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T1 - OPERAO DE UM FERMENTADOR LABORATORIAL PARA
PRODUO DE UMA PROTENA RECOMBINANTE INTRACELULAR,
CITOCROMO b5, POR CLULAS DE Escherichia coli
(2 sesses de laboratrio)
1. Objectivos
O presente trabalho tem por objectivo proporcionar um primeiro
contacto com a
operao de um fermentador, a unidade operacional central da
maioria dos processos
biotecnolgicos que tm por base a produo de biomassa activa
(crescimento celular).
Adicionalmente, pretende-se produzir um caldo fermentativo a
utilizar nos trabalhos
subsequentes, T2 a T4.
2. Introduo
Nas primeiras fases do desenvolvimento laboratorial de um
processo de
produo de biomassa e/ou produto metablico, a operao de
crescimento celular
habitualmente levada a cabo em frascos de incubao, normalmente
de vidro, com
volumes de meio que raramente ultrapassam os 2 litros. Aqui, a
esterilizao prvia do
meio e do prprio frasco de incubao efectuada colocando-os no
interior de uma
autoclave e a inoculao feita transferindo uma poro de cultura de
uma rampa ou
placa de Petri com meio slido directamente para o meio de
crescimento, aps
autoclavagem e arrefecimento. A homogeneizao do contedo do
frasco assegurada
por colocao deste num agitador com movimento orbital ou de
vai-vem. Este agitador
est normalmente contido numa cmara de temperatura controlada,
que permite manter
os frascos agitados temperatura desejada para o crescimento
celular. O mesmo efeito
de agitao responsvel pelo fornecimento de oxignio cultura, por
transferncia
atravs interface que separa o lquido do ar contido nos frascos
de incubao. Esta
transferncia promovida utilizando-se uma razo volume de
meio/volume de frasco
geralmente inferior a 0,2 e, em certos casos, utilizando frascos
com anteparas, que
aumentam a turbulncia no lquido. A renovao da fase gasosa no
frasco assegurada
pela utilizao de rolhas de material permevel a gases (p. ex.,
algodo hidrfobo).
Qualquer medida da qualidade da cultura em incubao (valor de pH,
concentrao de
biomassa ou de solutos no meio, concentrao de oxignio
dissolvido, temperatura)
envolve normalmente a interrupo da incubao para colheita de
amostras do caldo e
sua posterior anlise. A adio de agentes de controlo de pH s pode
ser feita nestas
ocasies.
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Quando o mesmo processo efectuado escala industrial, em
fermentadores
com volumes operacionais que podem ultrapassar a centena de m3,
as condies
operacionais so necessariamente diferentes1. O vaso reaccional
normalmente de ao
inox e esterilizado no local em que est instalado, por injeco de
vapor de gua a alta
presso no seu interior. A inoculao feita a partir de um
fermentador mais pequeno
(10-20% do volume de fermentao, em regra) em que a cultura foi
desenvolvida at
um ponto avanado da fase exponencial de crescimento. Este
pr-fermentador pode ter
sido, por sua vez, inoculado a partir de um fermentador ainda
mais pequeno (dito de
sementeira). Nestes fermentadores em escala industrial, a
homogeneizao
assegurada por um sistema de agitao mecnica interno, com um ou
mais andares de
turbinas (exceptuam-se os fermentadores tipo air-lift). O
fornecimento de oxignio
conseguido atravs de uma corrente de ar comprimido, introduzida
no seio do lquido
por intermdio de uma tubagem de ao perfurada. Esta corrente de
ar filtrada entrada
e sada do fermentador, para excluir contaminaes. A concentrao de
oxignio
dissolvido medida continuamente por um elctrodo esterilizado,
imerso no meio, e
controlada por actuaes na vlvula de admisso de ar comprimido e
na velocidade de
rotao das turbinas de agitao. A temperatura do meio medida por
uma sonda
(termopar) contida numa manga imersa no meio e controlada pela
passagem de fluidos
(normalmente gua) de aquecimento ou de arrefecimento numa camisa
que envolve a
parede lateral do fermentador. O valor de pH medido em contnuo
por um elctrodo
esterilizado imerso no meio e controlado por adio de solues
concentradas de cido
ou base, a partir de reservatrios esterilizados, ligados ao
fermentador principal. A
formao de espuma detectada por uma sonda colocada no topo da
parte interior do
fermentador e anulada pela alimentao controlada de um agente
oleoso anti-espuma
estril. Todo este processo opera com aquisio de dados e controlo
automtico por um
sistema computorizado SCADA (Supervisory Control And Data
Acquisition). Em
paralelo, podem ser colhidas amostras do caldo de fermentao,
para anlises off-line,
sem interrupo do processo, por intermdio de uma vlvula de
amostragem estril.
Um fermentador laboratorial pretende duplicar as condies
descritas no
pargrafo anterior, numa escala pequena. Deste modo, permite-se a
continuao dos
estudos de desenvolvimento do processo, sem custos demasiado
altos, possibilitando
uma previso mais correcta do comportamento da fermentao quando
ela for operada
em escala industrial (scale-up). Um esquema simplificado de um
fermentador
laboratorial dado na Figura 1. Fermentadores laboratoriais com
volumes at 5-10 litros
so ainda esterilizados no interior de autoclaves, sendo
necessrio prever sistemas
rpidos de acoplagem/desacoplagem para o motor de agitao, para as
entradas/sadas
de ar, gua de arrefecimento e solues de controlo de pH e de
espuma, e para as
conexes de sondas e elctrodos unidade de controlo. escala
laboratorial, o controlo
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da temperatura pode utilizar uma manga ou camisa de circulao de
gua fria, para o
arrefecimento, recorrendo normalmente a uma resistncia elctrica,
para o aquecimento.
A etapa de pr-fermentao realizada em frasco de incubao.
No presente trabalho, ser proporcionada a oportunidade de
manipular os
sistemas acima descritos, para um fermentador laboratorial,
incluindo as fases de
preparao para esterilizao, calibrao de elctrodos, montagem aps
esterilizao,
inoculao e acompanhamento da fermentao propriamente dita.
Figura 1 - Esquema simplificado de um fermentador laboratorial;
C - unidades de controlo; B -
bombas.
3. O caso em estudo - produo de citocromo b5 recombinante
O citocromo b5 faz parte de um complexo enzimtico que catalisa a
insaturao
de cidos gordos. Trata-se de uma protena de membrana constituda
por uma nica
cadeia polipeptdica (13.600 Da de peso molecular) e cuja
estrutura terciria apresenta
dois domnios distintos. Um deles de natureza globular e
hidroflica, contendo o grupo
heme que est envolvido em reaces de oxidao, e o outro de
natureza hidrfoba,
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sendo responsvel pela ligao da protena membrana do retculo
endoplsmico. O
domnio hidroflico do citocromo b5 de rato foi clonado em
Escherichia coli (TB1)
atravs da sntese de novo do gene e da sua introduo no plasmdeo
pUC 13, o que
permite a sua produo por fermentao em elevadas concentraes2 (at
8% da
protena total intracelular). Com este vector, esta estirpe de E.
coli resistente a
ampicilina. Assim, este antibitico includo no meio de
crescimento, evitando o
desenvolvimento de estirpes de E. coli que no tenham o vector e
de outros
contaminantes eventualmente presentes no fermentador aps
esterilizao.
Pretende-se operar o fermentador para quantificar a produo de
biomassa e de
citocromo b5, ao longo do tempo, num processo de crescimento
descontnuo (batch),
nas condies operacionais impostas. Esta experincia seria
subsequentemente repetida
para diferentes conjuntos de condies operacionais,
identificando-se assim as variveis
relevantes e o seu efeito, e possibilitando-se a seleco das
melhores opes a utilizar
no scale-up para as escalas piloto e industrial. O processo de
crescimento em batch
inclui as fases usuais, i.e., latncia/arranque, crescimento
exponencial, estacionria e de
lise ou decaimento. Com a inoculao a partir de uma pr-cultura
colhida na sua fase de
crescimento exponencial, pretende-se minimizar a durao da fase
de latncia, que
representa um desperdcio da capacidade produtiva do fermentador.
Por outro lado,
pretende-se identificar o instante da fermentao em que se atinge
a produtividade
mxima, em termos de biomassa e/ou em termos de citocromo b5. O
prolongamento da
fermentao para l deste instante s se justificar caso proporcione
valores mais
elevados de concentrao de biomassa ou citocromo, que facilitem
as etapas
subsequentes de recuperao e purificao. Assim, importante o
traado das curvas de
produo em toda a sua extenso (todas as fases, at lise). Com
estas, possvel a
determinao de valores para a taxa especfica de crescimento (fase
exponencial) e
respectivo tempo de duplicao (equaes 1 e 2, respectivamente), e
para a
produtividade em biomassa e em citocromo b5 (equaes 3 e 4,
respectivamente):
ft
X
X.ln
0
= para >> kd (Eq. 1)
2ln
=dt (Eq. 2)
Pf
biomassa
rtt
XP
+= (Eq. 3)
Pf
citocromocitocromo
rtt
CP
+= (Eq. 4)
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em que X e X0 so as concentraes de biomassa ao tempo de
fermentao tf e
logo aps a inoculao (tf = 0), e kd so as taxas especficas de
crescimento e de morte da biomassa, respectivamente, td o tempo de
duplicao da cultura, tP o tempo
necessrio para a preparao do fermentador, entre duas fermentaes
sucessivas,
Ccitocromo a concentrao de citocromo b5 atingida ao tempo tf,
Prbiomassa e Pr
citocromo so
as produtividades do processo em biomassa e em citocromo b5,
respectivamente,
atingidas ao tempo tf.
4. Procedimento experimental
4.1. Meio de cultura e inculo
A composio do meio de fermentao a seguinte (em gua
destilada):
Peptona 10 g/L
Extracto de levedura 5 g/L
Glucose 10 g/L
NaCl 5 g/L
Ampicilina 100 mg/L
O meio preparado em trs fraces:
a) Dado que a ampicilina termolbil, tem que ser esterilizada por
filtrao, em
soluo concentrada (100 g/L, em gua destilada), e adicionada ao
restante
meio somente aps este ter sido esterilizado e arrefecido at
temperatura
ambiente. Esta soluo fornecida na aula, j preparada e
esterilizada, em
tubos eppendorf.
b) Para evitar reaces de acastanhamento, a glucose esterilizada
parte, por
autoclavagem, em soluo concentrada (200 g/L, em gua destilada)
e
adicionada ao restante meio aps arrefecimento.
c) O restante meio, contendo peptona, extracto de levedura e
NaCl,
esterilizado dentro do fermentador, por autoclavagem, sendo
suplementado
com as fraces a) e b), aps arrefecimento.
Os volumes de meio a utilizar nos dois tipos de fermentador a
operar neste
trabalho so de 1200 e 1500 mL, para os fermentadores Minifors e
Fermac,
respectivamente. Estes volumes correspondem soma das fraces b)
[5%] + c) [95%],
desprezando-se a contribuio por parte da fraco a) [0,1%].
O inculo desenvolvido num frasco do tipo kitasato, num volume de
meio
igual a 10% do volume de meio do fermentador. Uma vez que no
fcil controlar o
valor de pH na incubao em frasco, o inculo crescido em meio sem
glucose, para
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evitar a acumulao excessiva de cidos orgnicos. O meio para o
inculo , assim,
constitudo pelas fraces a), b) e c) nas mesmas propores do meio
de fermentao,
excepto que a fraco b) substituda por gua destilada.
4.2. Preparao dos fermentadores
Neste trabalho sero utilizados fermentadores de 2 litros (volume
til mximo de
1,8 L), modelos Minifors (Infors, Sua; www.infors-ht.com) ou
Fermac 320
(Electrolab, Reino Unido, www.electrolab.biz).
4.2.1. Introduo ao sistema de fermentao
O vaso de fermentao de vidro, assente num sistema de suporte. A
tampa do
vaso em ao inox e nela esto suportados todos os acessrios
operacionais (ao inox),
nomeadamente: o tubo de arejamento perfurado na parte inferior,
o orifcio de sada de
gases encimado por um condensador arrefecido a gua, as anteparas
ou chicanas
internas, a serpentina de arrefecimento (modelo Fermac), o tubo
de recolha de amostras,
a manga que ir conter o sensor de temperatura, vrios tubos para
a entrada de solues,
o eixo de rotao com as turbinas de agitao e os orifcios de
montagem dos elctrodos
de oxignio dissolvido, de pH e de deteco de espuma. Recomenda-se
um exame
atento do vaso, para identificao prvia de todos estes
elementos.
A unidade de controlo apresenta visores para visualizao de
dados, um teclado
para introduo de valores operacionais e para seleco dos modos de
visualizao,
bombas peristlticas para a alimentao de solues, um circuito de
admisso de ar
comprimido (vindo de um circuito local) com vlvula e um rotmetro
(medida e
regulao manual do caudal), um circuito de admisso de gua de
arrefecimento, com
distribuio para o condensador e para a serpentina, um circuito
elctrico que alimenta a
camisa de aquecimento por resistncia elctrica, e suportes para
os frascos que contm
as solues a alimentar (cido, base, anti-espuma). Recomenda-se um
exame atento da
unidade, para identificao prvia de todos estes elementos.
4.2.2. Sensores e sua calibrao
O sensor de temperatura encontra-se ligado unidade de controlo e
no ser
sujeito a calibrao (identific-lo).
O elctrodo de pH disponibilizado imerso em gua destilada. A sua
calibrao
efectuada a dois pontos, com recurso a solues-padro a valores de
pH de 7,00 e
4,00, fora do vaso de fermentao, antes da esterilizao. Para tal,
o elctrodo deve ser
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acoplado unidade de controlo e sujeito ao procedimento de
calibrao indicado pelo
fabricante.
O elctrodo de oxignio dissolvido disponibilizado imerso em gua
destilada.
A sua calibrao efectuada em duas etapas. O ponto zero da escala
(% de saturao)
calibrado fora do vaso de fermentao, antes da esterilizao,
utilizando uma soluo de
sulfito de sdio (agente redutor, 50 mM) e sulfato de cobre
(catalisador, 1 mM),
preparada no momento ( fornecido um copo com os dois reagentes,
j doseados para
dissoluo em 100 mL de gua destilada). O elctrodo deve ser
acoplado unidade de
controlo (localizar previamente o ponto de ligao) e sujeito ao
procedimento de
calibrao especificado para o modelo de fermentador em uso. O
ponto 100 da escala de
saturao calibrado com o elctrodo imerso no meio j esterilizado,
imediatamente
antes da inoculao, ajustando por alguns minutos a velocidade de
agitao a 700 rpm e
o caudal de arejamento a um ponto prximo do mximo da escala do
rotmetro
(saturao do meio em oxignio) e seguindo o procedimento indicado
pelo fabricante.
O sensor de espuma no ser utilizado. A formao de espuma ser
controlada
por alimentao manual de um mnimo de agente anti-espuma (leo de
silicone), por
meio de uma seringa ligada a um dos tubos de alimentao.
4.2.3. Preparao e esterilizao do vaso e acessrios
Na preparao do fermentador para autoclavagem, devem ser
efectuadas as
seguintes operaes:
- Preparar a fraco c) do meio de fermentao, ajustar-lhe o valor
de pH a perto de
7,0 se necessrio (por adio de NaOH ou HCl) e introduzi-la no
fermentador, com
o auxlio de um funil.
- Montar os elctrodos (lavados com gua destilada) nos
respectivos orifcios da
tampa (enroscar com cuidado, sem apertar demasiado); desligar os
cabos de ligao
dos elctrodos unidade de controlo; envolver os topos dos
elctrodos em folha de
alumnio.
- Localizar os topos dos tubos de arejamento e de recolha de
amostras e acoplar-lhes
os troos de tubagem de silicone respectivos, a seringa de
recolha e o filtro de ar,
como esquematizado na Figura 1; colocar pinas de Hoffman nos
troos indicados e
fech-las; colocar algodo hidrfobo na sada do filtro de ar
(desacoplada do
rotmetro) e cobri-la com folha de alumnio; envolver o filtro e a
seringa em folha
de alumnio.
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- Tapar o orifcio da manga do sensor de temperatura com algodo
hidrfobo e folha
de alumnio; o sensor no esterilizado.
- Ligar, a um dos tubos de admisso de solues, um troo de tubagem
ligado a uma
seringa contendo 2-3 mL de leo de silicone; envolver a seringa
em folha de
alumnio.
- Cobrir os restantes tubos de admisso de solues com folha de
alumnio.
- Tapar a ponta da tubagem ligada sada do condensador com algodo
hidrfobo e
folha de alumnio.
- Desacoplar os tubos de admisso de gua de arrefecimento, caso
estejam acoplados
unidade de controlo.
- Desacoplar a camisa elctrica de aquecimento, caso esteja
acoplada ao vaso de
fermentao (a camisa no autoclavada).
- Desacoplar o motor de agitao, caso este esteja acoplado;
cobrir o topo do eixo de
agitao com folha de alumnio.
- Encher os recipientes de alimentao de cido e base com solues a
2N de HCl e
NaOH, respectivamente; fech-los com as tampas correspondentes e
ligar-lhes os
troos de tubagem que passaro pelas bombas (no modelo Minifors,
as tubagens
vo a autoclavar junto com as peas de montagem nas bombas); tapar
a ponta solta
de cada tubagem com algodo e folha de alumnio; colocar uma pina
de Hoffman
bem fechada nesta tubagem, junto ao extremo solto.
- Preparar o meio para o inculo (sem a ampicilina, ver parte
4.1), introduzi-lo num
frasco tipo kitasato de 250-500 mL e tap-lo com rolha de algodo
e folha de
alumnio; na tubuladura lateral do frasco, ligar um troo de
tubagem munido de
uma pea de unio de dimetro compatvel com um dos tubos de admisso
de
solues no vaso de fermentao (ou com o tubo de amostragem); tapar
a pea com
algodo e folha de alumnio; colocar uma pina de Hoffman no troo
de tubagem e
fech-la.
- Preparar a fraco b) do meio de fermentao (soluo de glucose,
ver parte 4.1)
num balo erlenmeyer de 250 mL e tap-lo com rolha de algodo e
folha de
alumnio.
- Reunir 10 seringas autoclavveis de 10 mL, envolver a ponta de
cada uma em folha
de alumnio e coloc-las num copo autoclavvel coberto com folha de
alumnio.
Todos os elementos acima descritos so autoclavados em conjunto,
a 1,1 bar e
121C, durante 20 minutos.
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4.3. Preparao do inculo
O frasco kitasato com o meio de inculo autoclavado e
arrefecido
suplementado, chama, com o volume adequado de soluo de
ampicilina estril. O
meio assim completo inoculado a partir de colnias retiradas duma
placa de Petri
recente (fornecida na aula) e incubado a 37C, com agitao orbital
a 200 rpm, durante
cerca de 12 h.
4.4. Arranque da fermentao
As condies operacionais a implementar na fermentao so as dadas
na Tabela
1. A temperatura e o pH sero controlados a valores fixos,
previamente determinados
como adequados para a produo de citocromo b5 pela presente
estirpe. Condies de
limitao do crescimento pelo oxignio so favorveis sntese deste
produto2. Procura-
se obter estas condies estabelecendo um caudal de arejamento
limitado (valor fixo,
entre 0,5 e 1 vvm) e controlando a concentrao de oxignio
dissolvido a um valor (set-
point do sistema de controlo) o mais prximo possvel de 2%
(escala de saturao),
actuando na velocidade de agitao (entre os limites de 130 e 600
rpm).
Tabela 1. Condies operacionais na fermentao
Parmetro operacional Set-point (ou limites de controlo)
Temperatura
pH
Taxa de arejamento
37 C
7,00 0,05
0,5 - 1,0 vvm (valor fixo)
Concentrao de oxignio dissolvido 2,0 % da saturao
Limites de variao da velocidade de agitao mnimo: 130 rpm
mximo: 600 rpm
Antes da inoculao, so efectuadas as seguintes operaes:
- Arrefecimento dos elementos autoclavados, at temperatura
ambiente.
- Ligao das tubagens de admisso de gua de arrefecimento
(serpentina,
condensador) aos pontos respectivos na unidade de controlo;
abertura da torneira da
rede de gua (se estiver fechada).
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- Ligao da tubagem de admisso de ar ao filtro e abertura da pina
colocada no
troo de ligao ao tubo perfurado; abertura da vlvula da rede de
ar comprimido,
se estiver fechada.
- Acoplagem do motor de agitao.
- Imerso da extremidade da tubagem de sada de ar num recipiente
contendo uma
soluo de hipoclorito comercial (lixvia) diluda 1:2, para preveno
de
contaminaes.
- Colocao da camisa elctrica de aquecimento volta do vaso de
fermentao.
- Introduo do sensor de temperatura na respectiva manga.
- Ligao dos cabos entre os elctrodos e a unidade de
controlo.
- Ligao (power on) da unidade de controlo, se estiver
desligada.
- Ligao da funo de controlo da temperatura, introduo do valor de
set-point e
colocao em servio (posio on), para que o meio seja aquecido at
temperatura
de fermentao.
- Ligao das tubagens dos recipientes de cido e base s bombas
(unidade de
controlo) e aos tubos de admisso de solues ao fermentador (
chama) (retirar as
pinas de Hoffman).
- Ferragem das bombas de admisso de cido e de base, se
necessrio.
- Ligao da funo de controlo do pH, introduo do valor de
set-point e colocao
em servio (posio on), para que o pH do meio seja ajustado, se
necessrio, ao
valor de fermentao.
- Ligao das funes de arejamento e agitao e procedimento de
calibrao do
elctrodo de oxignio ao ponto 100 da escala de saturao (ver parte
4.2.2);
suspenso do arejamento e ajuste da velocidade de agitao a 200
rpm.
- Introduo dos valores de set-point e limites de controlo das
variveis operacionais
(Tabela 1, oxignio dissolvido e agitao) na unidade de
controlo.
O frasco kitasato contendo a cultura de inculo retirado da
estufa de incubao
e suplementado, chama, com as partes a) (soluo de ampicilina) e
c) (soluo de
glucose) do meio de fermentao. Igualmente chama, a tubuladura
lateral do kitasato
ligada a um dos tubos de entrada de solues no fermentador. A
suspenso de inculo
suplementada cuidadosamente transferida para o interior do
fermentador e o tubo
utilizado fechado com a pina. O arejamento ligado e o seu caudal
ajustado no
rotmetro, ao valor operacional. So colocadas em servio (posio
on) as funes de
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controlo de variveis que ainda estiverem desligadas. A fermentao
tem incio neste
instante.
4.5. Amostragem e mtodos analticos
4.5.1. Amostragem
So retiradas amostras de cerca de 4-5 mL, de uma forma assptica
( chama),
utilizando a seringa de amostragem (substituda por uma nova em
cada amostragem) ao
longo da fermentao, para determinao das concentraes de biomassa
e de citocromo
b5. As amostragens ocorrem ao tempo de incio da fermentao e a
cada 30 minutos at
s 2 h de fermentao (5 amostras). So retiradas ainda mais 2-3
amostras no dia
seguinte (entre as 18 e as 24 horas de fermentao). Em cada
amostragem, so anotados
os valores das variveis operacionais e uma breve descrio de
qualquer ocorrncia
digna de registo. A fermentao terminada cerca de 24 horas aps a
inoculao, com
recolha do caldo para posterior processamento.
4.5.2. Determinao da concentrao de biomassa
A concentrao de biomassa determinada por medio da densidade
ptica de
cada amostra a 600 nm, contra um branco de gua destilada. Sempre
que necessrio, as
amostras so diludas em tampo fosfato (20 mM, pH 7,0, fornecido
na aula). A
densidade ptica obtida convertida em teor de biomassa (peso
seco) atravs da curva
de calibrao fornecida (Apndice I). Todas as medies devem ser
feitas em duplicado.
4.5.3. Determinao da concentrao de citocromo b5
A concentrao de citocromo b5 determinada de acordo com os
seguintes
passos:
Centrifugao das amostras (2 1,5 mL, em tubos eppendorf) a 10.000
rpm
(8.900g) durante 8 minutos. Remoo cuidadosa dos sobrenadantes
e
ressuspenso das clulas depositadas em tampo fosfato (20 mM, pH
7,0), at
perfazer o volume inicial.
Ruptura das clulas por sonicao de 3 mL de suspenso celular, num
tubo de vidro
grosso mantido em gelo. Os ultrassons sero produzidos num
sonicador Bandelin
modelo Sonopuls HD 3200
(www.bandelin.com/datenblaetter/labor_e.pdf ; a partir
da pg. 16), munido de um transdutor UW3200 e de uma ponta MS73,
durante um
tempo total de 3 minutos, interrompidos periodicamente para
controlo da
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temperatura em valores de refrigerao. O ciclo ser de 10s on e 5s
off, a uma
potncia de 30 W.
Centrifugao da suspenso de fragmentos celulares (2 1,5 mL, em
tubos
eppendorf) a 14.000 rpm (17.500g), durante 30 minutos, e
recuperao muito
cuidadosa da soluo de citocromo sobrenadante (Ateno: mesmo a
ressuspenso
de uma nfima quantidade de fragmentos celulares causadora de
interferncias no
passo seguinte).
Leitura directa (se possvel, seno diluir com gua destilada) da
absorvncia do
sobrenadante a 410 nm, contra gua destilada, e determinao da
concentrao de
citocromo b5 no homogenato celular, por aplicao da lei de
Lambert-Beer (vide
Apndice II). O coeficiente de extino molar do citocromo b5 a
este comprimento
de onda 410 = 130 mM-1
cm-1
.
As trs ltimas etapas deste procedimento so efectuadas j na sesso
do
Trabalho 2.
5. Informaes a anotar no caderno de laboratrio
Preparar uma tabela em que so registados, para cada amostra:
- A identificao da amostra (1, 2, ...).
- O dia e a hora em que a amostra foi recolhida.
- O valor do tempo de fermentao, a partir do instante de
inoculao.
- Os valores das variveis operacionais, medidos na altura da
amostragem
(temperatura, pH, oxignio dissolvido, velocidade de agitao,
caudal de ar
alimentado).
- Quaisquer observaes pertinentes.
Preparar uma outra tabela em que so registados, para cada uma
das mesmas
amostras atrs registadas:
- A identificao da amostra e respectivos duplicados (p.ex., a,
b).
- O factor de diluio utilizado na leitura da densidade ptica a
600 nm.
- O valor da densidade ptica medida a 600 nm.
- O factor de diluio utilizado na leitura da absorvncia a 410
nm, aps sonicao e
centrifugao.
- O valor da absorvncia medida a 410 nm.
-
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- Quaisquer observaes pertinentes
Nos cabealhos das tabelas, indicar os nomes das variveis, as
unidades em que
so medidas e a preciso da medida.
Elaborar uma lista com as seguintes informaes, indicando, para
os valores
numricos, as unidades e preciso das medidas:
- A marca e o modelo do sistema de fermentao usado.
- O valor do volume de lquido adicionado.
- As marcas e modelos de equipamentos auxiliares utilizados
(espectrofotmetro e
sonicador).
Para todos os reagentes usados (incluindo os utilizados na
preparao das
solues disponibilizadas), anotar a sua marca, referncia e grau
de pureza.
6. Elaborao do resumo alargado (relatrio)
O resumo alargado (relatrio) deste trabalho dever conter:
1) Uma introduo breve a explicar o objectivo do trabalho e os
mtodos usados.
2) Uma descrio do procedimento experimental, de forma resumida,
incluindo
os valores das variveis operacionais e as caractersticas do
fermentador e dos reagentes
usados.
3) Tabelas com os valores medidos para cada amostra (listados
acima)
acrescidos de colunas adicionais com os valores calculados de
concentraes de
biomassa e de citocromo b5, bem como os valores de teor de
citocromo b5 na biomassa.
4) Uma representao grfica da evoluo das concentraes de biomassa
e de
citocromo b5 no fermentador, ao longo do tempo do ensaio, bem
como da evoluo dos
valores de produtividade em biomassa e em citocromo; para os
dois ltimos, fazer uma
estimativa fundamentada do valor de tP.
5) Uma representao grfica dos valores de ln(X/X0) em funo do
tempo de
fermentao, para determinao do valor de .
6) A indicao dos valores e td, bem como dos valores de
produtividade mxima para a biomassa e para o citocromo b5, com os
respectivos tempos de
fermentao associados.
7) Um breve comentrio aos valores experimentais medidos e
calculados, bem
como s circunstncias em que decorreu o trabalho, em
concluso.
-
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7. Bibliografia
1. Fonseca, M. M. e Teixeira, J. A. (2007), Reactores Biolgicos
Fundamentos e
Aplicaes, Lidel, Lisboa.
2. Belo, I. e Mota, M. (1998), Batch and fed-batch cultures of
E. coli TB1 at different
oxygen transfer rates - Effect of stirring and oxygen partial
pressures on cell growth
and cytochrome b5 production, Bioprocess Engineering, 18:
451-455.
8. Apndices
-
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Local de realizao: Laboratrio 7.6.1, Piso 7, Torre Sul.
Docente orientadora: Helena Pinheiro
Docente assistente: Lusa Davies
Tcnico assistente: Ricardo Pereira
Contactos: Torre Sul, Piso 8, Gabinete 8.6.19
ext. 3125 / [email protected]