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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE FARMACIADepartamento de Parasitologa
LEISHMANIOSIS VISCERAL EN EL CRICETO
DORADO: VALORACION DE NUEVAS
FORMULACIONES DE ANFOTERICINA B
MEMORIA PRESENTADA PARA OPTAR AL GRADO DE
DOCTOR POR
Sara Rama iguez
Bajo la direccin del Doctor:
Francisco Bols Fernndez
Madrid, 2004
ISBN: 84-669-2518-X
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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA
LEISHMANIOSIS VISCERAL EN EL CRICETO DORADO:
VALORACION DE NUEVAS FORMULACIONES DE
ANFOTERICINA B
TESIS DOCTORAL
SARA RAMA IIGUEZ Madrid, 2004
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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA
LEISHMANIOSIS VISCERAL EN EL CRICETO DORADO:
VALORACION DE NUEVAS FORMULACIONES DE
ANFOTERICINA B
Memoria presentada por Sara Rama Iiguezpara optar al grado de
Doctor
Director: D. Francisco Bols Fernndez
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D. FRANCISCO BOLAS FERNANDEZ, PROFESOR TITULAR DE UNIVERSIDAD
DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA DE LA FACULTAD DE FARMACIA DE LA
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID,
CERTIFICA:
Que el presente trabajo de investigacin titulado: Leishmaniosis
visceral en el criceto dorado: valoracin de nuevas formulaciones de
anfotericina B,presentado por la Licenciada en Farmacia, Sara Rama
Iiguez, ha sido realizado bajo su direccin, en el Departamento de
Parasitologa de la Facultad de Farmacia de la Universidad
Complutense de Madrid, cumpliendo los requisitos exigidos para su
presentacin y defensa como Tesis Doctoral.
VB El Director del Departamento Madrid, de de 2004
Prof. Antonio R. Martnez Fernndez Prof. Francisco Bols
Fernndez
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A mis padres A Tito
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AGRADECIMIENTOS:
En primer lugar quisiera expresar mi ms sincero agradecimiento
al Prof. Francisco Bols Fernndez, director de esta Tesis Doctoral,
por haberme permitido formar parte de su equipo de investigacin
ofrecindome la posibilidad de desarrollar este trabajo, por sus
consejos, su ayuda y su paciencia sobre todo en la ultima etapa de
la parte experimental de la Tesis.
Tambin quiero darle las gracias al Prof. Antonio Ramn Martnez
Fernndez, Catedrtico de Parasitologa y Director de este
Departamento, por haberme facilitado sus instalaciones y equipos y
por su continuo respaldo.
A la Dra. M Auxiliadora Dea Ayuela porque sin su ayuda esta
Tesis no habra sido posible. La verdad es que podra llenar muchas
hojas agradecindole a Maruxi todo lo que ha hecho por m, pero
desafortunadamente tengo que ser breve. Quisiera destacar su tesn y
su empeo en que las cosas salgan adelante y aunque me ha hecho
trabajar a un ritmo muy fuerte durante estos aos, los frutos de
tanto esfuerzo estn aqu en forma de Tesis. Ella me ha ayudado mucho
a nivel profesional y personal y siempre ha estado ah en los
momentos buenos y no tan buenos, sin importarle trabajar cualquier
da del ao y a cualquier hora.
Al Prof. Juan Jos Torrado Durn y al Dr. Jos Antonio Snchez
Brunete, colaboradores del Departamento de Farmacia Galnica y
Tecnologa Farmacutica de esta Facultad, por su ayuda y consejos y
porque sin sus formulaciones galnicas esta Tesis tampoco habra sido
posible.
Al Prof. Jos Mara Alunda, Catedrtico del Departamento de
Patologa Animal I de la Facultad de Veterinaria de la Universidad
Complutense de Madrid, por confiar en nosotros, por sus consejos
cientficos y por conseguir la financiacin necesaria para la
realizacin de los proyectos de investigacin.
A todos los Profesores del Departamento de Parasitologa: Carmen
Cullar, Mercedes Martnez, Paco Ponce, Carmen Cuesta, Alicia Gmez,
Catalina Castao, Angel Snchez, Jos Luis Zapatero, Jos Antonio
Escario y Jos Luis Guilln por sus consejos y ayuda.
A mis compaer@s durante todos estos aos: Marta, Sonia, Gonzalo,
Chus, Patricia, Ana, Susana, Juan Jos Nogal, Sara Bejarano, David,
Carlos, Flery, Miriam, Celeste, Matthew, Sergio, Sara Palacios,
Carlota, Juan Jos Garca, Kennedy y Carolina por haberme ofrecido su
apoyo y ayuda siempre, y por las risas compartidas.
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A Javier, Ins, Piedad, Antonio y Judith porque ellos contribuyen
al da a da del departamento, en especial a Javier por estar siempre
ah para escucharme.
A los compaer@s del Departamento de Patologa Animal I de la
Facultad de Veterinaria: M Teresa, Susana, Fran, Salceda,
Francisco, Nacho, Israel, Lara, Pablo y lvaro por su
colaboracin.
A los Dres. Jos Mara Requena y Carlos Alonso de la Universidad
Autnoma de Madrid por proporcionarnos la cepa de Leishmania
infantum con la que se ha realizado esta tesis.
A la Profa. Joaquina Martn Snchez de la Faculta de Farmacia de
la Universidad de Granada por compartir con nosotros sus
conocimientos sobre PCR-ELISA y por su gran amabilidad.
A la Dra. Ana Canals, Directora del CISA, por permitirnos
utilizar sus aparatos e instalaciones para los ensayos de
linfoproliferacin in vitro.
A los compaer@s del Departamento de Microbiologa II de esta
Facultad: Ada, Marta, Isabel, Vctor, Carmina, Jos, Maria Molina y
Concha Gil, por su ayuda sobre todo en los estudios de Biologa
Molecular.
A todas aquellas personas que han contribuido directa o
indirectamente a la realizacin de este trabajo, en especial al
personal de los Centros de Ayuda a la Investigacin, por sus
consejos cientficos.
A mi familia y amig@s, sobre todo a mis padres por creer siempre
en mi, apoyarme en mis decisiones y animarme a continuar mi
formacin.
A Tito, por escucharme siempre que lo necesito, por darme nimos,
por su paciencia y sobre todo por su cario.
Por ltimo, aunque no menos importante, a todos los animales que
han perdido la vida en beneficio de este trabajo.
* Esta Tesis Doctoral la he realizado becada por el Ministerio
de Educacin Cultura y Deporte (Beca de Formacin de Profesorado
Universitario: FPU). * Este trabajo ha sido financiado por los
siguientes proyectos de investigacin: AGF 98-0731, AGL
2001-1295-C03-01, AGL 2002-02175GAN (M.C.Y.T, Direccin General de
Investigacin).
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INDICE.
Abreviaturas
Introduccin
Revisin Bibliogrfica
1. Introduccin
1.1. Filogenia y clasificacin taxonmica
1.2. Morfologa
1.3. Ciclo biolgico
1.4. Diversidad clnica
2. Respuesta inmune
2.1. Generalidades
2.2. Modelos experimentales y respuesta inmune
2.2.1. Modelos in vitro
2.2.2. Modelos in vivo
2.2.2.1. Modelo murino
2.2.2.1.1. Modelo murino de leishmaniosis cutnea
2.2.2.1.2. Modelo murino de leishmaniosis visceral
2.2.2.2. Modelo en criceto
2.2.2.3. Modelo canino
3. Anfotericina B y sus formulaciones
3.1. Eficacia de la anfotericina B
3.1.1. Eficacia en humanos
3.1.2. Eficacia en perros
3.1.3. Eficacia en ratones
3.1.4. Eficacia en cricetos
3.2. Toxicidad
3.3. Farmacocintica
3.4. Efecto inmunomodulador
Objetivos
Material y Mtodos
1. Animales de experimentacin
2. Cepas de Leishmania
3. Cultivo y recuento de promastigotes para infeccin
4. Infecciones experimentales
5. Principio activo y polmeros empleados en las distintas
formulaciones
galnicas ensayadas
6. Reactivos generales
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7. Reactivos para ELISA
8. Reactivos para Electroforesis de protenas
9. Reactivos para Western-blot
10. Reactivos para Citometra de flujo
11. Reactivos para la determinacin de inmunocomplejos en rin
12. Reactivos para PCR
13. Medios de cultivo
14. Pesos de los animales y de los rganos
15. Obtencin de amastigotes de tejidos y transformacin a
promastigotes
16. Determinacin de la carga parasitaria en bazo e hgado
17. Obtencin del antgeno (extracto bruto salino)
18. Valoracin de protenas por el mtodo Bradford
19. Obtencin de sueros
20. Determinacin de los niveles de anticuerpos
21. Electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida con
Dodecil Sulfato
Sdico (SD-PAGE)
22. Deteccin de antgenos por Western-blot
23. Obtencin de linfocitos esplnicos
24. Determinacin de subpoblaciones linfocitarias mediante
Citometra de flujo
25. Ensayos de Linfoproliferacin in vitro
26. Determinacin de inmuncomplejos en rin de criceto
27. Determinacin de la expresin de citoquinas en linfocitos
esplnicos de
criceto mediante una RT-PCR cuantitativa a tiempo real
28. Determinacin de la carga parasitaria en bazo e hgado de
criceto mediante
una PCR cuantitativa a tiempo real
29. Determinacin de los niveles de transaminasas en suero
30. Ensayos de toxicidad agua
31. Anlisis estadstico
Resultados
1. Eleccin del modelo experimental y de la dosis de infeccin
1.1. Modelo experimental en criceto dorado
1.2. Modelo experimental en ratones Balb/c
2. Tratamiento en la fase temprana (asintomtica) de la infeccin,
con
anfotericina B libre y formulada en microesferas de HSA, a la
dosis de 1
mg/Kg/da
2.1. Resultados a da 32 p.i.
2.2. Resultados a da 135 p.i.
2.3. Efecto de las microesferas de HSA vacias
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3. Tratamiento en el periodo sintomtico con anfotericina B
formulada en HSA, a
la dosis de 2 mg/Kg/da. Estudio de los estados de agregacin
4. Estudios de toxicidad aguda
5. Tratamiento en el periodo sintomtico con anfotericina B
poliagregada
formulada en HSA, a la dosis de 40 mg/Kg/da
6. Tratamiento en el periodo sintomtico con anfotericina B
poliagregada libre y
formulada en HSA, a las dosis de 10 y 20 mg/Kg/da
7. Efecto de la anfotericina B poliagregada formulada en HSA,
sobre la poblacin
CD4+ esplnica en cricetos sanos
8. Tratamiento en el periodo sintomtico con anfotericina B
poliagregada,
formulada en Acido Polilctico-co-Gliclico. Comparacin con
Fungizona
9. Puesta a punto de una tcnica de PCR cuantitativa a tiempo
real para la
determinacin de citoquinas y carga parasitaria en criceto
9.1. Determinacin de citoquinas
9.1.1. Medida de la expresin de citoquinas en linfocitos
esplnicos,
correspondiente a la puesta a punto del modelo experimental
en
criceto
9.1.2. Medida de la expresin de citoquinas en linfocitos
esplnicos de
cricetos infectados y tratados con la anfotericina B
9.1.3. Medida de la expresin de citoquinas en linfocitos
esplnicos de
cricetos no infectados y tratados con anfotericina B
9.2. Determinacin de la carga parasitaria en bazo e hgado
Discusin
1. Modelo de leishmaniosis visceral en ratones Balb/c
2. Modelo de leishmaniosis visceral en cricetos
3. Efecto del tratamiento sobre la carga parasitaria: eficacia
de las nuevas
formulaciones
4. Efecto del tratamiento sobre la respuesta inmune
4.1. Respuesta inmune humoral
4.2. Respuesta inmune celular
5. PCR cuantitativa a tiempo real
Conclusiones
Bibliografa
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143
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171
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241
243
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AAbbrreevviiaattuurraass
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Abreviaturas
ABREVIATURAS.
BSA: Bovine Seric Albumin (Albmina Srica Bovina) CS: Control
Sano Ct: Ciclo de amplificacin en PCR cuantitativa D.O.: Densidad
ptica DNP: Dinitrofenilhidrazina EDTA: Acido
Etilendiaminotetractico ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
GOT: Glutmico-Oxalactico-Transaminasa GPT:
Glutmico-Pirvico-Transaminasa HPRT: Hipoxantina
fosforribosiltransferasa HRPO: Horse Radish PeroxidaseHSA: Human
Seric Albumin (Albmina Srica Humana) IE: ndice de Estimulacin OPD:
O-fenileno-diamina PAGE: Polyacrylamide Gel Electrophoresis PBS:
Phosphate Buffered Saline PCR: Polymerase Chain Reaction PE:
Ficoeritrina PLGA: Polilactic-co-Glicolic Acid (Acido
Polilctico-co-Gliclico) RT: Retro-Transcripcin SBF: Suero Bovino
Fetal SDS: Sodium Dodecyl Sulphate TAE: Tampn Tris-Actico TCR:
Receptor de clulas T TEMED: N,N,N,N-Tetrametil-Etilendiamina
1
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IInnttrroodduucccciinn
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Introduccin
INTRODUCCION.
Para la especie humana, sus microorganismos patgenos y dems
parsitos forman parte inseparable de su historia. Desde tiempo
inmemorial, el curso de la humanidad se ha visto influido y hasta
modificado por epidemias de enfermedadesinfecciosas. Algunas de
estas enfermedades todava hoy representan una grave amenaza.
Pobreza, desnutricin, malas o pobres condiciones higinicas, el
aumento de la urbanizacin, las migraciones, los movimientos
sociales, las guerras, los millonesde refugiados, etc, son causas o
factores que explican, no solo el aumento de ciertas enfermedades
infecciosas, sino tambin su resurgir. Protozoos parsitos de gran
importancia mdica son los causantes de malaria, tripanosomiosis,
leishmaniosis,amebiosis, toxoplasmosis y giardiosis.
Una de estas enfermedades, la leishmaniosis, origina importantes
problemas de salud pblica y los esfuerzos que se estn haciendo para
combatirla son aninsuficientes. Alrededor de 12 millones de
personas sufren leishmaniosis en todo el mundo, amenazando a 350
millones de mujeres, hombres y nios en 88 pases del mundo, 72 de
los cuales se encuentran en vas de desarrollo
(http://www.who.int/tdr/diseases/leish/direction.htm). La amplia
diversidad tanto de lasformas clnicas de dichas enfermedades, como
de las situaciones epidemiolgicas, obliga a aplicar en cada foco
principios y mtodos de lucha especficos. Adems, lalucha contra las
leishmaniosis suele estar obstaculizada por la ignorancia de
laverdadera prevalencia de estas enfermedades y por la subestimacin
de lossufrimientos e incapacidades que causan. Existe una gran
preocupacin ante lacreciente propagacin de las leishmaniosis en el
mundo. El kala-azar, si no se trata, tiene una tasa de mortalidad
elevada. Las formas mucocutneas del Nuevo Mundoson mutilantes y
difciles de tratar, mientras que el desfiguramiento producido por
las formas cutneas tiene un impacto psicolgico permanente. Conviene
hacer especial hincapi en el riesgo que estas enfermedades
presentan para la salud de los nios, yaque este grupo de edad es ms
vulnerable y en l son ms probables los fallos en eldiagnstico.
Desde hace 10 aos las regiones endmicas se han extendido y ha
habido un incremento marcado en el nmero de casos registrados. Esto
est relacionado con eldesarrollo econmico y con cambios ambientales
y de comportamiento que
3
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Introduccin
incrementan la exposicin a los vectores, como por ejemplo nuevos
asentamientos, intrusin en bosques primarios, deforestacin,
migracin masiva de zonas rurales azonas urbanas, urbanizacin rpida,
nuevos esquemas de irrigacin, etc. Confrecuencia creciente se
registran casos de turistas que visitan zonas endmicas y regresan a
sus pases infectados. Entre la poblacin de la zona endmica, el
riesgopermanente de epidemia alimenta un miedo constante. Ms
recientemente, la superposicin de leishmaniosis visceral y SIDA ha
desembocado en una nueva entidad re-emergente: la co-infeccin
Leishmania/VIH. En Europa, donde entre el 25% y el 70% de los casos
adultos de leishmaniosis visceral estn relacionados con el VIH, los
drogadictos por va intravenosa han sido identificados como la mayor
poblacin deriesgo. Factores de riesgo individual como la
malnutricin y la inmunosupresin juegantambin un papel muy
importante en el desarrollo de la enfermedad
(http://www.who.int/tdr/diseases/leish/direction.htm).
En la infeccin parasitaria, al igual que en la viral o en la
bacteriana, el organismo utiliza sus mecanismos de defensa para
impedir tanto el establecimientocomo la multiplicacin de los
parsitos, y trata de eliminarlos del cuerpo. A su vez, los parsitos
evolucionan tambin, procurando escapar de estas defensas,
sobrevivir y multiplicarse en el organismo que los hospeda. La
investigacin en leishmaniosis, apesar de experimentar un incremento
lento pero sostenido durante los aosposteriores a la Segunda Guerra
Mundial, sufri de una ausencia de reconocimiento ypor lo tanto de
financiacin. Pero afortunadamente, en los ltimos 30 aos el nmero de
investigaciones y publicaciones en todos los aspectos de Leishmania
y lasleishmaniosis han ido creciendo exponencialmente.
En la cuenca mediterrnea la enfermedad es producida por la
especieLeishmania infantum. Si bien en el hombre, la infeccin tiene
un carcter oportunista, emergiendo en aquellos casos de severa
inmunodepresin, en el perro la enfermedadse manifiesta de forma
mucho ms agresiva, planteando un serio problema de salud pblica
Se calcula que unos 250.000 perros podran esta infectados en
Espaa, de ellos unos 15.000 se ubican en la Comunidad de Madrid, lo
que supondra alrededordel 5,5% del censo canino. Esta cifra se
incrementa hasta 9,1%-11,1% en las encuestas de seroprevalencia en
perros vagabundos, llegando hasta el 30% en
4
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Introduccin
muestras de clnicas veterinarias, segn datos de la Comunidad de
Madrid a travs delPrograma de Vigilancia y Control de la
leishmaniosis.
Las terapias comnmente empleadas consiguen mejoras clnicas
temporales y cambios en los parmetros inmunolgicos. Sin embargo, el
tratamiento normalmenteno impide las recidivas, ni elimina al
parsito totalmente. Debido a la inexistencia deuna terapia efectiva
para la leishmaniosis canina, nuevos frmacos, sistemas de liberacin
y estrategias de tratamiento son necesarias para conseguir una cura
parasitolgica consistente en perros. Por ello, sin abandonar otras
estrategias decontrol, tales como el diseo de vacunas y la lucha
contra los vectores, es necesario continuar en la bsqueda de nuevos
sistemas teraputicos que garanticen una curacin total y minimicen
los efectos secundarios.
Los perros consituyen un excelente modelo para estudiar la
leishmaniosis yaque actan como pacientes, dianas para el control y
un buen modelo para la leishmaniosis humana porque los sntomas en
el perro son similares a los desarrollados en humanos (Peters y
Killick-Kendrick, 1987). Sin embargo, la dificultad para manejarlos
hace a este modelo inapropiado para estudios en los que se
requieragran nmero de animales, por ejemplo durante los test de
proteccin.
Por todo ello, en el presente trabajo hemos empleado el criceto
dorado comomodelo de leishmaniosis visceral para la bsqueda de
nuevos sistemas teraputicos frente a esta enfermedad, ya que los
parmetros clnicos e histopatolgicosobservados en dicho modelo son
altamente coincidentes con los encontrados en el perro (Pearson y
Queiroz-Sousa, 1996; Nieto y cols., 1999; Requena y cols.,
2000).
5
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RReevviissiinn BBiibblliiooggrrffiiccaa
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Revisin bibliogrfica
REVISION BIBLIOGRAFICA.
1. INTRODUCCION.
En 1903, William Boog Leishman y Charles Donovan, por
separado,describieron al protozoo ahora denominado Leishmania
donovani, en tejido esplnico de pacientes de la India con fiebre
Dum-Dum o Kala-azar (Leishman, 1903; Donovan,1903), enfermedad
ahora denominada leishmaniosis visceral. Al mismo tiempo, Ronald
Ross describi con ms detalle, con el nombre de cuerpos de
Leishman-Donovan, los amastigotes del protozoo Leishmania (Ross,
1903).
Con el paso del tiempo se fue comprobando que algunas
enfermedades existentes en otras reas de diferentes continentes, se
correspondan con la leishmaniosis. Por ejemplo, los autores de la
poca no tardaron en diferenciar elagente infeccioso responsable del
Kala-azar en la India, L. donovani, del agente causal del Kala-azar
infantil en el Mediterrneo, L. infantum (Nicolle, 1908).
Un siglo despus, muchas caractersticas de las leishmaniosis y
sus principalessndromes (visceral, cutnea y mucosa) han permanecido
igual, pero otras han cambiado. Como antes, la epidemiologa de esta
enfermedad ocurre peridicamenteen India y otras zonas del mundo,
pero las leishmaniosis han emergido en nuevas regiones, por ejemplo
como infecciones oportunistas asociadas al SIDA. El
diagnsticotodava se basa en mtodos clsicos microbiolgicos, aunque
se estn introduciendo ya tcnicas moleculares. Los antimoniales
pentavalentes han sido la principal terapia antileishmanisica
durante medio siglo, pero las formulaciones lipdicas de
anfotericinaB (aunque muy caras y de administracin parenteral)
representan el mayor avancepara tratar la leishmaniosis visceral.
Son necesarios avances tecnolgicos en lacomprensin de la respuesta
inmune frente a Leishmania y la patognesis de la leishmaniosis para
poder encontrar buenos mtodos de diagnstico, tratamiento y
prevencin de esta enfermedad (Herwaldt, 1999).
La leishmaniosis es una enfermedad causada por un protozoo
intracelularobligado que se transmite mediante un vector y se
caracteriza por una gran diversidady complejidad. La leishmaniosis
es endmica de reas tropicales, subtropicales y del
7
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Revisin bibliogrfica
sur de Europa, en zonas que van desde los bosques americanos
hasta desiertos en el oeste asitico y, desde zonas rurales a zonas
periurbanas (Desjeux, 1996).
Distribucin de la leishmaniosis en el mundo (Handman, 2001).
Varios sndromes clnicos se engloban bajo el termino
leishmaniosis: leishmaniosis visceral, cutnea y mucocutnea, que
resultan de la replicacin del parsito en el sistema fagoctico
mononuclear a nivel visceral, de la mucosa drmica yde la mucosa
nasoorofarngea, respectivamente. Estos sndromes son causados porun
total de 21 especies de Leishmania que son transmitidas por unas 30
especies de vectores de mosquitos flebtomos (Shaw, 1994; Desjeux,
1996; Ashford, 1997).
Con algunas excepciones (la leishmaniosis visceral en la India y
la leishmaniosis cutnea causada por L. tropica), la especie humana
es un hospedador accidental de la infeccin y, otros mamferos, como
roedores o cnidos, son hospedadores reservorios. Sin embargo, la
especificidad se encuentra a travs de ladiversidad ya que especies
particulares de parsito, vector y hospedador mantienen elciclo de
transmisin en una determinada zona ecolgica (Ashford, 1996).
1.1. Filogenia y Taxonoma.
Leishmania es un protozoo flagelado que posee una nica
mitocondriaasociada al kinetoplasto, tpico del Orden
Kinetoplastida. Este Orden tambin incluye a
8
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Revisin bibliogrfica
los tripanosomas que dan nombre a la Familia Trypanosomatidae a
la que pertenecenlos protozoos del Gnero Leishmania. El Gnero
Leishmania, a su vez, se divide en dos Subgneros en funcin de en qu
lugar del tracto digestivo del vector semultiplique (OMS, 1990). De
este modo, las especies de Leishmania, se pueden clasificar en
Hipo-, Peri- y Suprapilaria.
Las Hipopilaria son las ms antiguas desde el punto de vista
evolutivo,constituyen Sauroleishmania spp. y no son patgenas
(Lainson y Shaw, 1987). LasPeripilaria aparecen despus en la escala
filogentica, estn agrupadas en el Subgnero Viannia y se encuentran
todas en el Nuevo Mundo, parasitando a mamferos como los perezosos
y los osos hormigueros. Las Suprapilaria, como sunombre indica, se
multiplican en las porciones suprapilricas (cerca de la probscide
del vector) y parasitan a mamferos, entre ellos el hombre, siendo
las ms cercanas enla escala evolutiva y constituyendo el Subgnero
Leishmania.
Dentro del Subgnero Viannia se incluyen las siguientes especies:
L.braziliensis, L. peruviana, L. guyanensis, L. panamensis, L.
shawi, L. lainsoni, L. naiffi, L. colombiensis y L. equatorensis.
Dentro del Subgnero Leishmania se incluyen las siguientes especies:
L. donovani, L. archibaldi, L. infantum (syn. L. chagasi), L.
tropica, L. killicki, L. major, L. gerbilli, L. arabica, L.
mexicana (syn. L. pifanoi), L. amazonensis(syn L. garnhami), L.
aristidesi, L. enrietti, L. hertigi, L. deanei, L. turanica y L.
venezuelensis (Alvar, 2001).
Debido a las pocas diferencias morfolgicas entre los diversos
miembros delgnero Leishmania, la clasificacin taxonmica est basada
en la enfermedad clnica producida, las caractersticas biolgicas,
geogrficas y epidemiolgicas. Donde existenmayores discrepancias es
en la caracterizacin como especie o subespecie, es decir,en el
empleo de trminos binmicos o trinmicos. Desde hace muchos aos se
han intentado hallar los caracteres taxonmicos ms idneos y los
estudios del parsitohan facilitado una comprensin ms bsica.
Ejemplos de este enfoque son losprimeros estudios serolgicos, la
determinacin de serotipos por el factor de excrecin y la
caracterizacin biolgica en cultivos, flebtomos y cricetos. Ms tiles
han sido losmtodos de biologa molecular con el fin de descubrir las
caractersticas intrnsecasdel parsito que no se modifican por
factores ambientales o propios del hospedador.
9
-
Revisin bibliogrfica
Algunos de estos mtodos han puesto de relieve dichas
caractersticas, que se utilizan ahora para distinguir las especies
o subespecies reconocidas (OMS, 1984).
Entre los mtodos bioqumicos fenotpicos ms utilizados encontramos
la caracterizacin mediante isoenzimas y los anticuerpos
monoclonales. Entre los genotpicos est el polimorfismo en el tamao
de los fragmentos de restriccin (RFLP),la hibridacin con sondas del
ADNk del kinetoplasto, la hibridacin con sondas de ADNgenmico (in
situ, en manchas, por contacto o por aplastamiento) y la reaccin
encadena de la polimerasa (PCR) y sus variantes: RAPD y PCR-RFLP
(Alvar, 2001).
La posicin taxonmica de L. infantum segn Cavalier Smith (1998)
es la siguiente:
IMPERIO O SUPER-REINO EUKARIOTA Dougherty, 1957REINO PROTOZOA
Goldfuss, 1818
SUBREINO NEOZOA Cavalier Smith, 1997 INFRA-REINO DISCICRISTATA
Cavalier Smith, 1998
PHYLUM EUGLENOZOA Cavalier Smith, 1981 SUBPHYLUM SACOSTOMA
Cavalier Smith, 1998
CLASE KINETOPLASTA Cavalier Smith, 1998 SUBORDEN TRYPANOSOMATINA
Kent, 1880
FAMILIA TRYPANOSOMATIDAE Doflein, 1901 GENERO Leishmania Ross,
1903
SUBGENERO Leishmania Safjanova, 1982 ESPECIE Leishmania infantum
Nicolle, 1908
1.2. Morfologa.
Los amastigotes (del griego mastigos: ltigo) de Leishmania de
varias especies encontradas en mamferos son aparentemente idnticos,
pero se ha demostrado que el tamao de esta forma vara entre
distintas especies (Gardener, 1975; Scorza y cols., 1979).
En improntas teidas con Giemsa, los amastigotes aparecen como
cuerposredondos u ovales dentro de una clula hospedadora o, ms
frecuentemente, libresdebido a la rotura celular producida al
realizar la impronta. El ncleo del parsito ocupa
10
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Revisin bibliogrfica
una posicin central en la clula y el kinetoplasto aparece
adyacente a l. El ncleo es redondo u oval. El kinetoplasto, que se
tie ms densamente que el ncleo, tambin vara en su forma, siendo
redondo, oval, con forma de vara o curvado en perfil.Aunque la
microscopia electrnica revela la presencia de un flagelo saliendo
delreservorio de los amastigotes, la microscopia ptica raramente
muestra este organelo(Peters y Killick-Kendrick, 1987).
Amastigotes en impronta de mdula sea (Rondanelli y Scaglia,
1993).
El promastigote es la forma tpica de Leishmania encontrada en el
intestino medio del vector. Killick-Kendrick y cols. (1974)
observaron que en algunas especiesde Leishmania existen dos formas
de promastigotes en el intestino. Por un ladoexistan largos
promastigotes nectomona, la mayora de los cuales estabanenganchados
a la pared del intestino por un flagelo tpicamente largo y sin
modificar,emergiendo anteriormente. Estas formas tienen un
kinetoplasto tpico y el ncleo est en el centro del cuerpo del
parsito. El otro tipo de promastigotes descritos en el vectoreran
los haptomona, que son promastigotes cortos, gordos y ms brillantes
que seadhieren a la cutcula de la vlvula estomacal por un flagelo
modificado.
Promastigotes formando una roseta (Rondanelli y Scaglia,
1993).
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Revisin bibliogrfica
Aproximadamente 10 das despus de entrar en el insecto, el
promastigotepierde la adherencia, el flagelo entonces se vuelve muy
largo y el cuerpo fino y corto.Este tipo de promastigote recupera
la infectividad, aunque deja de multiplicarse y se encuentra
libremente en la hipofaringe, es lo que se denomina el
promastigotemetacclico que ser posteriormente inoculado por el
insecto en el hospedador (Sacks y Perkins, 1984).
Dentro del hospedador el promastigote contiene el kinetoplasto
paralelo alncleo, el cuerpo se vuelve oval, la bolsa flagelar se
hace muy profunda y el flagelo se empieza a acortar, esta forma se
denomina paramastigote (Killick-Kendrick, 1979).
1.3. Ciclo Biolgico.
Leishmania se caracteriza por poseer un ciclo biolgico indirecto
en el queintervienen un hospedador invertebrado o mosquito flebtomo
y un hospedador vertebrado de sangre caliente. Numerosas especies
de mosquitos del gnero Lutzomyia en Amrica y del gnero Phlebotomus
(Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) en el Viejo Mundo son los
vectores de Leishmania. En el caso de L.infantum, los vectores son
varias especies de dpteros del gnero Phlebotomus y loshospedadores
vertebrados son fundamentalmente el perro y el hombre, adems
deotras especies como el zorro, la rata y otros posibles
reservorios silvestresespordicos (Botet y Ports, 1993).
Mosquito flebtomo (Rondanelli y Scaglia, 1993).
Todas las especies de Leishmania habitan en las clulas del
retculo endotelial del hospedador vertebrado y en el intestino del
mosquito flebtomo. Los amastigotesson ingeridos con la sangre
cuando el mosquito pica al hospedador vertebrado, instaurndose en
el intestino del mosquito. Muy pronto se transforman en
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Revisin bibliogrfica
promastigotes, que continan multiplicndose muy rpidamente. Tres
das despus dela picadura, el mosquito defeca los remanentes de la
sangre y en este punto todos los parsitos que no se han adherido
son eliminados. Los parsitos que han sobrevividose adhieren por el
flagelo a las microvellosidaes del intestino o a la vlvula pilrica.
Encualquier caso, despus de la defecacin, los parsitos adheridos
son liberados y sedividen rpidamente de nuevo, adhirindose
eventualmente a la vlvula cardias.Algunos parsitos se empiezan a
diferenciar en formas metacclicas, que no son adherentes y se
mueven muy rpidamente. La transmisin depende de la inyeccin deestas
formas metacclicas en una nueva picadura (Ashford, 2000).
Cuando el promastigote alcanza los capilares cutneos del nuevo
hospedadorvertebrado, se produce su fagocitosis por el macrfago en
una vacuola parasitforapara tratar de eliminarlo, mientras que las
leishmanias se transforman en amastigotes que se multiplican por
fisin binaria en el interior de dicha vacuola. Los amastigotesson
capaces de destruir al macrfago quedando libres y entonces pueden
ser fagocitados por otros macrfagos y mantener as la infeccin
(Russell y Talamas-Rohana, 1989).
La conveniencia o conformidad del hospedador para el
mantenimiento de laspoblaciones de Leishmania depende de muchos
factores, los ms importantes son: la densidad de poblacin del
hospedador, la duracin de la infeccin (y longevidad delhospedador),
la localizacin del parsito en el hospedador y el estado
inmunolgicodel mismo despus de la cura (Ashford, 2000).
La transmisin puede verse afectada tambin por la naturaleza de
laspicaduras efectuadas por el mosquito (Schlein y Jacobson, 1994)
y por la respuesta del hospedador a los antgenos de la saliva del
mosquito. La transmisin, ademspuede ser realizada por la inoculacin
de material infectado de una persona a otra. Porejemplo, hay
evidencias de que muchas de la leishmaniosis viscerales asociadas a
lainfeccin por VIH en el sur de Europa son transmitidas por el uso
de jeringuillas compartidas entre drogadictos (Alvar y cols., 1997;
OMS, 2000; Cruz y cols., 2002). La transmisin por contacto sexual y
por transfusin sangunea es pequea o pocosignificativa.
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Amastigote intracelular
Amastigotes
Promastigotesprocclicos
Promastigotesmetacclicos
Macrfago
Fagolisosoma
Amastigote intracelular
Amastigotes
Promastigotesprocclicos
Promastigotesmetacclicos
Macrfago
Fagolisosoma
Proliferacin
Lisis
Re-invasin
PicaduraPicadura
Proliferacin en el intestino
Adhesin
Internalizacin
Proliferacin
Lisis
Re-invasinRe-invasin
PicaduraPicadura
Proliferacin en el intestino
Adhesin
Internalizacin
Esquema del ciclo biolgico de Leishmania.
1.4. Diversidad Clnica (Ashford, 2000; Alvar, 2001).
Una de las caracateristicas ms notables de las leishmaniosis es
la diversidadde enfermedades causada por agentes morfolgicamente
similares. La diversidad no est totalmente explicada por la
diversidad gentica de los parsitos. Adems, estgenerada en parte por
la variedad en la respuesta del hospedador a la infeccin y en parte
por la restriccin de los parsitos a partes u rganos especficos del
cuerpo. Enexperimentacin animal se ha visto que la gentica tiene un
gran efecto en larespuesta del hospedador a la infeccin. Hay
evidencias considerables de que el parsito ms virulento de
Leishmania puede causar enfermedades no detectables en ciertos
individuos.
Las principales variedades clnicas de las leishmaniosis en
humanos son las siguientes:
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Revisin bibliogrfica
x Leishmaniosis cutnea, causada por L. tropica, L. major, L.
aethiopica, L. mexicana, L. amazonensis, L. panamensis, L.
guyanensis, L. peruviana o L.braziliensis, pero puede ser causada
por cualquiera de las especies de Leishmaniaque infectan al hombre.
Se caracteriza por una lesin cutnea simple, o leishmanioma,en el
sitio de la picadura del mosquito. Normalmente se cura sola,
acontece como un problema trivial y no hay manifestaciones
sistmicas.
x Leishmaniosis cutnea difusa, causada por L. aethiopica o
L.amazonensis. Los parsitos estn restringidos a la piel pero se
distribuyen por toda la superficie formando placas o ndulos. No hay
respuesta humoral ni celular, es difcilde tratar y puede durar el
resto de la vida del paciente.
Leishmaniosis cutnea (Rondanelli y Scaglia, 1993).
x
x
Leishmaniosis mucocutnea, causada normalmente por L.
braziliensis,despus de la cura de una leishmaniosis cutnea inicial.
Despus de meses o aos deuna lesin cutnea, los parsitos se
metastatizan por va linftica hacia laoronasofaringe. Se forman
lesiones nodulares que evolucionan a lceras. Al final se perfora el
tabique y se produce una deformacin de la nariz llamada nariz de
tapir. Otra veces la lesin mucosa empieza en el paladar blando con
posterior destruccinde la vula. Otras lesiones pueden aparecer en
la epiglotis y producen disfonas.
Leishmaniosis visceral o Kala-azar (OMS, 1984; Alvar, 2001).
Puede ser ampliamente restringida a nios, causada por L. infantum,
o tener una pequea especificidad-edad, causada por L. donovani o L.
infantum. Tambin afecta a gente de todas las edades que sufren
enfermedades inmunosupresoras. En ambos casos, elcurso de la
enfermedad se sabe que est muy relacionado con el estado de salud
delpaciente en el momento de la infeccin y diversos estudios han
mostrado que lamalnutricin exacerba la infeccin por L.
infantum.
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Revisin bibliogrfica
La infeccin comienza en el sitio de la picadura apareciendo a
veces una lesin primaria o leishmanioma. Si se presenta, puede ser
simplemente una lesinautolimitante sin que se produzca enfermedad
visceral. La enfermedad visceral sedesarrolla tpicamente despus de
un periodo de incubacin variable y se acompaapor fiebre en grado
irregular y persistente. Una vez establecida la enfermedad, su
desarrollo puede ser bastante variable: los sntomas severos pueden
ser muy agudos con progresin rpida de enfermedad en dos semanas o
la progresin puede serinsidiosa, casi sin notarse, pasando
probablemente como un simple ataque de malaria hasta que los
sntomas abdominales se convierten en ms importantes. La
esplenomegalia es el signo ms notable; el bazo aparece muy
agrandado y su tamao se enfatiza al ir acompaado de caquexia. La
hepatomegalia es menos consistente y menos extrema, pero se
presenta normalmente en caso terminales. El cuadrohematolgico se
altera considerablemente con anemia y leucopenia, que son
loscambios ms significativos.
Nio afectado de leishmaniosis visceral (Alvar, 1997).
La leishmaniosis visceral se puede clasificar como endmica,
espordica oepidmica y las manifestaciones clnicas suelen diferir
segn se trate de una u otra delas tres situaciones. La endmica
afecta sobre a todo a nios y se desarrolla en la zona del
Mediterrneo, Asia sudoriental, China y Amrica Latina. La incidencia
es dosveces mayor en los hombres que en las mujeres. El periodo de
incubacin oscila entre10 das y ms de un ao. Los sntomas ms
frecuentes son fiebre, malestar, prdidade peso y anorexia; a veces
aparecen tos y diarrea. Los signos clnicos ms corrientes son
esplenomegalia indolora a la presin (el bazo es blando a diferencia
de otras esplenomegalias (bazo de leche)), hepatomegalia moderada
(el hgado tambin es blando y con el reborde marcado) y
linfadenopata, consuncin y palidez de las membranas mucosas. En la
India es frecuente el oscurecimiento de la piel de la cara, manos,
pies y abdomen (kala-azar: enfermedad negra). Existen signos de
malnutricin
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Revisin bibliogrfica
(edema y alteraciones de la piel y el cabello). A veces se
producen neumona,disentera o tuberculosis pulmonar
intercurrentes.
La leishmaniosis visceral espordica se da cuando las personas no
nativas de cualquier edad entran en una zona endmica y contraen la
enfermedad. La fiebre aparece entre tres semanas y dos aos despus
de la exposicin. La enfermedadpuede avanzar de forma aguda con
escalofros, fiebre alta ondulante, sudorabundante, perdida de peso
rpida y malestar profundo. A veces aparece anemiahemoltica aguda
grave, lesin renal aguda y hemorragia intensa de las mucosas. La
leishmaniosis visceral epidmica se puede presentar en todas las
edades, excepto losque hayan sido infectados en una epidemia
anterior. Se produce ms frecuentemente en los hombres que en las
mujeres en una proporcin de 4:3. Las formas agudas sonraras.
Tambin existe enfermedad subclnica ya que se cree que en algunos
pases(Italia, Kenya) los casos subclnicos superan a los casos
clnicos en una proporcin de5:1.
x Leishmaniosis drmica post-kala-azar (LDPK), est causada por
L.donovani, despus de la cura de una leishmaniosis visceral inicial
y es caractersticadel subcontinente indio, aunque se observa
ocasionalmente en frica oriental. No est asociada a la infeccin por
L. infantum. Se presenta ocasionalmente en pacientes sin historia
de enfermedad visceral, pero solo en lugares en los que L. donovani
es transmitida. A veces se desarrolla antes de que la infeccin
visceral se haya curado, pero su aparicin se puede retrasar hasta
dos aos. Es una enfermedad variable quepuede empezar como una
puncin, despigmentacin progresiva dando a la piel un aspecto de
moteado o puede ser notada al principio como unas discretas ppulas,
principalmente en superficies expuestas a la luz. Puede progresar
produciendo una superficie extensa de ppulas o discretos
ndulos.
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Revisin bibliogrfica
2. RESPUESTA INMUNE.
2.1. Generalidades.
Despus de la picadura, los amastigotes procedentes de macrfagos
del hospedador son liberados en el intestino del mosquito donde se
transforman en promastigotes procclicos que no son infectantes
(Sacks y Perkins, 1985). Estospromastigotes procclicos expresan en
su superficie grandes cantidades delipofosfoglicano (LPG) y de la
metaloproteasa gp63 (Davies y cols., 1990; Pimenta ycols.,
1991).
La activacin del complemento por el LPG es por la va clsica
dando lugar a la lisis de los promastigotes procclicos, pero no
metacclicos. Como resultado, compuestos del complejo de ataque a la
membrana C5-C9 son liberados de lasuperficie del promastigote
metacclico (Puentas y cols., 1991). La gp63 tambin inhibe la lisis
mediada por complemento y promueve la captacin del parsito,mediante
la transformacin de C3b en C3bi (Brittingham y Mosser, 1996). La
opsonizacin de los parsitos con C3bi proporciona el medio adecuado
por el que lospromastigotes metacclicos se unan y penetren en los
macrfagos.
La muerte de Leishmania por parte de macrfagos est mediada por
NO tantoin vitro (Green y cols., 1990) como in vivo (Stenger y
cols., 1996). La fagocitosis de Leishmania induce fuertemente la
sntesis de NO (Corradin y cols., 1999), incluso si Leishmania posee
molculas de superficie que inhiban la produccin de NO,posiblemente
a travs de distintos receptores celulares. Adems, la infeccin
conLeishmania induce la liberacin de citoquinas que inhiben la
muerte mediada por NO como el TGF-E o la IL-10 (Bogdan y
Rollinghoff, 1999).
La saliva del mosquito, a travs del pptido maxadilan, suprime la
actividadleishmanicida del macrfago inhibiendo la produccin de
oxido ntrico y acelerando eldesarrollo de la lesin (Lima y Titus,
1996).
Cuando el promastigote metacclico se transforma en amastigote,
ocurre la fusin fagosoma-lisosoma y los parsitos son capaces de
sobrevivir y multiplicarse en la vacuola parasitfora rica en cidos
e hidrolasas (Russell y cols., 1992).
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Revisin bibliogrfica
La presentacin de los antgenos por parte de molculas del
Complejo Mayorde Histocompatibilidad (CMH) de tipo II existentes en
las clulas presentadoras de antgeno a las clulas T, causa la
expansin del protector IFN-J, produciendo una respuesta CD4+ Th1, y
se ha pensado durante largo tiempo que esto es esencial parael
control de la infeccin por Leishmania (Liew y ODonell, 1993).
Sin embargo, la presentacin por parte de las molculas del CMH de
tipo II sola, no es suficiente para estimular la respuesta de las
clulas T. Tambin se necesitan molculas coestimulatorias como la
unin de B7-1/B7-2 y CD40 (en el macrfago) con CD28 y CD40L (en la
clula T) respectivamente (Bogdan y cols., 1996).
Despus de la presentacin antignica por parte de las molculas de
Clase IIdel Complejo Mayor de Histocompatibilidad, las clulas Th
proliferan a travs del precursor Th0 hacia clulas Th1 Th2 que
difieren en el perfil de produccin de citoquinas. De hecho, las
clulas Th1 secretan IL-2, IFN-J, TNF-D y protenas inflamatorias de
migracin como las protenas MIP y MIP-1; mientras que las clulas Th2
secretan IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 y el factor inhibidor
de migracin (MIF)(Lohoff y cols., 1998).
Generalmente se acepta que la induccin de una inmunidad
protectora frente ala leishmaniosis depende de la produccin de
IL-12. Esta citoquina dirige la respuesta CD4+ Th1 e induce la
produccin de IFN-J tanto por los linfocitos T citotxicos (CD8) como
por clulas Natural Killer (NK) y clulas T. El IFN-J media en la
proteccininduciendo la expresin de NOS2 y la produccin de NO en los
macrfagos infectados (Liew y ODonell, 1993).
Los macrfagos secretan otras citoquinas adems de IL-12, que no
solo regulan la funcin de los macrfagos de una manera autocrina
sino que tambinjuegan un papel importante en la modulacin de la
adquisicin de la respuesta inmune.Por ejemplo, el TNF-D y el factor
quimiotctico activador de monocitos (MCAF) puedenfomentar la
actividad leishmanicida de los macrfagos (Mannheimer y cols.,
1996).
El TGF-E es un potente inhibidor de la induccin de NOS2 (Stenger
y cols., 1994). En los tejidos donde se encuentra menos NOS,
aparecen ms parsitos, y hay
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Revisin bibliogrfica
mas TGF-E en las lesiones de ratones susceptibles que en los
resistentes, a pesar deque hay cantidades parecidas de IL-4 e
IFN-J. Por lo tanto, el TGF-E parece ser unacitoquina importante
capaz de disminuir la respuesta del NOS2 a las seales del
IFN-J.
En general, la sntesis temprana de IL-4 es necesaria para el
desarrollo de la respuesta Th2. En esta respuesta Th2 estimula la
inmunidad humoral e inhibe la proliferacin de la respuesta Th1 y
hace al macrfago poco susceptible para laactivacin por IFN-J. La
regulacin de la respuesta humoral significa la activacin de los
linfocitos B con la formacin consiguiente de anticuerpos,
principalmente de IgG, pero que son incapaces de contrarrestar el
parsito al tener una localizacinintracelular, por lo que la
enfermedad se disemina y el ratn termina muriendo (Alvar,
2001).
La IL-4 no solo disminuye la produccin de IL-12 y IFN-J y la
expresin de IL-12, sino que tambin inhibe la produccin de NO por
los macrfagos, lo que es crtico para la actividad leishmanicida
(Vouldoukis y cols., 1997; Jones y cols., 1998).
Aunque con L. major en ratn la dicotoma Th1/Th2 esta muy clara,
en el humano y en el perro existe una respuesta combinada mucho ms
difcil de interpretar y de predecir. Existe una regulacin cruzada
de las distintas citoquinas y el balanceentre ellas va a ser
importante en la evolucin posterior de la enfermedad (Alvar,
2001).
La leishmaniosis visceral humana causada por L. donovani o L.
infantum es una enfermedad severa con diseminacin generalizada del
parsito al sistema retculo endotelial, como bazo, higazo y medula
sea. Los casos subclnicos o asintomticos estn identificados con
bajos ttulos de anticuerpos antileishmania y pueden bienmostrar una
anergia a los antgenos intradrmicos y desarrollar por lo tanto
enfermedad, o bien convertirse en seronegativos y en LST positivos,
sugiriendo una cura espontnea (Badar y cols., 1986; Davies y
Mazloumi, 1999).
Los ttulos de anticuerpos por lo general son bajos en el suero
de pacientes conleishmaniosis cutnea y mucocutnea (Labrada y cols.,
1989) y moderados o altos enpacientes con leishmaniosis visceral
(Pearson y cols., 1986), aunque esta dicotoma no est siempre tan
clara.
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La respuesta humoral tiene un efecto negativo en la
leishmaniosis y la proliferacin de linfocitos B, causantes del
exceso de produccin de anticuerpos, dalugar a la formacin de
inmunocomplejos circulantes (Lpez y cols., 1996) que
originanpatologas como la vasculitis, poliartritis y
glomerulonefritis (Endo y cols., 1985). El exceso de
autoanticuerpos circulantes da lugar a anemia y trombocitopenia
(Valladares y cols., 1998) y los anticuerpos circulantes facilitan
la fagocitosis de losamastigotes por los macrfagos, lo que es
esencial para su multiplicacin.
2.2. Modelos experimentales y respuesta inmune.
2.2.1. Modelos in vitro.
Los modelos in vitro para estudiar el metabolismo, la expresin
gnica onuevos compuestos frente a Leishmania son heterogneos
dependiendo de la especie de Leishmania ensayada, el estadio del
parsito, las condiciones del cultivo, as como la preparacin usada
en el ensayo. Es por ello, que los resultados obtenidos
sondiferentes y difciles de comparar y no se pueden correlacionar
bien con la respuesta in vivo.
El estadio de ms fcil manejo in vitro es el promastigote por lo
que es el ms empleado en los estudios de susceptibilidad a frmacos.
Sin embargo, muchos estudios realizados con antimoniales
pentavalentes muestran menor actividad que cuando se emplean
amastigotes (Callahan y cols., 1997; Ephros y cols., 1997).
Estopuede ser debido a la concentracin activa del frmaco dentro del
fagolisosoma delmacrfago que contiene al amastigote, a la
metabolizacin del frmaco a una forma con mayor actividad o a una
distinta susceptibilidad del estadio del parsito (Berman y Wyler,
1980; Roberts y cols., 1995; Callahan y cols., 1997, Ephros y
cols., 1997). Porotro lado se ha visto que la composicin del medio
puede afectar a la susceptibilidad de los promastigotes
(Petrillo-Peixoto y Beverly, 1987) y otros factores como ladensidad
celular y grado de crecimiento, junto con las posibles alteraciones
inducidaspor el frmaco en el medio de cultivo, pueden influir en
los resultados obtenidos empleando promastigotes (Moreira y cols.,
1995; Carri y cols., 2000).
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Debido a ello se utilizan tambin otros modelos in vitro como los
cultivosaxnicos de amastigotes-like o los macrfagos infectados con
amastigotes (modelointracelular).
Se han mostrado varias condiciones para muchas especies de
Leishmania quepermiten el crecimiento de una forma del parsito in
vitro que se asemeja a losamastigotes derivados de lesiones o
tejidos. Estos amastigotes in vitro se han denominado amastigotes
axnicos o formas amastigotes-like (Bates, 1993; Pan y cols., 1993;
Gupta y cols., 2001). Aunque estas formas no son replicas autnticas
delos amastigotes derivados de lesiones, son suficientemente
cercanas por lo queconstituyen un magnifico modelo y se han usado
ampliamente en estudios demetabolismo y expresin gnica (Beverly,
2003). Los experimentos iniciales paraobtener amastigotes axnicos
se basaron en la observacin de que el crecimiento delos
promastigotes a pH cido o alta temperatura induca cambios en la
forma y expresin gnica de los promastigotes (Duncan y cols., 2001).
Posteriormente,mediante la combinacin de pH cido y altas
temperaturas se consigui por primera vez la diferenciacin de
promastigotes de L. mexicana a amastigotes (Bates y cols., 1992).
Estas formas permiten el desarrollo de cribados farmacolgicos ms
representativos de la situacin in vivo, ya que el amastigote es el
estadio msrelevante del parsito.
Por otro lado, el desarrollo de un modelo de infeccin in vitro,
es decir, infectando macrfagos con promastigotes, ofrece mltiples
aplicaciones como por ejemplo, el estudio de las interacciones
receptor-ligando. Dichos estudios han permitido conocer que la
fagocitosis implica dos eventos de unin: un primer paso de anclaje
a travs de interacciones de baja afinidad y de cintica rpida y un
segundo paso de internalizacin posterior a una interaccin de alta
afinidad. En este sentido, seha podido saber que los receptores del
complemento CR1 y CR3 juegan un papel importante en el proceso de
fagocitosis, ocurriendo la interaccin del parsito con los CRs de
tres formas: (i) en presencia de suero, activando al componente C3
del complemento y unindose a travs del fragmento C3bi del
complemento a CR3; (ii) atravs de una unin independiente de suero
de la proteasa de superficie gp63 a CR3;y (iii) a travs de la unin
del lipofosfoglicano del parsito a un sitio lectina-like en CR3y
CR1. Los receptores CR4, de fibronectina, de manosa y el receptor
de glicosilacin de productos finales tambin estn implicados en la
invasin. Es posible que
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interacciones receptor-ligando mltiples ocurran simultneamente,
dependiendo delestado de activacin del macrfago. En el caso del
promastigote, se ha visto que las dos principales familias de
molculas de superficie, la gp63 y los fosfoglicanos como el
lipofosfoglicano (LPG), son los principales ligandos para el
anclaje a los macrfagos(Revisado en Bullen, 2002).
Este modelo de infeccin in vitro tambin ha resultado til en el
estudio de las bases bioqumicas de la interaccin
macrfago-Leishmania, ya que ha permitido caracterizar mecanismos de
evasin de la respuesta por parte del parsito, como porejemplo, la
inhibicin de la proteinkinasa C, lo que produce una entrada de Ca2+
en el macrfago y reduce los niveles de protenas relacionadas con la
miristoilato-alanina C kinasa, que son sustratos de la PKC. Adems,
se ha podido saber que Leishmaniabloquea la fosforilacin de la
tirosinkinasa inducida por IFN-J, con un consecuente deterioro en
la produccin de IL-12 y NO, y tambin activa a
fosfotirosinfosfatasas quedesrregulan la sealizacin de la
proteinkinasa activada por mitgenos y la expresinde c-fos y de
oxido ntrico sintetasa por parte de los macrfagos. Tambin se ha
observado que la cisteinproteinasa participa en la nutricin del
parsito a expensas dela clula hospedadora y juega un papel
importante en la penetracin en el macrfago(Brandonisio y cols.,
2000).
Otros estudios realizados con el modelo promastigote-macrfago,
han sido losdestinados a elucidar qu citoquinas estn implicadas en
favorecer los mecanismos celulares microbicidas, observndose que
algunas de ellas juegan un papel importanteen la regulacin de la
produccin de NO por parte de los macrfagos infectados con
Leishmania. As por ejemplo, el IFN-J y TNF-D desarrollan un papel
integral en laresistencia del macrfago frente a Leishmania y son
esenciales para la produccin de niveles citotxicos de NO. Pero la
infeccin por Leishmania tambin induce la liberacin de citoquinas
que inhiben la muerte mediada por NO, como el TGF-E o la IL-10
(Brandonisio y cols., 2000).
Los estudios celulares de linfoproliferacin han permitido
observar que el factor de crecimiento hematopoytico, GM-CSF, induce
la proliferacin de celular a la vez que incrementa la fagocitosis y
las funciones metablicas de los macrfagos lo que dalugar a la
muerte de los promastigotes (Revisado en Jones, 1996).
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Otra aplicacin es el estudio del efecto de la opsonizacin en la
adhesincelular. As, en un modelo de infeccin ex vivo con Leishmania
y sangre humana semostr que los promastigotes opsonizados con C3 se
adheran (inmunoadherencia) a los eritrocitos antes de la
fagocitosis del parsito (Domnguez y Torao, 1999).
Por ltimo, el estudio de agentes quimioteraputicos en dicho
modelo ha mostrado que concentraciones adecuadas de antimoniales
pentavalentes, pentamidinay anfotericina B eliminan el 90-100 % de
los amastigotes de diversas especies de Leishmania de los macrfagos
humanos infectados in vitro, representando una ventaja frente al
empleo de los promastigotes libres ya que los amastigotes son ms
sensibles,y, adems, los macrfagos pueden concentrar y metabolizar
frmacos paraincrementar su toxicidad (Berman y Wyler, 1980).
Los modelos en fagocitos residentes o procedentes de lneas
celulares yaestablecidas han sido tiles con las diferentes cepas
empleadas. Chang consigui en1980 el mantenimiento de una lnea
celular, J774.G8, infectada de manera indefinidacon amastigotes de
L. amazonensis. Pero en el caso de L. infantum el desarrollo del
modelo ha sido ms difcil, habindose descrito lneas celulares
caninas que podaninternalizar promastigotes de L. infantum
(Brandonisio y cols., 1986). Lneas como la U937, J774.G8 o la lnea
THP-1 humana tambin han sido capaces de interaccionarcon el parsito
(Savoia y cols., 1991; Gaspar y cols., 1992; Gebre-Hiwot y cols.,
1992), Sin embargo, no se demostr una multiplicacin activa de los
amastigotes en suinterior en ningn caso. Esto se mejor modificando
las condiciones estndares delcultivo, de manera que mediante la
preincubacin de los macrfagos durante 2 das a26C antes de realizar
la infeccin con los promastigotes, se consigui una
mayorinfectividad (Mndez y cols., 1996), demostrando posteriormente
este modelo su utilidad en estudios de infectividad con distintas
cepas in vitro, existiendo una correlacin entre la infectividad in
vitro e in vivo de las mismas (Mndez y cols., 2001), por lo que
este dicho modelo resulta muy til para el cribado farmacolgico.
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Revisin bibliogrfica
2.2.2. Modelos in vivo.
2.2.2.1. M odelo murino.
Se han desarrollado muchos modelos experimentales de
leishmaniosis. Estos modelos tienen la principal atraccin de
permitir el control de la gentica del parsito ydel hospedador, pero
no reproducen enteramente la enfermedad de humanos. Uno delos
factores que contribuyen a las diferencias entre humanos y animales
de laboratorio es el tamao y la naturaleza del inculo. En las
infecciones naturales el mosquito introduce en la piel un nmero muy
pequeo de promastigotes metacclicos junto consaliva fuertemente
bioactiva, mientras que en el laboratorio se inyectan
infeccionescon miles de millones de promastigotes derivados de
cultivos o amastigotes derivados de tejidos. El mosquito deposita
el inculo en un pequeo volumen de sangre, mientras que en las
infecciones en laboratorio se realizan en volmenes de 50 Pl o ms.
Adems, en el laboratorio la jeringa se introduce subcutnea o
intravenosamente(Handman, 2001). Un mejor conocimiento de los
mecanismos implicados en lamaduracin del parsito en el mosquito y
en la capacidad para mimetizar algo de estoen el laboratorio, ha
dado lugar a muchos protocolos de infeccin mejorados.
Losinvestigadores ahora usan por ejemplo, un pequeo nmero de
promastigotesmetacclicos derivados in vitro por va intradrmica ms
que subcutnea en la oreja delratn (De Krey y Titus, 1999; Mndez y
cols., 2001).
2.2.2.1.1 M odelo murino de leishmaniosis cutnea.
En la leishmaniosis cutnea la infeccin de cobayas con L.
enriettii fue el primer modelo que se caracteriz. Los cobayas
desarrollaban respuestas celulares T frente a los antgenos
parasitarios en 2 semanas de infeccin y la lesin se curaba en unas
10 semanas (Mauel y cols., 1981). La principal atraccin de este
modelo animales el hecho de que la combinacin hospedador-parsito es
natural y que el patrn essimilar al observado en la leishmaniosis
cutnea por L. major. El modelo de L. enriettiien cobayas ha sido
sustituido por la infeccin de cepas consanguneas de ratn
conespecies de Leishmania patgenas para humanos. Aunque no es
perfecto, el espectrode manifestaciones de la enfermedad observado
en la leishmaniosis humana puedeser mimetizado en el laboratorio
con la infeccin de diferentes cepas consanguneas de ratn con L.
major.
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Revisin bibliogrfica
El modelo en ratn reproduce muchos aspectos de la enfermedad en
humanos, incluyendo un amplio rango de estados de susceptibilidad
dependiendo de la cepa deratn usada.
Los ratones Balb/c son altamente susceptibles y tras la infeccin
desarrollan muchas lceras en la piel que se expanden y metastatizan
dando lugar a la muerte, yla infeccin produce lesiones nodulares
que visceralizan, con produccin de anticuerpos pero sin el
desarrollo de una hipersensibilidad tarda (Alexander y Philips,
1978; Alexander y Kaye, 1985). Por el contrario, los ratones
C57/BL6 y CBA/n son resistentes a la infeccin por L. major o L.
mexicana y desarrollan lesiones pequeas que se curan en 10-12
semanas, son resistentes a la reinfeccin y desarrollan respuestas
inmunes humoral y de hipersensibilidad tarda (Prez y cols., 1979;
Grimaldi y cols., 1980). La mayora de las otras cepas son
intermedias en lasusceptibilidad (Preston y Dumonde, 1976).
El desarrollo de la infeccin depende de la activacin polarizada
de una de las dos subpoblaciones de clulas T CD4+, Th1 Th2. Los
ratones Balb/c producen sobre todo citoquinas Th2, como la IL-4, y
este patrn se establece a las pocas horas deinfeccin (Bogdan y
Rollinghoff, 1998). Una diferencia importante entre
ratonessusceptibles y resistentes es que los resistentes son
capaces de cambiar a un perfilTh1 y controlar la enfermedad
(Heinzel y cols., 1991; Solbach y Laskay, 2000). Un importante
factor de decisin para formar un fenotipo Th1 Th2 es el ambiente
temprano de citoquinas y, como ya hemos visto anteriormente, la
IL-12 es una de lascitoquinas que contribuye significativamente al
establecimiento de un fenotipo Th1 (Solbach y Laskay, 2000). Sin
embargo, en ratones susceptibles Balb/c, se ha vistouna produccin
temprana simultnea de IL-12 y de citoquinas que inhiben a la
IL-12,como el TGF-E, IL-4 e IL-10 (Gorak y cols., 1998).
El IFN-J, adems de controlar la resistencia temprana frente a L.
major,tambin influye en el inicio de la diferenciacin Th1 en
ratones resistentes, no afectndose el desarrollo de la respuesta
Th1 por la presencia o ausencia de IFN-Jderivado de clulas no T
(Scharton-Kersten y cols., 1995; Wakil y cols., 1998).
En el modelo murino con L. major, las clulas T CD4+ son la
principal fuente de IL-4 temprana, lo que desemboca en una no
respuesta a la IL-12 en ratones Balb/c e
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Revisin bibliogrfica
induce el desarrollo de una respuesta Th2 (Launois y cols.,
1997). Estudios con L.major encontraron que un epitopo simple
derivado del antgeno parasitario LACK (Leishmania homologue of
receptors for activated C kinase) induca una rpida y temprana
produccin de IL-4 por clulas T CD4+ VE4VD8 en ratones
Balb/csusceptibles, lo que estaba correlacionado con el desarrollo
de las lesiones. Pero, losratones convertidos en tolerantes al LACK
mediante expresin transgnica en el timo, exhiban una respuesta Th2
menor y un fenotipo curativo (Julia y cols., 1996; Launois y cols.,
1997). Estos resultados indican que ciertos antgenos parasitarios
puedenpromover el desarrollo de una respuesta Th2
contraprotectora.
A pesar de las evidencias del papel exacerbador de la enfermedad
de IL-4 en la infeccin por L. major en ratones susceptibles, otros
estudios utilizando ratones Balb/c deficientes en IL-4 infectados
con L. major no han sido concluyentes. Scott y cols. en 1996
demostraron que la produccin temprana de IL-4 no predice
necesariamente la susceptibilidad a L. major.
Mientras que es til en muchos sentidos, uno debe recordar que el
modelomurino es solo un modelo y que la patognesis y la inmunidad
puede ser un pocodiferente en humanos por lo que la extrapolacin de
ratn a humano se ha de hacer con mucho cuidado (Kelso, 1995).
2.2.2.1.2. M odelo murino de leishmaniosis visceral.
Hasta hace poco no existan modelos animales de infeccin
adecuados para estudiar el desarrollo y progresin de las
infecciones causadas o por L. donovanio por L. infantum. Una de las
dificultades con el ratn como modelo de leishmaniosishumana
visceral es la necesidad de inyectar amastigotes intravenosamente
con el fin de inducir un patrn reproducible de la colonizacin del
bazo y el hgado. Paraconseguir una infeccin visceral detectable en
ratn, es necesario emplear un nmero muy elevado de parsitos, lo que
est muy lejos de lo que ocurre en la infeccin natural. Adems, los
ratones no mueren y la carga parasitaria, despus de uncrecimiento
moderado, disminuye a niveles muy bajos o indetectables, indicando
que los ratones desarrollan una inmunidad protectora frente a la
infeccin (Leclerq y cols., 1996; Engwerda y cols., 1998; Honor y
cols., 1998).
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Revisin bibliogrfica
Los ratones no consanguneos son generalmente resistentes a la
infeccin conL. donovani, pero las cepas consanguneas presentan
diferencias marcadas en la susceptibilidad, lo que dio lugar a
principios de los 70, al aislamiento del gen de la susceptibilidad
Lsh (posteriormente denominado NRAMP1) (Bradley, 1974). NRAMP1
determina el grado de expansin temprana de los parsitos en hgado y
bazo (Bradley,1989; Blackwell, 1996). Los estudios con los modelos
viscerales de ratn tambin handado dan lugar a la caracterizacin de
mecanismos inmunes importantes para el desarrollo de respuestas
rgano-especificas que causan el aclaramiento de los parsitos del
hgado pero no del bazo (Kaye y cols., 1995; Engwerda y Kaye,
2000).Otra contribucin importante del modelo murino ha sido el
descubrimiento de que la quimioterapia con antimoniales es
inefectiva en ausencia de respuestas mediadas por clulas T intactas
(Kaye y cols., 1995).
En general la respuesta inmune en cepas de ratn consanguneas
infectadas con especies de Leishmania viscerotrpicas, es similar a
la observada en el modelo murino con L. major. Pero al comparar
leishmaniosis cutnea y visceral en ratonesBalb/c infectados con L.
donovani se observ, que en la infeccin cutnea los esplenocitos y
las clulas de los ndulos linfticos mostraban alta respuesta
linfoproliferativa parsito-especfica con alta respuesta de IFN-J,
IL-4, IL-10 y NOS2, mientras que en la infeccin visceral no hubo
respuesta frente al antgeno (Melby ycols., 1998).
La infeccin por L. donovani en ratn ha inducido un desarrollo
variable dependiendo del background gentico de la cepa de ratn, va
de inoculacin, dosis einfectividad del organismo (Blackwell y
cols., 1980). Estudios realizados en ratonesconsanguneos han
identificado ciertas cepas como la C3H que es resistente,
mientrasque las cepas B10.D2, C57BL/10, etc siguen un fenotipo
susceptible curativo o no(Blackwell y cols., 1980; Nickol y
Bonventre, 1985). Sin embargo, el modelo Balb/c hasido el ms
estudiado, mostrando estos animales una susceptibilidad inicial,
siendo capaces, despus de varias semanas, de controlar la carga
parasitaria manteniendo un nivel bajo de infeccin crnica (Murray y
cols., 1982; Wilson y cols., 1996; Mukherjee y cols., 2003).
Por otro lado, los perfiles de citoquinas en este modelo de ratn
no son lostpicos de una respuesta Th2. Es decir, que el claro patrn
de respuesta Th1/Th2
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Revisin bibliogrfica
demostrado para L. major o L. mexicana no ha sido bien observado
en la leishmaniosis visceral en ratones y humanos (Honor y cols.,
1998; Kaye y cols., 1991; Kemp y cols., 1993; Miralles y cols.,
1994). Aunque la resistencia a L. donovani esta asociada con la
produccin de IFN-J, las citoquinas Th2 no determinan
susceptibilidad. De hecho ratones IL-4-/- son ligeramente ms
susceptibles a L. donovani que los controles silvestres, lo que
indica que la IL-4 puede tener un efecto protector frente a
laleishmaniosis visceral murina (Satoskar y cols., 1995). La
incapacidad para controlar las infecciones est asociada con la
prdida de capacidad de los esplenocitos paraproducir IFN-J in vitro
pero no la produccin de IL-4 IL-5 (Kaye y cols., 1991).
La resistencia frente a las infecciones viscerales murinas se ha
asociado con respuestas celulares que incluyen a las clulas CD4+ y
CD8+ (Stern y cols., 1988) y elaclaramiento de parsitos de la piel
en modelos viscerales obtenidos mediante inoculacin intradrmica se
ha correlacionado con respuesta inflamatoria e infiltracin y
activacin de CD4+ y CD8+ (Ahmed y cols., 2003).
Como se ha mencionado anteriormente, el desarrollo cutneo o
visceral puede depender de interacciones entre el genotipo del
parsito y del hospedador mas queexclusivamente del parsito. Debido
a las limitaciones del sistema experimental murino usando cepas
visceralizantes humanas como L. donovani y L. infantum, se ha
propuesto que la leishmaniosis visceral inducida en Balb/c por la
cepa dermotrpica L.major puede ser un modelo mejor para la
leishmaniosis visceral (Handman, 2001).
2.2.2.2. M odelo en criceto.
Se ha visto que distintas cepas de L. donovani, L. chagasi y L.
infantuminfectan al criceto, induciendo una forma fulminante de
leishmaniosis visceral queprogresa hacia la muerte del animal
(Hommel y cols., 1995), aunque los estudiosinmunolgicos en el
criceto han cado, en comparacin con otros modelos, debido a
laausencia de reactivos inmunolgicos, existiendo pocos trabajos al
respecto.
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Revisin bibliogrfica
Criceto dorado (Harlan Ibrica S.A.).
Sin embargo, hace ya aos que se empez a utilizar el criceto como
modelo experimental en la inmunologa de la leishmaniosis. Por
ejemplo, en 1976 Farrell observ que el criceto dorado era capaz de
adquirir resistencia a la infeccin inducida por L. donovani,
mediante la exposicin previa a la infeccin subcutnea con el
mismoparsito.
Goto y cols. observaron en 1987 que los cricetos infectados con
L. majortambin constituan un modelo interesante de leishmaniosis
visceral ya que todos losanimales desarrollaban la enfermedad, con
test cutneo negativo, presencia de anticuerpos y diseminacin del
parsito en hgado y bazo al igual que en humanos. Enel mismo ao,
Ghosh y Ghosh estudiaron el patrn de infeccin en cricetos
infectados con diferentes aislados de pacientes indios con
Kala-azar, y observaron que las cepasde L. donovani ms virulentas
producan una infeccin masiva, con hepatoesplenomegalia, cargas
parasitarias altas en hgado y bazo, anemia, leucopenia,
hipergammaglobulinemia, aumento de anticuerpos y baja respuesta
linfoproliferativa y de hipersensibilidad retardada frente al
antgeno.
En cricetos infectados con L. infantum no hubo cambios en las
concentracionesde urea, creatinina o nitratos, ni antes ni despus
del tratamiento con anfotericina B, elcual produjo un descenso del
98,2% en la carga parasitaria, sin reduccin de los niveles de
anticuerpos. Es decir, no existi produccin de NO, al contrario de
lo queocurre en ratn, por lo que parece que el NO no estara
implicado en el efecto curativo de la anfotericina B en este modelo
(Bories y cols., 1998).
En otro estudio, en el que se ensayaron distintas dosis de
infeccin por L.infantum por va intracardiaca, realizndose un
seguimiento de un ao, se mostr queexistiran tres grupos de
animales: sintomticos o susceptibles, oligosintomticos y
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Revisin bibliogrfica
resistentes, al igual que ocurre en perros y humanos (Requena y
cols., 2000). Estosautores observaron que exista una correlacin
entre la cantidad de inoculo y el tiempo de aparicin de los sntomas
clnicos externos y tambin en relacin con algunosparmetros
inmunolgicos. Un descubrimiento importante fue que cerca de la
mitad de los animales, independientemente del tamao del inoculo, no
desarrollan sntomasexternos de leishmaniosis visceral. Tambin se
encontr una correlacin entre eltamao del inoculo y el momento en
que se detectaba la respuesta humoral anti-Leishmania y cuando se
analizaron los anticuerpos en rin, se observ que existauna relacin
entre la presencia de anticuerpos en este tejido y la aparicin de
los sntomas.
Existen diferencias entre la infeccin con amastigotes o con
promastigotes de L. infantum por va intraperitoneal en cricetos.
Las clulas esplnicas respondieron fuertemente al antgeno especfico
en las primeras semanas post-infeccin, pero en el momento del pico
en la carga parasitaria los ndices de estimulacin disminuyeron en
ambos casos. En ambos grupos exista reconocimiento de antgenos de
21, 31, 40-42,47-50, 54-58, 63-69, 70-76, 80-88, 91-97, 100-107 y
110-118 kDa, pero el patrn dereconocimiento era muy heterogneo, no
existiendo correlacin con los cambios en la carga parasitaria. La
principal diferencia entre la infeccin por amastigotes
ypromastigotes fue el tiempo de incubacin que fue mayor en el
segundo caso (Ria-Capela y cols., 2003).
Anteriormente, se haba observado en cricetos infectados con L.
donovani que aparecan anticuerpos frente a antgeno de promastigotes
de 26, 35, 46, 59, 69, 107 y120 KDa (Evans y cols., 1990).
La protena GRP94 de L. infantum, que es muy abundante en el
retculo endoplsmico y esta asociada con el procesamiento antignico,
ha demostrado seruna diana importante durante la leishmaniosis
visceral en cricetos, pudindoseemplear como marcador temprano de
infeccin (Larreta, 2002).
Otros estudios sobre la respuesta humoral han sido los
realizados por Campos-Neto y Bunn-Moreno en 1982, que mostraron que
los cricetos infectados con L.donovani desarrollaban anticuerpos
frente al parsito e hipergammaglobulinemiadebido a la activacin
policlonal de las clulas B. Posteriormente, se observ que el
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Revisin bibliogrfica
extracto bruto de L. donovani induca in vitro a las clulas B a
producir anticuerpos, pero esa activacin pareca ser independiente
de un posible efecto mitognico sobre las clulas B (Bunn-Moreno y
cols., 1985).
Al emplear el inmunosupresor ciclofosfamida se bloque la
aparicin deanticuerpos especficos y policlonales frente a la
infeccin por L. donovani, debidoposiblemente a un efecto sobre la
poblacin de clulas T implicadas en el control de la produccin de
anticuerpos por las clulas B (Otero y cols., 1993).
La presencia de antgenos de L. donovani e inmunoglobulinas de
criceto en rin, origin una glomerulonefritis proliferativa
mesangial progresiva, asocindose condeposicin amiloidea (Oliveira y
cols., 1985; Sartori y cols., 1987). Los eluidos derin, mostraron
especificidad por el antgeno de L. donovani y por inmunoglobulinas
de criceto, detectndose protenas de 134, 110, 93, 89, 82, 52, 48,
31 y 26 KDa, y reconociendo la IgG de cricetos infectados la
protena de 134 KDa (Sartori y cols., 1991).
Tambin se han detectado inmunoglobulinas en otros rganos como
pulmn e hgado de cricetos infectados con L. chagasi (Mathias y
cols., 2001). Por otro lado, el cortex y la medula de las glndulas
adrenales mostraron una deposicin progresiva defibras amiloideas en
cricetos infectados con L. infantum, dando lugar a la destruccin
parcial del parnquima adrenal (Novoa y cols., 1990).
En cuanto a la respuesta linfoproliferativa, durante la infeccin
por L. donovanien cricetos se produce una fuerte inmunosupresin,
existiendo dos tipos de inhibicin: la anergia inespecfica frente a
concanavalina A y una inmunosupresin antgeno-especfica mediada por
la poblacin celular no adherente (clulas T), que serestauraba
despus del tratamiento con Glucantime (Nickol y Bonventre, 1985).
Alcontrario que en el trabajo anterior, la eliminacin de las clulas
adherentes restaur la capacidad de los esplenocitos para responder
al antgeno y adems esas clulas adherentes supresoras, que tenan
caractersticas de macrfagos, parece que no eranlas responsables de
la incapacidad de las clulas perifricas para responder alantgeno
(Gifawesen y Farrell, 1989).
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Revisin bibliogrfica
Esto se confirm ms tarde, ya que la eliminacin de las clulas
adherentes, con caractersticas de macrfagos, en cricetos infectados
con L. donovani, tambin restaur la respuesta proliferativa frente a
forbolmiristato e ionomicina. Adems, seobserv que la generacin de
NO por las clulas adherentes era, por lo menos enparte, responsable
de la inhibicin de la proliferacin al utilizar concanavalina A
(Dasgupta y cols., 1999).
Recientemente, se ha visto que el efecto supresor que ejercen
las clulas adherentes sobre la respuesta proliferativa, est mediado
por una inhibicin en la activacin de una ruta metablica en la que
interviene la proteinkinasa C (PKC). Estasupresin puede ser
revertida por el cido okadaico, que es un inhibidor de la fosfatasa
serina-treonina, y por anti-TGF-E (Mookerjee y cols., 2003).
Las clulas adherentes de bazo fueron incapaces de presentar los
antgenos de L. donovani pero si otros antgenos no relacionados, y
las clulas T no respondieron a los antgenos del parsito incluso
cuando fueron presentados pormacrfagos normales. Todo esto
demuestra que las clulas esplnicas presentadorasde antgeno eran
incapaces de mediar en la proliferacin de las clulas T
selectivamente frente a los antgenos del parsito (Rodrigues y
cols., 1992).
Las clulas presentadoras de antgenos (esplenocitos adherentes)
de cricetosinfectados con L. donovani producan altos niveles de
TGF-E, indicando que dicha citoquina participa fuertemente durante
el curso de la infeccin en este modelo animal(Rodrigues y cols.,
1998).
Por otro lado, se ha visto que factores humorales
(inmunoglobulinas, factoresreumatoides o triglicridos) del suero de
criceto infectados con L. donovani, inhiban respuesta proliferativa
frente a concanavalina A (Evans y cols., 1990). Previamente, se
haba observado que la inmunosupresin en cricetos infectados por L.
braziliensis o por L. donovani estaba relacionada con protenas
sricas probablemente delhospedador (ODaly y Cabrera, 1986).
Los lpidos del suero provocaron inhibicin de la proliferacin
celular en esplenocitos de cricetos normales a los que se les
aadieron mitgenos y suero decricetos infectados con altos niveles
de triglicridos, revirtindose la inhibicin al aadir
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Revisin bibliogrfica
albmina srica bovina, que es un carrier de cidos grasos libres
(Vasconcellos ycols., 1996).
Tambin se vio que el sistema del complemento juega un papel
importante en la reaccin inflamatoria y en la fagocitosis, en
cricetos inoculados con promastigotes de L. chagasi, puesto que la
deplecin del complemento disminuy la fagocitosis delos parsitos por
clulas polimorfonucleares y por macrfagos, lo que afect a
laevolucin de la infeccin (Laurenti y cols., 1996).
Por otro lado, se observ un incremento en el porcentaje de
clulas NaturalKiller al comienzo de la infeccin, que no fue capaz
de detener el desarrollo de la infeccin (Sartori y cols.,
1999).
La ausencia de reactivos inmunolgicos para criceto empez a ser
menos problemtica a partir del trabajo de Melby y cols. en 1998, en
el que se clonaron ysecuenciaron porciones de IL-2, IL-4, IFN-J,
TNF-D, IL-10, IL-12p40 y TGF-E,determinndose la expresin de estos
genes en cricetos infectados con L. donovani durante 56 das,
encontrando: (i) expresin basal de IL-4; (ii) fuerte expresin de
citoquinas Th1 (IL-2, IFN-J y TNF); (iii) ausencia de expresin de
RNAm de oxido ntrico sintetasa; y (iv) en los estadios tempranos an
no se expresaban IL-10 TGF-E(Melby, 1998 y 2001).
El estudio de estas citoquinas en cricetos afectados de
leishmaniosis cutnea muestra que la expresin de citoquinas
desactivantes de macrfagos de tipo Th2 y/o la respuesta exagerada
de citoquinas proinflamatorias de tipo Th1 pueden contribuir a la
severidad de las lesiones (Osorio y cols., 2003).
Como veremos ms adelante (apartado 3.1.4), el criceto dorado se
haempleado con xito en ensayos farmacolgicos en los que se empleaba
anfotericina B (Berman y cols., 1986; Berman y cols., 1992; Agrawal
y cols., 2002). Pero adems, se han ensayado otras sustancias con
fines inmunoteraputicos en cricetos como laprotena A de
Staphylococcus aureus (Ghose y cols., 1999), la protena papLe22
(Fragaki y cols., 2001), ciertos lipopptidos anlogos a
muramildipptido (MDP) (Zehra y cols., 1995) o el picroliv, el
glucsido iridoide de Picrorhiza kurroa (Puri y Saxena, 1992). El
propio parsito tambin ha sido empleado como inmunoprofilctico en
un
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Revisin bibliogrfica
modelo de leishmaniosis visceral criceto (Mukhopadhyay y cols.,
1999) y las vacunas de L. donovani y L. major autoclavadas en unin
a BCG, tambin han demostrado suutilidad profilctica frente a la
leishmaniosis visceral en este modelo (Srivastava ycols.,
2003).
2.2.2.3. M odelo canino.
Como ya hemos visto, el perro acta como reservorio de la
leishmaniosis y, adems, en numerosas ocasiones sufre la enfermedad.
La leishmaniosis canina esuna de las enfermedades parasitarias de
mayor gravedad y a su vez, de ms difcil manejo, debido
principalmente a la variabilidad de los cuadros clnicos, al
frecuentefracaso teraputico y a su carcter zoonsico y vectorial, lo
que dificulta el control endeterminadas reas endmicas (Mir y
Fraile, 1999).
Perro afectado de leishmaniosis, con atrofia muscular y
dermatitis (Alvar, 1997).
El perro es un buen modelo para la leishmaniosis humana, porque
en l lossntomas de la enfermedad son similares a los que se
desarrollan en humanos (Peters y Killick-Kendrick, 1987). Las
investigaciones realizadas en los ltimos aos hanpermitido la
estandarizacin del trabajo de laboratorio con perros y ahora
existen herramientas especificas bsicas para los ensayos
experimentales. La produccin deanticuerpos monoclonales frente a
los homlogos caninos de los clusters de diferenciacin antignicos
humanos (Cobbold y cols., 1994), proporciona laoportunidad de
definir subpoblaciones linfoides caninas (Willians, 1997) y
monitorizarestas clases celulares bajo condiciones normales
(Rabanal y cols., 1995; Weiss, 2001)y patolgicas (Bourdoiseau y
cols., 1997; Sinke, 1997).
De forma ms o menos terica se suponen dos tipos de respuesta
inmune: una respuesta celular eficaz, basada en la produccin de
linfocitos Th1 que producen IFN-J
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Revisin bibliogrfica
e IL-2, potentes activadores de macrfagos. Este tipo de
respuesta solo se observa en un porcentaje inferior al 10% de los
perros enfermos, considerados como animales resistentes presentando
anticuerpos negativos, pero una respuesta proliferativa positiva de
las clulas T frente a antgenos de Leishmania, con respuesta similar
a las personas inmunocompetentes frente a la infeccin por
Leishmania.
La otra respuesta es una respuesta humoral ineficaz, propia de
la mayora de los perros afectados (susceptibles) que se basa en la
induccin de los linfocitos Th2 supresores, productores de IL-4 e
IL-10, que dan lugar a la estimulacin de los linfocitos B,
provocando hipergammaglobulinemia inespecfica, con produccin
masivade anticuerpos anti-Leishmania no protectores y con clulas T
negativas. Se trata de una reaccin de hipersensibilidad de tipo III
con formacin de abundantesinmunocomplejos, responsables de la
mayora de los sntomas ms graves de la enfermedad.
En los casos en que la respuesta inmune no es eficaz, se produce
ladiseminacin del parsito principalmente a los rganos
hematopoyticos (bazo,medula sea), donde continua la replicacin del
parsito, y desde aqu, su diseminacin al resto de los rganos (piel,
rin, hgado, tubo digestivo, ojos,articulaciones, etc) (Mir y
Fraile, 1999).
La gentica parece que tiene influencia a la hora de determinar
la resistencia a la leishmaniosis clnica; por ejemplo, en perros de
caza ibicencos, la prevalencia decasos de enfermedad es mucho menor
que en otras razas y esta caracterstica ha sidoasociada a una
reactividad significativa de las clulas inmunes (Solano-Gallego y
cols.,2000).
Respecto a la polarizacin de las respuestas Th1 Th2, entre ambas
puedeexistir una amplia gama de posibilidades. En una primera fase,
de duracin variable,se producen ambas repuestas, con expresin de
citoquinas de ambas ramas, hasta que por motivos desconocidos, se
polariza en un sentido u otro. De un 20 a un 50% de los perros
tendra una respuesta Th2 con progresin a enfermedad patente, y el
resto mantendra un estado de tolerancia (Alvar, 2001).
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Revisin bibliogrfica
Un hecho muy significativo en la leishmaniosis canina es, la
cada progresiva de linfocitos CD4+ (Moreno y cols., 1999) entre el
sexto y el octavo mes despus de la infeccin, cuando empieza a
aparecer la sintomatologa. Desde las primeras semanas tambin se
observa un aumento en los linfocitos CD28+ que son precursores de
loslinfocitos B, y por eso se exacerba la respuesta humoral. Adems,
al igual que enhumanos, esta alta respuesta de inmunoglobulinas es
favorecedora para el parsito porque los anticuerpos facilitan su
fagocitosis por parte del macrfago (Slappendel, 1988).
Como nuestro trabajo se basa en el desarrollo de modelos
experimentales, repasaremos ms detenidamente solo los estudios
realizados en perros experimentalmente infectados.
Los subtipos de inmunoglobulinas IgG1 e IgG2 han sido propuestos
como indicadores de la dicotoma en la respuesta por anticuerpos
frente a la infeccin caninapor L. infantum y existe una correlacin
entre los niveles de IgG1 e IgG2 y la progresin de la enfermedad
(Nieto y cols., 1999; Leandro y cols., 2001; Solano-Gallego y
cols., 2001).
Se ha encontrado respuesta temprana frente a los antgenos de 29
y 50-57KDa, detectndose las bandas de 34-35.4 y 26 KDa solo durante
la fase aguda de laenfermedad (Carrera y cols., 1996). El
reconocimiento de la banda de 26 KDa desapareci despus del
tratamiento, apareciendo en ese momento dos protenas de 85 y 110
KDa (Lasri y cols., 2003). Por otro lado, en perros tratados con
antimoniatode meglumine se produjo un descenso en la intensidad de
las bandas en la regin de 12-30 KDa (Riera y cols., 1999).
En leishmaniosis canina experimental se ha observado una
respuesta celular B notable, pero los ensayos de transformacin de
linfocitos mostraron una ausencia derespuesta de las clulas T
durante la enfermedad (Martnez-Moreno y cols., 1993).
Tres aos despus de la infeccin experimental, los perros
resistentesrespondieron frente al antgeno, con ausencia de
anticuerpos, pero en los sintomticosocurri lo contrario. En ambos
grupos existi respuesta frente a concanavalina A y
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Revisin bibliogrfica
tambin existieron IL-2 y TNF en los sobrenadantes de las clulas
perifricas de los asintomticos (Pinelli y cols., 1994).
Al comparar infecciones naturales y experimentales, hubo falta
de respuestacelular frente al antgeno de Leishmania en todos los
casos, mientras que las respuestas inespecficas frente a mitgenos
fueron normales, estando parcialmente suprimidas en animales
infectados naturalmente (Martnez-Moreno y cols., 1995). Porotro
lado, Rhalem y cols. (1999), observaron proliferacin temprana
frente a antgeno bruto y a la fraccin purificada gp63, que disminua
al aparecer los sntomas.
En el caso de perros infectados con amastigotes o promastigotes,
existi alta proliferacin frente a concanavalina A en todos los
grupos, observndose en losinfectados con promastigotes una fuerte
respuesta linfoproliferativa frente al antgeno(Leandro y cols.,
2001).
En cuanto a las citoquinas, en las clulas de sangre perifrica de
perros Beagle infectados con amastigotes, existi un incremento en
la expresin de IFN-J e IL-2, mientras que la IL-12 e IL-10 solo se
detectaron espordicamente en algunos animales. En los perros no
infectados, solo se detect IFN-J en clulas estimuladas con
concanavalina A y no hubo relacin entre la respuesta humoral,
celular o laseveridad con la IL-10, sugiriendo todo esto un
establecimiento silencioso del parsito (Santos-Gomes y cols.,
2002).
3. ANFOTERICINA B Y SUS FORMULACIONES.
Tanto el tratamiento de la leishmaniosis visceral como cutnea,
ha sido mejorado en los ltimos 15 aos mediante la introduccin de
frmacos y formulacionesalternativas, sin embargo, el arsenal
teraputico contra la leishmaniosis visceral es anlimitado. Una
revisin de la farmacocintica de los antimoniales
pentavalentesestndares condujo al uso de dosis altas de estos
frmacos durante los aos 80; estofue necesario para el tratamiento
de la leishmaniosis visceral en India y Kenia despus de la
existencia de una poca de dramtico descenso en las curaciones a las
dosis recomendadas previamente (Olliaro y Bryceson, 1993). Debido a
ello, los antimoniales ya no pueden ser usados en el noreste indio,
donde la incidencia de la leishmaniosis visceral es mayor, por la
aparicin de resistencias.
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Revisin bibliogrfica
Otros frmacos de segunda eleccin tradicionales, como la
anfotericina B y la pentamidina, han re-emergido frente a
Leishmania debido al desarrollo de formulaciones mejoradas. El uso
del antibitico polinico anfotericina B estaba hasta hace poco
tiempo limitado por su toxicidad. Las formulaciones lipdicas
conanfotericina B, con menor toxicidad, originalmente desarrolladas
para el tratamiento de micosis sistmicas, han sido explotadas con
xito en la leishmaniosis visceral pero no son asequibles en pases
menos desarrollados. Otro antibitico, la paramomicina(aminosidina),
tambin ha sido formulado para el tratamiento de la leishmaniosis
cutnea y visceral. El alopurinol se ha usado en estudios clnicos de
leishmaniosis visceral y cutnea, al igual que el ketoconazol y el
itraconazol, pero los resultados han sido equvocos. La primera
medicacin oral frente a la leishmaniosis visceral,miltefosina,
registrada en la India, todava est en fase de estudio y, adems, es
abortiva y teratognica. El desarrollo de un segundo frmaco oral, la
sitamaquina,esta siendo muy lento. Al igual que en humanos, el
tratamiento de la leishmaniosis canina continua siendo problemtico
ya que los antimoniales, la anfotericina B y la paramomicina tienen
eficacia limitada (Croft, 1997; Guerin y cols., 2002).
Las limitaciones de la terapia antimonial en perros, como la
induccin deresistencias, ausencia de cura parasitolgica, toxicidad
y alto coste, tambin hanconducido, al igual que en humanos, a la
bsqueda de otras alternativas ms asequibles y de mayor eficacia. Es
difcil establecer en perros una infeccin experimental que mimetice
el curso natural de la infeccin. Por eso, los experimentos
controlados de respuesta a frmacos antiprotozosicos son pocos. Sin
embargo, existen varios trabajos publicados sobre la terapia de la
enfermedad adquirida naturalmente, que evalan aspectos sobre la
respuesta teraputica, como cambios en el estado clnico y parmetros
inmunolgicos (Baneth y Shaw, 2002). As, una buenarespuesta
teraputica est marcada por un descenso en los niveles de
anticuerpos y recuperacin de la inmunidad mediada por clulas
(Deplazes y cols., 1992;Vercammen y cols., 1995; Moreno y cols.,
1999; Rhalem y cols., 1999).
3.1. Eficacia de la anfotericina B.
El agente antifngico anfotericina B ha sido ampliamente
reconocid