LAPORAN RESMI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN UNIVERSITAS KATOLIK SOEGIJAPRANATA SEMARANG

LAPORAN RESMI PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

PENGECATAN BAKTERI

DISUSUN OLEH :

Nama : Angga Teja Kusuma

NIM : 0470.0006

Kelompok : B4

2005

JURUSAN TEKNOLOGI PANGANFAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

UNIVERSITAS KATOLIK SOEGIJAPRANATASEMARANG

1. PENDAHULUAN

1.1 Tinjauan Pustaka

Untuk mengamati sel – sel suatu mikroorganisme digunakan

suatu cara yang disebut pewarnaan. Hal ini mutlak

diperlukan karena sel mikroorganisme yang tidak diwarnai

umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila

diamati dengan mikroskop cahaya biasa sehingga sukar

dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang

hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat

cair (Hadioetomo, 1993).

Pengamatan terhadap bakteri, lebih sering dilakukan dengan

olesan terwarnai, daripada bakteri dalam keadaan hidup.

Artinya, mikroorganisme yang akan diamati telah diberi zat

pewarna kimia supaya lebih mudah dilihat dan dipelajari.

Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai dapat mengungkapkan

ukuran, bentuk, susunan dan ada atau tidaknya struktur

internal seperti spora dan butiran (Volk dan Wheller,

1993).

Bakteri merupakan mikroorganisme yang menempati golongan

prokariotik, karena tidak memiliki dinding inti yang jelas

atau belum memiliki dinding inti yang sejati, sehingga

semua bagian intinya tersebar di dalam sitoplasma secara

bebas. Tetap memiliki faktor pembawa sifat yang tersimpan

di dalam DNA yang berada di dalam kromosom namun tersebar

luas dan bebas di dalam sitoplasma. Bukan berarti tidak

memiliki inti namun hanya saja tidak memiliki dinding inti

yang jelas sehingga tampak tidak berinti sel. Beberapa

sifat morfologi bakteri perlu diperhatikan karena

pertumbuhannya di dalam makanan dan juga karena bakteri

memiliki ketahanan cukup tingggi selama pengolahan dengan

panas maupun dengan suhu dingin (Schlegel & Schmidt,1994).

Pengecatan sederhana dapat digunakan untuk melihat

morfologi dan komposisi sel bakteri karena asam nukleat

bakteri dan beberapa jenis komponen dinding sel tertentu

bermuatan negatif yang akan saling tarik-menarik dan

berikatan kuat dengan metilen blue, sehingga terbentuklah

warna sel biru (Cappuccino & Sherman, 1983).

Menurut Lay (1994), ada 3 jenis pengecatan yang dapat

digunakan pada pengecatan bakteri ini. Yaitu pengecatan

sederhana, pengecatan gram, dan pengecatan endospora.

Pengecatan sederhana adalah pewarnaan yang paling

sederhana, dimana pada pengecatan ini hanya dilakukan

dengan penambahan satu zat pewarna atau hanya melalui satu

tahap pewarnaan saja pada olesan bakteri. Pengecatan gram

adalah pewarnaan atau pengecatan dengan melalui beberapa

tahap pengecatan dengan beberapa reagen yang berbeda.

Pengecatan endospora adalah pengecatan yang bertujuan untuk

mengamati endospora, dimana tidak semua jenis bakteri mampu

membentuk endospora.

Pewarnaan bakteri dapat dibedakan atas beberapa golongan,

yang meliputi :

a. Pewarnaan sederhana

b. Pewarnaan diferensial

pewarnaan gram

pewarnaan asam cepat (acid-fast)

c. pewarnaan struktural

pewarnaan inti sel (Feulgen), yaitu pewarnaan

inti sel bakteri

pewarnaan endospora, yaitu pewarnaan spora

bakteri

pewarnaan dinding sel, yaitu pewarnaan dinding

sel dari bakteri

pewarnaan kapsul, yaitu pewarnaan kapsul yang

dibentuk oleh bakteri

pewarnaan flagella, yaitu pewarnaan flagel / alat

gerak bakteri

d. pewarnaan untuk menguji komponen dalam sel seperti

Glikogen, Lipida.

(Fardiaz, 1992).

Bentuk dan ukuran mikrobia merupakan karakteristik yang

penting untuk identifikasi. Adapun 3 bentuk dasar sel

bakteri : batang (baccil), bulat (coccus), dan lengkung

(koma, vibrion, dan spiral). Bentuk bakteri yang paling

dikenal ada 2 macam, yaitu batang dan bulat (Timotius,

1982).

Hubungan bakteri dengan zat perwarna basa yang menonjol

disebabkan oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar

dalam protoplasma sel. Jadi jika bakteri diwarnai, muatan

negatif dalam asam nukleat bakteri bereaksi dengan ion

positif zat pewarna basa. Oleh karena itu, pada percobaan

digunakan metilen loeffer yang memiliki sifat basa dan

alkalin sebagai pewarna sederhana. Pewarna alkalin lain

yang umumnya digunakan dapat berupa pewarna basa seperti

metylen blue, basic fuschin, dan violet kristal (Volk dan

Wheller, 1993).

Hal yang penting yang mempengaruhi keberhasilan pada

pengecatan bakteri adalah penyiapan preparat yang baik

yakni tidak terlalu tebal atau tidak terlalu tipis, biakan

dapat tetap melekat pada gelas preparat selama pencucian

berulang-ulang, sel-selnya tidak berubah bentuk setelah

fiksasi dan pengecatan. Selain penyiapan preparat,

pengolesan bakteri pada gelas benda tidak boleh terlalu

tebal ataupun terlalu tipis. Sebab jika olesannya terlalu

tebal, maka sel-sel bakteri akan bertumpang tindih,

sehingga ketika bagian selnya tidak bisa teramati dengan

jelas bila dilihat di bawah mikroskop, dan juga akan

menylitkan dalam pewarnaan. Apabila terlalu tipis, hal yang

dikhawatirkan adalah akan banyak sel yang hilang saat

pencucian sehingga bisa saja semua bakteri akan hilang

akibat pencucian selain itu mengingat kecilnya sel bakteri,

sehingga akan menyulitkan dalam pengamatan (Hadioetomo,

1993).

Pada setiap proses pengecatan yang dilakukan, baik

pengecatan sederhana, pengecatan gram, ataupun pengecatan

endospora, selalu dilakukan proses fiksasi. Proses fiksasi

ini dilakukan dengan cara melewatkan gelas benda pada nyala

api spirius beberapa kali selama 1-2 detik. Proses ini

bertujuan untuk lebih melekatkan bakteri pada gelas benda

dan mematikan bakteri, karena sebenarnya bakteri yang hidup

tidak dapat diamati, karena pada bakteri hidup, selnya

tidak mengandung pigmen atau transparan, karena indeks bias

sitoplasmanya hampir sama dengan indeks bias lingkungannya

yang bersifat cair (Lay, 1994).

Pengecatan deferensial merupakan pengecatan yang memiliki

keunggulan dalam mengelompokkan bakteri, karena dengan

pengecatan ini bakteri bisa digolongkan menjadi bakteri

gram positif dan gram negatif. Dimana hal yang

membedakannya adalah lapisan membran selnya, untuk bakteri

gram negatif hanya memiliki 5-20% peptidoglikan sedangkan

bakteri gram positif memiliki 90% peptidoglikan di dalam

membran selnya, dan dengan adanya peptidoglikan yang tebal

meyebabkan bakteri tersebut tidak mudah terdehidrasi saat

pelarutan ataupun pemanasan sehingga cat yang sudah masuk

tidak dapat keluar lagi. Disamping itu ada pula faktor lain

yang dapat mempengaruhi sifat gram negatif dan gram

positif, yaitu penyiapan preparat yang terlalu tebal

menyebabkan pelarutan kurang baik, konsentrasi dan

kesegaran bahan untuk pewarna, waktu pelarutan yang terlalu

lama menyebabkan warna pada sel bakteri gram positif ikut

terlarut, pencucian dan pengeringan yang mempengaruhi

keberadaan iodin, serta umur bakteri yang mempengaruhi

keutuhan bakteri (Trihendrokesowo, 1989).

Pengecatan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat

berguna dan paling benyak digunakan dalam laboratorium.

Selain itu pengecatan gram merupakan tahap penting dalam

pencirian dan identifikasi bakteri. Pengecatan gram ini

dapat digunakan untuk memilah bakteri menjadi kelompok gram

negatif atau gram positif (Lay, 1994).

Dalam pengecatan gram pada bakteri, digunakan zat warna

primer (violet kristal), larutan mordan (iodin), bahan

peluntur (alkohol), dan zat warna penutup (safranin).

Larutan mordan berfungsi untuk meningkatkan afinitas

pengikatan zat warna oleh bakteri, sehingga pengikatan zat

warna oleh bakteri menjadi lebih kuat, memperjelas zat

warna, mempersulit pelarutan zat warna, dan menyebabkan

terbentuknya persenyawaan kompleks kristal violet-yodium.

Sedangkan etanol, berfungsi untuk melunturkan zat warna

primer dengan daya kerja lambat, sehingga memperkecil

kemungkinan terjadinya pemucatan yang berlebihan. Fungsi

penambahan zat warna penutup adalah sebagai pembeda

(kontras) terhadap zat warna primer, dan juga untuk

mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan zat warna

primernya (Lay, 1994).

Perbedaan antara bakteri bergram negatif dan bakteri

bergram positif disebabkan oleh perbedaan struktur dinding

sel bakteri gram-positif dan gram-negatif, sehingga

menyebabkan perbedaan larutan pemucat. Sebagian besar

dinding sel bakteri gram-positif terdiri dari

peptidoglikan, sedangkan dinding sel bakteri gram-negatif

mempunyai kandungan lipida yang tinggi dibandingkan dinding

sel bakteri gram-positif. Lipida ini akan larut dalam

alkohol dan aseton yang digunakan sebagai larutan pemucat,

sehingga pori-pori dinding sel membesar dan meningkatkan

daya larut kompleks kristal-violet-yodium pada dinding sel

bakteri gram-negatif. Selain itu yang menyebabkan adanya

perbedaan antara bakteri bergram negatif dengan bakteri

bergram positif adalah pada bakteri gram-positif akan

terbentuk persenyawaan kompleks kristal-violet-yodium

ribonukleat yang tidak larut dalam larutan pemucat.

Persenyawaan kompleks ini tidak terbentuk pada bakteri

gram-negatif sehingga diduga adanya perbedaan kandungan

asam ribonukleat antara bakteri gram-positif dan gram-

negatif. Faktor-faktor lain yang juga dapat menentukan

jenis gram bakteri, yaitu pelaksanaan fiksasi panas

terhadap olesan, kerapatan sel pada olesan, konsentrasi dan

umur reagen-reagen yang digunakan, sifat dan konsentrasi

dan jumlah pemucat yang dipakai, serta sejarah biakan

(Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan gram ini memilahkan bakteri menjadi kelompok

bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif

berwarna ungu disebabkan kompleks zat warna kristal violet-

yodium tetap dipertahankan meskipun diberi larutan pemucat

sedangkan bakteri gram negatif berwarna merah karena

kompleks tersebut larut sewaktu pemberian larutan pemucat

dan kemudian mengambil zat warna yang kedua yaitu Safranin

yang menyebabkan sel menjadi berwarna merah. Fungsi zat

warna kedua hanyalah sebagai pembeda (kontras) terhadap zat

warna kristal violet (Capuccino & Sherman, 1983).

Jenis bakteri yang termasuk gram positif adalah famili

Micrococcaceae seperti Microsoccocus, Staphylococcus dan famili

Streptococcaceae seperti Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus,

Aerococcus. Streptococcus merupakan bakteri berbentuk bulat yang

hidup secara berpasangan, atau membentuk rantai pendek dan

panjang tergantung dari spesies dan kondisi pertumbuhannya

(Fardiaz, 1992).

Beberapa jenis bakteri yang merupakan jenis bakteri gram

(-) adalah Eschericia coli, Enterobacter aerogenes, dan kelompok

Pseudomonas. Sedangkan yang termasuk bakteri gram (+) adalah

kelompok Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Streptococcus.

(Hadioetomo, 1993).

Menurut Hadioetomo (1993), ada empat reagen yang digunakan

dalam pengecatan gram

Cat utama, yaitu larutan violet kristal

Mordan, yaitu senyawa yang digunakan untuk

mengindentifikasikan cat utama (kompleks antara cat

utama dengan senyawa yang dicat lebih baik) misalnya

larutan iodine

Bahan peluntur (decolorizing agent) yaitu solvent organik

(alkohol atau aseton) yang dapat digunakan untuk

melunturkan cat utama

Cat penutup seperti safranin, digunakan untuk mewarnai

kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utamanya

setelah dilunturkan. Karena cat penutup harus berbeda

dengan cat utama.

Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada

beberapa jenis bakteri. Endospora berbentuk sangat padat

dan bersifat sangat refraktif bila dilihat di bawah

mikroskop, karena kandungan airnya sangat rendah. Endospora

sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa, karenanya harus

digunakan pewarna spesifik, dan yang biasa digunakan adalah

pewarna hijau malasit (malachite green) (Fardiaz, 1992).

Endospora hanya terdapat dalam bakteri berbentuk batang

(basilus) dan dapat dilihat dengan pewarnaan endospora.

Pada umumnya, bakteri pembentuk endospora memang berbentuk

batang, dan setelah membentuk endospora sporangium, bakteri

akan mati lalu mengalami lisis (pemecahan membran sel).

Spora bekas lisis memiliki ukuran cukup besar, sehingga

dapat terlihat jelas pada mikroskop. Spora bekas inilah

yang menunjukkan adanya endospora (Lay, 1994).

Dalam percobaan pengecatan endospora, setelah penetesan

pewarna malachite green, dilakukan pemanasan. Pemanasan ini

bertujuan untuk mengembangkan lapisan luar spora yang

bersifat tahan terhadap perubahan faktor luar, yang dalam

hal ini adalah penambahan bahan kimia berupa larutan

pewarna malachite green, sehingga zat warna malachite green dapat

masuk ke dalam spora. Setelah didinginkan, warna hijau

tersebut terperangkap dalam spora, sehingga struktur

endospora dapat diamati (Lay, 1994).

Pengecatan bakteri akan berhasil, jika sebelum melakukan

pengecatan diperlukan penyiapan preparat yang baik, yaitu

tidak terlalu tebal atau terlalu tipis, tetap melekat pada

gelas preparat selama pencucian berulang-ulang, sel-selnya

tidak berubah bentuk atau morfologi setelah fiksasi dan

pengecatan (Hadioetomo, 1993).

1.2 Tujuan Praktikum

Tujuan praktikum ini adalah mengetahui cara pengecatan pada

bakteri dan yeast yang benar. Mengamati bentuk dari bakteri

dan yeast. Mengetahui cara pengelompokan bakteri dalam gram

positif atau gram negatif.

2. MATERI DAN METODA

2.1 Materi

2.1.1 Bahan

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah larutan

violet kristal, lugol, alkohol 95%, larutan safranin,

larutan malachite green, metilen blue.

2.1.2 Alat

Peralatan yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas

objek, ose, mikroskop, bunsen, Bacillius subtilis, Streptococcus

thermophilus, Echerichia coli, Sacharomyses cerevisiae.

2.2 Metoda

2.2.1 Pengecatan sederhana

Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat diberi

aquades 1 tetes kemudian ditambahkan biakan (B. Subtilis, S.

Thermophilus) sedikit dengan menggunakan jarum ose.

Dibiarkan dulu sampai kering dan difiksasi, setelah

difiksasi diberi perwarna violet kristal. Setelah itu

dipanaskan 3 menit tetapi jangan sampai kering, jika mulai

kering ditambahkan violet kristal 1 tetes lagi. Kemudian

dicuci dengan air mengalir dan alkohol, Setelah itu

dikeringkan. Setelah kering ditetesi dengan metylen blue, lalu

didiamkan selama 10 detik kemudian dicuci dengan air

mengalir. Kemudian dikeringkan, setelah itu diamati dalam

mikroskop dan hasilnya digambar.

2.2.2 Pengecatan gram

Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat dibersihkan

dengan alkohol kemudian dikeringkan kemudian ditetesi

dengan aquades sebanyak 1 tetes. Tambahkan mikroorganisme

(Escherichia coli dan Streptococcus thermophilus) yang diambil dengan

jarum ose dan diletakkan pada kaca preparat dan kemudian

dibiarkan sampai kering. Setelah kering, kemudian difiksasi

dan diberi pewarna violet kristal. Dan dibiarkan di meja

selama 1 menit. Kemudian dibilas dengan air mengalir, dan

sisa air yang tertinggal dibuang dan ditetesi dengan lugol.

Tunggu lagi selama 1 menit, kemudian dicuci kembali dengan

air dan kemudian dihilangkan warnanya dengan alkohol.

Setelah itu diberi pewarna safranin dan didiamkan selama 10

detik. Setelah kering, dicuci dengan air mengalir dan

dikeringkan. Hasilnya diamati di bawah mikroskop dan

digambar.

2.2.3 Pengecatan endospora (B. Subtilis)

Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat diberi

aquades 1 tetes kemudian ditambahkan biakan (B. Sublitis)

sedikit dengan menggunakan jarum ose. Dibiarkan dulu sampai

kering dan difiksasi, setelah difiksasi diberi perwarna

hijau malasit dan dibiarkan selama 20 menit tanpa pemanasan

atau selama 5 menit diatas pemanas air. Setiap kali

perwarna menjadi kering tetesi kembali pewarnanya. Kemudian

dicuci dengan air mengalir selama 20-30 detik, setelah itu

diberi safranin selama 30 detik. Setelah itu dibilas dengan

air mengalir dan dikeringkan. Hasilnya diamati di bawah

mikroskop dan digambar.

2.2.4 Pengecatan endospora yeast (Saccaromyces cereviseae)

Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat diberi

aquades 1 tetes kemudian ditambahkan biakan (Saccharomyces

cerevisiae) sedikit dengan menggunakan jarum ose Dibiarkan

dulu sampai kering dan difiksasi, setelah difiksasi diberi

perwarna violet kristal. Setelah itu dipanaskan 3 menit

tetapi jangan sampai kering, jika mulai kering ditambahkan

violet kristal 1 tetes lagi. Kemudian dicuci dengan air

mengalir dan alcohol, Setelah itu dikeringkan. Setelah

kering diberi warna yang kedua yaitu safranin, didiamkan

selama 10 detik dan dicuci dengan air mengalir. Kemudian

dikeringkan, hasilnya diamati di bawah mikroskop dan

digambar.

3. HASIL PENGAMATAN

Jenis

pengecatan

Jenis

mikroorganisme

Gambar Keterangan

Pengecatan

sederhana

Bacillus subtilis Perbesaran :

40 x 10

Warna : biru

Bentuk :

bacillus,

berkoloni

1. MOPengecatan

sederhana

Streptococcus

thermophilus

Perbesaran :

40 x 10

Warna : biru

Bentuk :

coccus,

menyebar

1. MO

Pengecatan

gram

Echerichia coli Perbesaran :

40 x 10

Warna : merah

Bentuk :

fibrio,

menyebar

1. MO 2.

pewarnaPengecatan

gram

Streptococcus

thermophilus

Perbesaran :

40 x 10

Warna : merah

Bentuk :

coccus,

menyebar

1. MO Endospora Bacillus subtilis Perbesaran :

40 x 10

Warna : hijau

Bentuk :

bacillus,

berkoloni

1. MO

Endospora Sacharomyses cerevisiae. Perbesaran :

40 x 10

Warna : merah

muda

Bentuk :

coccus,

berkoloni

1. MO

4. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini masing-masing kelompok mencoba

untuk mengamati morfologi dari bakteri dan spora yeast.

Karena ukurannya sangat kecil dan tidak dapat dilihat

dengan mata telanjang serta pada mikroskop kurang jelas

kenampakannya maka diperlukan suatu pewarnaan atau

pengecatan untuk memperjelas morfologi dari masing-masing

mikroba. Ini sesuai dengan pernyataan Hadioetomo (1993),

bahwa kebanyakan sel mikrobia tidak berwarna atau mempunyai

pigmen yang sangat sedikit dan tidak dapat mengadsorbsi

ataupun membiaskan cahaya sehingga tidak dapat dilihat

dengan mudah pada mikroskop karena indeks bias sitoplasma

sel yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang

bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya

dapat dipertajam dengan mewarnai sel-sel tersebut dengan

sel warna. Oleh karena itu, penggunaan zat warna terhadap

bakteri yang dilakukan pada percobaan bertujuan supaya zat

warna dapat mengadsorbsi atau membiaskan cahaya sehingga

dapat meningkatkan kontras dengan sekelilingnya dan

struktur sel bakteri dapat diamati.

Pada setiap proses pengecatan yang dilakukan, baik

pengecatan sederhana, pengecatan gram, ataupun pengecatan

endospora, selalu dilakukan proses fiksasi. Proses fiksasi

ini dilakukan dengan cara melewatkan gelas benda pada nyala

api spirius beberapa kali selama 1-2 detik. Proses ini

bertujuan untuk lebih melekatkan bakteri pada gelas benda

dan mematikan bakteri, karena sebenarnya bakteri yang hidup

tidak dapat diamati, karena pada bakteri hidup, selnya

tidak mengandung pigmen atau transparan, karena indeks bias

sitoplasmanya hampir sama dengan indeks bias lingkungannya

yang bersifat cair (Lay, 1994). Ini sesuai dengan yang kami

lakukan dalam praktikum.

Ada dua macam cara pewarnaan yang dilakukan selama

percobaan, yakni pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram.

Menurut Fardiaz (1992), pewarnaan bakteri dapat dibedakan

atas beberapa golongan, yang meliputi :

a. Pewarnaan sederhana

b. Pewarnaan diferensial

pewarnaan gram

pewarnaan asam cepat (acid-fast)

c. pewarnaan struktural

pewarnaan inti sel (Feulgen), yaitu pewarnaan

inti sel bakteri

pewarnaan endospora, yaitu pewarnaan spora

bakteri

pewarnaan dinding sel, yaitu pewarnaan dinding

sel dari bakteri

pewarnaan kapsul, yaitu pewarnaan kapsul yang

dibentuk oleh bakteri

pewarnaan flagella, yaitu pewarnaan flagel / alat

gerak bakteri

d. pewarnaan untuk menguji komponen dalam sel seperti

Glikogen, Lipida.

Percobaan yang pertama adalah pewarnaan sederhana dari

bakteri Bacillus subtilis dan Streptococcus thermophilus. Proses

pengamatan bakteri tidak akan sempurna jika kenampakan yang

diperoleh kurang jelas, pewarnaan berguna untuk

memperjelasnya. Pengecatan sederhana yang dilakukan dengan

pemberian warna terlebih dahulu pada bakteri sebelum

dilihat mikroskop, bertujuan untuk mengetahui ciri-ciri

tertentu bakteri. Hal ini dikarenakan bakteri hidup sukar

untuk dilihat dengan mikroskop cahaya biasa karena bakteri

itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri-

sendiri, walaupun biakan secara keseluruhan mungkin

berwarna (Volk & Wheeler, 1993). Dikatakan oleh Lay (1994),

bahwa pengecatan sederhana adalah pewarnaan yang paling

sederhana, dimana pada pengecatan ini hanya dilakukan

dengan penambahan satu zat pewarna atau hanya melalui satu

tahap pewarnaan saja pada olesan bakteri. Ini sesuai dengan

yang kami lakukan, karena hanya melewati satu tahap

pewarnaan dalam pewarnaan sederhana. Pewarna yang dipakai

adalah Methylen blue loefler (metilen biru). Pada percobaan

pengecatan dilakukan dengan zat warna yang bersifat basa

yaitu biru metilen (Lay, 1994). Hubungan bakteri dengan zat

perwarna basa yang menonjol disebabkan oleh adanya asam

nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi jika

bakteri diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri

bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa. Oleh karena

itu, pada percobaan digunakan metilen loeffer yang memiliki

sifat basa dan alkalin sebagai pewarna sederhana. Pewarna

alkalin lain yang umumnya digunakan dapat berupa pewarna

basa seperti metylen blue, basic fuschin, dan violet

kristal (Volk dan Wheller, 1993). Setelah diamati pada

mikroskop dengan perbesaran 40 x 10 terlihat bahwa B. subtilis

bentuknya basil (batang), berkoloni, dan berwarna biru.

Warna biru tersebut muncul setelah adanya penambahan

metilen biru. Bacillus subtilis adalah jenis bakteri yang

menghasilkan spora berbentuk silinder yang tidak

membengkak, sporanya langsing dan tidak melebihi diameter

0,9 m (Fardiaz, 1992). Bacillus subtilis merupakan bakteri

berwujud silinder terentang (Schlegel & Schmidt,1994).

Sedangkan pada Streptococcus thermophilus dengan perbesaran

mikroskop 40 x 10 terlihat bahwa bentuknya bulat (coccus),

menyebar, dan warnanya biru. Streptococcus merupakan bakteri

berbentuk bulat yang hidup secara berpasangan, atau

membentuk rantai pendek dan panjang tergantung dari spesies

dan kondisi pertumbuhannya (Fardiaz, 1992). Sama seperti

B.subtilis warna biru yang muncul juga dikarenakan adanya

penambahan metilen biru. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi

dengan pewarna sederhana, karena sitoplasmanya bersifat

basofilik (suka basa), dan zat-zat warna yang digunakan

dalam pengecatan sederhana umumnya bersifat alkalin

(komponen kromoforiknya bermuatan positif) (Hadioetomo,

1993). Jadi karena sifat metilen biru yang basa maka akan

mudah menempel pada bakteri dan sulit hilang.

Dengan dilakukannya pewarnaan sederhana ini terlihat bahwa

masing-masing bakteri memiliki bentuk yang berbeda-beda.

Pengecatan sederhana yang dilakukan memungkinkan

dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi

(kokus, basilus, vibrio, sprilum, dan sebagainya) dari

bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai

(Hadioetomo, 1993).

Percobaan yang kedua adalah pewarnaan bakteri dengan cara

pewarnaan gram. Ada dua bakteri yang dipakai yakni Echerichia

coli dan Streptococcus thermophilus. Digunakan beberapa macam

pewarna dalam praktikum ini, yakni violet kristal, larutan

iodium gram (lugol), dan safranin. Dalam pengecatan gram

pada bakteri, digunakan zat warna primer (violet kristal),

larutan mordan (iodin), bahan peluntur (alkohol), dan zat

warna penutup (safranin). Larutan mordan berfungsi untuk

meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri,

sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih

kuat, memperjelas zat warna, mempersulit pelarutan zat

warna, dan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks

kristal violet-yodium. Sedangkan etanol, berfungsi untuk

melunturkan zat warna primer dengan daya kerja lambat,

sehingga memperkecil kemungkinan terjadinya pemucatan yang

berlebihan. Fungsi penambahan zat warna penutup adalah

sebagai pembeda (kontras) terhadap zat warna primer, dan

juga untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan

zat warna primernya (Lay, 1994).

Pengecatan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat

berguna dan paling benyak digunakan dalam laboratorium.

Selain itu pengecatan gram merupakan tahap penting dalam

pencirian dan identifikasi bakteri. Pengecatan gram ini

dapat digunakan untuk memilah bakteri menjadi kelompok gram

negatif atau gram positif (Lay, 1994). Pebedaan bakteri

gram positif dan gram negatif :

Pada saat pengecatan dengan cat utama, bakteri gram

positif maupun gram negatif akan mengikat violet

kristal dan menunjukkan warna ungu atau biru tua.

Pada saat penambahan mordan, pada bakteri gram positif

maupun gram negatif sama-sama akan terbentuk kompleks

violet kristal dengan lugol atau iodin dan tetap

berwarna biru.

Pada saat pelarutan, bakteri gram positif akan

mengalami dehidrasi membran sel namun tidak sampai

pecah dan pori-porinya mengecil sehingga kompleks

violet kristal dan lugol atau iodin tetap tertinggal di

dalam sel dan bakteri tetap berwarna biru atau ungu.

Sedangkan pada bakteri gram negatif, akan terdehidrasi

sampai lemaknya terekstraksi dan pori-pori pada

membrannya akan melebar sehingga semua kompleks violet

kristal dan lugol atau iodin akan keluar dan sel

bakteri menjadi tidak berwarna.

Pada saat penambahan cat penutup, bakteri gram positif

tidak berpengaruh apa-apa dan warnanya tetap biru atau

ungu. Sedangkan bakteri gram negatif akan mengikat cat

penutup tersebut dan menjadi berwarna merah.

(Trihendrokesowo, 1989).

Sewaktu pengamatan terlihat bahwa E.coli bentuknya fibrio,

menyebar, dan warnanya merah. Ini berarti E.coli merupakan

bakteri gram negatif. Pada pengamatan Streptococcus thermophilus

terlihat bentuknya batang (coccus), menyebar, dan warnanya

merah. Menurut Hadioetomo (1993), Beberapa jenis bakteri

yang merupakan jenis bakteri gram (-) adalah Eschericia coli,

Enterobacter aerogenes, dan kelompok Pseudomonas. Sedangkan yang

termasuk bakteri gram (+) adalah kelompok Lactobacillus,

Streptococcus, Staphylococcus dan Streptococcus. Terlihat bahwa

ketidakcocokan terjadi pada Streptococcus thermophilus kami.

Seharusnya warnanya adalah tetap ungu tua atau biru kalau

menurut teori. Kemungkinan kesalahan terjadi karena

penyemprotan alkohol yang berlebihan. Etanol 95% berfungsi

sebagai larutan pemucat yang akan melarutkan zat warna

utama, namun larutan ini bekerja lambat sehingga

memperkecil kemungkinan terjadinya pemucatan yang

berlebihan. Iodin merupakan larutan mordan, yaitu senyawa

yang digunakan untuk mengintensifkan cat utama dan

berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna

oleh bakteri sehingga pengikatan ini menjadi lebih kuat

(Hadioetomo, 1993).

Percobaan yang ketiga adalah pewarnaan endospora. Ada dua

mikroba yang dipakai yakni B.subtilis dan Sacharomyses cerevisiae.

Pada B.subtilis pewarna yang digunakan adalah pewarna hijau

malasit dan safranin sedang pada Sacharomyses cerevisiae

pewarnanya violet kristal dan safranin. Endospora sukar

untuk diwarnai oleh pewarna biasa. Endospora merupakan

struktur di dalam sel pada tempat – tempat yang khas yang

dibentuk oleh bakteri jenis – jenis tertentu, misalnya

bakteri genus Bacillus dan Clostridium (Hadioetomo, 1993).

Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa,

karenanya harus digunakan pewarna spesifik, dan yang biasa

digunakan adalah pewarna hijau malasit (malachite green)

(Fardiaz, 1998). Sewaktu pengamatan B.subtilis terlihat bahwa

bentuknya batang (basil), berkoloni, dan warnanya hijau.

Bacillus subtilis merupakan bakteri berwujud silinder terentang

(Schlegel & Schmidt,1994). Karena bentuknya batang maka

B.subtilis dapat membentuk endospora. Bakteri pembentuk

endospora umumnya adalah bakteri berbentuk batang, dan

setelah membentuk endospora, sporangium mati dan akhirnya

lisis dan spora bekas ukurannya cukup besar dan dapat

dilihat di mikroskop (Hadioetomo, 1993). Endospora hanya

terdapat dalam bakteri berbentuk batang (basilus) dan dapat

dilihat dengan pewarnaan endospora (Lay, 1994). Setelah

diwarnai warna B.subtilis berubah menjadi hijau ini semakin

menunjukkan bahwa B.subtilis memiliki endospora. Pada

pengamatan Sacharomyses cerevisiae terlihat bahwa bentuknya

bulat (coccus), berkoloni, dan warnanya merah muda. Ini

menunjukkan bahwa tidak hanya bakteri bentuk batang saja

yang bisa membentuk endospora, tapi yeast juga bisa

membentuknya.

5. KESIMPULAN

Pewarnaan bakteri dapat digolongkan menjadi pewarnaan

sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan

struktural, dan pewarnaan untuk menguji keberadaan

komponen tertentu di dalam sel.

Pengecatan sederhana adalah pewarnaan yang paling

sederhana, dimana pada pengecatan ini hanya dilakukan

dengan penambahan satu zat pewarna atau hanya melalui

satu tahap pewarnaan saja pada olesan bakteri.

Pengecatan sederhana yang dilakukan memungkinkan

dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe

morfologi (kokus, basilus, vibrio, sprilum, dan

sebagainya)

Pengecatan gram adalah pewarnaan atau pengecatan

dengan melalui beberapa tahap pengecatan dengan

beberapa reagen yang berbeda.

Pengecatan endospora adalah pengecatan yang bertujuan

untuk mengamati endospora, dimana tidak semua jenis

bakteri mampu membentuk endospora.

Adapun 3 bentuk dasar sel bakteri : batang (baccil),

bulat (coccus), dan lengkung (koma, vibrion, dan

spiral).

Dalam pengecatan gram pada bakteri, digunakan zat

warna primer (violet kristal), larutan mordan

(iodin), bahan peluntur (alkohol), dan zat warna

penutup (safranin).

Dalam menyiapkan preparat tidak boleh terlalu tebal.

Pewarnaan gram memisahkan bakteri menjadi kelompok

gram positif dan gram negatif.

Beberapa jenis bakteri yang merupakan jenis bakteri

gram (-) adalah Eschericia coli, Enterobacter aerogenes, dan

kelompok Pseudomonas.

Beberapa jenis bakteri yang termasuk bakteri gram (+)

adalah kelompok Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan

Streptococcus.

Pada saat penambahan cat penutup, bakteri gram

positif tidak berpengaruh apa-apa dan warnanya tetap

biru atau ungu.

Bakteri gram negatif akan mengikat cat penutup

tersebut dan menjadi berwarna merah.

Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan

pada beberapa jenis bakteri.

Endospora hanya terdapat dalam bakteri berbentuk

batang (basilus) dan dapat dilihat dengan pewarnaan

endospora.

Pengecatan bakteri akan berhasil, jika sebelum

melakukan pengecatan diperlukan penyiapan preparat

yang baik, yaitu tidak terlalu tebal atau terlalu

tipis, tetap melekat pada gelas preparat selama

pencucian berulang-ulang, sel-selnya tidak berubah

bentuk atau morfologi setelah fiksasi dan pengecatan.

6. DAFTAR PUSTAKA

Cappuccino, I.G. & N. Sherman. (1983). Microbiology a LaboratoryManual. Addison-Wesley Publishing Company. Massachuset.

Fardiaz, S. ( 1992 ). Mikrobiologi Pangan 1. PT GramediaPustaka Utama. Jakarta.

Gaman, P. M. & K. B. Sherrington. (1994). Ilmu Pangan.Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Hadioetomo, R. S. ( 1993 ). Mikrobiologi Dasar DalamPraktek Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT GramediaPustaka Utama. Jakarta.

Hadioetomo, R.S. (1993). Mikobiologi Dasar dalam Praktek,Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia PustakaUtama. Jakarta.

Lay, B. W. ( 1994 ). Analisis Mikroba di Laboratorium. PTRaja Grafindo Persada. Jakarta.

Schlegel, H.G. & K. Schmidt. (1994). Mikrobiologi Umum.Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Timotius, K. H. ( 1982 ). Mikrobiologi Dasar. UniversitasKristen Satya Wacana. Salatiga.

Trihendrokesowo. (1989). Petunjuk Laboratorium MikrobiologiPangan. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi.Yogyakarta.

Volk, W.A. & M.F. Wheeler. (1993). Mikrobiologi Dasar.Erlangga. Jakarta.

7. LAMPIRAN