-
IMAM WAHYU DWI KARTASASMITA
IMAM MUNANDAR
IMRAN
ILZA ADE PRATAMA
IDHAM HOLID
INE KARNI
HILIDA SUCI IRAWANI
HIKMAWATI
HIJRATUL KAHFI
LAPORAN PRAKTIKUM
PENGANTAR BIOTEKNOLOGI
Oleh,
KELOMPOK 10
IMAM WAHYU DWI KARTASASMITA B1D 012 133
IMAM MUNANDAR B1D 2
B1D 012 134
ILZA ADE PRATAMA
IDHAM HOLID
HILIDA SUCI IRAWANI B1D 012 125
HIKMAWATI
HIJRATUL KAHFI
FAKULTAS PETERNAKAN
UNIVERSITAS MATARAM
2013
i
PENGANTAR BIOTEKNOLOGI
B1D 012 133
B1D 212 132
B1D 012 134
B1D 012 125
-
ii
HALAMAN PENGESAHAN
Laporan Ini Disusun Guna Memenuhi Sebagian Syarat untuk
Menyelesaikan
Mata Kutliah Pengantar Bioteknologi
Mataram, 23 Desember 2013
Mengetahui,
Co. Assisten,
Susila Wati
(Yendri Junaidi)
B1D 010 180
Ima Milawati
(Filman Hayadi)
B1D 010 225
-
iii
KATA PENGANTAR
Puji syukur senantiasa terucapkan dari lisan kita kepada Allah
SWT.
Tuhan Yang Maha Besar yang telah menciptakan ilmu yang berguna
dalam hidup
dan kehidupan manusia. Dengan ridho dan pertolongan-Nya kami
dapat
menyelesaikan penulisan laporan praktikum Pengantar Bioteknologi
ini secara
berjamaah. Laporan ini berisi tentang cara-cara melakukan
isolasi plasmid DNA
dari bakter E. Colly, cara-cara melakukan reaksi berantai
polimerasi atau yang
sering disebut dengan PCR dan cara-cara melakukan elektroforesis
protein dengan
tujuan untuk dapat mengetahui berat mulekul protein suatu bahan.
Laporan ini
disusun guna memenuhi sebagian syarat dalam mengikuti mata
kuliah pengantar
bioteknologi.
Terimakasih kami ucapkan kepada semu pihak dari dosen, Co.
Assisten
dan rekan-rekan yang telah membantu dan membimbing dalam
melaksanakan
praktikum.
Dalam penulisan laporan ini kami menyadari bahwa kami adalah
manusia
biasa yang tidak terlepas dari kekurangan dan kesalahan karena
tidak ada gading
yang tak retak, baik dalam penulisan maupun dalam isi laporan.
Oleh karena itu
kami dari kelompok 10 sangat mengharapkan kritik dan saran yang
membangun
dari semua pihak sebagai langkah untuk mendapatkan hasil yang
lebih baik di
kemudian hari.
Akhirnya kami mengkarapkan semoga laporan ini dapat brmanfaat
dan
dapat digunakan sebagai referensi tambahan bagi yang
membutuhkan.
Mataram, 20 Desember 2013
Penyusun
-
iv
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL
............................................................................
i
KATA PENGANTAR
.........................................................................
ii
HALAMAN PENGESAHAN
..............................................................
iii
DAFTAR ISI
........................................................................................
iv
ACARA I ISOLASI PLASMID DNA BAKTERI E. COLLY
BAB 1 PENDAHULUAN
...................................................................
1
1.1 Latar Belakang
...................................................................
1
1.2 Tujuan
.................................................................................
2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
.......................................................... 3
BAB III MATERI dan METODE PRAKTIKUM
............................... 5
3.1 Materi Praktikum
................................................................
5
3.2 Metode praktikum
..............................................................
6
3.3 Waktu dan Tempat Praktikum
........................................... 7
BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN
................................................ 8
4.1 Hasil Praktikum
..................................................................
8
4.2 Pembahasan
........................................................................
8
BAB V PENUTUP
...............................................................................
11
5.1 Kesimpulan
........................................................................
11
5.1 Saran
...................................................................................
11
ACARA II POLYMERASE CHAIN REACTION
BAB I PENDAHULUAN
....................................................................
12
1.1 Latar Belakang
...................................................................
12
1.2 Tujuan
.................................................................................
13
1.3 Kegunaan
............................................................................
14
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
.......................................................... 15
BAB III MATERI dan METODE PRAKTIKUM
............................... 17
3.1 Materi Praktikum
...............................................................
17
3.2 Metode praktikum
..............................................................
18
3.3 Waktu dan Tempat Praktikum
........................................... 18
-
v
BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN
................................................ 19
4.1 Hasil Praktikum
..................................................................
19
4.2 Pembahasan
........................................................................
19
BAB V PENUTUP
...............................................................................
22
5.1 Kesimpulan
........................................................................
22
5.1 Saran
...................................................................................
22
DAFTAR PUSTAKA
..........................................................................
23
LAMPIRAN
.........................................................................................
24
-
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang.
Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA
(Deoxyribonucleic
Acid), adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul
utama penyusun
berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya
terletak di dalam inti
sel.
Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai
materi
genetik artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas
sel. Ini berlaku
umum bagi setiap organisme. Di antara pengecualian yang menonjol
adalah
beberapa jenis virus (virus tidak termasuk organisme) seperti
HIV (Human
Immunodeficiency Virus).
Maka dari itu, DNA sangat berpengaruh pada bidang penelitian
yang
menggunakan tehnologi dalam membantu umat manusia untuk
memcahkan
berbagai maslah, telah banyak ilmuan yang telah menemukan cara
penanganan
pada DNA yang mempunyai runtutan yang teratur, bicara teantang
runtutan atau
langkah dalam perlakuan DNA ada satu materi yang mendasar yang
harus
dikuasai oleh para peneliti baru yaitu, isolasi plasmid DNA.
Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang dikenal pada
bakteri
berutas ganda dan berbentuk sirkuler. Plasmid memiliki ukuran
yang relatif kecil
dan terletak di luar kromosom dalam sel prokariot khususnya
bakteri dan sel
eukariot tingkat rendah seperti khamir. Plasmid mengalami
duplikasi sebelum
pembelahan sel inang.
Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan
menggunakan Escherichia coli sebagai inang sehingga dalam
rekayasa genetika,
plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen
tertentu yang
diinginkan ke dalam suatu sel inang. Pada bakteri Eschericia
coli, bahan genetik
utamanya terdiri atas sekitar 4.600 kb (4,6 x 106 bp). Plasmid
dapat dijadikan
sebagai vektor karena dapat melakukan replikasi, terletak ekstra
kromosom,
ditransfer secara stabil, berukuran kecil, susunan DNA sudah
diketahui, harus
-
2
mempunyai jumlah salinan yang banyak di dalam sel inang,
memiliki titil Ori,
memiliki marker seleksi, memiliki marker kedua yang berguna
untuk tanda
apabila plasmid disisipkan gen asing dan memiliki situs retriksi
yang unik sebagai
tanda untuk menyisipkan gen asing.
Pada dasarnya plasmid merupakan identitas genetik yang ditemukan
secara
alami di dalam sel beberapa kelompok prokariot dan eukariot.
Dengan teknik
rekayasa genetik, sekarang telah dikembangkan plasmid artifisial
dengan cara
menggabungkan gen-gen dari plasmid alami maupun genom
tertentu.
Pengamatan DNA plasmid dilakukan melalui proses isolasi
plasmid,
elektroforesis, dan visualisasi menggunakan sinar ultraviolet
(UV). Tahapan
pengendapan dalam isolasi plasmid adalah pemecahan sel,
keluarnya plasmid dari
nukleus dan pengendapan atau presipitasi plasmid. Tahapan
selanjutnya adalah
elektroforesis DNA yaitu, teknik untuk memisahkan sampel DNA
berdasarkan
atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya dengan
menggunakan
medan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA plasmid
yang
bermuatan negatif. Gel yang biasanya digunakan dalam proses
elektroforesis
adalah agarosae. Elektroforesis biasa digunakan untuk analisa
ukuran dan
konfirmasi sampel DNA, kuantifikasi DNA, pemisahan dan ekstraksi
DNA.
1.2 Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari isolasi plasmid ini addalah untuk
memisahkan
DNA plasmid dari bakteri E. Coli.
-
3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
DNA (deoxyribonucleic acid) adalah materi genetik yang terdapat
di
dalam inti sel makhluk hidup. Materi itu berbentuk seperti
tangga. Bukan tangga
yang lurus, tetapi tangga yang berpilin. Kedua sisi tangga
dihubungkan oleh anak
tangga. Pada DNA, hanya ada dua jenis anak tangga, yaitu anak
tangga yang
dibentuk oleh pasangan basa nitrogen Adenin dan Timin (A-T) dan
basa Guanin-
Citosin (G-C) (Warta Medika, 2008).
DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena
itu
DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang
mengandung sel
berinti, seperti darah, semen, akar rambut, tulang, liur dan
lain-lain. Bahan yang
paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah
dan rambut
beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudah
diperoleh. DNA dapat
diisolasi sekalipun dengan menggunakan bahan kering seperti,
bercak
darah maupun preparat autan, selain itu DNA juga dapat diisolasi
dari produk
olahan (Anonim, 2011).
Laju migrasi DNA tergantung dari ukuran, struktur, dan muatan
total
molekul. Molekul DNA tidak bisa dilihat dengan mata telanjang,
namun bisa
dilihat pada gel agarose melalui teknik pewarnaan dengan
menggunakan pewarna
yang disebut etidhium bromida. Etidhium bromida merupakan agen
interkalasi
yang menyisip ke antara busa-busa molekul DNA dan berfluoresensi
(Standfield,
2006).
Plasmid adalah DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi
secara
autonom dan bisa ditemukan pada sel hidup. Di dalam satu sel
dapat ditemukan
lebih dari satu plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi
namun semua
plasmid tidak mengkodekan fungsi yang penting untuk pertumbuhan
sel tersebut.
Umumnya, plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat
bertahan
pada keadaan yang kurang menguntungkan sehingga bila lingkungan
kembali
normal, DNA plasmid dapat dibuang (Royston 1972).
-
4
Keberadaan plasmid merupakan hal terpenting dalam teknik DNA
rekombinan. Keberhasilan suatu teknik DNA rekombinan tergantung
dari hasil
mengisolasi dan memurnikan DNA plasmid dari bakteri atau yeast.
Pemurnian
DNA plasmid dilakukan untuk menghilangkan berbagai
pengotor-pengotor yang
berasal dari bagian sel yaitu dinding sel dan beberapa protein.
Pada praktikum ini
DNA plasmid diisolasi dari bakteri Escherichia coli, sehingga
dengan
dilakukannya pengisolasian dan pemurnian DNA plasmid diharapkan
dapat
memaksimalkan hasil DNA rekombinan dan rekayasa genetic dapat
tercapai
(Sambrook& Russell 2006).
Menurut (Muladno, 1994) ada beberapa hal penting yang dapat
menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor)
kloning, antara
lain adalah :
a. Plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA
nya
lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi.
b. DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil
selama
diisolasi secara kimia.
c. Mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga
dapat
memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara
otonomi.
d. Jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di
dalam
sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah
diamplifikasi.
e. Mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap
antibiotik
tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid
yang
membawa gen tertentu.
.
-
5
BAB III
MATERI DAN METODE PRAKTIKUM
3.1.Materi praktikum
3.1.1 Alat praktikum
1. Mikropipet
2. Evendorf
3. Sentrifius
4. Sentrifius
5. Vorteks
6. Yelow tip
7. Es box
8. Gloves
3.1.2 Bahan praktikum
a) Larutan I
50 mM glucose
25mM tris-Cl (ph 8.0)
10 Mm EDTA (8.0)
b) Larutan II
0.2 NaOH (harus fresh)
1% SDS
c) Larutan III
5 M potasium acetate 60 ml
Acetic acid glacial 11.5 ml
H2O 28.5 ml
d) Pelet Bakteri e colli
-
6
3.2.Metode praktikum
Adapun langkah-langkah dalam melakukan melaksanakan pratikum
ini adalah sebagai berikut:
1. Meresuspensikan pellet dengan 100 l larutan I dingin,
kemudian campur
dengan merata dengan menggunakan vortex
2. Menambahkan 200 l larutan II campur dengan merata dengan
cara
membolak-balik tabung dengan cepat beberapa kali (jangan
menggunakan
vortex !!!)
3. Menambahkan 150 l larutan III dingin. Vortex selama beberapa
detik
kemudian balikan posisi tabung (inverced) selama 10 detik.
Mengembalikan tabung ke posisi semula dan simpan dalam es selama
4-5
menit.
4. Melakukan sentrifugasi (12,000 rpm) selama 5 menitpada suhu
40C.
Setelah itu ambil supernatant dan dipindahkan kedalam tabung
lain.
5. Menambahkan phenol:chloroform dengan perbandingan 1:1
dengan
jumlah supernatant yang diperoleh. Minsalnya volume supernatant
yang
diperoleh adalah 300 l, maka tambahkan phenol: chloroform
sebanyak
300 l.
6. Campur dengan merata menggunakan vortex kemudian
melakukan
sentrifugasi (12000 rpm) selama 2 menit pada suhu 4 0C.
7. Setelah sentrifugasi, mengambil supernatant dan pindahkan
kedalam
tabung lain.
8. Menambahkan ethanol (2 X volume supernatant) unntuk
mempresipitasikan DNA. mencampur dengan vortex, kemudian
biarkan
pada suhu kamar selama 2 menit.
9. Melakukan sentrifugasi 12000 rpm selama 5 menit pada suhu 4
0C.
10. Membuang supernatant perlahan-laha. Balikkan tabung dan
biarkan
kering udara selama beberapa menit.
11. Membilas DNA pellet dengan ethanol 70% (dingin) kemudian
sentrifugasi seperti cara no 9
-
7
12. Membuang supernatant, balikkan tabung dan membiarkan kering
udara
selama 10 menit.
13. Meresuspensi DNA dengan 25 l buffer TE (pH 8.0).
3.3. Tempat dan Waktu Praktikum
3.3.1 Tempat Praktikum
Praktikum ini diadakan di Labolatorium Mikrobiologi dan
Bioteknologi,
Fakultas Peternakan, Universitas Mataram.
3.3.2 Tanggal Prktikum
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin, 9 Desember 2013,
pukul
09.00 11.30 WITA.
-
8
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Praktikum
Setelah melaukan isolasi plasmid DNA bakteri E. Coli makahasil
yang
diperoeh adalah sebagai berikut :
Gambar 1 Plasmid DNA bakteri E. Coli
4.2 Pembahasan
Umumnya prinsip yang digunakan dalam mengisolasi DNA plasmid
adalah sama dengan isolasi DNA/RNA dari suatu sel. Prinsip yang
digunakan
adalah melakukan isolasi plasmid dengan sentrifugasi dan
presipitasi. Hal ini
-
9
dilakukan dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut
sehingga akan
terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA,
dan RNA. Kemudian
ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang
mengandung plasmid.
Langkah yang medasar untuk mendapatkan DNA plasmid adalah
menumbuhkan sel-sel bakteri (house) dalam sebuah media. Bakteri
yang
digunakan adalah Escherichia coli sedangkan media yang digunakan
adalah
media NB (Nutrien Broth). Bakteri Escherichia coli digunakan
karena bakteri ini
mudah didapatkan. Selain itu, Escherichia coli dapat
menghasilkan keturunan
yang banyak dalam waktu singkat. Kemampuanya berkembang biak
dengan fission binary (pembelahan sel) yang cepat, mampu tumbuh
pada media yang
murah, pertumbuhan tidak rewel.
DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning
gen,
sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA
plasmid
mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom.
Untuk
memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit
berbeda
dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan
penambahan
detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA,
protein
dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan
penambahan
potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan
dengan cara
sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan
protein yang
tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese
untuk
mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat
dipresipitasi
menggunakan etanol.
Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak
esensial
bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi
sering kali
menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik.
Dalam rekayasa
genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa
gen-gen
tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen
tersebut selanjutnya
akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin,
interferon, dan
berbagai enzim.
-
10
Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal
sebagai
proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1- 20 g.
Sedangkan
untuk jumlah yang lebih besar (100 200 g) dinamakan midi
preparation dan
maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar dari 200 g.
Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran
sel
sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA
kromosomal
serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid
saja harus
dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel dan
pengotor lainnya.
Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling
lysis, lysis with
detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic
digestion. Metode yang
paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline
lysis. Variasi
bentuk DNA memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis.
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding
sel,
yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi,
tekanan tinggi,
beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian
lisozim. Langkah
berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak
dapat dengan
mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan
bahan-bahan
yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat
seperti triton X-
100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot
langkah ini harus
disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami
lisis,
remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan
sel
dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa
dipresipitasi menggunakan
fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian
disentrifugasi dan
dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah
dibersihkan dari
protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga
perlu
ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA
yang
telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan
amonium asetat
dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan
CsCl.
-
11
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Dari hasil praktikum yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa:
1. Plasmid adalah molekul DNA berbentuk sirkular (bundar),
bereplikasi
sendiri dan membawa beberapa gen yang tidak terlalu penting.
2. Bakteri E. Coli merupakan bakteri yang paling mudah untuk
diisolasi.
3. Isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel
sehingga
semua organel sel dapat keluar
5.2 Saran
Kepada semua praktikan supaya melakukan praktikum lebih
aktif.
-
12
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Polymerase chain reaction merupakan teknik yang sangat berguna
dalam
membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens
DNA
tertentu di salin hingga jutaan kali untuk di perbanyak sehingga
dapat di analisis,
atau di modifikasi secara tertentu.
PCR dapat di gunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi,
atau
untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga
dapat di
gunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens DNA tertentu dalam
sempel. PCR
memnfaatkan enzim DNA polymerase yang secara alami memang
berperan dalam
perbanyakan DNA pada proses replikasi.
Teknik PCR ditemukan pertama kali oleh Kary, B. Mullis pada
tahun
1985. Impian Mullis dimulai ketika di bulan April 1983, malam
Jumat, saat
membawa kendaraannya keluar kota pada bulan purnama menuju ke
Negara
bagian utara California dimana Mullis mendapatkan inspirasi yang
bermakna
dengan menemukan cara baru untuk mendeteksi urutan basa yang
spesifik dari
DNA. Penemuan yang mempesonakan itu dipublikasi pada American
Scientific,
1990, yang memberinya peluang pada tahun 1993 mendapatkan hadiah
Nobel
dalam kimia atas penemuan PCR. Semula Mullis menggunakan enzim
Klenow
fragmen E.coli DNA Polymerase I untuk memicu perpanjangan
potongan DNA
yang spesifik. Namun, enzim ini tidak dapat bertahan pada saat
tahapan denaturasi
dari PCR, sehingga mengharuskan penambahan enzim yang baru lagi
pada setiap
siklus PCR. Kondisi ini merupakan suatu hambatan yang kritis,
khususnya pada
teknik yang diharapkan berlangsung secara automatis.
Setiap siklus PCR terdiri dari tiga tahap, berikut adalah tiga
tahap
bekerjanya PCR dalam siklus :
1. Tahap Peleburan (melting) atau Denaturasi
Pada tahapan ini berlangsung pada suhu 94 - 960 C. ikatan
hydrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berbekas
tunggal.
-
13
Biasanya pada tahap awal PCR ini dilakukan beberapa lama
(sampai
menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemesihan
ini
menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi template (patokan)
bagi
primer. Durasi tahap ini 1- 2 menit.
2. Tahap Penempelan atau Anealing
Primer menempel pada bagian DNA templet yang komplementer
urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu 45 - 6000 C. penenmpelan
ini
bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak
terjadinya
penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi
tahap ini
1- 2 menit.
3. Tahap Pemanjangan atau Elongasi
Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polymerase
yang
di pakai. Dengan taq-polymerase, proses ini biasanya dilakukan
pada suhu
760 C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit. Selain DNA template
yang akan
digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang di
butuhkan
adalah Primer, primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau
oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi
reaksi
pemanjangan rantai atau polymerase DNA. dNTP ( deoxynucleos
ide
triphosphate ) atau building blocks sebagai batu bata penyusun
DNA
yang baru. Buffer, buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan
kimia
untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan
menstabilkan
enzim DNA polymerase. Ion logam terbagi menjadi dua yaitu Ion
logam
bivalen, tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat
bekrja.
Sedangkan ion logam monovalen ( kalsium ).
1.2 Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dilaksanakannya praktikum ini adalah sebagai
berikut:
1. Untuk mengetahui teknik dan cara melakukan PCR
2. Untuk memperbanyak DNA yang di inginkan secara invitro
atau
diluar sel.
-
14
3. Digunakan dalaam penelitian biolog seperti mengamati
penyakit
keturunan dan identitas sidik jari.
1.2 Kegunaan Praktikum
Adapun kegunaan praktikum ini adalah sebagai berikut:
1. Mahasiswa dapat mengetahui apa itu PCR.
2. Mahasiswa dapat mengetahui alat-alat yang di gunakan
dalam
melakukan praktikum PCR.
3. Mahasiswa dapat mengetahui metode-metode yang digunakan
dalam PCR.
-
15
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah cara in vitro untuk
memperbanyak target sekuen spesifik untuk analisis cepat atau
karakterisasi,
walaupun material yang digunakan pada awal pemeriksaan sangat
sedikit. Pada
dasarnya PCR meliputi tiga perlakuan yaitu: denaturisasi,
hibridisasi dari "primer"
sekuen DNA pada bagian tertentu yang diinginkan, diikuti dengan
perbanyakan
bagian tersebut oleh Tag polymerase; dikerjakan dengan
mengadakan campuran
reaksi dalam tabung mikro yang kemudian diletakkan pada blok
pemanas yang
telah diprogram pada seri temperatur yang diinginkan (Prijanto,
1992).
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel
DNA
berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik
molekulnya. Gel yang
biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa
dapat dilakukan
untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus
hingga 20.000
pasang basa (bp) (Yuwono, 2005).
Laju migrasi DNA tergantung dari ukuran, struktur, dan muatan
total
molekul. Molekul DNA tidak bisa dilihat dengan mata telanjang,
namun bisa
dilihat pada gel agarose melalui teknik pewarnaan dengan
menggunakan pewarna
yang disebut etidhium bromida. Etidhium bromida merupakan agen
interkalasi
yang menyisip ke antara busa-busa molekul DNA dan berfluoresensi
(Standfield,
2006).
Agarose yang disari dari ganggang laut merupakan polimer dengan
dasar
struktur D-galaktosa dan 3,6 - anhidro L-galaktosa. Gel agarose
mempunyai daya
pemisah lebih rendah jika dibandingkan dengan gel poliakrilamid,
tetapi
mempunyai rantang pemisahan lebih serius. DNA dari 200 basa
sampai 50 kilo
basa dapat dipisahkan denagn gel agarose dengan berbagai
konsentrasi agarose.
Gel agarose biasanya dilakukan dalam konfigurasi horizontal
dalam kekuatan
medan listrik dan arah tetap (Sudjadi 2008).
Gel agarose dibuat dengan melelehkan agarose dalam buffer dan
kemudian
dituangkan pada cetakan dan diamkan sampai dingin. Setelah
mengeras, agarose
-
16
membentuk matriks dengan kerapatan yang ditentukan oleh
konsentrasi agarose.
Jika medan magnet diberikan antara kedua ujung gel, DNA yang
bermuatan
negatif pada pH netral akan bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi
ini ditentukan
oleh ukuran DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarose, dan
besaran tegangan
yang digunakan (Sudjadi 2008).
-
17
BAB III
MATERI DAN METODE PRAKTIKUM
3.1. Materi praktikum
3.1.1 Alat praktikum
Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah
sebagai berikut:
1. Mesin PCR
2. Sinar UV
3. Elektropolisis DNA
4. Mikro pipet
5. Efendorf
3.1.2 Bahan praktikum
Bahan yang dugunakan dalam praktikum ini adalah sebagai
berikut:
Campuran reksi terdiri dari :
1. Air steril : 6,7 l
2. 10 x buffer taq : 1 l
3. 2,5 mMdNTP mix : 0,4 l
4. 10 M primer forward : 0,4 l
5. 10 M primer reverse : 0,4 l
6. Template : 1 l
7. Enzim : 0.1 l
10 l
Bahan gel elektroforesis DNA
Agarose
Buffer TAE
-
18
EtB (ethibium bromide )
3.2. Metode praktikum
Adapun langkah-langkah dalam melaksanakan praktikum ini
adalah
sebagai berikut :
1) Mencampur bahan-bahan yang digunakan untuk melakukan PCR
a. Memasukkan air steril sebanyak 40 l ke dalam evendorf
b. Menambahkan 10 x buffer tag sebanyak 1 l ke dalam
evendorf
c. Menambahkan 2,5 mM primer forward sebanyak 0,4 l
d. Menambahkan 10 M primer forward sebanyak 0,4 l
e. Menambahkan 10 M primer reverse sebanyak 0,4 l
f. Menambahkan template sebanyak 1 l
g. Menambahkan enzim sebanyak 0,1 l
2) Memasukkan tabung PCR ke dalam mesin PCR
3) Mengatur mesin PCR
4) Mencapur cairan PCR dengan buffer TAE kemudian memasukkan
cairan
tersebut ke agarose
5) Melihat sample di bawah sinar UV
3.3.Tempat dan Waktu Praktikum
3.3.1 Tempat Praktikum
Praktikum ini diadakan di Laboratorium Mikrobiologi dan
Bioteknologi,
Fakultas Peternakan Universitas Mataram.
3.3.2 Waktu Praktikum
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin tanggal 9 Desember
2013,
pukul 09.00 11.30 WITA.
-
19
BABA IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
4.2 Pembahasan
PCR adalah singkatan dari Polymerase Chain Reaction. Teknik
ini
merupakan teknik perbanyakan DNA secara in vitro. Dalam sistem
kerjanya, PCR
dilandasi oleh struktur DNA. Dalam keadaan nativenya, DNA
merupakan double
helix, yang terdiri dari dua buah pita yang berpasangan
antiparalel antara satu
dengan yang lain dan berikatan dengan ikatan hidrogen. Ikatan
hidrogen terbentuk
antara basa-basa yang komplementer, yaitu antara basa Adenin (A)
dengan
Thymine (T), dan Guanine (G) dengan Cytosin (C) (Muladno 2002).
Diamana
pada alat ini kami memasukan hasil isolasi dari DNA bakteri
E.Coly.
PCR memiliki beberapa komponen, diantaranya yaitu enzim
Taqpolymerase, primer, dNTP dan buffer. Enzim Taq polymerase
memiliki
keaktifan dalam suhu tinggi, oleh karena itu penambahan enzim
tidak perlu
dilakukan dalam setiap siklus dan proses PCR dapat dilakukan
dalam satu mesin.
Pemakaian Taq polymerase dalam konsentrasi yang terlalu besar
akan
mengakibatkan munculnya background produk non-spesifik.
Sebaliknya, bila
konsentrasi Taq polymerase terlalu rendah, maka proses
amplifikasi berlangsung
-
20
secara inefisien, dan produk amplifikasi yang diperoleh akan
mempunyai
konsentrasi yang relatif rendah. Primer adalah sepasang DNA utas
tunggal atau
oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi
reaksi
pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Fungsi dari primer
yaitu menghindari
adanya polipurin atau polipirimidin dan menghindari adanya
struktur sekunder.
Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA
template,
jadi dirancang agar menempel dan mengapit daerah tertentu yang
diinginkan.
Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang ikut
menentukan
keberhasilan reaksi PCR. dNTP sebagai penyusun DNA yang baru
yang terdiri
atas 4 macam, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. Buffer untuk
mengkondisikan
reaksi agar PCR berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA
polymerase
(Innis et al. 1990).
Dalam kegiatan praktikum biologi molekuler, elektroforesis
merupakan
salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid,
dan produk
PCR. DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan
ukurannya
berdasark anmigrasinya pada gel agarose maupun gel
poliakrilamid. Migrasi
DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat
divisualisasikan,
maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida
(EtBr),
kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida
dapat menangkap
sinar ultraviolet sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat.
Ethidium mengikat
molekul DNA, sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat
di atas
sinar ultra violet. DNA merupakan molekul bermuatan negatif,
sehingga bila
diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub
negatif ke kutub
positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh: 1) ukuran molekul
DNA, 2)
prosentase atau kerapatan gel yang dilalui DNA, 3) arus listrik
yang diberikan
untuk memigrasikan molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan
semakin
cepat migrasi DNA. Semakin rapat media yang digunakan, semakin
tinggi
prosentaseny, maka semakin lambat DNA bermigrasi. Semakin besar
arus
yang diberikan, maka semakin cepat DNA bermigrasi.
Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA
berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti
memisahkan molekul
-
21
menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis
berarti memisahkan
molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis
mengambil
keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif.
Ketika
diletakkan didalam medan listrik, molekul DNA menuju kekutub
positif (anoda)
dan menjauhi kutub negatif (katoda).
Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu
harus
ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk 1)
menambah densitas,
sehingga DNA akan selalu berada didasar sumur, 2) pewarna untuk
memudahkan
meletakkan sampel DNA kedalam sumur, 3) agar dapat bergerak ke
arah anoda
dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan
sebagai tanda
migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol
bluedanxylenecyanol. Selain itu, pembacaan pita DNA didalam gel
yang telah
diwarnai dengan ethidium bromida diatas lampu UV yang
dibandingkan dengan
DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas
jumlah DNA
(Suharsono dan Widyastuti, 2006).
-
22
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
5.2 Saran
-
23
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2011. ht tp://www. scribd. com/doc/302
75768/Laporan-
Praktikum
Bioselmol-Isolasi-Dna-Plasmid Diakses tanggal 20 Desember
2013.
Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White JT. 1990. PCR Protocols,
A guide to
Metods and Applications. Sanm Diego: Academic Press Inc.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor:
Pustaka
Wirausaha Muda.
Prijanto, Muljati. 1992. Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk
Diagnosis
Human
Royston C Clowes. 1972. Molecular Structure of Bacterial
Plasmids.
Bacteriological Reviews
Sambrook, Russell. 2006. The Condensed Protocols From Molecular
Cloning: A
Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory
Press
Standfield W.D, Jaime S.C Raul J.C. 2006. Schaums Easy Outline
Biologi
Molekuler dan sel. Penerjemah: Varian Fahmi, terjemahan
dari:
Schaums Easy Outline Molecular and Cell Biology. Jakarta:
Erlangga.
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius.
SuharsonodanWidyastuti,U. 2006.PenuntunPraktikum Pelatihan
Teknik
Pengklonan Gen . Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan
Bioteknologi, IPB Bahan Kuliah dan Praktikum Rekayasa
Genetika.
Warta Medika. 2008. Sidik DNA.
(http://www.wartamedika.com/2008/07/sidik-
dna.html). Diakses 20 Desember 2013.
Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlang.
-
24
LAMPIRAN
FOTO-FOTO PRAKTIKUM
Gambar 1 Vortex Gambar 2 Yellow Tip
Gamabar 3 Sentrifuse Gambar 4 Micro Pipet