IDENTIFIKASI BAKTERI PERAIRAN BERDASARKAN SEKUENSING DNA
LAPORAN PRAKTIKUM BIOSISTEMATIKA
Oleh
Nurul MufitdhahNIM 151820401003
PROGRAM STUDI MAGISTER BIOLOGIJURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS JEMBER2015PENDAHULUANAir merupakan sumber daya alam yang sangat penting dalam kehidupan makhluk hidup, khususnya manusia. Salah satu parameter kualitas air adalah adanya adanya mikroorganisme/bakkteri yang terandung di dalamnya. Bakteri yang lazim diamati sebagai parameter penilaian kualitas perairan adalah kelompok bakteri koli, heterotrofik dan bakteri patogen. Dalam penilaian kualitas perairan, semakin banyak jumlah bakteri koli dan bakteri patogen yang terdapat pada perairan dapat mengakibatkan dampak negatif seperti munculnya penyakit hingga kematian. Bakteri patogen atau non patogen umumnya dapat ditemukan pada tubuh biota laut. Bakteri patogen yang biasa ditemukan antara lain Salmonella, Vibrio, Aeromonas, Proteus, Citrobacter dan bakteri patogen dapat hidup pada organ luar maupun dalam biota (WHO, 1982 dalam Sutiknowati, 2013). Bakteri non patogen umumnya termasuk dalam kelompok bakteri heterotrofik. Bakteri heterotrofik pada suatu perairan menjadi salah satu indikator aktifitas penguraian senyawa organik yang menunjukkan kesuburan perairan dan berkaitan dengan pakan alami bagi biota laut. Bakteri heterotrofik di lingkungan laut berperan sangat vital sebagai dekomposer yang menguraikan material organik menjadi komponen yang lebih sederhana sebagai unsur hara yang esensial (Sutiknowati, 2013). Beberapa jenis bakteri heterotrofik antara lain Pseudomonas, Micrococcus, Sarcina, Staphylococcus dan Flavobacterium. Penurunan kualitas perairan yang terus terjadi sangat perlu mendapat perhatian, terlebih lagi adanya berbagai jenis mikroba di dalam perairan. Salah satu usaha yang dapat dilakukan untuk menentukan kualitas air adalah proses identifikasi. Identifikasi bakteri perairan sangat dibutuhkan untuk kepentingan klasifikasi sehingga dapat diketahui apakah bakteri tersebut bersifat patogen atau non-patogen. Seringkali proses identifikasi bakteri dilakukan dengan mengamati struktur morfologi (mikroskop, pengecatan) maupun fisiologinya. Metode tersebut dirasa kurang efekif sehingga muncul metode modern secara bisistematika. Laporan ini membahas tentang identifikasi yang dilakukan menggunakan sequensing 16S rRNAMETODE PENELITIANPraktikum ini menggunakan sequensing dari bakteri perairan BA9920 hasil dari penelitian Masruroh, Dewi (2015). Sekuen gen dari bakteri tersebut diperoleh melalui tahap sebagai berikut:
A. Editing hasil sekuensing menggunakan BioEditHasil sekuensing yang diperoleh berupa data mentah yang harus diolah menggunakan berbagai aplikasi. Dalam praktikum ini digunakan seperti aplikasi BioEdit, dengan langkah-langkah sebagai berikut:1. Pastikan BioEdit App sudah terinstal di laptop buka aplikasi BioEdit di tombol start (desktop) buka hasil sekuensing yang diperoleh satu persatu
Gambar 1. Buka aplikasi BioEdit
Gambar 2. Data mentah hasil sekuensing dari Firt Base Laboratorys
2. Setalah muncul hasil seperti gambardi bawah ini, dilakukan editinig sekuen nukleoida.
Proses editing dilakukan dengan memilih urutan basa nitrogen berdasarkan chromatogram, pola chromatogram yang kurang baik di hilangkan, sedangkan yang baik, di blok Ctrl+C Ctrl+V pada Ms.Word kasih judul untuk masing-masing hasil editing. Di ulang langkah ini pada ke-3 hasil sekuensing yang lain. Untuk mengahapus beberapa nukleotida hasil editing: Blok beberapa nukleotida yang akan dihapus Ctrl+C buka Ms.Word yang tadi klik Find di Menu toolbar Ctrl+V klik find next delete.
Gambar 3. Pemilihan sekuen yang baik dengan cara bloking
Gambar 4. Hasil editing sekuen DNA mentah menggunakan BioEdit
3. Setelah semua sekuen mentah di edit, buka BioEdit App klik File New aligment Ctrl+C (hasil editing sekuen di Ms. Word) klik file (menu BioEdit) import from clipboard kasih nama sekuen Save. Ulangi pada hasil editing sekuen yang lain. Namun untuk hasilsekuensing dengan primer reverse harus dilakukan reverse complement, dengan cara: blok nama/judul sekuen klik sequence pada menu bar pilih Nucleic acid reverse complement Save.
Gambar 5. Hasil editing semua sekuen dari pasangan primer yang berbeda yang telah di beri judul
4. Langkah selanjutnya adalah mencocokkan dan menggabungkan kedua sekuen dari pasangan primer 27F-907R, dengan cara: Blok P27F dan P907R klik pairwise aligment Aligment two sequence (allow end to slide) Aligment creat consensus sequence muncul hasil seperti gambar berikut.
Gambar 6. Hasil pengabungan sekuen dengan pasangan primer F/R menjadi consensus1.
Klik pada tulisan consensus klik edit copy sequence to clipboard buka Ms. Word Ctrl+V Ulangi kedua langkah sebelumnya pada pasangan primer 533F & 1492R, sehingga di peroleh 2 consensus
Gambar 7. Sekuens gabungan (consensus) dari masing-masing pasangan primer F/R pada Ms. Word.
5. Selanjutnya penggabungan ke dua consensus, dengan langkah: klik file new aligment Ctrl+C sekuen consensus 1 dan 2 secara bergantian (Ms. Word) Blok judul consensus1 dan consensus2 klik pairwise aligment Aligment two sequence (allow end to slide) Aligment creat consensus sequence (hasil berupa sekuen utuh dari gabungan 2 pasang primer).
Gambar 8. C1 dan C2 yang kemudian dipilih/diblok untuk digabungnkan menjadi 1 consensus
Gambar 9. Sekuen utuh dari bakteri perairan BA9920 setelah penggabungan 2 consensus dari masing-masing pasangan primer yang digunakan.
Hasil di beri judul (utuh) blok judul klik edit copy sequence to clipboard buka Ms. Word Ctrl+V (hasil digunakan untuk identifikasi sekuen DNA (Blast).
Gambar 10. Sekuen utuh dari bakteri perairan BA9920 setelah penggabungan 2 consensus dari masing-masing pasangan primer yang digunakan pada Ms. Word dan siap untuk dilakukan BLAST.
B. Analisis Nukleotida Hasil Sekuensing dan Konstruksi Pohon FilogenetikData hasil editing dengan aplikasi BioEdit digunakan sebagai data mentah pada program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Identitas suatu gen yang telah diketahui sekuennya dapat ditentukan dengan membandingkan sekuen yang diketahui dengan data sekuen yang terdapat di GenBank yaitu National Centre for Biotechnology Information atau NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Data tersebut akan disejajarkan (multiple alignment) dengan data yang tersimpan di GenBank yang bertujuan untuk mencari similaritas suatu sekuen nukleotida atau protein dengan sekuen database pada GenBank. Sehingga dapat digunakan juga untuk mengkonstruksi pohon filogenetika berdasarkan perhitungan matriks jarak. Data dari hasil peraktikum ini disajikan dalam bentuk gambar berupa elektroforegram dan pohon filogenetik.Untuk memulai blast, dilakukan langkah sebagai berikut:1. Buka web blast.ncbi.nlm.gov/blast.cgi2. Pilih menu nucleotide blast3. Copi sekuen utu dari Ms. Word dan paste pada kotak yang disediakan4. Pilih 16 S ribosomal RNA sequences (bacteria & Archaebacteria)5. Klik BLAST
Gambar 11. Cara analisis sekuen menggunakan program BLAST
HASIL DAN PEMBAHASANSekuens DNA merupakan penyandi informasi yang diperlukan bagi makhluk hidup untuk melangsungkan hidup dan berkembang biak. Dengan demikian, penentuan sekuens DNA berguna di dalam ilmu pengetahuan hubungannya dengan mengapa dan bagaimana makhluk hidup dapat hidup, DNA merupakan ciri kunci pada makhluk hidup, sehingga pengetahuan tentang sekuens DNA dapat berguna dalam berbagai penelitian biologi. Sebagai contoh, dalam ilmu pengobatan sekuensing DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatan penyakit genetik. Demikian pula halnya, penelitian pada agen penyebab penyakit (patogen) dapat membuka jalan bagi pengobatan penyakit menular (Sajidan. 2011). Bioteknologi merupakan bidang ilmu yang memanfaatkan sekuensing DNA, yang saat ini berkembang pesat dan berpotensi menghasilkan banyak barang dan jasa berguna. Dewasa ini, hampir semua usaha sekuensing DNA dilakukan dengan menggunakan metode terminasi rantai yang dikembangkan oleh Frederick Sanger dan rekan-rekannya. Teknik tersebut melibatkan terminasi atau penghentian reaksi sintesis DNA in vitro yang spesifik untuk sekuens tertentu menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi (Sajidan. 2011).Berdasarkan hasil analisis pengurutan basa nukeotida isolate bakteri perairan BA9920 yang dibandingkan dengan database gen dari Genebank DNA menggunakan program BLAST,diperoleh hasil seperti pada Gambar 12.
Gambar 12. Hasil sekuensing dengan program BLAST di IUCN
Dari hasil sekuensing dapat diketahui bahwa isolat bakteri perairan BA9920 teridentifikasi sebagai Barrientosiimonas humi strain 39 dengan presentase kemiripan 99%. Menurut Dancourt et al., (2000), jika kemiripan 99% dengan database maka isolat tersebut teridentifikasi pada tingkat spesies, 97% teridentifikasi pada tngkat genus, dan jika kemiripan 97% kemungkinan spesies baru karena belum adanya data pasa database atau ukuran hasil sekuensing yang dibandingkan dengan database terlalu pendek. Hubungan kekerabatan dari isolat bakteri perairan BA9920 dapat dilihat dari pohon filogenetik beikut. Pada gambar tersebut dapat dikeahui bahwa isolat ini memiliki hubungan yang sangat dekat dengan Barrientosiimonas humi strain 39, juga memiliki kedekatan dengan Tamilococcus marinus strain MSW. Namun hubungan isolat bakteri perairan BA9920 dengan Tamilococcus marinus strain MSW kemungkinan berada pada tingka genus, hal ini dit5unjukkan dengan persen kemiripannya 97% dan 99%.
Gambar 13. Pohon filogenetik untuk melihat hubungan kekerabatan isolat bakteri perairan BA9920
Barrientosiimonas berada dalam domain Bacteria, filum Actinobacteria, kelas] Actinobacteria, ordo Actinomycetales, termasuk dalam keluarga Dermacoccaceae dan genus Barrientosiimonas. Barrientosiimonas adalah bakteri aerobic dan termasuk actinobacterium gram-positif yang berbentuk kokus tidak teratur dan batang pendek (0.25-0.3860.25- 2,25 mm), sel berupa sel tunggal non-motil dan tidak bersporulasi, biasanya hidup secara berpasangan dengan rantai pendek atau membentuk kloni kecil yang tidak teratur. Peptidoglikan pada dinding selnya termasuk jenis A4A dengan ikatan interpeptide L-Lys-L-Ser-D-Asp. Komponen gula pada dinding sel berupa galaktosa dan glukosa. Jenis asil pada polisakarida dinding selnya adalah N-asetil. Lipida polar berupa diphosphatidylglycerol, fosfatidilgliserol, phosphatidylinositol, phosphoglycolipid, dua glikolipid dan satu fosfolipid. Asam lemak utama adalah anteisoC17: 0, anteiso-C17: 1v9c dan iso-C16: 0. Konten DNA G + C adalah 68,4% mol. Pertumbuhannya baik pada medium R padat dan ISP 2, 3, 4, 5, 6 dan 7 setelah 7 hari pada 28 uC, sedangkan pertmbuhannya memburuk pada medium agar-air. Koloni bakteri ini berwarna krim putih hingga kuning pucat, melingkar, penuh, cembung dan halus pada kebanyakan media diuji. Pertumbuhan terjadi pada pH 6,0-10,0 (pH optimum 7,0-9,0), dengan 0-14% NaCl (optimum 0-4%) dan pada 24-40 UC (optimum 32 UC) (Lee, Learn-Han et al., 2013)
DAFTAR PUSTAKADancourt, M., Bollet C. Carlios A. Martelin R. Gayral J.P and Roult D. 2000. 16S Rbosomal DNA Sequence Analysis of a Large Collection of Environmental and Clinical Unidentifiable Bacteria Isolates. Journal of Clinical Microbiology 38 (10): 3623-3630Lee, Learn-Han., Y-K. Cheah, S.M Sidik, Q-Y. Xie,Yi-Li Tang, H-P. Lin, Nurul S.A.B., and Kui H. 2013. Barrientosiimonas humi gen. nov., sp. nov., an actinobacterium of the family Dermacoccaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2013), 63, 241248Sajidan. 2011. Sekuensing DNA & RNA. Universitas Negeri Surakarta. http://sajidan.staff.fkip.uns.ac.id/2011/02/18/sekuensing-dna-rna/Sutiknowati, Lies Indah. 2013. Mikroba Parameter Kualitas Perairan P. Pari Untuk Upaya Pembesaran Biota Budidaya Microbes Parameters Of Water Quality For Aquaculture On Pari Island Waters. Jurnal Ilmu dan Teknologi Kelautan Tropis, Vol. 5(1): 204-218.
