LAPORAN BIOKIMIA I | Penentuan Kadar Glukosa dalam Darah I. Judul Percobaan : Penentuan Kadar Glukosa dalam Darah II. Tanggal Percobaan : Senin, 19 Oktober 2015 III. Tujuan Percobaan : Menentukan kadar glukosa dalam darah IV. Dasar Teori : Gula darah merupakan istilah yang mengacu kepada tingkat glukosa yang ada di dalam darah. Glukosa dibentuk dari senyawa-senyawa glukogenik yang mengalami glukogenesis. Glukoneogenesis memenuhi kebutuhan akan glukosa pada saat karbohidrat tidak tersedia dalam jumlah yang cukup dalam makanan. Pasokan glukosa yang terus menerus diperlukan sebagai sumber energy, khususnya bagi sistem saraf dan eritrosit. Glukosa juga diperlukan di dalam jaringan adipose sebagai sumber gliseralida- gliserol dan glukosa juga mempunyai peran dalam mempertahankan kadar intermediet pada siklus asam sitrat di seluruh jaringan tubuh. Glukosa juga merupakan satu- satunya bahan bakar yang memasok energi bagi otot rangka pada keadaan anaerob (Murray 2006). Gambar 1. Struktur Glukosa Kadar glukosa darah yang diketahui dapat membantu memprediksi metabolismeme yang mungkin terjadi dalam sel dengan kandungan gula yang tersedia. Jika kandungan
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
I. Judul Percobaan : Penentuan Kadar Glukosa dalam Darah
II. Tanggal Percobaan : Senin, 19 Oktober 2015
III. Tujuan Percobaan : Menentukan kadar glukosa dalam darah
IV. Dasar Teori :
Gula darah merupakan istilah yang mengacu kepada tingkat glukosa yang ada
di dalam darah. Glukosa dibentuk dari senyawa-senyawa glukogenik yang mengalami
glukogenesis. Glukoneogenesis memenuhi kebutuhan akan glukosa pada saat
karbohidrat tidak tersedia dalam jumlah yang cukup dalam makanan. Pasokan glukosa
yang terus menerus diperlukan sebagai sumber energy, khususnya bagi sistem saraf
dan eritrosit. Glukosa juga diperlukan di dalam jaringan adipose sebagai sumber
gliseralida-gliserol dan glukosa juga mempunyai peran dalam mempertahankan kadar
intermediet pada siklus asam sitrat di seluruh jaringan tubuh. Glukosa juga merupakan
satu-satunya bahan bakar yang memasok energi bagi otot rangka pada keadaan
anaerob (Murray 2006).
Gambar 1. Struktur Glukosa
Kadar glukosa darah yang diketahui dapat membantu memprediksi
metabolismeme yang mungkin terjadi dalam sel dengan kandungan gula yang
tersedia. Jika kandungan glukosa dalam tubuh sangat berlebih maka glukosa tersebut
akan mengalami reaksi katabolisme secara enzimatik untuk menghasilkan energi.
Namun jika kandungan glukosa tersebut dibawah batas minimum,maka asam piruvat
yang dihasilkan dari proses katabolisme bisa mengalami proses enzimatik secara
anabolisme melalui glukoneogenesis untuk mensintesis glukosa dan memenuhi kadar
normal glukosa dalam darah ( salam serum atau plasma darah ) yaitu 65-110 mg/dL
(3,6-6,1 mmol/L) (Murray 2006).
Deprote inas i Serum Darah
Deproteinasi serum darah dilakukan untuk menghilangkan protein dalam
serum darah agar tidak mengganggu uji-uji yang akan dilakukan selanjutnya. Protein
adalah senyawa yang akan mengalami denaturasi dalam keadaan asam dan
|
menggumpal bila dipanaskan, karena itulah dilakukan pemanasan dan penambahan
asam asetat pada larutan serum darah dan air kemudian terjadi endapan. Endapan
yang terjadi kemudian disaring dan hasil saringan (filtrat) diambil untuk digunakan
pada uji selanjutnya. Protein akan mengalami koagulasi apabila dipanaskan pada suhu
500C atau lebih. Koagulasi ini akan terjadi apabila larutan protein telah mencapai titik
isoelektriknya. Protein terdenaturasi pada titik isoelektriknya masih dapat larut pada
pH diluar titik isoelektrik tersebut. Titik isoelektrik dalam darah ialah 4,88.
Metode Penentuan Kadar Glukosa Darah
Metode Nelson Somogyi
Metode Nelson Somogyi digunakan untuk mengukur kadar gula reduksi
dengan menggunakan pereaksi tembaga-arsenol-molibdat. Prinsip kerja Nelson
Somogyi yaitu tereduksinya jumlah endapan kuprooksida yang bereaksi dengan
arsenomolibdat yang tereduksi menjadi molybdine blue dan warna biru diukur
absorbansinya. Reagen nelson somogyi berfungsi sebagai oksidator antara
kuprooksida yang bereaksi dengan gula reduksi membentuk endapan merah bata.
Dalam hal ini, pereaksi Somogyi merupakan pereaksi tembaga alkali yang
mengandung Na2PO4 anhidrat dengan garam K-Na-tartrat (garam Rochelle),
sedangkan pereaksi Nelson mengandung amonium molibdat
H2SO4.NaHAsO4.7H2O. Dengan membandingkannya terhadap larutan standar,konsent
rasi gula dalam sampel dapat ditentukan. Reaksi warna yang terbentuk dapat
menentukan konsentrasi gula dalam sampel dengan mengukur absorbansinya. Reaksi
Pada penambahan reagen Cu Alkalis, ion kupri (Cu+) akan direduksi oleh gula
menjadi kupro (Cu2+) dan mengendap sebagai Cu2O (kuprooksida). Dengan
menambahkan reagen arsenomolibdat, kuprooksida melarut lagi dan warna larutan
akan berubah menjadi biru jernih. Penambahan larutan Ba(OH)2 sebelumnya juga
membantu terjadinya reduksi ion Cu2+ karena reaksi terjadi dalam suasana basa.
Intensitas warna larutan adalah ukuran banyaknya gula yang ada di dalam filtrat
(Girindra 1999).
Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri adalah salah satu cara yang dapat digunakan dalam
penentuan kadar glukosa dalam darah. Spektrofotometri merupakan metode analisis
yang didasarkan pada absorpsi radiasi elektromagnet. Cahaya terdiri dari radiasi
terhadap gelombang dengan panjang berlainan akan menimbulkan cahaya yang
berlainan sedangkan campuran cahaya yang berbeda panjang gelombangnya ini akan
menyusun cahaya putih. Cahaya putih meliputi seluruh spektrum nampak 400-760
mm. Spektrofotometri terjadi karena adanya perpindahan elektron dari tingkat energi
yang rendah ketingkat energi yang lebih tinggi. Perpindahan elektron tidak diikutioleh
perubahan arah spin, hal ini dikenal dengan sebutan tereksitasi singlet.
Besar penyerapan cahaya (absorbansi) dari suatu kumpulan atom/molekul
dinyatakan oleh Hukum Beer-Lambert. Hukum Lambert menyatakan bahwa proporsi
berkas cahaya datang yang diserap oleh suatu bahan/medium tidak bergantung pada
intensitas berkas cahaya yang datang. Hukum Lambert ini tentunya hanya berlaku jika
di dalam bahan/medium tersebut tidak ada reaksi kimia ataupun proses fisis yang
dapat dipicu atau diimbas oleh berkas cahaya datang tersebut. Perubahan warna yang
terjadi diamati dan intensitas warnanya diamati dengan spektronik-20 pada panjang
gelombang 660 nm (Lehninger 1982)
Dengan menggunakan Hukum Lambert-Beer konsentrasi glukosa dalam darah
dapat ditentukan . hukum Lambert-Beer menyatakan :
A= k × C × l
Dimana :
A = absorbansi (serapan cahaya)
k = koefisien ekstingsi molar larutan
l = tebal kuvet
|
C = konsentrasi sampel
Berdasarkan hukum Lambert-Beer, serapan cahaya berbanding lurus dengan
konsentrasinya.
Pengamatan dengan spektronik-20 menggunakan prinsip hukum Lambert
Beer. Faktor yang mempengaruhi adalah konsentrasi larutan dan bentuk wadah.
Bagian sinar yang diserap akan tergantung pada berapa banyak molekul yang
beinteraksi dengan sinar. Jika zat warna tersebut berupa larutan pekat, maka akan
diperoleh absorbansi yang sangat tinggi karena ada banyak molekul yang berinteraksi
dengam sinar. Akan tetapi, dalam larutan yang sangat encer, sangat sulit untuk
melihat warnanya. Absorbansinya sangat rendah. Bentuk wadah yang semakin
panjang akan mempengaruhi panjang larutan sehingga sinar akan lebih banyak diserap
karena sinar berinteraksi dengan lebih banyak molekul (Murray 2006).
Metode Lain
Metode lainnya yaitu metode kondensasi dan metode enzimatik. Glukosa (dan
aldosa lain) dapat berkondensasi dengan macam-macam senyawa aromatik dalam
suasana asam panas membentuk produk-produk yang berwarna. Hidroksimetilfurfural
terbentuk dari glukosa dalam larutan asam kuat panas. Gugus aldehida dari produk ini
berkondensasi dengan suatu fenol untuk menghasilkan senyawa hijau yang dapat
diukur secara spektrofotometrik. Kadar glukosa darah diukur dengan metode
enzimatik (glukosa oksidase) menggunakan alat glukometer.
Prinsip kerja penggunaan alat tersebut yaitu oksigen dengan bantuan enzim
glukosa oksidase mengkatalis proses oksidasi glukosa menjadi asam glukonat dan
hidrogen peroksida. Enzim peroksidase dalam reaksi kedua mengkatalisis reaksi
oksidasi kromogen (akseptor oksigen yang tidak berwarna), kemudian oleh hidrogen
peroksidase membentuk suatu produk kromogen teroksidasi berwarna biru yang
diukur dengan glukometer. Tes strip pada glukometer mengandung bahan kimia
glukosa oksidase kurang lebih 0,8 IU, garam naftalena, asam sulfat 42 µg, dan 3-
metil-2-benzothiazolin hidrazon.
|
V. Alat dan Bahan :
Alat – alat :
1. Sentrifuge
2. Spektrofotometer UV-Vis
3. Tabung Reksi 10 buah
4. Kompor listrik 1 buah
5. Gelas Ukur 10mL 1 buah
6. Labu ukur 25mL 1 buah
7. Pipet tetes 10 buah
8. Gelas Kimia 400mL 2 buah
Bahan – bahan :
1. Larutan Cu Alkalis
2. Larutan Ba(OH)2 0,3 N
3. Larutan ZnSO4.7H2O 5%
4. Larutan standart glukosa 1 mg/L
5. Pereaksi Arsenomolibdat
6. Aquades
7. Sampel darah
VI. Cara Kerja :
1. Deproteinasi filtrat darah
|
2. Penentuan kadar glukosa darah
3. Penentuan kurva standar
Hasil pengamatan
Filtrat
1,9 mL aquades
- dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge- ditambahkan 3 tetes darah- dicampur- ditambahkan 1,5 mL Ba(OH)2 0,3N- diaduk hingga merata- ditambahkan 1,5 mL ZnSO4.7H2O 5%- dicampurkan dengan baik- didiamkan selama 5 menit- disentrifuge selama 30 menit- didekantasi
- diuji biuret
|
Absorbansi
1 mL darah bebas protein
- dimasukkan ke dalam tabung reaksi- ditambahkan 1 mL reagen Cu alkalis- dimasukkan ke dalam air mendidih selama 20 menit- didinginkan dalam air dingin selama 10 menit- diaduk hingga merata- ditambahkan 1 mL reagen arsenomolibdat- diaduk sampai merata- diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis (λ=660 nm)
4. Larutan blanko
Absorbansi
1 mL glukosa 0,2 mg/mL
- dimasukkan ke dalam tabung reaksi- ditambahkan 1 mL reagen Cu alkalis- dimasukkan ke dalam air mendidih- didinginkan dalam air dingin- diaduk hingga merata- ditambahkan 1 mL reagen arsenomolibdat- diaduk sampai merata- diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis (λ=660 nm)
Absorbansi
1 mL aquades
- dimasukkan ke dalam tabung reaksi- ditambahkan 1 mL reagen Cu alkalis- dimasukkan ke dalam air mendidih- didinginkan dalam air dingin- diaduk hingga merata- ditambahkan 1 mL reagen arsenomolibdat- diaduk sampai merata- diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis (λ=660 nm)
|
1 mL glukosa 0,4 mg/mL
1 mL glukosa 0,6 mg/mL
1 mL glukosa 0,8 mg/mL
VII. Hasil Pengamatan
No. Perc.
Prosedur PercobaanHasil Pengamatan
Dugaan / Reaksi KesimpulanSebelum Sesudah
1 Deproteinasi filtrat darah- Aquades: tak
berwarna- Sampel
darah : berwarna merah
- Ba(OH)2 : tak berwarna
- ZnSO4.H2O 5% : tak berwarna
- Sampel 1 : Qod
- Sampel 2 : Azah
- Aquades + sampel 1 : larutan berwarna merah
- Aquades + sampel 2 : larutan berwarna merah
- Sampel 1 dan 2 + Ba(OH)2 : Larutan berwarna merah, terdapat endapan merah
- Sampel 1 dan 2 + ZnSO4.H2O 5%: larutan menjadi 2 fasa. Lapisan atas : berwarna
- Filtrat yang diperoleh adalah filtrat darah bebas protein
- Fungsi dari aquades mengencerkan darah sehingga albumin yang merupakan protein dalam darah dapat larut
- Fungsi dari Ba(OH)2 mengendapkan albumin
- Fungsi ZnSO4.H2O 5% untuk mempercepat reaksi pengendapan albumin oleh Ba(OH)2
Filtrat darah bebas protein
- diuji biuret
- dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge- ditambahkan 3 tetes darah- dicampur- ditambahkan 1,5 mL Ba(OH)2 0,3N- diaduk hingga merata- ditambahkan 1,5 mL ZnSO4.7H2O 5%- dicampurkan dengan baik- didiamkan selama 5 menit- disentrifuge selama 30 menit- didekantasi
1,9 mL aquades
Filtrat
Berwarna biru
|
No. Perc.
Prosedur PercobaanHasil Pengamatan
Dugaan / Reaksi KesimpulanSebelum Sesudah
merah. Bawah : tak berwarna
- Sampel 1 dan 2 di sentrifuge : tak berwarna, terdapat gumpalan darah di bawah tabung
- Sampel 1 diuji biuret : larutan berwarna biru
- Sampel 2 diuji biuret : larutan berwarna biru
|
No. Perc.
Prosedur PercobaanHasil Pengamatan
Dugaan / Reaksi KesimpulanSebelum Sesudah
2. Penentuan kadar glukosa darah - Filtrat darah bebas protein : larutan tak berwarna
- Pereaksi Cu alkalis : larutan berwarna biru
- Pereaksi arsenomolibdat : larutan tak berwarna
- Filtrat I + Cu alkalis : larutan berwarna biru kehijauan
- Filtrat 2 + Cu alkalis : berwarna biru
- Filtrat I dipanaskan : larutan tak berwarna, endapan biru kehijauan
- Filtrat 2 dipanaskan : larutan tak berwarna, endapan berwarna biru
- Filtrat I dan 2 di dinginkan: larutan berwarna biru,
Kadar glukosa pada sampel darah :I : 85, 24 mg/100mLII : 75,73 mg/100mL
- dimasukkan ke dalam tabung reaksi- ditambahkan 1 mL reagen Cu alkalis- dimasukkan ke dalam air mendidih- didinginkan dalam air dingin- diaduk hingga merata- ditambahkan 1 mL reagen arsenomolibdat- diaduk sampai merata- diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis (λ=660 nm)
1 mL darah bebas protein
Absorbansi
|
No. Perc.
Prosedur PercobaanHasil Pengamatan
Dugaan / Reaksi KesimpulanSebelum Sesudah
endapan biru
- Filtrat I dan 2 + arseno molibdat, setelah itu dikocok: larutan berwarna biru
- Diukur absorbansi :
- Absorbansi sampel I : 0,3
- Absorbansi sampel 2 : 0,223
3. Penentuan kurva standar - Larutan glukosa : tak berwarna
- Pereaksi Cu alkalis : larutan berwarna biru
- Pereaksi arsenomolibdat : larutan tak
- Larutan glukosa konsentrasi 0,2 0,4 0,6 0,8 + Cu alkalis : berwarna biru
- Dipanaskan- Larutan
glukosa 0,2mg/ml:
Semakin besar konsentrasi maka nilai absorbansi juga semakin besar.Persamaan kurva standar yang diperoleh :Y = 0,8095x – 0,39R2 = 0,9781
- dimasukkan ke dalam tabung reaksi- ditambahkan 1 mL reagen Cu alkalis- dimasukkan ke dalam air mendidih- didinginkan dalam air dingin- diaduk hingga merata- ditambahkan 1 mL reagen arsenomolibdat- diaduk sampai merata- diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis (λ=660 nm)
1 mL glukosa berbagai konsentrasi
Absorbansi
|
No. Perc.
Prosedur PercobaanHasil Pengamatan
Dugaan / Reaksi KesimpulanSebelum Sesudah
0,4 mg/ml : berwarna jingga (+)Larutan glukosa 0,6 mg/ml : berwarna jingga (++)Larutan glukosa 0,8 mg/ml : berwarna jingga (+++)- + pereaksi
Arsenomolibdat :
Glukosa 0,2 mg/ml : berwarna biruGlukosa 0,4 mg/ml : berwarna biru (+)Glukosa 0,6 mg/ml : berwarna biru (++)Glukosa 0,8 mg/ml : berwarna biru (+++)- Diukur
- dimasukkan ke dalam tabung reaksi- ditambahkan 1 mL reagen Cu alkalis- dimasukkan ke dalam air mendidih- didinginkan dalam air dingin- diaduk hingga merata- ditambahkan 1 mL reagen arsenomolibdat- diaduk sampai merata- diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis (λ=660 nm)
1 mL aquades
Absorbansi
|
VIII. Analisis dan Pembahasan
1. Deproteinasi Filtrat Darah
Pada percobaan ini bertujuan untuk memperoleh sampel filtrate darah yang
bebas protein. Pertama yang harus dilakukan adalah dimasukkan 3 tetes darah ke
dalam tabung sentrifuge yang telah berisi 1,9 mL aquades. Terdapat 2 sampel
darah yang diambil dari anggota kelompok kami. Penambahan aquades bertujuan
untuk mengencerkan darah yang digunakan sehingga albumin dalam darah akan
larut. Albumin adalah protein yang larut dalam air serta dapat terkoagulasi dalam
darah dan terdapat dalam serum darah. Kemudian ditambahkan 1,5 mL Ba(OH)2
0,3 N tak berwarna, larutan darah berwarna merah. Fungsi penambahan Ba(OH)2
adalah sebagai pemberi suasana basa dan juga untuk mengendapkan albumin
yang terlarut dalam air. Lalu ditambahkan 1,5 mL ZnSO4.7H2O 5% tak
berwarna, larutan darah mulai mengendap ke bagian atas. Setelah itu larutan di
diamkan selama 5 menit, dimana tujuannya agar terjadi endapan albumin secara
sempurna. Penambahan ZnSO4.7H2O 5% ini berfungsi sebagai katalisator untuk
mempercepat reaksi pengendapan albumin oleh Ba(OH)2 dan juga untuk
mengendapkan serta mendenaturasi protein secara sempurna.
Langkah yang dilakukan selanjutnya adalah sentrifugasi selama 10 menit
dengan kecepatan 3000. Sentrifugasi dilakukan berdasarkan berat jenis protein
yang lebih besar dari glukosa agar terjadi endapan albumin secara sempurna,
sehingga endapan tersebut dapat dipisahkan dengan cara dekantasi. Hasil
sentrifuge berupa larutan tak berwarna dan endapan merah. Bagian yang tak
berwarna merupakan filtrate darah bebas protein sedangkan bagian yang
mengendap merupakan albumin darah. Kemudian dilakukan dekantasi pada
filtrate tersebut yang merupakan filtrate darah bebas protein. Proses pengendapan
tersebut dilakukan untuk memisahkan protein dari glukosa karena akan
mengganggu pengukuran. Lalu dilakukan uji biuret untuk memastikan bahwa
filtrat darah telah bebas protein. Ditambahkan 1 tetes biuret pada kedua sampel
filtrat darah, dan ternyata larutan berwarna biru yang menandakan bahwa filtrat
tersebut telah benar – benar bebas protein.
2. Penentuan Kadar Glukosa Darah
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar glukosa darah pada
sampel filtrat bebas protein dari percobaan pertama. 1 mL filtrat bebas protein
|
hasil sentrifuge tak berwarna dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya
ditambahkan 1 mL larutan Cu alkalis berwarna biru dan menghasilkan larutan
berwarna biru. Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam air yang mendidih
selama 20 menit dan terdapat endapan berwarna biru kehijauan. Pemanasan ini
bertujuan untuk mempercepat laju reaksi oleh Cu alkalis. Lalu larutan
dimasukkan kedalam air dingin selama 10 menit untuk menstabilkan larutan
sebelum direaksikan dengan reagen arsenomolibdat sehingga menghasilkan
warna biru. Kemudian ditambahkan 1 mL reagen arsenomolibdat menghasilkan
larutan berwarna biru (+). Fungsi dari penambahan pereaksi Cu alkalis dan
arsenomolibdat yaitu dimana glukosa darah akan mereduksi ion Cu2+ menjadi Cu+
dalam suasana basa. Pada suasana basa, bentuk enadiol pada glukosa menjadi
dominan dan mereduksi ion kupri (Cu2+). Cu+ akan membentuk endapan jingga
merah Cu2O. Cu+ akan bereaksi oksidasi dengan arseno molibdat menghasilkan
warna biru. Hal tersebut sesuai reaksi yang terjadi :