Laporan Praktikum Nama : Hartadi Gunawan Mikrobiologi NIM : J3L112182 Kelas : KIM 2C P1 Kelompok : 4 Hari/Tanggal : Jumat/15 November 2013 Waktu : 08.00-11.20 WIB PJP : M. Arif Mulya, S.Pi Asisten : Ramdhani Yuriska Sekar Rani Lia Suliani AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA PROGRAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
PendahuluanMikroorganisme adalah sumber enzim yang paling banyak digunakan
dibandingkan dengan tanaman dan hewan. Sebagai sumber enzim,
mikroorganisme lebih menguntungkan karena pertumbuhannya cepat, dapat
tumbuh pada substrat yang murah, lebih mudah ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan kondisi pertumbuhan dan rekayasa genetik, serta mampu
menghasilkan enzim yang ekstrim. Adanya mikroorganisme yang unggul
merupakan salah satu faktor penting dalam usaha produksi enzim. Oleh karena
itu, penggalian mikroorganisme indigenous penghasil protease perlu dilakukan di
Indonesia. Keragaman hayati yang tinggi memberikan peluang yang besar untuk
mendapatkan mikroorganisme yang potensial untuk dikembangkan sebagai
penghasil enzim (Dwijoeseputro 1990).
Mikroba memerlukan nutrisi untuk pertumbuhannya sama halnya dengan
mahluk hidup lainnya. Mikroba memiliki karakteristik dan ciri-ciri yang berbeda-
beda didalam persyaratan pertumbuhannya. Ada mikroba yang bisa hidup pada
media yang menngandung sulfur dan ada juga yang tidak mampu untuk hidup pada media yang mengandung sulfur. Selain itu ada juga mikroba yang bisa
menghidrolisis pati menjadi glukosa, ada yang mampu menghidrolisis
lipid menjadi asam lemak dan ada juga yang mampu menghidrolisis protein
menjadi asam-asam amino. Untuk menghidrolisis polimer tersebut menjadi
bentuk yang sederhana, maka dibutuhkan bantuan enzim. Enzim juga yang
digunakan berbeda-beda ada yang khusus untuk polimer pati, polimer protein dan
lipid (Djide et al 2006).
Enzim adalah biokatalisator yang merupakan molekul biopolimer dan
tersusun dari serangkaian asam amino dalam komposisi dan susunan rantai yang
teratur dan tetap. Enzim memiliki peranan yang sangat penting dalam berbagaireaksi kimia yang terjadi di dalam sel yang mungkin sangat sulit dilakukan oleh
reaksi kimia biasa. Enzim alfa amilase merupakan salah satu jenis enzim yang
berperan atau berfungsi menghidrolisis ata memecah molekul-molekul pati
menjadi molekul-molekul lain yang lebih sederhana seperti dekstrin, maltosa, dan
glukosa. Mekanisme kerja dari enzim alfa amilase adalah dengan cara memecah
ikatan α-1,4 glikosidik rantai glukan pati dari sebelah dalam (Darmajan et all
2008).
Enzim terbentuk dari protein yang sangat peka terhadap perubahan suhu
lingkungannya, ketika suhu lingkungannya sesuai, enzim akan aktif atau akan
bekerja dengan optimal, akan tetapi apabila suhu lingkungannya tidak sesuai,
maka enzim tidak aktif atau tidak bisa melakukan aktivitasnya (pekerjaannya), bahkan bisa terdenaturasi. Berdasarkan uraian tersebut, maka dalam percobaan ini
dilakukan uji terhadap aktivitas enzimatis pada mikroba. Sehingga kita bisa tahu
pada suhu berapa enzim itu dapat bekerja atau dapat beraktivitas secara optimal
(Pelczar 1988).
Enzim berdasarkan tempat bekerjanya dapat digolongkan menjadi dua
yaitu eksoenzim dan endoenzim. Endoenzim disebut juga enzim intraseluler, yaitu
enzim yang bekerjanya di dalam sel. enzim ini digunakan untuk proses sintesis di
dalam sel dan untuk pembentukan energi (ATP) yang berguna untuk proses
kehidupan sel, misalnya dalam proses respirasi sedangkan, Eksoenzim disebut
juga enzim ekstraseluler, yaitu enzim yang bekerjanya di luar sel. Umumnya
berfungsi untuk “mencernakan” substrat secara hidrolisis, untuk dijadikan
molekul yang lebih sederhana dengan BM lebih rendah sehingga dapat masuk
melewati membran sel. Energi yang dibebaskan pada reaksi pemecahan substrat
di luar sel tidak digunakan dalam proses kehidupan sel (Volk dan Wheeler 1988).
Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk mengamati pengaruh enzim terhadap
aktivitas mikroorganisme.
Alat dan BahanAlat-alat yang digunakan yaitu inkubator, tabung reaksi berpenutup, kawat
oase, bunsen, cawan petri, pipet tetes, object glass dan spidol. Bahan-bahan yang
digunakan yaitu biakan padat bakteri E.coli dan Bacillus sp, Larutan lugol’s
iodine, nutrient agar, Skim Milk Agar (SMA), HCl 10%, dan H2O2 3%.
Metode percobaan
Uji amilolitik dilakukan dengan cara terlebih dahulu nutrient agar yangmengandung pati (2 g/l) dengan E. Coli dan Bacillus sp diinokulasi, setelah
diinokulasi, cawan petri yang berisi media dan bakteri tersebut diambil dengan
menggunakan kawat oase sambil didekatkan ke api, kemudian goreskan ke cawan
petri yang berisi media, lalu diinkubasi selama 48 jam pada suhu 370C, setelah
diinkubasi larutan lugol’s iodine diteteskan secukupnya sehingga seluruh
permukaan media yang berisi bakteri terkena. Hasil positif pada uji ini yaitu
terbentuk zona bening pada bakteri sedangkan, hasil negatif pada uji ini yaitu
tidak terbentuk zona bening.
Uji proteolitik dilakukan dengan cara terlebih dahulu Skim Milk Agar
(SMA) dengan E. Coli dan Bacillus sp diinokulasi, setelah diinokulasi, cawan petri yang berisi media dan bakteri tersebut diambil dengan menggunakan kawat
oase, kemudian goreskan ke cawan petri yang berisi media, lalu diinkubasi selama
48 jam pada suhu 370C, setelah diinkubasi larutan HCl 10% diteteskan
secukupnya sehingga seluruh permukaan media yang berisi bakteri terkena. Hasil
positif pada uji ini yaitu terbentuk zona bening di sekitar bakteri sedangkan, hasil
negatif pada uji ini yaitu tidak terbentuk zona bening di sekitar bakteri.
Uji katalase dilakukan dengan cara koloni bakteri diambil dengan
menggunakan kawat oase secara aseptis dan diinokulasi pada object glass, setelah
diinokulasi, object glass ditetesi larutan H2O2 3% secukupnya. Hasil positif pada
uji ini yaitu terbentuk gelembung pada bakteri sedangkan, hasil negatif pada uji
ini yaitu tidak terbentuk pada bakteri.
Hasil dan Data Pengamatan
Hasil uji aktivitas enzim pada mikroorganisme diantaranya uji amilolitik,
uji proteolitik, dan uji katalase. Enzim yang digunakan pada percobaan ini
memiliki aktivitas dan identifikasi yang berbeda pada setiap bakteri, perbedaan
tersebut mempengaruhi aktivitas, sehingga dapat dengan mudah membedakan
bakteri yang memiliki enzim amilum atau tidak, memiliki enzim protease atau
tidak, dan proses respirasi secara aerobik. Setiap uji pada percobaan dapat dilihat
hidrolisis protein pada uji proteolitik, dan uji katalase untuk mengetahui respirasi
secara aerobik pada mikroorganisme (Umbreit 1960).
Amilolitik merupakan aktivitas bakteri dalam merombak pati dengan
bantuan enzim amilase. Enzim amilase adalah enzim yang mampu menghidrolisis
pati menjadi senyawa lebih sederhana seperti maltosa dan glukosa. Enzim ini
banyak digunakan untuk keperluan industri. Enzim ini dapat memecah atau
menghidrolisa pati, glikogen dan turunan polisakarida dengan cara memecah
ikatan glikosidik pati. Enzim amilase dibedakan menjadi 3 grup yaitu α-amilase
yang disebut juga endoamilase, β-amilase yang disebut juga eksoamilase dan
glukoaminase (Rehm dan Reed 1987).Amilum memiliki berat molekul tinggi, terdiri atas polimer glukosa yang
bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. Degradasi amilum
membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis menjadi
polisakarida yang lebih pendek (dextrin), dan selanjutnya menjadi maltosa.
Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransportmasuk ke dalam sel. Indikator yang dipakai pada uji amilolitik adalah iodine.
Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk warna biru hitam yang terlihat
pada media. Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase. NA yang
tersuspensi pati digunakan sebagai media. Indikator yang dipakai adalah iodine.
Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk komplex warna biru hitam yang
terlihat pada media. Warna biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian
kosong pada amilum yang berbentuk spiral. Reaksi yang terjadi pada uji amilolitik
dapat dilihat pada Gambar 5 di bawah ini (Friedmann dan Herbert 1981):
Uji amilolitik ini menggunakan Nutrien Agar yang mengandung pati 2%,
hal ini karena media tersebut merupakan medium untuk pertumbuhan bakteri,
selain itu kandungan pati yang terkandung dalam media NA yang nantinya akan
digunakan untuk produksi amilase. Larutan iodin digunakan untuk deteksi adanya
amilase dalam medium atau bahan. Larutan iodin yang digunakan karena
degradasi yang terjadi pada pati dapat diketahui dengan hilangnya material yang
terwarnai oleh iodin. Uji deteksi α amylase yang menghidrolisis α-1,4-glikogen
dan poliglucosan lainnya. Saat awal perlakuan terjadi penurunan yang cepat berat
molekul pati yang dihasilkan dari pewarnaan iodin. Amilum akan bereaksi dengan
iodin membentuk kompleks warna biru hitam yang terlihat pada media. Warna
hitam ini terjadi karena iodin masuk kedalam bagian kosong pada amilum yang
atau pemutusan ikatan peptida pada protein. Neutrase, suatu protease netral
banyak digunakan pada proses hidrolisis protein makanan dalam industri makanan
dengan derajat hidrolisis yang rendah. Beberapa protease netral termasuk jenis
protease logam dan membutuhkan ion logam divalen untuk aktivitasnya. Sebagian
lagi termasuk protease serin, tidak membutuhkan ion logam dalam aktivitasnya.Protease alkalin dari bakteri memiliki aktivitas tertinggi pada pH 10 dan suhu
optimal pada suhu 60oC. Sifat-sifat yang dimiliki protease ini membuatnya cocok
untuk digunakan dalam industri detergen (Umbreit 1960).
Termofilik sebagai salah satu jenis bakteri dapat tumbuh pada suhu tinggi
yaitu 45oC-70oC dan berada di atas suhu tumbuh rata-rata bakteri mesofil. Oleh
karena memiliki ciri khas demikian, maka bakteri ini sebagian besar tumbuh dan
hidup pada daerah bersuhu tinggi, seperti sumber airpanas, kawah gunung berapi,
dan tempat pengomposan. Keuntungan dari bakteri ini adalah memiliki protein
yangdapat bekerja pada kondisi lingkungan dengan suhu tinggi dimana protein/
enzim lain dapat mengalami denaturasi. Salahsatu protease termostabil dapat
dihasilkan darimikroorganisme termofilik yaitu Bacillus subtilis (Umbreit 1960).Hasil percobaan pada uji proteolitik positif menngandung enzim protease
pada bakteri Bacillus sp. Hal ini ditunjukkan oleh adanya produksi enzim amilase
oleh koloni bakteri pada media ditunjukkan adanya zona bening dengan
penambahan larutan HCl 10% di sekitar koloni bakteri.
Uji katalase ini dilakukan untuk mengidentifikasi kelompok bakteri bentuk
kokkus. Penentuan adanya katalase ini terlihat dari pembentukan gelembung
udara di sekitar koloni setelah ditambahkan larutan H2O2 3% atau suatu pengujian
respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif) pada mikroorganisme, beberapa
bakteri yang memiliki flavoprotein dapat mereduksi O2 dengan menghasilkan
hidrogen peroksida (H2O2) atau superoksida (O2-). Kedua bahan ini merupakan
bahan yang toksik dan menghancurkan kompenen sel dengan sangat cepat.
Bakteri harus dapat mempertahankan diri seperti dengan produksi O2 atau akan
terbunuh. Beberapa bakteri dapat memproduksi enzim yang dapat mengkatalisis
superoksids yaitu peroksida dismutase, dan juga katalase atau peroksidase yang
dapat mendekstruksi hidrogen peroksida (Hardioetomo 1983).
Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrogen
peroksida (H2O2) menjadi air dan O2. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu
metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan
aerob dapat menguarikan zat toksik tersebut. Mikroorganisme tersebut akan
menghasilkan hidrogen peroksida, bahkan ada yang menghasilkan superoksida
yang sangat beracun. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkankematian pada mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme
aerobik, fakultatif aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur respirasi
aerobik. Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk
penguraian khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat katalase
negatif. Produksi katalase bisa diidentifikasi dengan menanmbahkan reagen
H2O2 pada suspensi bakteri. Jika dihasilkan gelembung gas, berarti bakteri
tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Jika tidak dihasilkan gelembung
gas berarti uji katalase dinyatakan negatif. Reaksi kimiawi yang dikatalisasikan
oleh enzim terlihat dapat dilihat pada Gambar 7 dan Gambar 8 sebagai berikut
Hasil percobaan pada uji katalase pada bakteri Bacillus sp dan E. Coli
menunjukkan hasil yang positif. Hal ini ditunjukkan oleh adanya terbentuk
gelembung udara ketika ditambahkan larutan H2O2, sehingga dapat disimpulkan
bahwa pada bakteri Bacillus sp dan E. Coli terjadi proses respirasi secara aerob.
SimpulanBerdasarkan hasil percobaan yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa
pada uji amilolitik dan proteolitik pada bakteri Bacillus sp menunjukkan hasil
positif, sedangkan pada bakteri E. Coli menunjukkan hasil negatif, sehingga pada
bakteri Bacillus sp dan E. Coli mengandung enzim protease dan enzim amilum, begitu juga pada uji katalase pada bakteri Bacillus sp dan E. Coli menunjukkan
hasil positif, berarti bakteri Bacillus sp dan E. Coli terjadi proses respirasi secara
aerob yaitu terbentuknya gelembung udara.
Daftar Pustaka
Djide, et al . 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Makassar: Universitas Hasanuddin