STERILISASI ALAT DAN BAHAN PADA PENGUJIAN MIKROBIOLOGI
I. TUJUAN Dapat memahami dan melaksanakan proses sterilisasi
yang tepat dan sesuai untuk alat dan bahan yang akan digunakan
dalam pengujian mikrobiologi.
Mampu menyiapkan dan membuat media steril untuk pengujian. dapat
mengamati hasil dari proses sterilisasi alat dan bahan pada
pengujian mikrobiologi.II. TEORI DASAR
Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap
semua mikroba hidup dan spora-sporanya. Sebelum melakukan suatu
percobaan dengan mikroorganisme, diperlukan proses dekontaminasi
untuk meminimalisir organisme yang aktif dari suatu sistem bakteri
atau virus. Upaya untuk mengeleminasi mikroba patogen dengan
memanfaatkan bahan kimia yaitu antiseptik dan disinfektan, serta
memanfaatkan metode disinfeksi dengan memanfaatkan energi panas.
Semua metode tersebut dapat membunuh mikroba patogen kecuali
endospora bakteri. Pemusnahan digunakan dengan cara sterilisasi,
agar semua mikroba patogen dan endosporanya dapat hancur. Dalam
bakteriologi, sterilisasi dipakai untuk menggambarkan langkah yang
diambil agar mencapai tujuan untuk meniadakan atau membunuh semua
bentuk kehidupan mikroorganisme.(1)Dekontaminasi adalah proses
menghilangkan atau membunuh mikroorganisme sehingga objek aman
untuk ditangani yang bertujuan untuk melindungi praktikan yang
melakukan percobaan menggunakan bakteri atau semacamnya. Ada
beberapa metode dekontaminasi, yaitu:
1. Sterilisasi : proses penghancuran secara lengkap semua
mikroba hidup dan spora-sporanya.2. Desinfeksi : metode untuk
memusnahkan atau menghancurkan mikroorganisme patogen.3. Sanitasi :
metode untuk mengurangi tingkat organisme yang hidup.
Beberapa mikroorganisme memiliki resistensi terhadap
dekontaminan kimia, seperti : bakteri vegetatif, jamur, dan virus
yang mengandung lipida relatif yang mudah didekontaminasi dengan
senyawa kimia. Virus yang tidak mengandung lipida dan bakteri
berlapis lilin memiliki tingkat resistensi tinggi. Resistensi
terhadap dekontaminan kimia dipengaruhi beberapa faktor, seperti :
konsentrasi dari zat aktif, lamanya kontak, pH, suhu, kelembapan,
dan kehadiran senyawa organik.(1)Inaktivasi mikroorganisme dengan
dekontaminan kimia dapat melalui mekanisme sebagai berikut :
Koagulasi dan denaturasi protein
Lisis
Ikatan dengan enzim atau destruksi substrat enzim
OksidasiBerikut adalah beberapa Hal penting yang harus
diperhatikan dalam melakukan dekontaminasi :1. Target
mikroorganisme.
2. Dekontaminan yang digunakan (bentuk dan target yang
diinginkan).
3. Tingkat inaktivasi yang diperlukan.
4. Adanya substrat organik seperti darah, agar, dsb.
5. Tipe permukaan dari target seperti : padat, berpori atau
mudah diterbangkan udara.
6. Konsentrasi tertinggi dari sel yang dapat ditanggulangi
dengan inaktivasi.
7. Kemampuan dekontaminan kontak dengan mikroorganisme.
8. Prosedur antisipasi yang diperlukan dalam dekontaminasi agar
efisien dalam waktu dan konsentrasi yang digunakan.
9. Toksisitas dari dekontaminan yang dapat membahayakan
praktikan di area tersebut.Sterilisasi adalah suatu proses
penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan
spora-sporanya(2). Ada 5 metode umum sterilisasi, yaitu :
1. Sterilisasi Uap (Panas Lembab)
2. Sterilisasi Panas Kering
3. Sterilisasi dengan Penyaringan (Filtrasi)
4. Sterilisasi Gas
5. Sterilisasi dengan Radiasi
Metode yang biasa digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan
pengujian mikrobiologi adalah metode sterilisasi uap (panas lembab)
dan metode sterilisasi panas kering.1. Sterilisasi Uap (Panas
Lembab)
Sterilisasi Uap dilakukan menggunakan autoclave dengan
prinsipnya menggunakan uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya.
Adanya kelembapan ( uap air ) bakteri akan terkoagulasi dan dirusak
pada temperatur yang lebih rendah dibandingkan tidak adanya
kelembapan. Mekanisme penghancuran bakteri oleh uap air panas
karena terjadinya denaturasi dan koagulasi beberapa protein
esensial dari organisme. Kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi
uap dengan menggunakan autoclave adalah :
- Suhu 115,5 , waktu 30 menit
- Suhu 121,5 , waktu 20 menit
- Suhu 126,5 , waktu 15 menit
Temperatur sterilisasi yang digunakan adalah 121, tekanan yang
biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1
atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis.
Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara
20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Metode
sterilisasi uap umumnya digunakan untuk sterilisasi sediaan farmasi
dan bahan-bahan lain yang tahan terhadap temperatur yang
dipergunakan dan tahan terhadap penembusan uap air, larutan dengan
pembawa air, alat-alat gelas, pembalut untuk bedah, penutup karet
dan plastik, dan media untuk pekerjaan mikrobiologi.(2)
Metode ini digunakan untuk :
Larutan dengan pembawa air
Alat-alat gelas
Pembalut untuk bedah
Penutup karet dan plastik
Media untuk pekerjaan mikrobiologi
Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan :
1. Penguraian gula.
2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.
3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.
4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar. 2.
Sterilisasi Panas Kering
Sterilisasi Panas Kering dilakukan menggunakan oven pensteril,
karena metode sterilisasi panas kering kurang efektif untuk
membunuh mikroba dibandingkan dengan sterilisasi uap air panas.
Prinsipnya adalah protein mikroba pertama-tama akan mengalami
dehidrasi sampai kering. Selanjutnya teroksidasi oleh oksigen dari
udara sehingga menyebabkan mikrobanya mati.(2) Metode ini
memerlukan temperatur yang lebih tinggi dan waktu yang lebih
panjang, sterilisasi panas kering ditetapkan pada temperatur
160-170 dengan waktu 1-2 jam. Umumnya digunakan untuk
senyawa-senyawa yang tidak efektif untuk disterilkan dengan uap
air, seperti minyak lemak, minyak mineral, gliserin (berbagai jenis
minyak), petrolatum jelly, lilin, wax, dan serbuk yang tidak stabil
dengan uap air. Metode ini efektif untuk mensterilkan alat-alat
gelas dan bedah.(2)
Karena tingginya suhu yang diterapkan dalam sterilisasi panas
kering, maka metode ini dapat digunakan untuk alat-alat gelas yang
membutuhkan keakuratan. Contohnya alat ukur dan penutup karet atau
plastik. Kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi panas kering
dengan menggunakan oven steril adalah :
Suhu 170C, waktu 1 jam
Suhu 160C, waktu 2 jam
Suhu 150C, waktu 2,5 jam
Suhu 140C, waktu 3 jam3.Sterilisasi dengan Penyaringan
(filtrasi)
Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) digunakan untuk
sterilisasi larutan yang termolabil, penyaringan ini menggunakan
filter bakteri. Metode ini tidak dapat membunuh mikroba, mikroba
hanya akan tertahan oleh pori-pori filter dan terpisah dari
filtratnya. Dibutuhkan penguasaan teknik aseptik yang baik dalam
melakukan metode ini. Filter biasanya terbuat dari asbes, porselen.
Filtrat bebas dari bakteri tetapi tidak bebas dari virus. Cara
kerja dari sterilisasi ini berbeda dari metode lainnya karena
sterilisasi ini menghilangkan mikroorganisme melalui penyaringan
dan tidak menghancurkan mikroorganisme tersebut. Penghilangan
mikroorganisme secara fisik melalui penyaring dengan matriks pori
ukuran kecil yang tidak membiarkan mikroorganisme untuk dapat
melaluinya. Cara sterilisasi ini untuk produk berupa cairan yang
dapat disaring atau bahan yang tidak tahan terhadap panas dan tidak
dapat disterilkan dengan cara sterilisasi lain. Teknologi tinggi
membran filtrasi meningkatkan penggunaan sterilisasi filtrasi,
khususnya jika digunakan berpasangan dengan sistem proses aseptik.
(2)4. Sterilisasi Gas
Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk
membunuh mikroorganisme dan sporanya. Meskipun gas dengan cepat
berpenetrasi ke dalam pori dan serbuk padat, sterilisasi adalah
fenomena permukaan dan mikroorganisme yang terkristal akan dibunuh.
Sterilisasi yang digunakan dalam bidang farmasi untuk mensterilkan
bahan-bahan dan menghilangkan dari bahan yang disterilkan pada
akhir jalur sterilisasi, gas ini tidak inert, dan kereaktifannya
terhadap bahan yang disterilkan harus dipertimbangkan misalnya
thiamin, riboflavin, dan streptomisin kehilangan protein ketika
disterilkan dengan etilen oksida. Sterilisasi gas berjalan lambat
waktu sterilisasi tergantung pada keberadaan kontaminasi
kelembaban, temperatur dan konsentrasi etilen oksida. Konsentrasi
minimum etilen oksida dalam 450 mg/L, 271 Psi, konsentrasi ini 85C
dan 50% kelembaban relatif dibutuhkan 4-5 jam pemaparan. Di bawah
kondisi sama 1000 mg/L membutuhkan sterilisasi 2-3 jam. Dalam
pensterilan digunakan bahan kimia dalam bentuk gas atau uap,
seperti etilen oksida, formaldehid, propilen oksida, klorin oksida,
beta propiolakton, metilbromida, kloropikrin. Digunakan untuk
sterilisasi bahan yang termolabil seperti bahan biologi, makanan,
plastik, antibiotik. Aksi antimikrobialnya adalah gas etilen oksida
mengadisi gugus SH, -OH, -COOH,-NH2 dari protein dan membentuk
ikatan alkilasi sehingga protein mengalami kerusakan dan mikroba
mati.(2)
Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk
kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan distribusi gas dalam chamber
pengsterilan. Penghancuran bakteri tergantung pada adanya
kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui
bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan,
persyaratan desain khusus pada bahan pengemas. (2)5. Sterilisasi
dengan Radiasi
Sterilisasi dengan radiasi digunakan untuk bahan/produk dan
alat-alat medis yang peka terhadap panas (termolabil) dan jika
residu etilen oksida tidak diharapkan. Pengukuran presisi dari
dosis radiasi, yang tidak berhubungan dengan suhu, adalah merupakan
faktor kontrol dalam sterilisasi radiasi selama dengan waktu
radiasi. Monitoring dan kotrol proses sangat sederhana, tetapi
kehati-hatian akan keamanan harus dilakukan oleh operator
sterilisasi. Prinsip sterilisasi radiasi adalah radiasi menembus
dinding sel dengan langsung mengenai DNA dari inti sel sehingga
mikroba mengalami mutasi. Ada dua macam radiasi yang digunakan
yakni gelombang elektromagnetik (sinar x, sinar ) dan arus partikel
kecil (sinar dan ).(2)III. ALAT DAN BAHANIV. PROSEDUR Persiapan dan
Sterilisasi AlatAlat alat yang akan disterilkan dicuci dan
dikeringkan terlebih dahulu. Alat-alat yang mempunyai mulut ditutup
dengan kapas berlemak, seperti tabung reaksi, erlenmeyer, botol
media, gelas ukur, labu takar, dan pipet dengan cara sepotong kapas
di lipat kedua ujungnya membentuk segi empat sebesar mulut alat.
Lalu kapas digulung silinder cukup padat. Kemudian dibungkus dengan
kain kasa, lalu dimasukkan ke dalam mulut alat sedalam 2/3. Khusus
untuk pipet, ditutup dengan kapas yang dimasukkan dengan sebatang
kawat dan kapas yang terurai keluar dari bagian mulut pipet
dihilangkan dengan melewatkan mulut pada api Bunsen. Setelah itu
kapas penutup ditutup dengan alumunium foil, lalu di ikat dengan
benang kasur.Alat yang permukaannya harus steril ditutup dengan
alumunium foil satu per satu. Untuk cawan petri dibungkus
seluruhnya dengan kertas bekas yang masih bersih.Alat-alat gelas
ataupun bukan di sterilkan di autoklaf pada suhu 1210C, selama
15-20 menit. Lalu disimpan ditempat terbuka. Sterilisasi media
serta larutan pengencerNutrient agar ditimbang sebanyak 8,8 gram
untuk pembuatan 440 mL dan nutrient broth ditimbang sebanyak 2,2
untuk pembuatan 275 mL. masing-masing media yang telah ditimbang
dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang sudah diberi tanda sesuai nama
media. Ditambahkan akuades lalu dipanaskan di atas penangas air dan
diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer sampai larutan
jernih.
Setelah itu ditutup dengan kapas dan alumunium foil dan diikat
dengan benang kasur dan diberi etiket (tanggal pembuatan, nama
media, dan nama pembuat). Lalu disterilisasi dengan autoklaf.
Setelah steril, didinginkan pada suhu kamar, kemudian dimasukkan ke
dalam lemari pendingin untuk disimpan. Diamati kondisi media dalam
waktu 24 jam.V. DATA PENGAMATAN DAN PERHITUNGAN Perhitungan jumlah
nutrient Agar20 gram untuk 1000 mL.
Maka, untuk 400 mL = 400/1000 20 gram = 8 gram (belum ditambah
10 %)Nutrient agar: 10 % 8 = 0,8 gram.
Total : 8 + 0,8 = 8,8 gram
Akuades: 10% 400 ml = 40 mL
Total : 400 + 40 = 440 mL
Perhitungan jumlah nutrient Broth
8 gram untuk 1000 mL.
Maka, untuk 250 mL = 200/1000 8 gram = 2 gram (belum ditambah 10
%)
10 % 2 = 0,2 gram.
Total : 2 + 0,2 = 2,2 gram
Akuades: 10% 250 ml = 25 mL
Total : 250 + 25 = 275 mL
Untuk pembuatan media kami tidak melakukan pengamatan dalam
waktu 24 jam karena lab tutup saat akan dilakukan pengamatan
(Jumat, pukul 13.00)VI. PEMBAHASAN Persiapan dan Sterilisasi
AlatPada percobaan dilakukan pensterilan terhadap beberapa alat
gelas, seperti erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, labu takar,
batang pegaduk, dan cawan petri. Sterilisasi adalah suatu proses
untuk membuat benda menjadi steril. Suatu benda dikatakan steril
apabila alat atau bahan tersebut bebas dari mikroba, baik dalam
bentuk vegetatif maupun spora. Metode pensterilan yang digunakan
adalah metode panas lembab dengan alat autoklaf. Autoklaf adalah
alat yang berfungsi untuk sterilisasi dengan uap panas bertekanan.
Pada saat persiapan dan sterilisasi alat, dilakukan pencucian dan
pengeringan alat. Hal ini bertujuan agar alat terbebas dari zat zat
yang mungkin masih menempel pada alat. Lalu alat-alat yang
mempunyai mulut ditutup dengan kapas berlemak. Pemilihan kapas yang
berjenis kapas berlemak dikarenakan saat alat-alat disterilkan
dengan metode panas lembab, pada kapas biasa akan menjadi basah
oleh uap yang menjadi air dan akan memicu pertumbuhan mikroba.
Sedangkan pada kapas berlemak, uap yang dihasilkan dari autoklaf
tidak membuat kapas berlemak basah sehingga akan terbebas dari
timbulnya mikroba di sekitar kapas. Setelah alat-alat tersebut
disumbat dengan kapas berlemak, lalu di tutup lagi dengan alumunium
foil dan seluruh bagian alat dilapisi dengan kertas bekas yang
bersih. Hal ini dilakukan agar proses sterilisasi lebih
maksimal.Lalu semua alat yang telah terbungkus dimasukkan kedalam
autoklaf pada suhu 121C selama 20 menit. Menurut Wetherell (1976),
dalam waktu 10-15 menit hampir semua sel-sel mikroba dapat terbunuh
oleh uap air 250F (121C) dalam waktu 15 menit. Untuk menaikkan suhu
yang lebih tinggi dari titik didih tersebut yaitu dengan menaikkan
tekanan uap air.Setelah disterilisasi, kemudian alat di simpan
ditempat terbuka untuk menghilangkan uap air yang masih tersisa.
Pembuatan dan sterilisasi mediaMasing-masing nutrient ditimbang
sebanyak yang diperlukan. Jumlah nutrient dan akuades masing-masing
ditambah 10% karena saat dipanaskan, akan terjadi penguapan.
Sehingga apabila larutannya tidak ditambah 10% jumlah larutannya
akan berkurang. Larutannya akan kurang dari 400 mL (untuk larutan
nutrient agar) dan kurang dari 250 mL (untuk larutan nutrient
Broth). Larutan nutrient agar ini akan berfungsi sebagai media
padat sedangkan larutan nutrient broth akan berfungsi sebagai media
cair. Masing-masing media yang telah ditimbang dimasukan kedalam
erlenmeyer yang telah diberi label nama media masing-masing agar
tidak tertukar. Saat praktikum, larutan nutrient agar yang kami
buat dimasukkan ke dalam dua erlenmeyer yang berbeda masing-masing
sebanyak 220 mL karena kami menggunakan Erlenmeyer 500 mL sehingga
dikhawatirkan saat diaduk dan dipanaskan Erlenmeyer 500 mL akan
sangat penuh dan menjadi over cavacity. Selain itu, dengan
dituangkan kedalam dua Erlenmeyer yang berbeda akan mempercepat
kerja di laboratorium karena waktu yang diperlukan untuk membuat
larutan nutrient agar menjadi panas dan jernih menjadi lebih
sedikit. Dalam pengadukkan digunakan magnetic stirrer karena dengan
magnetic stirrer akan mempermudah dan mempercepat kerja pengadukkan
sehingga tidak merepotkan praktikan untuk mengaduk larutan. Setelah
larutan jernih, Erlenmeyer ditutup dengan kapas berlemak dan kasa
kemudian dengan alumunium foil. Hal ini dilakukan karena seperti
telah dijelaskan sebelumnya bahwa dengan menggunakan kapas berlemak
uap yang dihasilkan dari autoklaf tidak membuat kapas berlemak
basah sehingga akan terbebas dari timbulnya mikroba di sekitar
kapas. Setelah alat-alat tersebut disumbat dengan kapas berlemak,
lalu di tutup lagi dengan alumunium foil. Hal ini dilakukan agar
proses sterilisasi lebih maksimal. Setelah disterilisasi dibiarkan
dingin pada suhu kamar terlebih dahulu sebelum dimasukkan ke dalam
lemari pendingin, hal ini bertujuan agar uap panas nya hilang
terlebih dahulu sehingga saat dimasukkan ke dalam lemari pendingin
tidak akan merusak komponen lemari pendingin karena suhu nya telah
sesuai.Setelah dimasukkan ke dalam lemari pendingin dilakukan
pengamatan dalam waktu 24 jam. Dilihat apakah ada petumbuhan
bakteri atau kapang. Namun shift kami tidak melakukan pengamatan
dalam waktu 24 jam tersebut karena saat kami akan melakukan
pengamatan pada hari berikutnya lab mikrobiologi dalam keadaan
tutup, sehingga kami tidak dapat melakukan pengecekkan dan
mengamati media yang kami buat sehari sebelumnya. Tetapi disini
kami tetap akan membahas apabila terjadi pertumbuhan kapang atau
bakteri pada media yang telah dibuat, hal itu menunjukkan bahwa
proses sterilisasi tidak berlangsung maksimal. Bisa disebabkan oleh
beberapa faktor yang mempengaruhi seperti penutup kapas yang tidak
pas, kelembaban yang tidak sesuai saat dalam autoklaf, dan lain
sebagainya. Tetapi apabila tidak terjadi pertumbuhan bakteri atau
kapang berarti hal itu menunjukkan bahwa proses sterilisasi
berlangsung maksimal.VII. KESIMPULAN1. Sterilisasi merupakan suatu
proses penghancuran mikroba pada benda, baik dalam bentuk vegetatif
maupun sporanya.2. Metode sterilisasi ada 5, yaitu sterilisasi uap
(panas lembab), sterilisasi panas kering, sterilisasi dengan
penyaringan (filtrasi), sterilisasi gas, dan sterilisasi dengan
radiasi.VIII. DAFTAR PUSTAKA
Razuna. 2010. Sterilisasi Alat dan Bahan pada Pengujian
Mikrobiologi (1)Sandra, Rantika. 2012. Sterilisasi Alat dan Bahan.
Bandung: UNISBA (2)Wetherell, dkk. 1976. Biologi. Jakarta: Erlangga
(3)