PENETAPAN KADAR EUGENOL DALAM BUNGA KERING ATAU DAUN Eugenia
caryophyllata L. Merr. & Perry (Myrtaceae) SECARA DISTILASI UAP
(STEAM DISTILLATION) Makalah Analisis Farmasi dan Validasi Metode
Distilasi Uap(Steam Distillation)
Disusun oleh :Asti Aprilia Putri138114071Edwin Tesalonika
138114072Michael Ryanda E. 138114073Andre Syofian138114081Dendi
Putro A.138114082Marcellina D. D.138114084GOLONGAN A1
PJ Laporan: Henry
FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA2015PENETAPAN KADAR EUGENOL DALAM BUNGA KERING ATAU DAUN
Eugenia caryophyllata L. Merr. & Perry (Myrtaceae) SECARA
DISTILASI UAP (STEAM DISTILLATION)A. Tujuan1. Mengetahui cara
mendapatkan minyak cengkeh dengan metode distilasi uap.2. Memahami
isolasi dan determinasi kadar Eugenol dalam bunga kering atau daun
Eugenia caryophyllata L. Merr. & Perry (Myrtaceae) secara
ekstraksi dan analisis Gas Chromatography.
B. PrinsipDistilasi uap merupakan salah satu jenis distilasi
yang merupakan gabungan antara distilasi kontinu dan distilasi
batch. Bahan yang akan dipisahkan dengan distilasi berada dalam
kolom distilasi (batch) sedangkan uap air mengalir melalui bahan
secara kontinu (Vargasa et al, 2009).Prinsip dari distilasi uap
adalah dengan mengalirkan uap air ke dalam campuran bahan dimana
terdapat komponen yang ingin dipisahkan. Contohnya pada pemisahan
minyak atsiri yang terdapat pada batang, daun dan bunga tumbuhan.
Bagian tumbuhan yang akan didistilasi, ditempatkan diatas plat
penyangga yang berlubang-lubang tempat aliran uap. Selama proses
distilasi berlangsung, uap air akan mengalir melalui sela-sela
bahan baku tersebut dan memanaskan minyak yang terkandung di
dalamnya, sehingga menguap dan terbawa bersama uap air. Campuran
uap air dan uap minyak ini kemudian diembunkan di dalam kondensor
sampai seluruhnya mencair. Karena antara minyak dengan air tidak
dapat larut maka akan dengan mudah dapat dipisahkan dengan cara
didiamkan (dekantasi) (Vargasa et al, 2009).Prinsip ekstraksi yaitu
analit dibersihkan dari bahan-bahan dalam matriks formulasi yang
akan mengganggu dalam analisis dengan menggunakan pelarut yang
sangat mudah melarutkan analit, tetapi tidak melarutkan senyawa
pengganggu. Tahap-tahap pemisahan pelarut lebih lanjut mungkin
dapat digunakan untuk mengurangi senyawa pengganggu tersebut
(Watson, 2007).Prinsip kerja rotary evaporator adalah menggunakan
prinsip distilasi (pemisahan). Prinsip utamanya adalah penurunan
tekanan sehingga pelarut dapat menguap pada suhu dibawah titik
didihnya. Dengan demikian suatu pelarut akan menguap dan senyawa
yang larut dalam pelarut tersebut akan mengendap. Pemanasan dibawah
titik didih pelarut memungkinkan senyawa yang terkandung dalam
pelarut tidak rusak oleh suhu yang tinggi (Sarker,Latif & Gray,
2006).Prinsip kerja kromatografi gas yaitu gas dalam silinder baja
bertekanan tinggi dialirkan melalui kolom yang berisis fasa diam.
Cuplikan berupa campuran yang akan dipisahkan, biasanya berbentuk
larutan, diinjeksikan ke dalam aliran gas tersebut. Cuplikan dibawa
oleh gas pembawa ke dalam kolom dan di dalam kolom terjadi proses
pemisahan. Komponen-komponen campuran yang telah terpisahkan satu
persatu meninggalkan kolom. Detektor diletakkan di ujung kolom
untuk mendeteksi jenis maupunjumlah komponen campuran. Hasil
pendeteksian direkam dengan recorder dan dinamakan kromatogram yang
terdiri dari beberapa peak (puncak). Jumlah peak yang dihasilkan
menyatakan jumlah komponen (senyawa) yang terdapat dalam campuran.
Sedangkan luaspeak bergantung kepda kuantitas suatukomponen dalam
campuran. Karena peak-peak dalam kromatogram berupa senyawa
segitiga maka luasnya dapat dihitung berdasarkan tinggi dan lebar
peak tersebut (Tim Kimia Analitik Instrumen., 2010).
C. Latar Belakang Teoritik Cengkeh memiliki nama botani Syzygium
aromaticum atau Eugenia caryophyllus merupakan tanaman asli
Indonesia yang merupakan famili dari Myrtaceae. Dalam bunga cengkeh
selain terkandung minyak atsiri,yaitu eugenol, juga mengandung
senyawa kimia yang disebut euginin, asam oleanolat, asam galotanat,
fanilin, karyofilin, resin dan gom (Thomas, 2005). Eugenol
(4-alil-metoksi fenol) merupakan konstituen dari bunga cengkeh
dengan wujud cairan tidak berwarna yang memiliki bobot molekul
164.2 g/mol, memiliki titk didih 253,20C dan titik lebur -7,50C.
Massa jenisnya 1,055 dengan tekanan uap 0,03 mmHg. Eugenol larut
dalam air dingin, dan bersifat bakterisidal dengan rumus molekul
C3H5C6H3(OH)OCH3 (Anonim, 2005).Distilasi ialah salah satu
pemisahan campuran yang memiliki prinsip sederhana namun tetap
memiliki variasi, dimana setiap variasi distilasi tersebut memiliki
kelebihan dan kelemahan. Secara umum, bagian bagian dari alat
distilasi adalah labu distilasi, pemanas, kolom distilasi dan labu
penampung. Langkah awal, labu distilasi yang berisi cairan
dipanaskan, lalu uap dari cairan tersebut akan naik ke kolom zat
yang memiliki titik didih yang tinggi yang kemudian mencair lagi
pada kolom kondensor. Zat yang titik didihnya lebih rendah akan
terus terbawa hingga di labu penampung (Sunardi, 2004).Distilasi
untuk 2 cairan yang dapat bercampur, hasilnya agak berbeda.
Campuran cairan tersebut akan mendidih pada suhu lebih rendah dari
titik didih dari salah satu komponen yang terpisah sebagai senyawa
murni. Ketika steam digunakan untuk menghsilkan salah satu fase
dari campuran cairan tersebut, proses ini disebut distilasi uap.
Keuntungan dari teknik ini adalah komponen yang diinginkan, dapat
menguap pada suhu di bawah 100 C. Jika komponen yang ingin
dipisahkan merupakan zat-zat yang tidak stabil, peristiwa
dekomposisi harus dihindari. Distilasi uap digunakan secara luas
dalam mengisolasi cairan dari sumber alami, juga digunakan untuk
menghilangkan produk reaksi (produk samping) dari reaksi campuran
yang berlangsung lama. (Pavia, 2005).Distilasi uap merupakan metode
untuk isolasi suatu senyawa atau memurnikan suatu senyawa pada cara
ini digunakan suatu cairan yang tidak saling melarutkan akan
mengikuti Hukum Dalton, dimana tekanan yang dihasilkan oleh
campuran gas yang tidak bereaksi dengan jumlah tekanan
masing-masing uap (Sunardi, 2004).Distilasi uap melibatkan
kotidilitas campuran air dan senyawa organik volatil yang tidak
bercampur dengan air . Distilasi uap sering kali digunakan untuk
memisahkan senyawa volatil dari senyawa non volatil . Metode ini
juga sering digunakan untuk memisahkan senyawa yang terdekomposisi
pada titik didihnya hal ini dapat di sebabkan suhu distilasi uap
lebih rendah dari 100oC . Secara umum, tekanan uap senyawa yang
lebih besar dari 10 mmHg pada 100oC sangat efektif bila dipisahkan
dengan distilasi uap . Senyawa yang dipisahkan dengan distilasi uap
harus tidak larut dalam air, dan memiliki bobot molekul antara
2-1000 dalton. Tekanan uap parsial tidak tergantung pada komposisi
dalam campuran Pn=Ptotal campuran berair merupakan jumlah tekanan
uap komponen yang tidak bercampur (Arsyad , 2001 ).
Instrumentasi kromatografi gas :(McNair dan Miller,
1998).Keuntungan dari kromatografi gas : Analisisnya cepat Efisien,
didukung dengan resolusi yang tinggi Sensitive, mudah mendeteksi
ppm sampai ppb Akurasi tinggi untuk analisis kuantitatif (RSD 1-5%)
Membutuhkan jumlah sampel yang sedikit (L) Kepercayaannya tinggi
dan relatif mudah Tidak mahal biaya operasionalnyaKelemahan dari
kromatografi gas : Hanya bisa menggunakan sampel yang menguap
(Volatil) Tidak cocok untuk sampel yang tidak stabil pada suhu
tertentu Susah untuk sampel yang sangat besar Membutuhkan
spektroskopi (mass spektroskopi, untuk mengkonfirmasi identitas
peak)(McNair dan Miller, 1998).
Isolasi minyak bunga cengkeh umum dilakukan menggunakan metode
distilasi uap dan distilasi air. Kedua metode tersebut mudah dan
aman bagi lingkungan karena tidak menggunakan pelarut organik
berbahaya. Isolasi dengan distilasi uap menghasilkan minyak cengkeh
dengan kandungan eugenol lebih tinggi daripada isolasi dengan
distilasi air. (Srivastava, 2005).Hukum Raoult, menyatakan campuran
paling sederhana dalam dua pelarut yang larut secara sempurna,
volatilitas dari keduanya tidak dapat diganggu oleh zat lain. Titik
didih campuran akan berada di tengah-tengah dari zat murni
(perbandingan titik didih diantara kedua zat tersebu adalah sama
besar), dan tingkat pemisahan yang dihasilkan oleh distilasi
tunggal akan bergantung pada tekanan uap atau volatibilitas dari
komponen yang terpisah pada suhu tersebut. Pertama kali dikemukakan
oleh Raoult. Persamaan Raoult:PT = ( P1)o X1+ (P2) ^o X2Distilasi
alkohol 99% menghasilkan uap yang konsentrasinya kurang dari 99%.
Oleh sebab itu alkohol tidak dapat dikonsentrasikan dengan
distilasi hingga 97% (Edgar dan Showick, 2009).Distilasi uap
digunakan teutama dalam kasus distilasi bahan yang sensitif
terhadap panas. Substansi-substansi tidak than panas tersebut dapat
dipisahkan dengan mengurangi tekanan uap pada komponen yang volatil
ini menggunakan inert vapour yang dapat menurunkan temperatur dari
proses distilasi itu. Inert vapour yang digunakan harus dapat
bercampur dengan komponen yang akan didistilasi. Dalam distilasi
uap, cairan didistilasi dengan menambahkan uap secara langsung ke
dalam cairan di dalam alat distilasi, kemudian uap tersebut terbawa
dari cairan-cairan volatil yang kemudian dikondensasikan. Sementara
bahan-bahan yang tidak volatil tetap berada di alat distilasi.
Ketika dua campuran tidak bercampur ini didistilasi, tekanan total
uap Pt di atas cairan sama dengan jumlah tekanan uap dari setiap
campurannya, pernyataan tersebut dihubungkan dengan hukum Dalton.
Persamaan Dalton:PT = (P1)^o + (P2)^o(P1) ^o+(P2) ^o = 1atm = 760
mmHg (Gavhanne, 2008).Validasi metode menurut USP (United State
Pharmacopeia) dilakukan unutk menjamin bahwa metode analisis
akurat, spesifik, reproduksi, dan tahan pada kisaran analit yang
akan di analisis. Suatu metode analisis harus divalidasi untuk
verifikasi bahwa parameter parameter kinerjannya cukup mampu untuk
mengatasi problem analisis, oleh karena itu suatu metode analisis
harus divalidasi, pada saat : Metode baru dikembangkan untuk
analisis mengatasi problem analisis tertentu Metode yang sudah baku
direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau karena manualnya
suatu problem yang mengarahkan bahwa metode baku tersebut harus
direvisi. Penjaminan mutu yang mengindikasikanbahwa metode baku
telah berubah seiring dengan berjalannya waktu Metode baku yang
digunakan di Laboratorium yang berbeda, digunakan oleh analisis
yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda Untuk
mendemontrasikan kesetaraan antar dua metode, sepperti metode yang
baru dan metode baku. (Gandjar dan Rohman, 2007).Validasi metode
dilakukan untuk mengetahui sejauh mana penyimpangan suatu metode
tidak dapat dihindari pada kondisi normal, di mana seluruh elemen
terkait telah dilaksanakan dengan baik dan benar. Teknik yang
digunakan hendak dilakukan dalam memvalidasi metode merupakan salah
satu atau kombinasi dari hal-hal berikut: kalibrasi dengan
menggunakan standar acuan, pembandingan hasil yang diperoleh dengan
metode lain, asesmen yang sistematik dari faktor-faktor yang
mempengaruhi hasil antara lain penentuan batas deteksi khususnya
untuk metode pengujian yang meliputi LDL (Instrument Detection
Limit), LOD (Limit of Detection), LOQ (Limit of Quantitation),
akurasi metode (Method Accuracy), metode presisi (Method Precision)
(Hadi, 2007).Menurut USP, ada sembilan langkah dalam validasi
metode analisis, yaitu : Akurasi: merupakan ketelitian metode
analisis, atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai yang
diterima, baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, atau nilai
rujukan. Presisi: merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan
biasanya diekspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah
sampel yang berbeda signifikan secara statistik. Spesifitas: adalah
kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan
spesifik dengan adanya komponen komponen lain dalam matriks sampel
sperti ketidakmurnian, produk degrasi dan komponen matriks. Batas
deteksi (Limit of Detection, LOD): merupakan konsentrasi analit
terkecil atau terendah, yang dapat dideteksi, meskipun tidak selalu
dapat dikuantifikasi. Batas Kuantifikasi (Limit of Quantification,
LOQ): merupakan konsentrasi analit terendah dalam suatu sampel yang
dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat yang
diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.
Linearitas: merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil
hasil uji secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit
pada kisaran yang diberikan Kisaran (range): merupakan konsentrasi
terendah dan tertinggi, yang mana suatu metode analisis menunjukkan
akurasi, presisi, linearitas yang mencukupi. Kekasaran
(Ruggedness): merupakan tingkat reproduktibilitas hasil yang
diperoleh dibawah kondisi yang bermacam macam yang diekspresikan
sebagai persen standar deviasi relatif (% RSD). Ketahanan
(Robutness): merupakan metode untuk tetap tidak berpengaruh oleh
adanya variasi parameter metode yang kecil.(Gandjar dan Rohman,
2007).
Sifat fisika kimia analit yang digunakan :1. Minyak Cengkeh
KarakteristikNilai
Bobot jenis 25CKadar Eugenol (%)1,048-1,0561,534-1,538
Minyak cengkeh mengandung dan komponen utama yakni eugenol
(80-90 %) dan -karyofilen (10-20%) yang turut berperan dalam
menentukan aroma dari minyak cengkeh tersebut. Minyak bunga cengkeh
berupa cairan yang berwarna kuning sampai coklat muda bila bertemu
besi berubah menjadi warna coklat - ungu tua, mempunyai rasa yang
pedas, keras dan berbau aroma cengkeh yang dimanfaatkan dalam
industrifragrance (parfum)danflavorkarena memiliki aroma yang khas
dan industri farmasi karena bersifat antiseptik (Nurdjannah, N.,
2004).Kualitas minyak bunga cengkeh ditentukan dari fenol, terutama
eugenol, bau, dan warna minyak, serta hidrokarbon dan senyawa
aromatik. Hasil penyulingan dan sifat fisika kimia minyak bunga
cengkeh tergantung pada sumber dan kualitas tanaman cengkeh, metode
penyulingan serta keadaan bahan yang disuling. Cengkeh yang
didistilasi dapat menghasilkan minyak dengan kadar eugenol tinggi
dengan bobot jenisnya 1,06, sedangkan cengkeh yang ditumbuk akan
menghasilkan minyak dengan kadar eugenol sedikit lebih rendah
(Memmou, F., R. Mahboub, 2012).2. EugenolNama IUPAC:
2-methoxy-4-prop-2-enylphenol Bentuk: CairanWarna: Bening atau
kuning pucatBau: Bau cengkehRasa: Pedas dan tajam Berat molekul:
164,20108 g/moLTitik lebur: -9.2 sd 9.1C Titik didih: 225C pKa:
10,19 (25C)Berat jenis: 1,0652 g/cm3 (pada suhu 20C)Kelarutan: 2460
mg/L pada suhu 25C dalam air Larut dalam alkohol, kloroform, eter,
asam asetat glacial, aquadesStabilitas: Menggelap pada paparan
udara Merupakan komponen utama dalam minyak cengkeh (kandungan
mencapai 70-96%). Berwujud cairan bening hingga kuning pucat, mudah
menguap, dengan aroma menyegarkan, khas dan pedas. Eugenol adalah
senyawa alkohol siklis monohidrasi sehingga dapat beraksi dengan
basa kuat, seperti NaOH, KOH, atau Ca(OH)2. Mempunyai rumus molekul
C10H12O2, mengandung beberapa gugus fungsional yaitu alil
(-CH2-CH=CH2), fenol (-OH) dan metoksi (-OCH3), sehingga
memungkinkan eugenol sebagai bahan dasar sintesis berbagai senyawa
lain yang lebih tinggi. (Bulan, 2004). Untuk mendapatkan eugenol
dari minyak cengkeh biasanya dilakukan dengan penambahan basa kuat,
3-5% sehingga membentuk garam eugenolat yang larut dalam air.
Dengan penambahan HCl , eugenol akan terbebas lalu di ekstraksi
dengan eter (Kardinan, 2005).
Struktur Eugenol3. AquadestBentuk : CairanWarna: BeningBau:
Tidak berbauRasa: Tidak berasaBerat molekul : 18.01528 g/mol Titik
lebur: 0CTitik didih: 99.974CBerat jenis: 0.9950 g/cm3 (pada suhu
20C)Kelarutan: Mudah larut dalam etanol, methanol, asetonMerupakan
pelarut yang baik, bukan oksidator kuat, bahkan cenderung bersifat
reduktor.Reaksi oksidasi dari air sendiri dapat terjadi jika
direaksikan dengan logam alkali atau alkali tanah.(International
CHEMTREC, 2013).4. Na2SO4( Natrium sulfat anhidrat)Bentuk: Padatan
kristal, serbuk kering, cairanWarna: PutihBau: Tidak berbauRasa:
PahitBerat molekul: 142,042139 g/moLTitik lebur: 884C Titik didih:
> 1700C Berat jenis: 2,671 g/cm3Kelarutan: Sangat larut dalam
airKegunaan : sebagai bahan pengering, bersifat sebagai
pengering(International CHEMTREC, 2013).
5. KOH (Kalium hidroksida)Bentuk: Padatan kristal, serbuk,
cairan (kristal/ serpihan)Warna: Putih hingga uningBau: Tidak
berbauRasa: Tidak berasaBerat molekul: 56.10564 g/moLTitik lebur:
380C Titik didih: 1384C Berat jenis: 2.044 g/cm3 (pada suhu 20C)pH:
13.5 (dalam larutan 0,1 M)Kelarutan : Larut dalam air, tidak larut
dalam dietil eter(International CHEMTREC, 2013).6.
DiklorometanaRumus molekul : CH2Cl2Bentuk: CairanWarna: Tidak
berwarnaBau: Berbau seperti kloroformRasa: Pedas dan tajam Berat
molekul: 84.932588g/moLTitik lebur: -95C Titik didih: 40C
(1013hPa).pH: netral (dalam air, 20C)Berat jenis: 1,3255 g/cm3
(pada suhu 20C)Kelarutan:13.00 mg/L pada suhu 25C dalam air Larut
dalam alcohol, eter, etanol, etil eter, karbon
tetraklorida(International CHEMTREC, 2013).
7. Asam Klorida Asam Klorida mengandung tidak kurang dari 36,5%
b/b dan tidak lebih dari 38,0% b/b HClBentuk: Cairan, GasWarna:
Tidak berwarnaBau: TajamRasa: Tajam Berat molekul: 36.46094
g/moLTitik lebur: -114.22C Titik didih: -85C pKa: 10,19 (25C)Berat
jenis: 1,639 g/cm3 (pada suhu 20C)Kelarutan: 2460 mg/L pada suhu
25C dalam air Larut dalam air, etanolStabilitas: Stabil dalam suhu
tinggi, bersifat korosif(International CHEMTREC, 2013).
8. Natrium kloridaNatrium klorida mengandung tidak kurang dari
99,0% dan tidak lebih dari 101,0% NaCl dihitung terhadap zat yang
telah dikeringkan. Tidak mengandung zat tambahan.Bentuk: Padatan
kristal, Serbuk kering, CairanWarna: Tidak berwarna, kristal
beningBau: Tidak berbauRasa: Rasa garam Berat molekul: 58.442769
g/moLTitik lebur: 800.7C Titik didih: 1465C pH: 6.7-7.3Berat jenis:
2.17 g/cm3 (pada suhu 25C)Kelarutan: 36.0 mg/L pada suhu 25C dalam
airLarut dalam air dingin, air panas. Larut dalam gliserol, asam
hidroklorat, dan amonia. Sangat mudah larut dalam alkohol. Sedikit
larut dalam etanol.Stabilitas: Stabil dalam kondisi penyimpanan
yang direkomendasi(International CHEMTREC, 2013).9. Heksana Nama
IUPAC: 3,3-Dimetil butanaBentuk: Padatan kristal, Serbuk,
CairanWarna: PutihBau: Tidak berbauRasa: Tidak berasaBerat molekul:
56.10564 g/moLTitik lebur: -128.8C Titik didih: 57.9C Berat jenis:
0.65 g/cm3 (pada suhu 20C)Kelarutan: Larut dalam etanol, eter,
sangat larut dalam aseton(International CHEMTREC, 2013).
D. Alat dan Bahan Alat :- Labu alas bulat 500ml - Pipa Liebig -
Erlenmeyer 250 ,125 ml - Penjepit - Klem cincin - Ball filler pipet
- Adapter Claesin - Pipet gondok - Heating mantel - Statif - Gelang
karet - Mortir & stamper - Baskom - Gelas ukur - Corong pisah
250 ml - Flakon - Beaker glass 1000 ml, 250 ml- GC - Pipet tetes -
Timbangan Analitik
Bahan:- bunga cengkeh- es batu - aquadest- batu didih - eugenol-
Diklormetan - NaCl- Natrium sulfat exicc - larutan 5% Kalium
hidroksida- asam klorida - natrium sulfat anhidrat p. - larutan 1/2
jenuh natrium klorida - vaselin - indikator pH universal
E. Bagan KerjaDilakukan untuk setiap sampel A, B, C, D, E1.
Distilasi Uap2 g Daun Cengkeh DitumbukSerbuk Daun Cengkeh Ditimbang
Ditambahkan 100 ml eugenol pada sampel A Distilasi LAB: Serbuk daun
cengkeh + 150 ml akuades + 3 batu didih Corong pisah: 200 ml
akuades Destilat(diambil 1 ml destilat E, kemudian dimasukkan ke
dalam flakon yang bersih untuk dianalisis)Ekstraksi cair-cair
Ditambah 5 g NaCl Ditambah 15 ml diklorometan, `bilas dengan 10 ml
diklorometan
Lapisan air Lapisan diklorometan I Ekstraksi cair-cair ditambah
10 ml diklorometan Lapisan air Lapisan diklorometan II Ekstraksi
cair-cair ditambah 10 ml diklorometan
Lapisan air Lapisan diklorometan III
Lapisan diklorometan (I+II+III)Lapisan diklorometan (I+II+III)
Keringkan dengan Natrium Sulfat exicc.Lapisan diklorometan kering2.
PartisiLapisan diklorometan Ekstraksi cair-cair Ditambah 100 ml
eugenol Ditambah 30 ml larutan 5% KOH Lapisan air I Lapisan
diklorometan Ekstraksi cair-cair Ditambah 25 ml larutan 5 % KOH
Lapisan air II Lapisan diklorometanEkstraksi cair-cair Ditambah
25 ml larutan 5% KOH
Lapisan air III Lapisan diklorometanLapisan air (I+II+III)
Dimasukkan ke corong pisah Dicuci dengan 15 ml diklorometan
Lapisan air Lapisan diklorometan Didinginkan Diasamkan secara
perlahan dengan larutan 5%HCl sampai pH 1 Lapisan air asam
Ekstraksi cair-cair Bilas dengan 10 ml diklorometan (dilakukan
2x)
Lapisan air Lapisan diklorometan (I) Ekstraksi cair-cairDitambah
10 ml diklormetan
Lapisan airLapisan diklormetan (II)
Lapisan airEkstraksi cair-cairDitambah 10 ml diklorometan
Lapisan airLapisan diklorometan (III)Lapisan dikorometan
(I+II+III) Dimasukkan ke corong pisah yang sama Cuci dengan 15 ml
akuades
Larutan Air Larutan diklorometanCuci dengan 15 ml NaCl setengah
jenuh (8 ml NaCl jenuh & akuades)
Lapisan Air Lapisan diklorometanDimasukkan ke dalam
erlenmeyer/beaker glassDitambah 15 gram Natrium sulfat anhidrat
p.aLarutan Eugenol dalam diklorometan3. PemekatanLabu alas bulat
ditimbang
Larutan eugenol dalam diklorometan didecanter dalam LAB sesuai
label A B C D E
Ditambahkan 100 mg eugenol pada labu C
Diklorometan didistilasi dengan rotary evaporator
Saat pelarut habis akan tersisa minyak kuning pucat yang berbau
tajam dan khas dari cengkeh dan mengandung sekitar 98% eugenol
4. DeterminasiDitambahkan 100 mg eugenol pada labu D
Diinjeksikan ekstrak A B C D E dan 1 ml hasil distilasi E yang
disisihkan ke GC-FID yang sudah dioptimasikan
5. Pembuatan Larutan Baku EugenolDibuat larutan stok dengan
mengambil 0,1 ml baku eugenol
Dilarutkan dalam heksan dan diencerkan dalam labu takar hingga
batas tanda
Dari larutan stok tersebut diambil sejumlah 0,5; 1,0; 1,5; 2,0;
2,5 ml larutan
Dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml
Diencerkan dengan heksan hingga batas tanda
6. Pengkondisian GCGC dinyalakan sesuai petunjuk pemakaian
Suhu injektor, oven, dan detektor diatur
Pengkondisian dilakukan selama 1 jam
7. Penentuan waktu retensiOven diatur pada suhu 150C
Standar diinjeksikan sebanyak 1-2 l
Ditunggu sampai puncak eugenol keluar
Waktu retensinya dicatat
Ulangi dengan sampelBandingkan puncak kromatogram sampel dengan
standard, nilai Rsnya dihitung8. Jika puncak sudah
terpisahDisiapkan seri kadar larutan standar eugenol dari larutan
stok standar
Masing-masing seri larutan standar diinjeksikan, dibuat hubungan
konsentrasi dengan luas puncak (kurva baku), dihitung LOD
teoritis
Sampel diinjeksikan, jika puncak terlalu besar, diencerkan
dengan metanol sampai luas puncak masuk ke dalam rentang kurva
baku
Dihitung kadarnya dan % recovery
F. Data Pengamatan1. Data Penimbangan Sampel CengkehSampelKertas
(g)Kertas + isi (g)Isi (g)
A0.26702.27292.2577
B0.25322.26572.2064
C0.24932.26152.2077
D0.25642.57842.5488
E10.24842.28582.2144
E20.25052.27202.2377
2. Data Perhitungan Baku Eugenol0.1 mL x 99% (v/v) = 0.099 mLm =
x V = 1.07 g/mL x 0.099 mL = 0.10593 gram dalam 10 mLC = = 0.010593
g/mL = 10.593 /mL
Konsentrasi Larutan SeriSeri 10.5 mL X 10.593 g/mL = C1 X 10
mLC1 = 529.65 g/mlSeri 21.0 mL X 10.593 g/mL = C2 X 10 mLC2 =
1059.3 g/mlSeri 31.5 mL X 10.593 g/mL = C3 X 10 mLC3 = 1589.5
g/mlSeri 42.0 mL X 10.593 g/mL = C4 X 10 mLC4 = 2118.6 g/mlSeri
52.5 mL X 10.593 g/mL = C5 X 10 mLC5 = 2648.25 g/ml
3. Kurva Baku EugenolTabel Seri Larutan BakuSeriKadarIntegral
1Integral 2AUC
1529.652.8372.9080.071
21059.30.2330.3570.124
31588.950.6580.8350.177
42118.62.5462.7670.221
52648.252.0632.3260.263
4. Data Perhitungan Sampel CengkehTabel Kadar Eugenol Sampel
SebenarnyaSampelIntegral 1Integral 2AUCKadar (g/mL)Faktor
pengenceranKadar Sebenarnya (g/mL)
A20.35820.5160.1581456.6673.3334855.556
B22.72522.9130.1881790.0002035800.000
C23.07823.2440.1661545.5562030911.111
D22.03722.1850.1481345.5562026911.111
E22.36122.5370.1761656.6671016566.667
LOD LOQ y-LOD = YB + 3SBy-LOQ = YB + 10SBKeterangan: YB = a dari
persamaan baku y=bx+aSB = Sy/xy-LOD dan y-LOQ dianggap y dalam
persamaan baku, sehingga didapatkan x yang merupakan nilai LOD dan
LOQ.
EugenolPersamaan kurva baku y = 0.00009x + 0.0269Xi (Kadar)Yi
(AUC)Yi-(Yi-)2
529.650.071-0.0040.0000127
1059.30.1240.0020.0000031
1588.950.1770.0070.0000503
2118.60.2210.0030.0000117
2648.250.263-0.0020.0000050
0.0000829
Sy/x= = 0.00526y-LOD = YB + 3SB = 0.0269 + 3(0.00526) = 0.0427
LOD= 0.0427 = 0.00009x + 0.0269X = 175.5 g/ml y-LOQ = YB + 10SB =
0.0269 + 10(0.00526) = 0.080LOQ= 0.080 = 0.00009x + 0.0269X= 590
g/ml5. % Recovery dan % KesalahanSampelAUC (Y)Kadar (ppm)Kadar
(mg/ml)Bobot (mg)
A0.1584855.5564.8560.486
B0.18835800.00035.8003.580
C0.16630911.11130.9113.091
D0.14826911.11126.9112.691
E0.17616566.66716.5671.657
Recorvery A = = = - 1.171 % b/b
Recorvery B = = = 1.923 % b/b
Recorvery C = = = 1.434 % b/b
Recorvery D = = = 1.034 % b/b
% kesalahan total = 100 % - % recorvery A100 % - (-1.171%) =
101.171 %% kesalahan distilasi =% kesalahan total (100% - %
recorvery B) 101.171 % - (100% - 1.923 %) = 3.094 %% kesalahan
partisi= (100 % - % recorvery B) (100 % - % recorvery C)(100 % -
1.923 %) (100 % - 1.434 %) = -0.489 %% kesalahan pemekatan = (100 %
- % recorvery C) (100 % - % recorvery D)(100 % - 1.434 %) (100 % -
1.034 %) = -0.400 %% kesalahan determinasi = (100 % - % recorvery
D) (100 % - % recorvery E)(100 % - 1.034 %) (100 % - 100 %) =
98.966 %
6. Presisi Intraday Larutan SeriREPLIKASI ISeriKadarIntegral
1Integral 2AUC
1529.650.0740.1480.074
21059.30.260.3720.112
31588.950.560.7480.188
42118.60.951.1520.202
52648.251.491.8280.338
REPLIKASI IISeriKadarIntegral 1Integral 2AUC
1529.652.092.1530.063
21059.31.9282.0270.099
31588.952.3122.4720.16
42118.62.692.9080.218
52648.253.1913.4730.282
REPLIKASI IIISeriKadarIntegral 1Integral 2AUC
1529.653.5423.6110.069
21059.33.7143.8160.102
31588.953.9954.1730.178
42118.64.4194.6640.245
52648.254.9555.2460.291
SD dan %RSDSERI 1X(X-)(X-)2
0.0740.0050.0000284
0.063-0.0060.0000321
0.06900
SD0.0000605
SERI 2X(X-)(X-)2
0.1120.1040.0080.0000588
0.099-0.0050.0000284
0.102-0.0020.0000054
SD0.0000927
SERI 3X(X-)(X-)2
0.1880.1750.0130.0001604
0.16-0.0150.0002351
0.1780.0030.0000071
SD0.0004027
SERI 4X(X-)(X-)2
0.2020.222-0.0200.0003868
0.218-0.0040.0000134
0.2450.0230.0005444
SD0.0009447
SERI 5X(X-)(X-)2
0.3380.3040.0340.0011788
0.282-0.0220.0004694
0.291-0.0130.0001604
SD0.0018087
7. ResolusiSeri 5 = = = 18.891Sampel C = = = 20.544
8. Faktor Asimetri dan Tailing FactorSeri 5FA = = = 1TF = = =
0.97Sampel CFA = = = 0.8TF = = = 0.85
G. PembahasanTujuan praktikum kali ini bertujuan untuk mengenal
dan memahami teknik pemisahan dengan teknik distilasi uap,
menentukan kadar eugenol yang terkandun g dalam bunga kering secara
kromatografi gas, mendapatkan minyak cengkeh dari bunga cengkeh
dengan distilasi uap, dan mengisolasi serta mendeterminasi eugenol
dari minyak cengkeh secara ekstraksi dan kromatografi gas.Metode
distilasi digunakan untuk memisahkan dan memurnikan senyawa-senyawa
organik. Prinsip distilasi yaitu pemisahan dua komponen atau lebih
berdasarkan titik didih suatu senyawa, prosesnya meliputi penguapan
cairan dengan adanya panas yang kemudian uap tersebut
dikondensasikan dengan kondensor.Metode distilasi secara sederhana
dibagi menjadi tiga, distilasi sederhana, distilasi uap, dan
distilasi fraksi. Teknik distilasi uap biasanya digunakan untuk
mengisolasi minyak. Prinsip distilasi uap yaitu didasarkan pada
volatilitas beberapa senyawa organik terhadap uap pada temperatur
kurang dari 100oC.Pemisahan yang terjadi dalam distilasi uap
didasarkan pada perbedaan titik didih dari masing-masing zat dalam
campuran, sehingga zat dengan titik didih lebih rendah akan menguap
paling awal, uap yang didinginkan akan membentuk embun, menetes,
dan menghasilkan destilat (zat murni). Keuntungan digunakan
distilasi uap dalam mengisolasi minyak atsiri yaitu penetrasi uap
ke dalam sel tanaman cukup baik sehingga dapat membawa minyak
keluar dari sel tanaman. Uap air menembus dengan cara osmosis yang
menyebabkan pembengkakan membran dan membawa minyak sampai ke
permukaan.Distilasi uap didasari oleh Hukum Dalton yaitu tekanan
campuran dari gas sebanding dengan jumlah tekanan parsial gas
masing-masing senyawa dalam campuran, dinyatakan dengan rumus
Ptotal = P1 + P2 (Helmenstine, A. M., 2014).Tekanan uap larutan
yang mengandung pelarut mudah menguap dan tidak mudah menguap
digambarkan dengan Hukum Raoult, dinyatakan oleh rumus : Plarutan =
Xsolven x P0solven. Dimana Plarutan adalah tekanan uap larutan,
Xsolven adalah fraksi mol dari solven, dan P0 adalah tekanan uap
dari pelarut murni pada suhu tertentu (Helmenstine, T.,
2014).Distilasi uap digunakan untuk mendistilasi campuran air
dengan senyawa yang tidak larut dalam air, dilakukan dengan
mengalirkan uap air ke dalam campuran sehingga suatu bagian akan
menguap pada suhu lebih rendah. Dengan adanya tekanan uap campuran
dari dua senyawa, maka titik didih masing-masing senyawa akan lebih
rendah dari titik didih awalnya.Praktikum kali ini meliputi 5 kali
ekstraksi untuk sample A,B,C,D, dan E. Pada sample A, sebelum bubuk
cengkeh didistilasi, ditambahkan larutan eugenol sebanyak 100 l.
Labu alas bulat yang berisi bubuk cengkeh diberi batu didih untuk
mempercepat dan menyebarkan panas saat proses distilasi, lalu
tambahkan aquadest sebanyak 150 ml. Penting untuk diperhatikan
yaitu air harus tetap pada labu alas bulat, sehingga setiap tetes
hasil distilasi yang keluar harus digantukan dengan tambahan dari
aquadest. Setelah distilasi selesai, pada destilat E diambil 1 ml
untuk dianalisis.Proses selanjutnya yaitu ekstraksi dengan tujuan
untuk memisahkan suatu senyawa berdasarkan kelarutannya dalam dua
cairan yang tidak saling campur, biasanya digunakan air dan pelarut
organik. Ekstraksi yang dilakukan yaitu ekstraksi cair-cair dan
menggunakan corong pisah. Pelarut yang digunakan dalam praktikum
ini yaitu air (aquadest) dan diklorometan, solute akan berpindah ke
dalam pelarut diklorometan dari pelarut air sesuai dengan koefisien
distribusinya. NaCl ditambahkan pada hasil destilat supaya terjadi
peristiwa salting out yaitu proses penambahan larutan elektrolit ke
dalam fase air yang mengandung senyawa organik, penambahan ini
bertujuan untuk menurunkan kelarutan senyawa organik dalam air,
sehingga konsentrasi senyawa organik dalam pelarut organik akan
lebih besar daripada dalam fase air, kemudian ditambah
diklorometan. Ekstraksi menghasilkan dua lapisan, di mana lapisan
yang atas merupakan fase air dan lapisan bawah merupakan fase
diklorometan (organik), hal ini dapat terjadi karena BJ
diklorometan lebih besar daripada BJ air yaitu 1,33. Penggojokan
konstan dilakukan saat proses ekstraksi supaya tidak terjadi
emulsi. Emulsi yang terbentuk akan mengganggu dalam pengamatan saat
pemisahan dua lapisan tersebut. Penambahan NaCl dapat digunakan
untuk mengatasi terbentuknya emulsi.Larutan diklorometan diambil,
sedangkan larutan air dilakukan ekstraksi ulang sebanyak dua kali
untuk memastikan apakan zat yang diinginkan benar-benar terbawa
oleh pelarut diklorometan karena mencapai kesetimbangan lebih dari
saru kali. Ketiga hasil ekstraksi digabungkan. Air yang masih
terkandung di dalamnya dikeringkan denga penambahan natrium sulfat
exicc.PARTISIProses selanjutnya yaitu partisi, partisi dilakukan
dengan tujuan untuk memisahkan senyawa eugenol dari senyawa organik
atau pengotor lain. Lapisan diklorometan yang sudah dikeringkan
dipindahkan dalam corong pisah, kemudian ditambahkan 100 mg eugenol
baku pada larutan B dengan tujuan untuk melihat kesalahan yang
terjadi saat proses partisi. Ekstraksi cair-cair dilakukan dengan
cara yang sama untuk semua sample yaitu ditambahkan 30 ml larutan
KOH 5% dengan tujuan untuk membentuk garam eugenol yang larut dalam
air, sehingga senyawa eugenol dapat terpisah dari senyawa organik
lainnya yang terkandung dalam minyak cengkeh. Setelah terbentuk dua
lapisan kemudian dipisahkan. Lapisan air disimpan, sedangkan
lapisan diklorometan diekstraksi kembali sebanyak dua kali dengan
KOH 5%, lapisan air yang terbentuk digabungkan dengan lapisan air
sebelumnya. Berikut reaksi pembentukan garam eugenol :
Lapisan air gabungan yang diperoleh dicuci kembali dengan
diklorometan sebanyak 15 ml dengan tujuan agar pemisahan yang
terjadi benar-benar optimal. Lapisan air diambil dan ditampung
dalam erlenmeyer sambil didinginkan (agar eugenol tidak
terhidrolisis). Kemudian diasamkan dengan menggunakan HCl 5% hingga
mencapai pH 1. Tujuan pengasaman adalah untuk mengubah garam
eugenol menjadi bentuk eugenol kembali yang larut dalam pelarut
organik dan tidak larut air. Pada pH 1 molekul eugenol akan
terbentuk lebih banyak dibanding bentuk ion nya. Dibuktikan oleh
persamaan Handerson-Hasselbach:1 = 10,19 + log -9,19 = log =
Keterangan : A adalah bentuk ion HA adalah bentuk molekulReaksinya
sebagai berikut :
Larutan asam dipindahkan ke dalam corong pisah, kemudian
erlenmeyer dibilas dengan 10 ml diklorometan sebanyak dua kali. Dua
lapisan yang terbentuk dipisahkan, lapisan diklorometan (lapisan
bawah) ditampung dalam erlenmeyer dan ditutup aluminium foil karena
eugenol mudah menguap. Lapisan air diesktraksi lagi dengan
diklorometan 10 ml sebanyak dua kali, lapisan diklorometan yang
terbentuk diambil dan digabungkan dengan lapisan diklorometan
sebelumnya. Tujuan pengesktraksian dengan diklorometan ini adalah
untuk memisahkan senyawa eugenol dari senyawa lain dalam air.
Lapisan diklorometan kemudian dicuci kembali dengan air dalam
corong pisah yang sama supaya pemisahan optimal, lapisan
diklorometan yang terbentuk diambil dan dicuci dengan NaCl setengah
jenuh. Tujuan pencucian ini adalah untuk memisahkan senyawa eugenol
dari senyawa lain berupa ion. Lapisan diklorometan dipindahkan
dalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan natrium sulfat anhidrat
dengan tujuan untuk menarik air yang tersisa dalam larutan.
PEMEKATANProses selanjutnya adalah pemekatan dengan rotary
evaporator. Tujuan dari pemekatan ini adalah untuk meningkatkan
kadar eugenol tanpa mengubah menjadi bentuk kering, sehingga
didapat minyak kental eugenol. Keunggulan dari vacuum rotary
evaporator yaitu dapat menguapkan pelarut lebih cepat karena
terdapat vakum yang dapat menurunkan tekanan sehingga titik didih
pelarut juga akan turun, maka akan lebih mudah menguap. Rotary
(perputaran) akan menyebabkan luas permukaan semakin luas sehingga
pemekatan dilakukan dengan waktu yang cukup singkat. Sebelumnya,
100 mg standar eugenol ditambahkan pada labu C yang bertujuan untuk
mengetahui persen kesalahan pada proses pemekatan.Evaporasi adalah
peristiwa menguapnya pelarut dari campuran. Evaporasi didasarkan
pada proses pendidihan secara intensif yaitu (1) pemberian panas ke
dalam cairan, (2) pembentukan gelembung-gelembung akibat uap, (3)
pemisahan uap dari cairan dan (4) mengkondensasikan uapnya.
Evaporasi dilaksanakan dengan cara menguapkan sebagian dari pelarut
pada titik didihnya, sehingga diperoleh larutan zat cair pekat
dengan konsentrasi lebih tinggi. Dalam evaporasi zat cair pekat
merupakan produk yang dipentingkan, sedangkan uapnya biasanya
dikondensasikan dan dibuang. Disinilah letak perbedaan antara
evaporasi dan distilasi (Praptiningsih, 1999).Prinsip utama dari
evaporasi adalah pemisahan larutan dari pelarutnya dengan
menggunakan uap panas, pemisahan didasarkan pada perbedaan titik
didih dari cairan dalam larutan tersebut, biasanya pelarut yang
digunakan adalah air. Pada praktikum kali ini alat yang digunakan
untuk evaporasi adalah rotary vakum evaporator. Prinsip kerja
rotary vakum evaporator adalah mengubah fase cair menjadi fase gas
dengan cara memanaskan campuran sehingga tersisa fase dengan titik
didih lebih tinggi dan konsentrasi yang lebih tinggi. Hasil yang
diperoleh lebi murni dibandingkan hasil dari partisi. Setelah
melalui pemekatan, eugenol dimasukkan dalam labu 5 ml, ditambahkan
heksan hingga batas tanda dan siap dideterminasi dengan
kromatografi gas.Pada praktikum kali ini larutan yang dievaporasi
yaitu larutan partisi C dan E1, selanjutnya setiap larutan diberi
diklorometan sebagai pelarut. Kemudian masing-masing larutan
tersebut di evaporasi dengan pemanasan ?0 C. Hal ini dilakukan
untuk menguapkan diklorometan agar terbentuk cairan yang yang
mengandung eugenol sekitar 98% dan berbau khas eugenol serta
berwarna kuning pucat. Hal tersebut menandakan bahwa pelarut
diklorometan sudah diuapkan.DETERMINASITujuan dari determinasi
adalah untuk mengetahui keakuratan hasil senyawa yang telah
diekstraksi. Pada tahap determinasi, sampel D ditambahkan 100 mg
eugenol dan kemudian sampel A, B, C, D, dan E diinjeksikan dalam GC
yang telah dioptimasi.Kromatografi gas adalah metode kromatografi
yang diguakan untuk memisahkan dan mendeteksi senyawa-senyawa yang
mudah menguap dan stabil terhadap suhu panas dalam suatu campuran.
Pemisahan kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu
senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi
anatara solute dengan fase diam. Fase gerak yang berupa gas akan
mengelusi solute dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke
detektor. Penggunaan suhu yang meningkat (pada kisaran 50-3000C)
bertujuan untuk menjamin bahwa solute akan menguap dan karenanya
akan cepat terelusi.Dalam praktikum ini digunakan kromatografi gas
cair dengan fase diam yang digunakan adalah HP-INNOWax dan HP-5%
yang bekerja pada rentang suhu 0-300oC. fase diam yang digunakan
memiliki sifat polar sehingga apabila analit yang akan di uji
memiliki sifat nonpolar maka akan memiliki waktu retensi yang
pendek. Selain itu digunakan fase diam yang lain yaitu 5%-fenil
metil siloksan yang bersifat nonpolar yang berfungsi untuk
mengoptimalkan pemisahan. Kedua fase diam tersebut bekerja pada
rentang suhu 0-300oC sehingga dapat dipakai pada pemisahan dan
deteksi, karena suhu pada sistem kromatografi gas diatur di dalam
rentang suhu tersebut begitu pula dengan titik didih eugenol.Fase
gerak yang digunakan biasanya adalah gas helium, argon, nitrogen,
dan hydrogen. Pada praktikum kali ini digunakan fase gerak Nitrogen
(N2), Hidrogen (H2), dan udara. Fungsi utama dari fase gerak adalah
untuk membawa uap analit melalui sistem kromatografi tanpa
berinteraksi dengan komponen-komponen sampel. Gas N2 memerlukan
kecepatan alir yang lambat (10cm/detik) untuk dapat mencapai
kinerja yang optimum pada HETP minimum. Sementara itu gas H2 dan He
dapat dialirkan lebih cepat untuk memperoleh kerja yang optimum,
25cm/detik untuk N2 dan 35cm/detik untuk gas He. Adapunn syarat-
syaat fase gerak pada kromatografi gas sebagai berikut : Tidak
reaktif Murni (agar tidak mempengaruhi deteksi oleh detektor) Dapat
disimpan dalam tangki tekanan tinggi (mengandung helium, nitrogen,
hydrogen, ataupun campuran argon dan metana. Pemilihan gas pembawa
yang digunakan tergantung dari detektor yang digunakan (Gandjar dan
Rohman, 2007).Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan,
dimana profil kolom yang digunakan pada praktikum adalah kolom
kapiler dengan ukuran 30 m x 0.32 mm. Semakin sempit diameter
kolom, maka semakin besar efisiensi pemisahan pada kolom yang
ditandai dengan puncak kromatogram yang dihasilkan semakin tajam.
Kolom kapiler lebih banyak digunakan karena kemampuannya yang
memberikan harga jumlah pelat teori (N) yang sangat besar
(>300.000 pelat).Detektor yang digunakan adalah FID (Flame
Ionized Detector) dengan gas penembaknya adalah gas hydrogen (H2)
yang berfungsi untuk memanaskan detector agar dapat membakar uap
sampel agar dapat terion dan dapat terdeteksi. Detektor pada
kromatografi gas adalah suatu sensor elektronik yang berfungsi
mengubah sinyal gas pembawa dan komponen didalamnya menjadi sinyal
elektronik. Prinsip dari detector FID adalah pembakaran terhadap
senyawa organik yang nantinya akan terurai menjadi pecahan
sederhana dan kemudian diukur dan direkam. Pada pemakaian FID,
sebaikanya kecepatan alir dari H2 30ml/menit agar hasilnya efisien
dan suhu system harus berada diatas 100oC untuk mencegah kondensasi
uap air yang mengakibatkan FID berkarat atau menurunkan
sensitifitasnya. Kromatogram yang merupakan hasil pemisahan
komponen disajikan detector sebagai deretan luas puncak terhadap
waktu.Injektor yang digunakan adalah split use sehingga terdapat
pembagian aliran fase gerak yang bertujuan untuk mengurangi tekanan
dalam kolom. Untuk menembus lubang pada injektor digunakan syringe
yang berujung runcing sehingga memudahkan untuk menembus lubang
injektor yang berupa septum. Septum tersebut berfungsi untuk
mencegah masuknya zat pengotor yang berasal dari udara yang dapat
mengganggu pengukuran. Sebelum diinjeksikan ke GC dilakukan
terlebih dahulu pengkondisian GC. Tujuan dari kondisioning GC ini
adalah untuk mendapatkan kondisi instrumentasi kromatografi yang
sesuai supaya dapat menerima analit-analit yang akan
dimasukkan.Kondisioning dilakukan dengan mengatur suhu/temperatur
oven sebesar 150oC, temperatur injektor sebesar 200 oC menggunakan
gas nitrogen, hidrogen dan udara selama 1 jam. Pemisahan dengan
kolom disebut pemisahan dengan prinsip isothermal. Pemisahan ini
sering dilakukan pada analisis rutin atau ketika mengetahui banyak
sifat sampel yang akan dipisahkan. Diperhatikan jika suhu yang
terlalu tinggi akan mengelusi komponen tanpa terpisah, jika suhu
terlalu rendah maka komponen yang bertitik didih tinggi akan keluar
sangat lambat sehingga dapat mengganggu proses kromatografi
selanjutnya.Setelah dilakukan kondisioning, maka diinjeksikan
pelarut heksan terlebih dahulu. Tujuannya penginjeksian pelarut
adalah untuk melihat kromatogram dari pelarut yang digunakan oleh
analit, apakah pelarut tersebut terdapat pengtor atau tidak dan
melihat waktu retensi dari pelarut itu sendiri.Kelebihan dari
metode kromatografi gas adalah : Waktu analisis relatif singkat dan
ketajaman pemisahan yang tinggi Dapat digunakan kolom yang lebih
panjang untuk hasil pemisahan yang lebih baik Banyak pilihan
detektor dan kolom Temperatur dapat diukur Pemakaian fase cair
memungkinkan kita memilih dari sejumlah fase diam yang sangat
beragam yang memisahkan hampir segala macam campuran.
Kelemahan dari metode kromatografi gas adalah : Terbatas untuk
zat yang mudah menguap Tidak mudah dipakai untuk memisahkan
campuran dalam jumlah besar Hanya bisa untuk senyawa yang stabil
pada suhu tinggi yang dapat diukur dengan kromatografi gas Alat dan
penggunaannya mahalDalam praktikum kali ini digunakan standar adisi
yaitu standar yang ditambahkan dengan tujuan untuk mengetahui
persen recovery dari keseluruhan tahap yang dilakukan. %recovery
dari setiap tahap diperoleh dengan rumus :
Perhitungan dilakukan dari tahap determinasi terlebih dahulu.
%kesalahan yang terjadi saat determinasi diperoleh dengan cara
mengurangkan 100% dengan %recovery yang didapat. Sedangkan untuk
%recovery dari setiap tahapnya diperoleh dengan cara mengurangkan
100% dengan %kesalahan dari masing-masing tahap. Persen kesalahan
masing-masing tahap didapat dari 100% dikurangkan dengan jumlah %
kesalahan dari tahap sebelumnya dengan % recovery dari
masing-masing sampel (A, B, C, D, dan E).Heksan diinjek dahulu
sebelum dilakukan pengukuran seri baku, hal ini dilakukan karena
heksan merupakan pelarut yang digunakan. Heksan dipilih sebagai
pelarut karena waktu retensinya yang berbeda cukup jauh dengan
eugenol. Heksan akan terbaca lebih dahulu oleh detektor karena
titik didihnya hanya 69oC sehingga akan menguap lebih cepat
dibanding eugenol yang mempunyai titik didih 254oC, maka peak
heksan akan lebih dahulu dibanding peak eugenol.Standar eksternal
juga digunakan yaitu baku eugenol. Seri larutan baku eugenol dibuat
dengan 5 level konsentrasi. Seri larutan baku tersebut digunakan
untuk membuat persamaan linear baku, persamaan kurva baku yang
diperoleh yaitu y = 0,9x10-5 + 0,0269 dengan r = 0.998, dapat
disimpulkan bahwa kurva yang diperoleh cukup linear karena r
mendekati 1. Dari persamaan yang diperoleh dapat dihitung
konsentrasi sampel yang diuji berdasarkan AUC sebagai nilai y dan x
sebagai konsentrasi sample.Berdasarkan hasil yang diperoleh, nilai
AUC pada sampel A, B, C, D, dan E berturut-turut adalah 0.158,
0.188, 0.166, 0.148, 0.176, sehingga kadar yang diperoleh dari
sampel A, B, C, D, dan E adalah 4855.556 g/ml, 35800.000 g/ml,
30911.111 g/ml, 26911.111 g/ml, 16566.667 g/ml. Secara teori urutan
kadar sampel dari yang terendah sampai tertinggi yaitu sampel E, A,
B, C, D. Sampel E secara teori memiliki kadar terendah, hal ini
disebabkan karena pada sampel E tidak dilakukan penambahan adisi.
Dari data yang praktikan peroleh sampel dengan kadar tertinggi
adalah sampel B, sementara sampel dengan kadar terendah adalah
sampel A. Hal ini tidak sesuai dengan teori, karena pada tahap
partisi sampel A ada kesalahan, dimana fase organik sebagian kecil
tumpah sehingga otomatis akan mengurangi jumlah analitnya.
Sementara untuk sampel dengan kadar tertinggi seharusnya dimiliki
oleh sampel D, karena penambahan baku adisi pada sampel D terjadi
sesaat sebelum sampel dideterminasi menggunakan kromatografi gas,
hal ini menyebabkan kemungkinan hilangnya eugenol menjadi semakin
kecil. Namun, pada data praktikan sampel D memiliki kadar ketiga
terendah setelah A dan E. Hal ini tidak sesuai dengan teori, dapat
disebabkan karena analit ikut terbawa menguap bersama pelarut
(diklorometan) saat sampel disimpan di dalam almari asam selama 1
minggu. Hal lain yang dapat menyebabkan data tidak sesuai dengan
teori adalah karena setiap sampel dikerjakan oleh praktikan yang
berbeda sehingga data tidak objektif.Dari hasil percobaan yang
dilakukan, dapat disimpulkan parameter validasi metode menurut ICH
yang sudah terpenuhi, yaitu : Akurasi, merupakan ketelitian metode
analisis atau kedekatan dari nilai terukur dengan nilai diterima.
Diukur dengan banyaknya analit yang diperoleh kembali pada
pengukuran melakukan spiking pada sampel. Data yang dilaporkan
sebagai persentase perolehan kembali (Gandjar dan Rohman,
2007).
Rentang kesalahan yang diijinkan pada setiap konsentrasi analit
pada matriks, yaitu : (Harmita, 2004).Hasil yang didapat yaitu %
recovery sampel adalah: sampel A -1.71% b/b, sampel B 1.923% b/b,
sampel C 1.434% b/b, dan sampel D 1.034% b/b, sehingga dapat
disimpulkan %recovery yang didapat tidak sesuai dengan kriteria
yaitu 99-101%. Hasil %recovery sampel A didapatkan nilai minus
dikarenakan saat setengah sampel terbuang saat dilakukannya proses
partisi. Hasil yang didapat yaitu, % kesalahan total sebesar
101.171%, % kesalahan destilasi sebesar 3.094%, % kesalahan partisi
sebesar -0.489%, % kesalahan pemekatan sebesar -0.400%, dan %
kesalahan determinasi sebesar 98.966%, dari hasil yang didapat
tersebut dapat disimpulkan bahwa kesalahan terbesar terjadi pada
tahap determinasi. Dari hasil-hasil yang didapatkan dapat
disimpulkan bahwa metode yang digunakan kurang akurat dikarenakan
hasil yang didapatkan tidak tepat dan masih jauh dari teori yang
sebenarnya. Presisi/ Reprodusibel Pada percobaan ini dilakukan
perhitungan presisi intra day yang dilakukan dengan menghitung 5
seri larutan baku sebanyak 3 kali replikasi. Parameter presisi
dapat dilihat dari %RSD. Dari hasil percobaan yang dilakukan
didapatkan nilai %RSD : seri 1 sebesar 0.088%, seri 2 sebesar
0.089%, seri 3 sebesar 0.230%, seri 4 sebesar 0.426%, dan seri 5
sebesar 0.595%. %RSD yang baik yaitu memiliki nilai 8%, sehingga
dapat disimpulkan %RSD dari semua seri memiliki presisi yang baik
sehingga keterulangan dari metode yang dilakukan baik dan
reprodusible. Selektivitas, merupakan suatu ukuran seberapa mampu
metode tersebut mengukur analit saja dengan adanya senyawa senyawa
lain yang terkandung didalam sampel. Metode analisis yang paling
selektif melibatkan pemisahan secara kromatografi (Watson, 2007).
Pengukuran selektivitas dapat dilakukan dengan mengukur resolusi
dari 2 puncak yang terbentuk pada senyawa, sedangkan resolusi yang
baik yaitu 2.0. Resolusi yang didapatkan dari hasil percobaan yaitu
sebesar 18.891 untuk seri 5 larutan baku dan 20.544 untuk sampel c
cengkeh, sehingga kesimpulannya yaitu seri 5 larutan baku sudah
diklasifikasikan telah terpisah namun kurang baik, sedangkan untuk
sampel c cengkeh resolusinya sudah terpisah baik antar 2 puncaknya.
Batas Deteksi (LOD/Limit Of Detection) Batas deteksi adalah
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat
dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LOD
merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit
diatas atau dibawah nilai tertentu (Gandjar dan Rohman, 2007). Dari
hasil yang didapatkan, nilai LOD nya yaitu sebesar 175.5 g/ml.
Semakin kecil nilai LOD maka semakin mampu untuk mengidentifikasi
sampel yang akan diuji, dan hasil LOD yang didapat kecil. Batas
Kuantifikasi (LOQ/Limit Of Quantification) Batas kuantifikasi
adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat
ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada
kondisi operasional metode yang digunakan (Gandjar dan Rohman,
2007). Dari hasil yang didapatkan, nilai LOQ nya yaitu sebesar 590
g/ml. Semakin kecil nilai LOQ maka semakin mampu untuk
mengidentifikasi sampel yang akan diuji, dan hasil LOQ yang didapat
kecil. Linearitas, Pada hasil pengukuran terhadap seri larutan
baku, didapatkan konsentrasi sebesar 529.65 g/mL, 1059.3 g/mL,
1588.95 g/mL, 2118.6 g/mL, dan 2648.25 g/mL. Dari hasil pengukuran
juga didapatkan waktu retensi eugenol sekitar 255-265 sekon (puncak
berada pada 262 sekon), dan didapatkan kurva baku yaitu y =
0.00009x + 0.0269 dengan nilai r = 0.997. Dalam persamaan y = bx +
a, b merupakan nilai slope/ kemiringan kurva, dan a merupakan nilai
intersep. Dapat dikatakan nilai linearitas baik saat nilai r
mendekati 1, dimana korelasi antara kadar analit (x) dengan respon
instrument AUC (y) baik. Dari hasil r yang didapatkan dapat
disimpulkan bahwa linearitas dari kurva baku sudah baik.Farmakope
Amerika (United StatesPharmacopeia, USP) menentukan parameter
parameter yang dapat digunakan untuk menetapkan kesesuaian sistem
sebelum analisis. Pada umumnya paling tidak ada 2 kriteria yang
biasanya dipersyaratkan untuk menunjukkan kesesuaian sistem suatu
metode (Gandjar dan Rohman, 2007). Dari hasil percobaan, kriteria
menurut USP yaitu : Tailing Factor dan Faktor AsimetrisGuna
menentukan tingkat asimetri puncak dilakukan dengan menggukur
faktor asimetris dan tailing factor (Tf). Nilai Tf =1 menunjukkan
bahwa hasil puncak pada kromatogram sudah simetris. Harga Tf > 1
menunjukkan adanya tailing (Gandjar dan Rohman, 2007). Besarnya Tf
dihitung menggunakan persamaan berikut :Tf (tailing factor) =
(Ahuja and Dong, 2005). Dari hasil percobaan yang diukur pada 2
peak terbaik, didapatkan nilai Tf dari seri 5 larutan baku sebesar
0.97 dan Fa sebesar 1, dan pada sampel C cengkeh Tf sebesar 0.85
dan Fa sebesar 0.8, dan dapat disimpulkan bahwa puncak seri 5
larutan baku hanya terjadi sedikit tailing karena nilainya tidak
jauh dari teori yaitu 1, sedangkan untuk puncak yang dihasilkan
sampel C cengkeh cenderung tailing karena nilai Tf nya jauh dari
1.
H. KesimpulanTeknik pemisahan senyawa dapat dilakukan dengan
menggunakan metode distilasi uap yaitu berdasarkan pada perbedaan
titik didih dan tekanan uap dari campuran. Eugenol didapatkan
dengan cara isolasi minyak cengkeh menggunakan metode ekstraksi
corong pisah (partisi) kemudian dilanjutkan dengan pemekatan untuk
mendapatkan isolat murni, setelah itu eugenol yang didapat
dideterminasi dengan Kromatografi Gas. Jumlah eugenol yang didapat
tiap sampel yaitu 4855.556 g/ml (sampel A), 35800.000 g/ml (sampel
B), 30911.111g/ml (sampel C), 26911.111g/ml (sampel D), dan
16566.667g/ml (sampel E).
I. Jawaban Pertanyaan1. Cek kromatogram 1 mL E yang disisihkan,
perlukah dilakukan tahap clean up?Dari hasil kromatogram yang
diperoleh untuk sampel E tidak perlu dilakukan tahap clean up,
karena kromatogram yang diperoleh cukup bagus (tidak terjadi
fronting ataupun tailing) dan terpisah dengan puncak pelarut cukup
jauh (tidak terjadi overlapping) hal ini menunjukkan bahwa anait
sudah cukup bersih dari zat pengotor.2. Hitung konsentrasi
masing-masing ekstrak dengan cara standarisasi eksternal yang sudah
valid dan sesuai peruntukannya!Perhitungan Baku Eugenol0.1 mL x 99%
(v/v) = 0.099 mLm = x V = 1.07 g/mL x 0.099 mL = 0.10593 gram dalam
10 mLC = = 0.010593 g/mL = 10.593 /mLKonsentrasi Larutan Seri Seri
10.5 mL X 10.593 g/mL = C1 X 10 mLC1 = 529.65 g/ml Seri 21.0 mL X
10.593 g/mL = C2 X 10 mLC2 = 1059.3 g/ml Seri 31.5 mL X 10.593 g/mL
= C3 X 10 mLC3 = 1589.5 g/ml Seri 42.0 mL X 10.593 g/mL = C4 X 10
mLC4 = 2118.6 g/ml Seri 52.5 mL X 10.593 g/mL = C5 X 10 mLC5 =
2648.25 g/mlSampelIntegral 1Integral 2AUCKadar (g/mL)Faktor
pengenceranKadar Sebenarnya (g/mL)
A20.35820.5160.1581456.6673.3334855.556
B22.72522.9130.1881790.0002035800.000
C23.07823.2440.1661545.5562030911.111
D22.03722.1850.1481345.5562026911.111
E22.36122.5370.1761656.6671016566.667
Persamaan kurva baku y = 0.00009x + 0.0269Konsentrasi Sampel
A0,158= 0.00009x + 0.0269x= 1456,667 ppm Konsentrasi Sampel B0,188=
0.00009x + 0.0269x= 1790 ppmKonsentrasi Sampel C0,166= 0.00009x +
0.0269x=1545,556 ppmKonsentrasi Sampel D0,148= 0.00009x + 0.0269x=
1345,556 ppmKonsentrasi Sampel E0,176= 0.00009x + 0.0269x= 1656,667
ppmKonsentrasi samepl tersebut dalam ppm, dikalikan dengan faktor
konversi masing-masing sampel hingga didapat kadar dalam g/mL
(tabel perhitungan).3. Hitung LOQ metode diatas!Persamaan kurva
baku y = 0.00009x + 0.0269Xi (Kadar)Yi (AUC)Yi-(Yi-)2
529.650.071-0.0040.0000127
1059.30.1240.0020.0000031
1588.950.1770.0070.0000503
2118.60.2210.0030.0000117
2648.250.263-0.0020.0000050
0.0000829
Sy/x= = 0.00526y-LOD = YB + 3SB = 0.0269 + 3(0.00526) = 0.0427
LOD= 0.0427 = 0.00009x + 0.0269X = 175.5 g/ml y-LOQ = YB + 10SB =
0.0269 + 10(0.00526) = 0.080LOQ= 0.080 = 0.00009x + 0.0269X= 590
g/ml4. Apakah konsentrasi eugenol pada E diatas/dibawah LOQ?
Kesimpulan?Konsentrasi Eugenol E = 16566.667 g/ml16566.667 g/ml
> 590 g/ml (LOQ). Kesimpulannya adalah eugenol dapat
dikuantifikasi dengan akurasi dan presisi yang baik pada kondisi
pengujian diatas.5. Hitung % recovery konsentrasi ekstrak A, B, C
dan D SampelAUC (Y)Kadar (ppm)Kadar (mg/ml)Bobot (mg)
A0.1584855.5564.8560.486
B0.18835800.00035.8003.580
C0.16630911.11130.9113.091
D0.14826911.11126.9112.691
E0.17616566.66716.5671.657
Recorvery A = = = - 1.171% b/b
Recorvery B = = = 1.923% b/b
Recorvery C = = = 1.434% b/b
Recorvery D = = = 1.034% b/b6. Hitung % kesalahan konsentrasi
ekstrak A, B, C dan D! % kesalahan total = 100 % - % recorvery A100
% - (-1.171%) = 101.171 % % kesalahan distilasi (A)=% kesalahan
total (100% - % recorvery B) 101.171 % - (100% - 1.923 %) = 3.094 %
% kesalahan partisi (B)= (100 % - % recorvery B) (100 % - %
recorvery C)(100 % - 1.923 %) (100 % - 1.434 %) = -0.489 % %
kesalahan pemekatan (C)= (100 % - % recorvery C) (100 % - %
recorvery D)(100 % - 1.434 %) (100 % - 1.034 %) = -0.400 % %
kesalahan determinasi (D)= (100 % - % recorvery D) (100 % - %
recorvery E)(100 % - 1.034 %) (100 % - 100 %) = 98.966 %7. Tahapan
mana yang perlu dioptimasi lagi? Tahapan yang perlu dioptimasi lagi
adalah tahap determinasi karena memiliki %kesalahan yang besar
yaitu 98.966%.
J. Daftar PustakaAnonim, 2005,
http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9924007 di akses pada 11
Maret 2015 pukul 17.58.Arsyad, M., 2001, Kamus Kimia, PT. Gramedia
Pustaka Utama, Jakarta, hal. 93,94. Bulan, R., 2004, Reaksi
Asetilasi Eugenol dan Isolasi Metil Eugenol, Program Studi Teknik
Kimia, FMIPA, Universitas Sumatera Utara, diakses pada 11 Maret
2015 pukul 17:17.Edgar and Showick, 2009, General Studies Manual,
6th ed, Dorling Kindersley, India, p. 1147.Gandjar, I.G., Rohman,
A.,2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal.
459, 460, 465-470.Gavhanne, 2008, Mass Transfer II,`6th ed, Nirali
Prakashan, India, pp. 174-175.Hadyana, P.A., 2004, Kamus Kimia,
Balai Pustaka, Jakarta, hal. 236.International CHEMTREC, 2013,
Material Safety Data Sheet Aquadest,
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/., diakses tanggal 11 Maret 2015,
pukul 17:58.International CHEMTREC, 2013, Material Safety Data
Sheet Chloride Acid, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/., diakses
tanggal 11 Maret 2015, pukul 17:58.International CHEMTREC, 2013,
Material Safety Data Sheet Dichloride methane,
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/., diakses tanggal 11 Maret 2015,
pukul 17 :58.International CHEMTREC, 2013, Material Safety Data
Sheet Eugenol, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/., diakses tanggal
11 Maret 2015, pukul 17:59.International CHEMTREC, 2013, Material
Safety Data Sheet Haxane, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/.,
diakses tanggal 11 Maret 2015, pukul 17:59.International CHEMTREC,
2013, Material Safety Data Sheet Sodium Chloride,
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/., diakses tanggal 11 Maret 2015,
pukul 17:59.International CHEMTREC, 2013, Material Safety Data
Sheet Sodium Sulfate Anhydride, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/.,
diakses tanggal 11 Maret 2015, pukul 17:59.Kardinan, A. 2005.
Tanaman Penghasil Minyak Atsiri, Agromedia Pustaka, Jakarta, hal.
74.McNair, H.M., Miller, J.M., 2009, Basic Gas Chromatography, John
Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 1,2.Memmou, F., R. Mahboub,
2012, Composition of Essential Oil from Fresh Flower of Clove,
Jour. Of Sci. Res. In Phar, 1(2), pp. 33-35Nurdjannah, N., 2004,
Diversifikasi Tanaman Cengkeh, J. Perspektif, 3(2), hal.
6170.Pavia, D. L., 2005, Introductionto Organic Laboratory
Techniques: A Small Scale Approach, Thomson Learning, Inc., USA,
pp. 786, 797.Srivastava, A.K., SK Srivastava, K.V. Syamsundar,
2005, Bud and Leaf Essential Oil Composition of Syzygium aromaticum
from India and Madagascar, Flavour Fragr. J., 20, pp.51-53. Sarker,
S.D., Latif, Z., Gray, A.I., 2006, Natural Products Isolation,
Humana Press Inc., New Jersey, p. 327.Sunardi, 2004, Diktat Kuliah
Cara-cara Pemisahan, Departemen Kimia, FMIPA UII, Depok, hal.
183.Thomas, A.N.S., 2005, Tanaman Obat Tradisional, Kanisius,
Yogyakarta, hal. 22,24.Tim Kimia Analitik Instrumen, 2010, Penuntun
Praktikum Kimia AnalitikInstrumen (KI-431), Jurusan Pendidikan
Kimia FPMIPA UPI, Bandung, hal. 15.Vargasa, R.M.F., N. Martinez, D.
Lorenzo, E. Dellacassa, 2009, Steam Distillation Modeling For
Essential Oil Extraction Process, Volume 29, Issue Press, pp.
171176.Watson, D.G., 2007, Analisis Farmasi: Buku Ajar untuk
Mahasiswa Farmasi dan Praktisi Kimia Farmasi, Edisi II, Buku
Kedokteran EGC, hal. 413.
Yogyakarta, 17 April 2015Praktikan,
Asti Aprilia PutriEdwin TesalonikaMichael
Ryanda138114071138114072138114073
Andre SyofianDendi Putro A.Marcellina D.
D.138114081138114082138114084