
TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina qui ont aimablement répondu a notre
sollicitation de siéger en tant que membres de jury et nous ont consacré une
partie de leur précieux temps. Leurs observations et leurs remarques seront
reçues avec intérêt.
Au Docteur RAMAMONJISOA Daniel, Maître de Conférences à
l’université d’Antananarivo pour m’avoir dirigé, conseillé et soutenu lors de
la réalisation du stage et du présent manuscrit, malgré ses multiples
occupations.
Au Docteur Baohanta Rondro Harinisainana pour son amabilité et sa
disponibilité, qui a suivi ce travail pas à pas et qui m’a beaucoup aidé par l’intérêt
qu’elle a bien voulu porter à mes résultats malgré ses lourdes responsabilités.
Aux Docteurs RAMANANKIERANA Heriniaina,
RASOLOMAMPIANINA Rado, RAKOTOARIMANGA Nirina, chercheurs au
Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME) pour l’accueil
chaleureux qu’ils nous ont toujours réservé et pour les conseils qu’ils nous
ont donnés au cours de notre stage.
A toutes les équipes de l’unité 1 et de l’unité 2 du Laboratoire de
Microbiologie de l’Environnement.
A tous mes amis stagiaires au Laboratoire de Microbiologie de
l’Environnement.
A tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à la réalisation de
ce travail.
Table des matières
TABLE DES MATIERES
GLOSSAIRE ............................................................................................................................................... i
LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................................ ii
LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................................... iii
LISTE DES FIGURES ......................................................................................................................... iv
I.1. Généralités sur les polysaccharides ...................................................................................... 3
I.2. Les polysaccharides d’origine microbienne ........................................................................ 3
I.2.1. Définitions des exopolysaccharides (EPSs) ....................................................................... 3
I.2.2. Importances des EPSs dans la vie de la cellule productrice ........................................... 3
I.2.3. Composition chimique des EPSs ....................................................................................... 4 a) Composition osidique ............................................................................................................. 4
b) Les substituants organiques .................................................................................................... 5
c) Les substituants inorganiques ................................................................................................. 5
I.2.4. Classification des EPSs ....................................................................................................... 6
a) Les homopolysaccharides ....................................................................................................... 6
b) Les hétéropolysaccharides ...................................................................................................... 7
I.3. Utilisation des exopolysaccharides ....................................................................................... 9
I.3.1.Dans le domaine médical ..................................................................................................... 9
I.3.2. Dans l’industrie alimentaire ............................................................................................ 11
I.3.3.Les applications en agronomie .......................................................................................... 12 a) Notion de rhizosphère ........................................................................................................... 12
b) Notion d’agrégat, de structuration et de stabilité du sol ....................................................... 12
c) Les microorganismes rhizosphériques et la production d’EPS ............................................ 13
Table des matières
I.4.La production des EPSs ....................................................................................................... 15
I.4.1. Conditions de culture ........................................................................................................ 15
I.4.2. Milieu de culture ............................................................................................................... 15
I.4.3. Conditions optimales de synthèse des EPSs ................................................................... 15
I.4.4. Extraction des EPSs .......................................................................................................... 16
I.5.Intérêts des EPSs ................................................................................................................... 16
II.2. Organisation et classification ............................................................................................ 18
II.3. Les différentes castes .......................................................................................................... 19
II.4. La termitière ....................................................................................................................... 19
II.5. Répartition mondiale ......................................................................................................... 19
II.6. Les termites de Madagascar .............................................................................................. 20
II.7. Le tube digestif des termites .............................................................................................. 20
II.7.1. Morphologie générale du tube digestif des termites .................................................... 20
II.7.2. Diversité des microorganismes du tube digestif des termites ...................................... 20
II.8. Rôles et utilisations des termites ....................................................................................... 21
MATERIELS ET METHODES ............................................................................................................ 23
I.ISOLEMENT ET CRIBLAGE DES MICROORGANISMES PRODUCT EURS D’EPSS .................................................................................................................................................................. 23
I.1. Matériels biologique : le termite ouvrier ........................................................................... 23
I.2. Isolement des microorganismes producteurs d’EPSs ....................................................... 24
I.2.1. Dissection du tube digestif des termites .......................................................................... 24
I.2.2. Isolement et dénombrement des microorganismes ........................................................ 24
Table des matières
a) Préparation du milieu de culture ........................................................................................... 24
b) Ensemencement .................................................................................................................... 24
c) Comptage des colonies ......................................................................................................... 25
d) Purification et criblage des souches ..................................................................................... 25
I.2.3. Conservation des souches ................................................................................................. 26
I.3. Etude de la croissance des dix (10) souches sélectionnées : mesure du poids sec .......... 27
I.3.1. Mesure du poids sec .......................................................................................................... 27
I.3.2. Détermination de la vitesse spécifique de croissance maximale µmax ........................... 27
I.3.3. Détermination du temps de génération G ....................................................................... 28
II. CARACTERISATION DES SOUCHES BACTERIENNES .............................................. 28
II.1. Etude des caractères culturaux ......................................................................................... 28
II.2. Description des caractères morphologiques et structuraux ........................................... 28
II.2.1. Observation à l’état frais ................................................................................................ 28
II.2.2. Coloration de Gram ........................................................................................................ 29
a) La fixation ............................................................................................................................. 29
b) La coloration ......................................................................................................................... 29
II.3. Etude des caractères biochimiques ................................................................................... 29
II.3.1. Culture sur milieu mannitol mobilité ............................................................................ 29
II.3.2. Milieu citrate de SIMMONS .......................................................................................... 30
II.3.3. Milieu de Hajna-Kligler .................................................................................................. 30
II.3.4. Milieu lysine – fer ............................................................................................................ 32
III. LES SOUCHES BACTERIENNES, LA PRODUCTION D’EPSS ET LE PHENOMENE D’AGREGATION DU SOL ................................................................................ 33
III.1. Mise en évidence de la production d’EPS par les souches bactériennes ..................... 33
III.1.1. La fermentation ............................................................................................................. 33
a) Préparation du milieu de fermentation ................................................................................. 33
b) Inoculation microbienne ....................................................................................................... 33
c) Suivi de la croissance bactérienne ........................................................................................ 33
III.1.2. Extraction des polysaccharides .................................................................................... 34
Table des matières
III.1.3. Description des propriétés physiques des EPSs .......................................................... 34 a) Mesure de l’élasticité des exopolysaccharides ..................................................................... 34
b) Evaluation de la viscosité ..................................................................................................... 35
c) Calcul du débit-volume qv .................................................................................................... 35
III.2. Les souches bactériennes et le phénomène d’agrégation du sol ................................... 36
III.2.1. Préculture des souches .................................................................................................. 36
I. DENOMBREMENT DES MICROORGANISMES PRODUCTEURS D’E PS ................ 38
II. ISOLEMENT ET SELECTION DES BACTERIES PRODUCTRIC ES D’EPSS ......... 38
II.1. Criblage selon la taille des colonies bactériennes ............................................................ 38
II.2. Criblage selon la viscosité du milieu de culture ............................................................... 39
II.3. Etude de la croissance des souches en milieu de culture liquide .................................... 40
II.3.1. Cinétique de croissance des dix souches sélectionnées ................................................. 40
II.3.2. Vitesse de croissance maximale et temps de génération .............................................. 43
III. CARACTERISATION ET IDENTIFICATION DES DIX SOUC HES MICROBIENNES ISOLEES ........................................................................................................... 44
III.1. Morphologie des colonies bactériennes sur milieu solide .............................................. 44
III.2. Caractères morphologiques des souches ........................................................................ 45
III.3. Caractères biochimiques des souches ............................................................................. 46
IV. PRODUCTION DE POLYSACCHARIDES PAR LES 10 SOUCHES .......................... 47
IV.1. Courbe de croissance des souches en cours de fermentation ....................................... 47
Table des matières
IV.2. Quantité d’EPS extraits pour chaque milieu de fermentation ..................................... 48
V. PROPRIETES PHYSIQUES DES EPS .................................................................................... 49
V.1. Elasticité des EPS ............................................................................................................... 49
V.2. Viscosité du milieu de culture ............................................................................................ 49
VI. POTENTIALITE DES SOUCHES MICROBIENNES ET LE PHE NOMENE D’AGREGATION DU SOL .............................................................................................................. 50
VI.1. Pourcentage en agrégats stables à l’eau .......................................................................... 50
VI.2. Solubilisation du phosphate par les souches bactériennes ............................................ 52
Agrégation : Fait de s’assembler pour constituer une masse plus ou moins compacte.
Chélation : (du grec khêlê : « pince ») Processus physico-chimique au cours duquel est formé un complexe, le chélate, entre un ligand, dit chélateur (ou chélatant), et un cation (ou atome) métallique, alors complexé, dit chélaté.
Dispersion : éparpillement en divers endroits (des éléments d'un groupe) en les séparant. Chez les termites, seuls les adultes reproducteurs sont responsables de cette dispersion.
Embolie : Largage de matériel (appelé embole) dans la circulation sanguine. Le risque est l'obstruction d'une artère périphérique ou pulmonaire provoquant une ischémie.
Flagellé : Organisme unicellulaire pourvu d’un appendice filiforme assurant son déplacement.
Foret sclérophylle : Type de végétation dépendant des conditions climatiques caractérisées par une saison sèche marquée et des minima de température assez accusés.
Géophagie : Pratique consistant à s'alimenter de substances minérales, comme par exemple l'argile.
Inoculation : Apport contrôlé d’un germe, bienfaisant dans une culture végétale.
Nisine : Peptide antibactérien polycyclique de 34 résidus d’acides aminés utilisé comme conservateur alimentaire. Elle est utilisée dans les industries de transformation des fromages, viandes, boissons, etc. pour prolonger leur durée de vie.
Nutraceutique : (mot-valise des mots « nutrition » et « pharmaceutique ») Se dit d’un produit alimentaire ou d’un aliment qui procure des avantages médicaux et de santé y compris la prévention et le traitement de la maladie.
Rhéologie : (du grec rheo, couler et logos, étude) Etude de la déformation et de l'écoulement de la matière sous l'effet d'une contrainte appliquée.
Rhizosphère : Interface ou région du sol sous l’influence directe de la racine.
Sarcome : Tumeur maligne qui se forme aux dépens du tissu conjonctif ou des tissus qui en dérivent comme le tissu musculaire, l'os.
Symbiose : Vie en commun d’individus appartenant à des espèces différentes dont les organismes demeurent proches l’un de l’autre, ceci avec avantages réciproques pour les deux partenaires.
Synérèse : Exudation de l’eau.
Thrombose : Caillot de sang qui se forme dans une veine (thrombose veineuse) ou dans une artère (thrombose artérielle).
Ubiquistes : Qui se trouvent au même moment en plusieurs lieux.
Liste des abréviations
ii
LISTE DES ABREVIATIONS
A: Acétate
ANOVA : Analyses of variance
CNRE : Centre National de Recherche sur l’Environnement
Da: Dalton
DV : Débit-volume
E.D : Eau distillée
EPS(s): Exopolysacharide(s)
Gal: Galactose
Glc: Glucose
LME : Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement
ln : Logarithme népérien
MOS: Matière Organique du Sol
P: Pyruvate
Rha: Rhamnose
RP: Rouge phénol
TCP : Phosphate de Calcium Tricalcique
tr/min : Tours par minute
UFC : Unité Formant Colonies
Liste des tableaux
iii
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Origine des EPS en concordance avec leur substituant………………………….…6
Tableau 2 : Applications des polysaccharides bactériens (Sutherland, 1998)……………........10
Tableau 3 : Effet de l’inoculation avec NAS206 sur les propriétés physiques du sol rhizosphérique………………………………………………………………………...................14
Tableau 4: Modalité d’ensemencement, de lecture et d’interprétation des milieux d’identification………………………………………………………………………………….31
Tableau 5 : Nombre de colonies isolées sur le milieu YM………………………………............................................................................................... 37
Tableau 6 : Diamètre des colonies isolées sur milieu YM mesuré après 3 jours d’incubation……………………………………………………………………………………..37
Tableau 7 : Classement des souches selon la viscosité des milieux de culture………………. 39
Tableau 8 : Vitesse spécifique de croissance maximale et temps de génération des 10 souches……..................................................................................................................................42
Tableau 9 : Caractéristiques des 10 souches sélectionnées…………………………………….43
Tableau 10 : Aspect morphologique des colonies des dix souches bactériennes cultivées sur YM (observation macroscopique)………………………………………………………............43
Tableau 11 : Caractères morphologiques des souches étudiées………………………………..44
Tableau 12 : Caractères biochimiques des souches…………………………………………….45
Tableau 13 : Quantité d’EPS extraits du milieu de culture de chaque souche (pour un litre de milieu de fermentation)………………………………………………………………….............47
Tableau 14 : Elasticité des polysaccharides des 10 souches…………………………………...48
Tableau 15 : Temps d’écoulement et Débit-volume des EPSs………………………………...49
Tableau 16 : Poids et pourcentage en agrégats stables à l’eau après inoculation……………....50
Tableau 17 : Diamètre du halo+colonie des souches après 7 jours de culture sur le milieu TCP…………………………………………………………………………………………... 51
Liste des figures
iv
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Structure du dextrane, un homopolysaccharide……………………………………....7
Figure 2 : Structure de l'EPS de Lb. rhaminosus RW-9595M…………………………………..8
Figure 3 : Structure du xanthane………………………………………………………………. 8
Figure 4 : Structure du gellane………………………………………………………………......8
Figure 5 : Microagrégats bactériens du sol rhizosphérique extrait du sol de la Martinique…………………………………………………………………………………..…...13
Figure 6 : Production d’EPS dans un fermenteur de 2 litres…………………………………...16
Figure 7 : Schéma du tube digestif d'un termite humivore, Thoracotermes macrothorax….….21
Figure 8 : Termites ouvriers humivores dans leur habitat naturel…………………….….……22
Figure 9 : Mesure du diamètre des colonies selon un axe vertical (Dx) et un axe horizontal (Dy). Culture observée après 3 jours d’incubation………………………………….………………...25
Figure 10 : Mesure de l’élasticité (exemple des souches 40 et 44) après 3 jours d’incubation des souches à 30°C..............................................................................................................................34
Figure 11 :Répartition des souches selon leur diamètre après 8 jours de culture sur le milieu YM................................................................................................................................................38
Figure 12 : cinétique de croissance des 10 souches sélectionnées sur le milieu YM après 10 jours d’incubation.........................................................................................................................40
Figure 13 : Cinétique de croissance des 10 souches au cours des trois jours de la fermentation…………………………………………..…………………………………………47 Figure 14: Pourcentage en agrégats stables à l’eau du sol inoculé par les souches après 10 jours d’incubation………………………………………………………………………..……………51
INTRODUCTION
Introduction
1
INTRODUCTION Les polymères d'origine biologique ou biopolymères tels que les polysaccharides
présentent une diversité de structures qui offre un large spectre de propriétés fonctionnelles.
Outre leurs intérêts dans les exploitations pétrolières, dans l'agroalimentaire ou dans les
industries papetières, les activités biologiques de ces molécules ne sont pas négligeables
(Garrido et al., 2002). Par ailleurs, le marché qui a été essentiellement dominé par les gommes
d'origine végétale ou algale, s'ouvre désormais aux polysaccharides issus de bactéries
(exopolysaccharides EPSs) qui eux ne dépendent pas des aléas climatiques, écologiques et
politiques qui affectent la qualité, le coût et l'approvisionnement, contrairement à leurs
homologues extraits d'algues ou de plantes (Guezennec, 2004).
De plus, les points positifs des EPSs bactériens résident, d’une part sur les possibilités
d’agir sur les conditions de fermentation (sources de carbone, température, aération, pH, etc...)
en vue d’optimiser la production, d’assurer la traçabilité, mais aussi de modifier le polymère
produit, et d’autre part, sur la diversité de leur structure et des microorganismes producteurs qui
sont également issus de divers habitats (Vincent et al., 1994). Les microorganismes qui vivent à
l’intérieur du tube digestif des termites sont parmi les plus étudiés étant donné qu’ils sont
particulièrement nombreux et diversifiés (Ohkuma et al., 2001). En effet, grâce à l’association
symbiotique, ils profitent de l’environnement stable à l’intérieur de ces deniers et participent en
retour à la dégradation des aliments au bénéfice des termites par la production de substances
diverses dont les exopolysaccharides.
En matière d’exploitation, l’importance de ces EPSs dans l’amélioration et le maintien
de la fertilité des sols de culture, notamment celle des sols tropicaux, représente actuellement
l’un des nouveaux défis à relever pour les scientifiques. En effet, l’amélioration et le maintien de
cette fertilité des sols sont parmi les éléments-clés dans le contexte actuel de priorisation de
l’autosuffisance alimentaire des pays en voie de développement. Etant donné que la stabilité de
la structure du sol est fortement corrélée avec sa teneur en matière organique, les
polysaccharides bactériens, fractions importantes de cette dernière, y jouent alors un rôle
prépondérant (Kaci & Heulin, 2008), notamment, dans la formation des agrégats qui sont les
unités de base du sol (Santaella et al., 2008). En effet, les agrégats déterminent les propriétés
mécaniques et physiques du sol (mobilité de l'eau, aération, régulation de la température…) et
jouent un rôle important dans la germination et la croissance racinaire des plantes. L’importance
de ces EPS est ainsi cruciale du point de vue agronomique et environnemental.
Introduction
2
Or, il est actuellement bien connu que, d’une part, les sols tropicaux continuent à se
dégrader, et d’autre part, la résilience naturelle des écosystèmes est particulièrement lente, voire
même inexistante, dans certains cas. Le recours à des procédés biologiques pour la restauration
du sol est donc impératif et a déjà fait l’objet des nombreuses études (Alami et al., 2000 ;
Bomfeti et al., 2011). De ce fait, l’inoculation du sol rhizosphérique par les bactéries
productrices d’EPS est l’une des technologies biologiques de taille pour améliorer et maintenir
la fertilité du sol pour stimuler le développement des plantes (Kaci et al., 2005). De ce fait, pour
le cas des pays en voie de développement comme Madagascar, l’exploitation de cette
potentialité des microorganismes producteurs d’EPSs pour la restauration des écosystèmes
cultivés représente une alternative intéressante pour pallier les utilisations abusives des produits
chimiques.
Ce travail de recherche sur l’importance des polysaccharides d’origine microbienne
dans l’amélioration de la structure du sol en valorisant les ressources naturelles disponibles est
parmi les pionniers dans ce domaine. En considérant le fait que le tube digestif du termite
renfermerait diverses communautés de bactéries productrices d’EPS et que ces derniers
augmenteraient le processus d’agrégation du sol, cette étude a eu comme objectif principal de
décrire les impacts de l’inoculation du sol par les exopolysaccharides bactériens sur sa structure
et son fonctionnement. Les objectifs spécifiques seront i) d’isoler et de caractériser diverses
souches de bactéries productrices d’exopolysaccharides à partir du tube digestif des termites, ii)
de faire un criblage des souches productrices d’exopolysaccharides et iii) d’étudier l’importance
de ces souches sur le phénomène d’agrégation du sol et la dynamique du phosphore dans le sol.
Cette étude se divise en trois parties : la première partie résumera les données
bibliographiques sur les exopolysaccharides et sur les termites, la deuxième partie décrira les
matériels et les méthodes utilisés, la troisième partie exposera les résultats obtenus ainsi que leur
discussion respective. Ces trois parties seront terminées par les conclusions et les perspectives.
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Synthèse bibliographique
3
I.LES EXOPOLYSACCHARIDES D’ORIGINE MICROBIENNE
I.1. Généralités sur les polysaccharides Les glucides sont des composés organiques constitués de carbone, d'hydrogène et
d'oxygène selon la formule empirique (CH2O) n. Ils incluent les sucres simples, les
polysaccharides et leurs dérivés (Mustapha & Babura, 2009). Ces composés sont les principales
substances nutritives de la plupart des organismes et sont absorbées généralement sous forme de
sucre simple (glucose). Ils fournissent l'énergie et les carbones nécessaires pour la biosynthèse
de protéines, d'acides nucléiques, de lipides et d'autres glucides (Pigman et Horton, 1972).
Les glucides se subdivisent en quatre (4) groupes, à savoir : les monosaccharides, les
disaccharides, les oligosaccharides et les polysaccharides.
Les polysaccharides sont des macromolécules constituées par un grand nombre de
résidus monosaccharidiques liés entre eux par des liaisons glycosidiques. Ils constituent une
importante famille de molécules souvent ramifiées et sans forme particulière (molécules
amorphes), insolubles dans l'eau, et ils n'ont pas de pouvoir sucrant (Flitsch et Ulijn, 2003).
Les polysaccharides ont comme formule générale [Cx (H2O)y)] n où y est généralement
x – 1 et où x est généralement un nombre compris entre 200 et 2500.
En considérant que les motifs récurrents dans le squelette de la molécule polymère sont
souvent constitués de monosaccharides à six carbones, la formule générale peut aussi être
définie par (C6H10O5) n où 40 ≤ n ≤ 3000.
I.2. Les polysaccharides d’origine microbienne
I.2.1. Définitions des exopolysaccharides (EPSs) Les exopolysaccharides (EPSs) sont des polymères biosynthétisés [substances
polymériques extracellulaires (SPE) ou Extracellular polymeric substances (EPS)] (Geesey,
1982). La majorité d’entre eux sont des polymères de surface excrétés par les cellules
procaryotes ou eucaryotes (bactéries et champignons) sous forme de capsules enrobant la cellule
ou de matières visqueuses excrétées dans le milieu extérieur (Sutherland, 1972 ; Cerning, 1994 ;
Mata et al., 2006).
I.2.2. Importances des EPSs dans la vie de la cellule productrice Etant donné que les bactéries productrices d'EPS occupent une large gamme de niches
écologiques, les propriétés des EPSs changent d’un environnement à un autre. En effet, la
capacité de production d'EPS a été décrite comme étant une réponse directe et logique aux
Synthèse bibliographique
4
pressions sélectives de l'environnement (Dudman, 1997). Ces polymères, qui sont
essentiellement constitués de carbohydrates, sont principalement impliqués dans la formation
d’agrégats ou "biofilm" microbiens (Sutherland, 1990). Les EPS peuvent également jouer de
nombreux rôles qui sont dans la majorité des cas aux bénéfices des cellules productrices :
certains agents pathogènes produisent des EPS(s) pour exprimer leur virulence, certains groupes
de microorganismes les produisent pour interagir avec leur environnement (plante, sol, autres
microorganismes, dessiccation, composés toxiques présents dans le milieu) (De Vuyst, 1999 ;
Leigh et Coplin, 1992 ; Lopez-Lara et al., 1993).
In vitro, l’importance des EPS pour la cellule n’est pas très remarquable, pourtant en
milieux naturels leur production procure aux bactéries un avantage compétitif et protecteur qui
leur permet de se maintenir en vie plus longtemps que les autres groupes non producteurs d’EPS
(Cerning, 1994).
- La couche d'EPS autour de la cellule influence significativement la diffusion de
différentes molécules aussi bien vers l'extérieur que vers l'intérieur de la cellule ce qui rend
difficile l’action des agents antimicrobiens (Whitfield, 1998). A titre d’exemple, la production
d'EPS a conféré à une souche de Lactococcus lactis une tolérance significative envers le cuivre,
la nisine et le lysozyme (Looijesteijn et al. , 2001).
- Les EPS permettent aux bactéries d’agréger des particules en suspension en
utilisant leur caractère anionique et leur capacité à chélater les métaux et les ions. Ces propriétés
les font ressembler à une résine échangeuse d’ions et favorisent l’apport en nutriments
nécessaires à la croissance bactérienne (Costerton et al., 1981).
- Les EPSs sont en grande partie impliqués dans la formation des biofilm
bactériens qui permettent aux communautés bactériennes de s’adhérer à des surfaces en milieux
naturels ou qui les protègent contre les surfactants et même les antibiotiques (O’Toole et al.,
2000).
I.2.3. Composition chimique des EPSs
a) Composition osidique Les EPSs sont composés de résidus glycosidiques, qui peuvent être liés de façon
covalente à des substituants organiques ou inorganiques. Les sucres que l’on peut trouver dans
les EPS sont extrêmement divers. Le D-glucose, le D-galactose et le D-mannose sous forme
pyranose, sont présents dans de nombreux EPSs. La plupart de ces résidus sont également
présents chez les animaux et les végétaux. Toutefois, les EPSs des cellules eucaryotes se
distinguent par la présence, dans certains cas, de pentoses comme le D-ribose ou le D-xylose,
Synthèse bibliographique
5
qui sont beaucoup moins fréquents dans les polysaccharides dérivés des procaryotes
(Sutherland, 1990).
b) Les substituants organiques Les EPSs microbiens peuvent contenir différents types de substituants organiques liés
par des liaisons éther, ester, amide ou acétalique au squelette glycosidique qui sont fréquents
dans les unités répétitives des EPSs bactériens mais rares dans les polysaccharides d’eucaryotes
et sont en grande partie responsables des propriétés physico-chimiques des polymères qui les
portent.
c) Les substituants inorganiques Les groupements sulfates ont longtemps été limités aux polysaccharides eucaryotes et
aux protéoglycanes mais il s’avère que les polysaccharides sulfatés sont également présents chez
les procaryotes. La majorité des EPSs sulfatés décrits sont produits par des cyanobactéries (De
Phillips et Vincenzini, 1998). D’autres bactéries sont capables de produire des EPS possédant un
groupement sulfate dans l’unité répétitive (Parolis et al., 1996, Raguénès et al., 1997). Les taux
de sulfates de ces EPSs sont bas (< 10 % du poids de la molécule) contrairement aux
polysaccharides d’algues comme les fucoïdanes (Percival et McDowel, 1967, Chevelot et al.,
2001) ou certains glycosaminoglycanes (GAG) comme l’héparine qui peuvent contenir jusqu’à
40 % de sulfates.
Les phosphates sont beaucoup plus répandus et représentent un constituant
fréquemment rencontré dans les EPS bactériens. Beaucoup des EPS phosphorylés ressemblent à
l’acide téichoïque présent dans la paroi des bactéries à Gram positif. En réalité, beaucoup de
souches produisent à la fois des polymères phosphorylés constitutifs des membranes et des EPS
phosphorylés. Les groupements phosphates peuvent se présenter sous deux formes : (i) sous
forme de mono-esters, ils contribuent alors à accentuer le caractère anionique des
polysaccharides qui les portent. C’est le cas des phosphomananes (Parolis et al., 1996) ; (ii) sous
forme de phosphodiesters. L’atome de phosphore est alors engagé dans deux liaisons avec les
hydroxyles de deux résidus différents (Van Casteren et al., 1998).
Les EPS peuvent être soit neutres, soit polyanioniques. Pour ces derniers, la charge
négative est due aux acides uroniques, aux substituants inorganiques (sulfate ou phosphate), aux
groupements pyruvate ou succinate. Le tableau 1 recense les différents substituants les plus
fréquents dans les structures des EPSs selon leur origine (Dumitriu, 2005).
Synthèse bibliographique
6
Tableau 1 : Origine des EPSs en concordance avec leur substituant (Dumitriu, 2005)
Type de substituant Origine des EPS
Acétate
Glycérate
Phosphate
Pyruvate
Succinate
Sulfate
Bactéries
Bactéries
Bactéries gram positives
Bactéries et algues
Bactéries
Archaea et cyanobactéries
I.2.4. Classification des EPSs
Selon leur composition chimique, les EPSs peuvent être subdivisés en deux groupes:
les homopolysaccharides et les hétéropolysaccharides (Sutherland, 1972).
a) Les homopolysaccharides
Une chaîne d’homopolysaccharide est composée d’un seul type de monomère
saccharidique dont la variation de la structure permet de différencier les homopolysaccharides.
A titre d’exemple, le curdlane, la cellulose et le dextrane qui sont tous composés par le D-
glucose montrent des comportements très différents concernant leurs capacités épaississantes.
Les homopolysaccharides sont de poids moléculaire élevé et peuvent être classés en
quatre (4) groupes: α-D-glucanes, β-D-glucanes, les fructanes et les polygalactanes. Ainsi, la
masse moléculaire du dextrane produit par Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F varie
entre 6,2 et 7,1x106 Da, et celles des levanes et fructanes, produits par Streptococcus mutans
vont jusqu'à 21,6x106 Da et 12,4x106 Da, respectivement (Cerning et al., 1990). La figure 1
montre la structure du dextrane (Homopolymère).
Synthèse bibliographique
7
Figure 1 : Structure du dextrane, un homopolysaccharide (Lapasin, 1999)
Les homopolysaccharides suivants sont parmi ceux qui sont les plus étudiés:
- les curdlanes sécrétés par Agrobacterium radiobacter (Phillips et al, 1983) sont des
polyglucanes β(1,3) formant un gel en solution.
- les dextranes produits par Leuconostoc mesenteroides (Sutherland, 1972) sont des
polyglucanes β(1,4) formant un gel en solution.
- la cellulose synthétisée par Acetobacter xylinum (Lin et al, 1985) est également un
polyglucaneβ(1,4) mais celui-ci est insoluble en solution.
b) Les hétéropolysaccharides
La majorité des polysaccharides bactériens sont des hétéropolysaccharides formés par
des polymères dont l’unité répétitive est constituée d’au moins deux résidus saccharidiques
différents. Les principaux représentants de cette classe sont : la pectine, l'acide alginique, l'agar,
les carraghénanes (Rougeaux et al., 1999).
Le nombre de types de monosaccharides des hétéropolysaccharides est finalement
assez limité. Parmi eux, les hexoses tels que le D-glucose, le D-galactose et le D-mannose, mais
aussi des méthylpentoses (généralement le L-fucose ou le L-rhamnose) et les acides uroniques,
les acides D-glucuronique et D-galacturonique sont les plus communs (Vandamme et al., 2002).
De plus, il y a aussi des résidus qui ne sont pas des sucres, comme le phosphate, l'acétyle et le
glycérol. Les différentes structures des hétéropolysaccharides ont été résumées par De Vuyst et
Degeest(1999), Riccardi et Clementi (2000), De Vuyst et al. (2001) et Ruas-Madiedo et al.
(2002).
La figure 2 présente la structure de l'unité répétitive de l'EPS synthétisé par
Lactobacillus rhaminosus RW-9595M. Il s'agit d'un heptasaccharide contenant du glucose,
galactose et rhamnose avec un groupement pyruvate.
Synthèse bibliographique
8
Figure 2 : Structure de l'EPS de Lb. rhaminosus RW-9595M (Van Calsteren et
al. 2002).
- Le xanthane (Figure 3) sécrété par Xanthomonas campestris est un des
hétéropolysaccharides les plus étudiés (Rehm, 2009). Il s'agit d'un polymère dont la chaîne
principale est constituée de D-glucoses avec des liaisons en β(1-4) et dont un maillon glucose
sur deux est substitué en position 3 par une chaîne latérale tri-saccharidique comportant un
résidu acide glucuronique, et deux résidus mannose, l'un sous forme d'acétate, l'autre sous forme
pyruvate. Cette structure de molécule anionique est primordiale pour comprendre le
comportement, l’affinité et les interactions du xanthane.
Figure 3 : Structure du xanthane (Rehm, 2009)
A part le xanthane, les hétéropolysaccharides les plus utilisés sont:
- le gellane (Figure 4) , qui est produit par Pseudomonas elodea (O’Neill et al.,
1983) , peut concurrencer la gélatine dans certains domaines;
intermédiaire, début du proctodéum (intestin postérieur ou IP) ; 4 : tubes de Malpighi ; 5 :
premier segment de l'intestin postérieur (IP1) ; 6 : valvule entérique (IP2) ; 7 : panse (IP3) ; 8 :
côlon (IP4) ; 9 : rectum (IP5)
II.8. Rôles et utilisations des termites
Les termites sont utilisés pour nourrir les volailles dans le Sud de Madagascar et
comme matériaux de construction dans certains pays (le mélange de salive des termites et
d'argile très fine de la termitière donne un matériau très dur, qui ne se rétracte pas au séchage et
résiste à la pluie).
En outre, les termites contribuent à la micro-agrégation de sols tropicaux. De
nombreuses espèces de termites fabriquent des micro-agrégats minéraux, organiques ou organo-
minéraux, ovoïdes à sphériques, de taille comprise entre 50 et 100 m : les « boulettes
termitiques » (Eschenbrenner, 1986).
Les termites sont considérés comme des espèces-clé de voûte dans plusieurs
écosystèmes (déserts, savanes, forêts tropicales...) en raison du rôle qu'ils jouent dans la
minéralisation de la matière organique. Ils sont notamment responsables de l'émission de
grandes quantités de méthane et d'azote minéral. Le terme d' « île de fertilité » a été suggéré
pour les termitières en raison de l'accumulation de matières organiques et de minéraux
(notamment nitrate et azote) qui s'y produit. Cette richesse en minéraux, d’une part, favorise le
développement des plantes qui poussent à proximité ou sur les termitières, et, d’autre part, attire
certains animaux (éléphants...) qui viennent préférentiellement s'y nourrir.
Synthèse bibliographique
22
Les termites jouent également d’importants rôles écologiques à cause de leur
implication dans la décomposition des matières végétales lignocellulosiques et le cycle du
carbone mondial (Ohkuma, 2003; Katsumata et al., 2007). En effet, grâce aux microorganismes
associés contenus dans leur tube digestif ou en produisant eux même leurs propres enzymes, ils
sont capables de dégrader des molécules récalcitrantes habituellement non dégradables par
d’autres organismes (Breznak & Brune, 1995; Zhou et al., 2007 ; Scharf & Tartar, 2008). Les
termites ouvriers sont, en grande partie, responsables de la digestion des aliments et de la
dégradation de la lignocellulose (Kouame et al., 2005).
Par ailleurs, il a été constaté que la termitière est composée spécialement par un
mélange de matières fécales et de sol extrêmement riche en matières organiques, renforcé par
leurs sécrétions salivaires (Contour-Ansel et al., 2000). Ces dernières sont composées
essentiellement d’enzymes, de polysaccharides, d’acides aminés, etc..., qui contribuent au
maintien et à la stabilité de la termitière (Garnier-Sillam, 1987 ; Garnier-Sillam et al., 1989 ;
Scharf et Tartar, 2008). De ce fait, ce groupe d’insectes joue des rôles importants dans le
processus d’humification et dans la fertilité du sol (Garnier-Sillam et al., 1989 ).
MATERIELS ET METHODES
Matériels et méthodes
23
I. ISOLEMENT ET CRIBLAGE DES MICROORGANISMES PRODUC TEURS D’EPSs
I.1. Matériel biologique : le termite ouvrier Les microorganismes producteurs d’EPS sont isolés du tube digestif des termites
ouvriers, prélevés à l’intérieur d’une termitière localisée au sein de la forêt sclérophylle de
Tapia d’Arivonimamamo située à 50km à l’Ouest de la capitale de Madagascar. Ce sont des
termites humivores avec un nid de type épigé. Ils sont prélevés avec une petite portion de leur
nid et conservés dans une boite aérée jusqu’à l’arrivée au laboratoire.
I.1.1. Classification La classification du termite est donnée ci-dessous. Toutefois le genre et l’espèce
n’ont pas pu être déterminés aucours de l’étude.
• Règne: ANIMAL
• Embranchement: ARTHROPODES
• Super-classe: HEXAPODES
• Classe: INSECTES
• Sous-classe: PTERYGOTES
• Ordre: BLATTODES
I.1.2. Morphologie Les termites ouvriers sont caractérisés par des pièces buccales broyeuses avec un
abdomen relié au thorax. De couleur blanche, l’adulte mesure environ 5mm tandis que les
jeunes mesurent moins de 2mm. La figure 8 montre les termites dans leur habitat naturel.
Figure 8 : Termites ouvriers humivores dans leur habitat naturel
.
: 1mm
Matériels et méthodes
24
I.2. Isolement des microorganismes producteurs d’EPSs
I.2.1. Dissection du tube digestif des termites (Lefebvre, 2008)
Le travail est effectué en milieu stérile, c'est-à-dire sous une hotte à flux laminaire.
Après avoir été lavés dans de l’eau distillée stérile, les termites (cinquante individus adultes)
sont disséqués avec des pinces fines stériles sous loupe binoculaire afin d’accéder à leur tube
digestif. Pour ce faire, l’insecte est déposé dans une goutte d’eau salée à 0,6% de NaCl
préalablement versée sur une lame en verre stérile. La tête est coupée, puis chaque extrémité
du corps décapité est enserrée à l’aide des pinces. En tirant délicatement de chaque côté, le
tube digestif quasi-entier s’extirpe de l’abdomen par la partie postérieure. Après étalement en
longueur du tractus digestif sur la lame, la panse est isolée avec précaution du reste de
l’intestin (intestin moyen et parties de l’intestin postérieur IP1, IP4 et IP5) étant donné que
c’est à ce niveau que se situe la majorité de la microflore symbiotique.
I.2.2. Isolement et dénombrement des microorganismes Les panses de chaque termite sont respectivement placées dans des eppendorfs puis
broyées à l’aide d’un pilon. Chaque broyat mis en suspension dans 1ml d’eau distillée
stérilisée sert de solution mère pour l’isolement.
a) Préparation du milieu de culture
Le milieu gélosé YM (yeast molds) est utilisé comme milieu de sélection des
bactéries productrices de polysaccharides. C’est un milieu synthétique qui a prouvé ses
applications dans plusieurs travaux de recherche concernant les microorganismes producteurs
d’EPS. Le milieu est stérilisé à la chaleur humide (autoclave) à 121°C pendant 20 minutes,
pression 2 bars puis réparti dans des boîtes de Pétri stérilisées à raison de 12ml par boîte.
b) Ensemencement
La technique de dilution en cascade, suivie de l’étalement sur milieu de culture
solide dans des boites de Pétri est utilisée pour l’isolement des microorganismes. La dilution
est effectuée en mélangeant 100µl de la solution mère à l’aide d’une micropipette munie de
cônes stériles avec 900µl d’eau distillée stérilisée contenues dans des éppendorfs. Les
solutions, de dilutions à sont par la suite ensemencées sur le milieu de culture à
raison de 1ml de solution et deux répétitions par dilution, puis étalées sur toute la surface de la
gélose à l’aide d’un racloir. Les cultures ont été incubées à l’étuve à 30°C pendant 72 heures.
Matériels et méthodes
25
c) Comptage des colonies
Le nombre de colonies est compté par observation macroscopique après la période
d’incubation. Seules les boîtes de Pétri contenant entre 30 et 300 colonies sont considérées.
Le nombre de colonies par boîte est ramené en nombre de bactéries productrices
d’exopolysaccharides par tube digestif de termite utilisé pour la préparation de la solution
mère et est exprimé en Unité Formant Colonie (UFC) par tube digestif. Le nombre d’Unité
Formant Colonie noté N est déterminé selon la formule :
� : Nombre d'UFC ou par ml de produit initial
� : Somme des colonies des boîtes interprétables
� : volume de solution déposée (1ml) � : nombre de boîtes considéré à la première dilution retenue � : nombre de boite considéré à la seconde dilution retenue
� : facteur de la première dilution retenue
d) Purification et criblage des souches
A partir des colonies comptées, soixante (60) souches numérotées de 1 à 60 sont
repiquées, à l’aide de cures dents stérilisés, sur du milieu YM enrichi par du saccharose à
10g/l. L’opération est répétée jusqu’à l’obtention de souches pures exemptes de toute
contamination.
Le criblage, en deux temps, sur milieu solide puis dans un milieu liquide, est effectué
à partir de ces 60 souches.
- Criblage sur milieu solide
Les souches repiquées sur milieu YM enrichi et solidifié sont incubées à 30°C. Le
diamètre de chaque colonie est mesuré toutes les 24 heures suivant deux axes (vertical et
horizontal). Les valeurs sont notées en millimètre et les valeurs suivant l’axe vertical sont
notées Dy tandis que celles suivant l’axe horizontal sont notées Dx. L’aspect de la colonie
(muqueux ou pas) est noté. La mesure est effectuée jusqu’à ce que le diamètre des colonies
n’augmente plus. La figure 8 suivante montre la mesure du diamètre des colonies.
Matériels et méthodes
26
Figure 9 : Mesure du diamètre des colonies selon un axe vertical (Dx) et un axe horizontal (Dy). Culture observée après 3 jours d’incubation.
- Criblage sur milieu liquide
Le milieu liquide utilisé est le milieu YM sans ajout d’agar. Le milieu est réparti
dans soixante (60) tubes à essais (un tube pour chaque souche) et est stérilisé à 121°C pendant
20 minutes à l’autoclave. Une ansée de la colonie est prélevée et inoculée dans le milieu. La
culture est bien mélangée à l’aide du vortex puis incubée à 30°C pendant trois jours.
Après incubation, l’anse de platine bien stérilisée est plongée dans le milieu puis
remontée doucement pour le criblage. L’objectif est de suivre et d’observer à l’œil nu
l’écoulement du milieu le long de l’anse afin de pouvoir conclure s’il est visqueux ou pas.
Les milieux qui s’écoulent rapidement sans s’adhérer à l’anse sont considérés comme
non visqueux et sont notés (-), ceux qui s’écoulent lentement le long de l’anse sont considérés
comme visqueux (+) et ceux qui adhèrent à l’anse avec un écoulement très lent sont
considérés comme très visqueux (++).
Les souches, qui ont à la fois formé la plus grande colonie en termes de taille et qui
ont permis d’obtenir les milieux les plus visqueux, sont choisies pour la suite des expériences.
Ainsi, 10 souches numérotées sont sélectionnées et repiquées sur le milieu YM enrichi au
saccharose à 10g/l une fois tous les 14 jours afin de s’assurer de la pureté et du rajeunissement
des colonies et également pour conserver les caractères génétiques des souches.
I.2.3. Conservation des souches
La conservation des souches est faite à -80°C dans du glycérol 50%. Ainsi, 500 µl de
milieu liquide stérilisé sont mélangés avec 500 µl de glycérol stérilisé dans un cryotube stérile
pour chaque souche. Puis, une ansée de la colonie pure et jeune est inoculée dans le milieu de
Matériels et méthodes
27
conservation. L’ensemble est mélangé à l’aide d’un agitateur magnétique avant d’être placé
dans le congélateur -80°C.
I.3. Etude de la croissance des dix (10) souches sélectionnées : mesure du poids sec
Il existe différentes méthodes pour évaluer la croissance microbienne parmi
lesquelles la mesure du poids sec. L’objectif est de tracer la courbe de la cinétique de
croissance bactérienne X= f(t) où X est la concentration en biomasse exprimée en gramme de
matière bactérienne sèche par litre de milieu.
Le milieu liquide utilisé est le milieu YM enrichi sans ajout d’agar, stérilisé à 121°C
pendant 20 minutes, pression 2 bars. Une ansée de la culture pure et jeune est inoculée dans
20 ml de milieu contenu dans un tube à essais qui est par la suite bouché hermétiquement à
l’aide d’un coton cardé. Les tubes sont ensuite incubés à 30°C.
I.3.1. Mesure du poids sec
Toutes les 24 heures, 1ml d’échantillon est prélevé de chaque tube dans des
conditions stériles, puis versé dans un éppendorf puis centrifugé à 4000 tr/mn pendant 30
minutes. Ensuite le culot est séché dans l’étuve à 109°C pendant 3 heures. Il est par la suite
pesé sur une balance de précision après avoir été refroidi à la température ambiante.
La concentration en biomasse exprimée en gramme de cellules sèches par litre est notée X (g/l).
En même temps que la mesure du poids sec, 1 ml d’échantillon de chaque tube est
prélevé afin de mesurer la densité optique D.O à 520 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
La courbe X= f(t) a été par la suite tracée.
I.3.2. Détermination de la vitesse spécifique de croissance maximale µmax
La vitesse spécifique de croissance (µ) ou taux de croissance est le nombre de
divisions exprimé par unité de temps. Elle est égale à la vitesse de croissance en biomasse
rapportée à l’unité de biomasse.
X : Concentration en biomasse
Matériels et méthodes
28
Le taux de croissance maximal µmax est à déterminer pendant la phase de croissance exponentielle. C’est la période pendant laquelle µ est maximal et constant.
I.3.3. Détermination du temps de génération G
Le temps de génération G ou temps de dédoublement de la population est l’intervalle
de temps qui s’écoule entre deux divisions cellulaires. Il est exprimé en heure (h) et déterminé
selon la formule suivante :
G=
II. CARACTERISATION DES SOUCHES BACTERIENNES
Cette caractérisation est partielle car a été effectuée selon la disponibilité des milieux
de culture et réactifs au sein du laboratoire.
II.1. Etude des caractères culturaux
L’étude des caractères culturaux permet d’observer macroscopiquement l’aspect des
colonies cultivées sur milieu solide. Les souches pures sont ensemencées sur milieu YM, puis
incubées à 30 °C pendant 5 jours. La croissance est suivie toutes les 24h en notant la forme, la
taille, la couleur et l’aspect des colonies.
II.2. Description des caractères morphologiques et structuraux
II.2.1. Observation à l’état frais En l’absence de toute fixation ou de coloration, un montage entre lame et lamelle
permet d’observer les bactéries vivantes et de mettre en évidence leur morphologie, leur mode
de groupement et leur mobilité (Marchal, 1985).
Une colonie bactérienne pure a été prélevée à l’aide d’une anse de platine stérilisée,
puis étalée sur lame et recouverte d’huile d’immersion. L’observation a été faite sous
microscope optique (objectif X40) pour la description des caractères des bactéries (forme,
taille, etc.).
Après observation, les lames sont jetées immédiatement dans un bocal contenant de
l'eau de Javel pure (100%).
Matériels et méthodes
29
II.2.2. Coloration de Gram (Marchal, 1985 ; Singleton, 1999)
La coloration de GRAM est une méthode de coloration de base en bactériologie. Elle
consiste à colorer les cellules par le violet de gentiane, un colorant basique qui a la
particularité de se fixer sur les composants cytoplasmiques. Les bactéries dites à Gram négatif
sous l’action de l’alcool (ou le mélange alcool + acétone) se décolorent du fait de leur paroi,
riche en lipides, perméable à l'alcool. Par contre, les bactéries à Gram positif dont la paroi est
imperméable à l'alcool demeurent colorées en violet.
a) La fixation
Une colonie bactérienne pure est prélevée à l’aide d’une anse de platine stérilisée
puis étalée sur lame en un film mince par un mouvement régulier et circulaire. La fixation est
effectuée en versant quelques gouttes d’alcool 90°C sur le frottis puis en séchant le tout à la
flamme du bec Bunsen. Le frottis doit devenir terne mais ne doit ni brunir, ni brûler. Il s’agit
de tuer les bactéries, de rendre les membranes plus perméables, de fixer les structures sans les
altérer et de faire adhérer le frottis à la lame.
b) La coloration
La coloration est effectuée par le contact du frottis avec le colorant, Violet de
Gentiane, pendant une minute puis avec le lugol pendant une minute. L’ensemble est par la
suite rincé à l’eau du robinet, séché avec du papier Joseph et rincé de nouveau avec de
l’alcool (90°C) pour enlever les restes de colorant avant la recoloration avec la safranine
pendant une minute. Un dernier rinçage est effectué avant le séchage complet du frottis par un
court passage au-dessus de la flamme du bec Bunsen. L’observation est effectuée sous
microscope optique (objectif x 100).
II.3. Etude des caractères biochimiques
Cette étude permet de distinguer différents genres ou espèces de bactéries, basée sur
la différence de leur métabolisme en utilisant différents milieux de culture.
II.3.1. Culture sur milieu Mannitol Mobilité Nitrat e
Ce milieu de culture bactérienne permet de décrire à la fois la mobilité des bactéries
et l'utilisation du mannitol comme source de carbone et d’énergie. Il s’agit de noter le virage
de l’indicateur coloré, le rouge de phénol RP contenu dans le milieu en jaune, et les traces de
migration bactérienne sur le milieu.
Matériels et méthodes
30
Le milieu de culture est coulé dans des tubes à essai vissés stérilisés.
L’ensemencement par la culture bactérienne pure et jeune est effectué au fil droit par piqûre
centrale à l’aide d’une anse de platine stérile. L’incubation se fait à 30°C pendant 24h.
D’une part, les bactéries sont dites Mannitol (+) si la couleur du milieu vire en jaune
et Mannitol (-) si le milieu ne montre aucun changement de couleur (milieu rouge ou orange)
étant donné qu’il n’y a pas eu acidification du milieu suite à la dégradation du mannitol.
D’autre part, le milieu faiblement concentré en agar (milieu semi-solide) favorise la
mobilité des bactéries dans le milieu. Les bacilles mobiles diffusent à partir de la piqûre
d’ensemencement.
II.3.2. Milieu citrate de SIMMONS
Ce milieu permet de déterminer l’utilisation du citrate (C6H5O7 3-) qui constitue
l’unique source de carbone dans ce milieu de culture. L'utilisation de ce substrat, pour la
plupart des bactéries pouvant le cataboliser, est une utilisation aérobie, et se traduit par une
alcalinisation du milieu témoignée par le virage de l'indicateur de pH au bleu pour les
bactéries citrate de Simmons (+). Par contre, pour les bactéries citrate de Simmons (-) la
couleur de l'indicateur de pH ne change pas.
L'équation de l'oxydation par respiration aérobie du citrate est :