β-Catenin LRP5/6 LRP5/6 SOST P β-Catenin APC GSK3 Axin Proteasomal degradation p300/CBP TCF/LEF Kremen DKK LRP5/6 WIF-1 Wnt sFRP Wnt Wnt Axin Frat-1 Dsh GSK3 β-Catenin β-Catenin β-Catenin Wnt Regulated Gene Expression Frizzled Frizzled Nuclear Localization 図 1, 古典的 Wnt シグナル経路とその構成因子 細胞培養培地へ外因性 Wnt タンパク質 /Wnt アゴニストもしくは Wnt アンタゴニスト (Dkk) を加えると、本キット に含まれている細胞株のレポーター遺伝子由来のルシフェラーゼ活性が量依存的にアップ / ダウンレギュレートしま す。 Wnt 非活性化状態 Wnt 活性化状態 図 2、Leading Light TM Wnt レポーター細胞における Wnt3a および Dkk-1 タンパク質の量応答 ( 左 ) 細胞を 200ng/ml Wnt-3a 存在下で上図に記載された量の Dkk-1 で処理した。Dkk-1 は Wnt-3a により増加したルシフェラーゼ レベルを量依存的に阻害した。( 中央 ) Leading Light TM Wnt レポーター細胞を、上図に記載された量の Wnt-3a タンパク質を加えて 6 時間インキュベートした。Wnt-3a 処理細胞の化学発光は量依存的に増加した。( 右 ) 細胞を上図に記載された量の LiCl で処理した。 LiCl 処理してから 6 時間後にルシフェラーゼ活性を測定したところ、LiCl 処理細胞の化学発光は量依存的に増加した。 構成内容 特長 品名 品番 包装 希望販売価格 Leading Light TM Wnt Reporter Assay Starter Kit ENZ-61001-0001 1kit \157,000 Enzo Life Sciences, Inc. メーカー略号:ENZ ● Leading Light TM Wnt レポーター細胞株 ( 品番 ENZ-61002-0001) ● Leading Light TM Wnt レポーター細胞株培地パック ( 品番 ENZ-60003-0001) 濃縮成長培地 / 濃縮アッセイ培地 / 凍結培地 ● Leading Light TM Wnt レポーター細胞株分析試薬 ( 品番 ENZ-60004-0001) ルシフェラーゼ基質 / ルシフェラーゼアッセイバッファー /2M 塩化リチウム マウス Wnt-3a/ マウス Dkk-1 TCF/LEF の縦列反復 TATA box ホタルルシフェラーゼ アッセイの原理 品名 品番 包装 希望販売価格 ENZ-61002-0001 ENZ-60003-0001 ENZ-60004-0001 ENZ-60001-C001 ENZ-60002-C005 1ml (2x10 6 cells) 1kit 1kit 1μg 5μg ¥87,000 ¥56,000 ¥61,000 ¥24,000 ¥34,000 Leading Light TM Wnt Reporter Cell Line Leading Light TM Wnt Cell Line Medium Pack Leading Light TM Wnt Cell Line Assay Reagents Wnt-3a, Mouse Dkk-1, Mouse 【関連商品】 Life Sciences ® scientists enabling scientists. 化学発光プレートリーダーによる判定 Leading Light TM Wnt レポーターアッセイ Wnt シグナリングはガンなど の疾患を引き起こすことや 胚発生 ( 神経発達・可塑性、骨発生・形成 ) に多様な役割を果たしている為、非常によく 研究されています。Wnt シグナリング経路に は、ガン、パターン形成、骨形成に関わる古 典的経路 (β- カテニン経路 )、脂質形成、カ ルシウム恒常性、アポトーシスに関わる非古 典的経路 ( 平面内細胞極性経路:PCP)、原 腸成中の細胞接着や移動に関わる Wnt/Ca +2 経路の 3 つに枝分かれした経路があります。 Wnt シグナリング: Wnt signaling 本システムでは、古典的 Wnt シグナリングの様々な Wnt 関連リガンド(Wnt、Dkk など)の機能や活性の解明に有用 です。また、Wnt のアゴニスト又はアンタゴニストとして機能する小分子や抗体の活性スクリーニングにもお使いいた だけます。 ●トランスフェクションは不要: 細胞株、培地、試薬、コントロールが入っています! ●真のエンドポイント検出システム: 完全なパスウェイ研究を可能にするインタクトなパスウェイ ●高感度(Wnt3a EC50 = 45.9nm/mL) ●高い再現性(Z 値 0.74) ●高いシグナルノイズ比: シグナル強調のためのリチウムクロライドは不要! ●ハイスループットスクリーニング対応 Response Ratio [Wnt3a] Wnt3a EC50=46ng/ml Z’=0.74 Maximum Response Ratio=12.4 Amount of Wnt Induced activity remaining [Dkk1 (ng/ml)] Dkk1 EC50=51.5ng/ml Z’=0.81 LiCl EC50=21.9mM Z’=0.66 Fold Increase in Signal [LiCl] 本アッセイにはルシフェラーゼレポーター遺伝子を持つ改 変型 3T3 マウス線維芽細胞株が入っています。この Wnt 経路に焦点を当てた転写因子応答レポーターシステムでは、 ルシフェラーゼレポーター遺伝子は基本的なプロモーター 要素 (TATA box) の制御下にあり、また特許取得済みの Wnt 応答要素 (TCF/LEF) の縦列反復と接合しています。 ルシフェラーゼ活性は細胞培養培地に外因性の Wnt タンパ ク質、アゴニスト、アンタゴニストを加えることで量依存 的に制御されます。