Criopreservação de espermatozóides eqüinos comparando duas curvas de congelamento combinadas com diluentes comerciais: uma análise laboratorial Cryopreservation of equine spermatozoa comparing different freezing rates combined with commercial extenders: laboratorial analysis Terraciano et. al; Ciência Rural, 2008
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Criopreservação de espermatozóides eqüinos
comparando duas curvas de congelamento combinadas
com diluentes comerciais: uma análise laboratorial
Cryopreservation of equine spermatozoa comparing
different freezing rates combined with commercial
extenders: laboratorial analysis
Terraciano et. al; Ciência Rural, 2008
Introdução
BiotécnicasReprodutivas
Preservação e armazenamento
de sêmen
Animais de alto valor zootécnico
Transporte de sêmen
Seguro biológico
Introdução
• Bovinos
Baixos índices de fertilidade
• Lesões celulares
• Desidratação
• Cristais
Curva de congelamento • Leite x ovo
• Amida x glicerol
Modificações
(PARKS & GRAHAM, 1992)(MOORE et al., 2006) (PALMER 1984, VIDAMENT et al.,
2001, ALVARENGA et al., 2005)
Objetivo
Duas curas
Dois diluentes
Estruturais e funcionais
Material e Métodos
Material e Métodos
Puro Sangue Inglês6 anos de idade
Mestiço30 anos de idade
- A cada 3 dias- 10 coletas - Outubro – Dezembro 2006
1ml congelamento
Gel
Material e Métodos
20 µl Motilidade progressiva Motilidade total
Contrate de fase 200x
Material e Métodos
Integridade física da membrana
400 µl sêmen
3 µl PI
2 µl CFDA
- 37°C- 8 minutos
Fluorescência 1000x 100 SPTZ Verde
Material e Métodos
Integridade funcional da membrana
Teste hiposmótico
100mOsmol kg-1
400 x
Enrolamento de cauda
Material e Metodos
FR-1®
Botu-Sêmen®
Botu-Sêmen®
FR-1®
650 G10 min.
- 0,5 ml
A B
Material e Métodos
Curva A
24°C 5°C
(0,3°C min-1)
5°C a -15°C
(10°C min-1)
-15°C até -100°C
(-25°C min-1)
-100°C
(30°C min-)
Palhetas horizontalmente
Estante 3cm acima do nitrogênio
20 minutos imediatamente
-70°C min-1
Curva B
(SPRECKELS, 1994) (KNEIßL, 1993)
Descongeladas a 37°C
Motilidade total Motilidade progressiva Integridade da membrana plasmática Funcionalidade da membrana
plasmática
Material e Métodos
Analise de variância
Teste de Turkey 5%
Minitab 14.1
Analise estatística
Resultados
Parâmetros Avaliados Médias
Motilidade Progressiva 14,2% 6,9
Motilidade Total 70% 18,2
Integridade física da membrana 81,9% 8,9
Integridade funcional da
membrana
71,5% 10,1
Resultados
Quadro 1. Médias dos parâmetros analisados para o sêmen fresco
Resultados
Figura 1. Valores da média e desvio padrão da motilidade progressiva, motilidade total, integridade e
funcionalidade da membrana espermática do sêmen criopreservado com curva automatizada (A) e curva não-
automatizada (B), e os diluentes Botucrio e FR-5. * e # significam diferença significativa entre os diluentes
(P<0,05); & significa diferença significativa entre as curvas de congelamento (P<0,05).
Criopreservação de espermatozóides eqüinos
comparando duas curvas de congelamento combinadas
com diluentes comerciais: uma análise laboratorial