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Hospices Civils de Lyon, Laboratoire de Virologie et « Biologie cellulaire de l’infection virale » INSERM CIRI U1111

Professeur Patrice ANDRE

Laboratoire de Virologie Nord, Hospices Civils de Lyon.

INSERM unité U1111, CIRI « Biologie cellulaire de l’infection virale »

[email protected]@inserm.fr

Les anti-rétroviraux, mécanismes d’action et mécanismes de

résistance virale


RetroviridaleRetroviridae Hepadnaviridae

VIH HBV


Cycle de réplication du HIV

Engelman


HIV virus de l’immunodéficience humaine

singe singe Gorille MangabéSIVrcm SIVgsn SIVsm

chimpanzéP.troglodytes

SIVcpz

H.hominis H.hominis H.hominis H.hominis H.hominisHIV-1M HIV-1OHIV-1N HIV-1P HIV-2

sous types :A,B,C,D, classification surenvF,G,H,J, K variations nucléotiques inter-groupes :20-50%RCF-AG,… variations nucléotiques intra-groupes :10-15%

quasi espèce :5%

Touslesprimatessontinfectésparunlentivirus.

FamilleRetroviridae :oncovirus,lentivirusetspumavirus

OriginedesVIH-1et-2.


Cycle de réplication du HBV

Nassal Gut 2015


HBV virus de l’hépatite B

Hepadnaviridae, Orthohepadnavirus, HBV: 8 génotypes; WHV; GSHV…Avihepadnavirus, DHBV, HHBV…

Diversité entre les génotypes < 15%

Strictement humain


Evolution naturelle des infections HIV et HBV

HIV HBVPrimo-infection :

- ChroniquePrimo-infection :

- Aiguë- Chronique

Réplication continue Réplication continue“functional cure” “functional cure”

- rare, “elite controllers”- “rémissions”

- Fréquente- rémissions

Latence et réservoirPas d’élimination Elimination, non ou parfois ?


Effets des traitements actuels

HIV HBVvaccin

non oui (prophylactique)antiviraux indirects

no functional cure IFN type 1 functional cure 20%antiviraux directs

(DAA)viro-suppression NRTI viro-suppressionviro-suppression CART -

rare functional cure rare functional curelatency, reservoir latency, reservoir

no HIV cure(one case)

no HBV cure


Vers une “cure” et l’éradication des virus

- La persistance de l’infection est possible grâce à l’existence de réservoirs silencieux : mécanisme premier de résistance aux anti-rétroviraux

- Une « cure » doit attaquer et détruire ces réservoirs

- Les DAA, s’ils peuvent induire une viro-suppression, sont très généralement inefficaces pour stériliser les réservoirs ou même simplement obtenir une cure fonctionnelle (rémission) : traitement de longue durée (à vie?)

- Les cures fonctionnelles sont dépendantes de la réponse ou de l’état physiologique de l’hôte : recours à des traitements avec des Indirect Acting Antivirals (IAA)


Les « anti-rétroviraux » actuels

Rappel des cibles accessibles à la thérapeutique.

Les inhibiteurs d’entrée et de fusion.

Les inhibiteurs de la transcriptase inverse.

Les inhibiteurs de la protéase virale.

Les inhibiteurs de l’intégrase

L’evolution des virus résistants.

Les méthodes d’études de la résistance virale.


Cycle de réplication du HIV

Engelman


Les inhibiteurs d’entrée et de la fusion

Structure et fonction des glycoprotéines d’enveloppe.

Structure de la gp41.

Les trois étapes de l’entrée.

Inhibition du docking.

Inhibition de la liaison aux co-récepteurs.

Inhibition de la fusion.


Les trois étapes de l’entrée

I-Docking II-Liaison aux corécepteurs III-FusionInsertion

Phénomène très rapide dont la cinétique dépend :

• de la qualité des boucles variables V1 et v3,• de la concentration et de la qualité des corécepteurs.


Inhibition de la liaison aux corécepteurs

CXCR4 CCR5

RANTES, MIP-1α, -1β

• Les chimiokines, ligands naturels des récepteurs CXCR4 et CCR5, bloquent la fixation du site, la boucle V3 (11, 24, 25, lysine, arginine X4) dévoilée lors du docking, de la gp120 à ces récepteurs.

• L’inhibition de cette étape est réalisée par masquage des récepteurs.


Le switch des co-récepteurs

• Stade précoce R5: réplication dans un site riche en CCR5, le tractus intestinal• Evolution de la quasi espèce virale de R5 vers X4 ?• Contrôle immunitaire ?• Evolution des populations cellulaires cibles ?• Souches X4 sont plus virulentes (plus cytopathogènes ou plus grand nombre de

cellules infectées), plus fréquentes pour les sous types B que C, A que D…Regoes, Trends in Microbiol, 05


Liaison de la gp120 à CCR5

Huang, Science, 07


La boucle V3

Huang, Science, 05 et 07

• résidus 11, 25, 30 (règle 11-25)• charge nette globale; faible R5 (<5), forte X4 (>5)• score spécifique des aa (glycosylation, N301, absence en faveur de X4)• modèle de structure tridimensionnelle

• MAIS rôle d’autres domaines de gp120 et gp41.


Agonistes et antagonistes de CCR5

Agonistes

Activent CCR5

Internalisation

Absence d’expression

Transduction ?

Résistance ?

PSC-RANTES

Antagonistes

Occupent le site

Pas d’internalisation

Bloqués à la surface

Pas de transduction

Résistance ?

MVC, VVC


Les antagonistes


Fixation des antagonistes (MVC)

MARAVIROC VICRIVIROC APLAVIROCaa CCR5 æIC50 si A aa CCR5 æIC50 si A aa CCR5 æIC50 si A

E283 (H7) 2000x E283 (H7) 700x F109 (H3) 158xI198 (H5) 89x Y108 (H3) 60x E283 (H7) 61xY108 (H3) 70x I198 (H5) 25x W86 (H2) 39xY251 (H6) 12x Y251 (H6) 18x I198 (H5) 35x

Kondru, Mol Pharmacol, 08



Structure et fonctions des glycoprotéines d’enveloppe

• Les GP sont des hétéropolymères constitués de 3 gp120 et de 3 gp41 fichés dans l’enveloppe virale.

• L’ensemble réalise un moteur moléculaire capable de changer deux fois de conformation.

• Ces changements de conformation, en rapprochant les peptides de fusion des domaines transmembranaires, amènent les membranes virales et cellulaires au contact et entraînent la fusion de celles-ci.


Inhibition de la fusion

T20se fixe ici bloque là

• T20 et T1249 sont des peptides, homologues de HR2, qui se fixent sur HR1 et qui empêchent le repliement ultérieur de la gp41.

• L’inhibiteur à 5 hélices est un autre inhibiteur de fusion qui se fixe sur HR2 et bloque le repliement de la gp41.


Structure de la gp41

• Les deux domaines HR1 et HR2 s’organisent en hélice α. Cette structuration rigidifie chaque molécule du trimère et projette les domaines de fusion, hydrophobes, dans la membrane de la cellule cible.

• Les deux domaines des gp41 se replient ensuite pour faire coïncider les résidus hydrophobes de chaque hélice ce qui réalise un faisceau à 6 éléments et entraîne la fusion des membranes.


Mutations de résistance au T20


Les inhibiteurs de la transcriptase inverse

Deux classes d’inhibiteurs de la reverse transcriptase:

- Les inhibiteurs nucléos(t)idiques (NRTI), analogues de base, inhibiteurs par compétition

- Les inhibiteurs non nucléosidiques, inhibiteurs allostériques


Structure et fonctions de la RT


Les analogues nucléosi(ti)diques

ABC abacavirAZT zidovudine

D4T stavudine

ddI didanosine3TC lamivudine *

tenofovir *emtricitabine


Analogues nucléosidiques et nucléotidiques


« Chain terminator »

Pyrophosphorolyse

Les TAMs :

70R, 215Y/F, 41L, 210W, 67N, 219QDiminuent la processivité de la RT.Favorisent la pyrophosphorolyse.

AZT, ABC, et d4T, ddI.

Mécanismes d’action et de résistance aux NRTI


Mécanismes d’action et de résistance aux NRTI

- Discrimination des ddNTP : affinité ( ^ Kd), la RT mutée présente une affinité beaucoup plus grande pour les dNTP que pour les ddNTP: M184V

- Incorporation des ddNTP (kpol), l’affinité pour le ddNTP n’est pas modifiée, mais la liaison 3’-5’ phosphodiester avec le ddNTP est nettement moins efficace qu’avec le dNTP : K65R L74V Q151M


1) Butterfly like, interaction aile avec résidus aromatiques, 181,188,227,229, 3182) Hydrophobic site, collapsed, elastic3) Y181C et Y188L =>défaut des interactions aromatiques, L100I G190A

encombrement stérique, K103N hydrogen bond Y1884) Stabilisation possible par F227 W229

Inhibiteurs non nucléosidiques


Efavirenz, Nevirapine, Etravirine, Rilpivirine,

TMC125 Etravirine



Résistance aux non nucléosidiques

Mutations aux codons 98 – 108K103N, DLV, NVP et EFZV106A, NVP et +/- DLVK101I, EFZA98G, K101E, V108I, +/- DLV, NVP et EFZ

Mutations aux codons 179 – 190Y181C/L, NVP et DLVY188C/L/H et G190A/S, NVP et EFZ

Mutations aux codons 225 – 236

Résistance croiséeFaible barrière génétique


Les inhibiteurs de la protéase


fonctions de la protéase du HIV-1


Structure de la protéase


Mutations associées à la résistance aux IP

Le site catalytique : le sillon

Mutations majeures qui induisent une résistance à un ou plusieurs IP.

Le volet :

Mutations majeures, 48VM, 50V/LMutations compensatoires, 46I/L, 47A/V, 54*

Les mutations compensatoires ou accessoires :

Non polymorphes : 23, 24, 32, 33, 73, 76, 88Polymorphes : 10, 20, 36, 63, 71, 77, 93


Résistance aux inhibiteurs de la protéase

Les mutations du site catalytique :

V82A/T/F/S IDV, LPVet contribue à la résistance aux autres IPI84V tous les IP, DRV, sauf NFVD30N NFVI54V tous les IP (46, 47, 53) (I54L)L90M SQV, NFV, IDV et RTV

G48V, V84A/F/T, I84V et L90M sont les déterminants majeurs associés à une résistance aux IP.

Les mutations « compensatoires » :

10, 20, 36, 63, 71, 77, 93 contribuent à la résistance aux IP mais sont aussi des codons polymorphes.

Boost avec le ritonavir


Anti-intégrases


Fonctions de l’intégrase


Fonctions de l’intégrase


Les étapes de l’intégration



Engelman 2013 Current Opinion in Chemical Biology

Relations structure-fonction


Profiles de résistance

Pour Raltegravir et Elvitegravir : Trois voies :- Y143R/C- Q148K/R/H- N155H exclusives

- Cinétique d’apparition:- N155H puis Q148K/R/H qui sont les plus fréquentes des trois voies de résistance

- Mécanisme: dépend des mutations compensatoires; N155H + L74M, E92Q, G163R Q148K/R/H + E138K, G140R Cette dernière association de mutations confère un plus haut degré de résistance que la première

-Faible barrière génétique (moins vrai pour Y143R/C)

Pour Dolutegravir : haute barrière génétique- R263K peut être sélectionnée sans grand impact- N155H avec d’autres mutations ?


L’évolution des virus résistants


Mécanisme de la sélection des mutations associées à la résistance

Prés = Nxrép x Txerreur x Cméd

La probabilité de sélectionner une mutation associée à la résistance à un anti-rétroviral dépend de trois facteurs:• le niveau de réplication du virus• le taux d’erreur de la transcriptase inverse• la présence d’un agent de sélection, l’anti-rétroviral.


Mécanisme de la sélection des mutations

3-5 109 virus/jour

1 à 100 x106 LT CD4 infectés

1 LT CD4 infecte 20 LT CD4

10 à 100 x106 LT CD4 détruits/jour

5 à 50 x109 virions liés au CDF

Une erreur toutes les 5x103 bases, soit environ deux erreurs par réplication du génome.

La probabilité de mutation, une base donnée à une position donnée, est (2 x 10-4) / 4 = 5 x 10-5

Soit P ~ 104 / jour

La réplication Le taux d’erreur(estimation grossière)


Notion de barrière génétique

M184V M ATGV GTN

L10I, M36I, M46I/M, A71V/A

Faible barrière Forte barrière


Evolution des quasi-espèces

AR ar ar AR


Quelques règles virologiques d’usage des anti-rétroviraux

Préférer utiliser une combinaison de molécules agissant sur des cibles différentes.

Sur la même cible, éviter, jusqu’à preuve du contraire, d’utiliser des molécules très proches susceptibles d’avoir les mêmes voies métaboliques et d’entrer en compétition sur leur cible.

Empêcher le virus d’essayer des solutions d’échappement aux anti-rétroviraux; bloquer totalement la réplication virale. Taper fort et bien.

« Once considered an inevitable consequence of HIV treatment, drug resistance isdeclining. This decline supports the hypothesis that antiretroviral therapy can arrestreplication and prevent the evolution of resistance » J. Siliciano and R. Siliciano, 2013

Mais constat fait avant l’essor de la prophylaxie pré-exposition !!!


Constitution du réservoir


Les cellules de la réplication et de la latence

Production active de virus, durée de vie des cellules de 2-3 jours, R0 élevé.

Peu nombreuses (1/106

cellules). Provirus défectifs majoritaires

-Prolifération clonaleSilencieuse, pas d’expression virale(mécanismes multiples)

-Evidences cliniques


Les cellules de la réplication et de la latence

3-5 109 virus/jour

1 à 100 x106 LT CD4 infectés

1 LT CD4 infecte 20 LT CD4

10 à 100 x106 LT CD4 détruits/jour

5 à 50 x109 virions liés au CDF

Latence :

CDFT-CD4 quiescentsmacrophages

L’infection par le VIH est une infection active, génératrice de diversité, chronique et persistante avec latence et sauvegarde de l’information.


Participation cellulaire à la charge virale

NB. Les cellules infectées sont présentes dans les organes lymphoïdes mais aussi dans d’autres sites comme le SNC qui constituent des réservoirs de virus.


Les approches pour “HIV cure”

Attaquer le réservoir, les cellules de la latence:

Ø les approches “héroïques”, le patient de Berlin

Ø“Shock and kill”

Ø les approches type siRNA, CRISPR/Cas

Les approches pour “HBV cure”

Attaquer le réservoir, les cellules de la latence:

Ø les approches immunologiques

Ø les approches sur les récepteurs nucléaires, le contrôle épigénétique

Ø les approches type siRNA, CRISPR/Cas


2,9% de virus X4

Le patient de Berlin


Shock and kill: principe


Le contrôle de la transfection

-Histone déacétylase inhibiteurs(HDACi), PKC et MAPK agonistes, BETi, DNA-méthylation- vorinostat, romidepsin, panobinostat…

Mais effets secondaires sur les cellules T et leurs fonctionsimmunitaires


DART (dual-affinity re-targeting) protein

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