-
i
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Studi Marker Protein Prediktor Diabetes Melitus pada
Individu
dengan Pre-Diabetes
Disusun oleh:
dr. Asri Werdhasari, M.Biomed dan Tim
PUSAT PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN
BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN
BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN
KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA
2017
-
ii
SURAT KEPUTUSAN (SK) PEMBENTUKAN TIM
PELAKSANA PENELITIAN
-
iii
-
iv
-
v
-
vi
-
vii
SUSUNAN TIM PENELITI
No Nama Keahlian/
Kesarjanaan
Kedudukan dalam
Tim Uraian Tugas
1. 1 dr. Asri Werdha
Sari, M. Biomed Biomed Ketua Penelitian
Bertanggung jawab pada
keseluruhan penelitian
(Bertanggung jawab atas
perencanaan, pelaksanaan,
kualitas dan evaluasi serta
laporan penelitian)
2. 2 drh. Win
Winarno,M.Kes. Dr hewan Peneliti
Bertanggung jawab pada
reviu internal pelaporan dan
diseminasi hasil penelitian
3. drh. Uly Alfi
Nikmah, M.Biomed. Biomed Peneliti
Bertanggung jawab atas
pengajuan etik, bahan
penelitian, membantu
penyelenggaraan pertemuan
koordinasi
penelitian/pelatihan,
pembuatan protokol,
penyusunan
RAB/RPD/RPK, pengajuan
etik, analisis data dan
pembuatan laporan
4. 3 dr. Frans Dany Dokter umum Peneliti
Bertanggung jawab atas
penelusuran jurnal,
pembuatan
protokol,pemisahan plasma
dan buffy coat, ekstraksi
DNA, pemeriksaan variasi
genetik (polimorfisme) dan
analisis hasil pemeriksaan
5. 4 drh. Risqa Novita,
M.KM. Dokter hewan Peneliti
Bertanggung jawab
penghubung administrasi,
penyelenggaraan pertemuan
koordinasi
penelitian/pelatihan,
membantu pengajuan bahan
penelitian dan pembuatan
laporan
6. 5 Holy Arif Wibowo,
S.Si Biologi Peneliti
Bertanggung jawab atas
ekstraksi DNA,
pemeriksaan variasi genetik
(polymorfism) dan analisis
hasil pemeriksaan
-
viii
7. drh. Putri Reno Intan Dokter hewan Peneliti
Bertanggung jawab atas
pemisahan buffycoat,
ekstraksi DNA dan
pemeriksaan protein
8. Rosa Adelina, M.Si,
Apt Biomedik Peneliti
Bertanggung jawab atas
pemisahan buffycoat,
ekstraksi DNA dan
pemeriksaan protein
9. Sehatman, S.Si,
M.Sc Biomedik Peneliti
Bertanggung jawab atas
pemisahan buffycoat,
ekstraksi DNA dan
pemeriksaan protein
10. Dwi Febriyana, S.Si Biologi Pembantu Peneliti Membantu
pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
11. 1 Daryanto, S.Kom Sarjana
Komputer IT
Bertanggung jawab atas
manajemen data dan
spesimen
12. 1 Driya Shintia Dewi
Adianti, S.Biotech Bioteknologi Pembantu Peneliti
Membantu pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
13. 1 Wika
Sumartyaningsih,
S.Biotech
Bioteknologi Pembantu Peneliti Membantu pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
14. 1 Tati Febrianti, S.Si Biologi Pembantu Peneliti Membantu
pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
15. 1 Primarasprabu IT Pembantu Peneliti Membantu dalam
manajemen sampel
16. 1 Anggi Aris Faisal Analis
kesehatan Pembantu Peneliti
Membantu dalam
manajemen sampel
17. 2 Kristina
Retnoningtyas
Palupi, S.Si
Biologi Pembantu Peneliti Membantu pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
18. 2 Rulina Novianti,
S.Si
Analis
kesehatan Pembantu Peneliti
Membantu pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
19. Juwita Kurniawati,
Amd. Ak.
Analis
kesehatan Pembantu Peneliti
Membantu pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
20. Adit Prasetyo Analis
kesehatan Pembantu Peneliti
Membantu pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
21. 2 Fri Handayani, Amd. SE Administrator Melaksanakan
administrasi
keuangan
22. 2 Yuswanto SE Administrator Melaksanakan administrasi
keuangan
-
ix
PERSETUJUAN ETIK
-
x
-
xi
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas selesainya penyusunan
laporan
penelitian Studi Marker Protein Prediktor Diabetes Melitus pada
Individu dengan
Pre Diabetes tahun 2017. Terima kasih tim peneliti haturkan pada
Kepala
Puslitbang Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan (PBTDK) dan
seluruh
jajarannya sehingga penelitian ini dapat dibiayai melalui DIPA
PBTDK tahun
2017. Terima kasih pula kepada tim Panitia Pembina Ilmiah PBTDK
yang telah
memberi arahan substansial, kepada tim Komisi Etik Penelitian
Badan Litbangkes
yang telah mengeluarkan Persetujuan Etik dan kepada ibu Dr.
Efriwati, M.Si yang
telah mereviu dan memberi masukan membangun sehingga tersusunlah
laporan
penelitian ini. Terima kasih kepada seluruh tim peneliti dan
tenaga honor yang
ikut membantu dengan segenap daya upaya menyelesaikan penelitian
ini dan
kepada seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu per
satu.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi masukan kepada
program
penanggulangan penyakit tidak menular. Marker genetik dan
protein yang
ditemukan secara statistik bermakna pada populasi penelitian,
dapat dilakukan
eksplorasi lebih lanjut untuk dapat diterapkan sebagai salah
satu mekanisme untuk
mendeteksi faktor risiko secara dini sebelum munculnya
gejala.
Tim peneliti berharap penelitian ini dapat bermanfaat bagi
masyarakat
dalam upaya pencegahan penyakit tidak menular, terutama diabetes
melitus. Suatu
penyakit yang merupakan faktor risiko bagi munculnya penyakit
lainnya.
Tim Peneliti
-
xii
RINGKASAN EKSEKUTIF
Diabetes mellitus tipe-2 (DM) merupakan faktor risiko dari
penyakit tidak
menular lainnya, seperti kardiovaskuler, gagal ginjal dan
lain-lain.Secara ekonomi,
DM menjadi penyakit yang mahal, karena prevalensi serta
progresivitasnya yang
meningkat. Kondisi sebelum DM, yang ditandai dengan peningkatan
kadar gula
darah puasa (GDPT) atau peningkatan kadar gula darah setelah
pembebanan
glukosa (TGT) disebut pre-DM. Pre-DM ini telah menimbulkan
adanya gangguan
metabolisme dan komplikasi. Hal ini telah menjadi beban bagi
individu maupun
masyarakat dan pemerintah. Sehingga pencegahan pre-DM menjadi DM
dan
mengembalikan kondisi pre-DM menjadi kembali normal sangatlah
penting
dilakukan.
Salah satu cara yang sedang dikembangkan untuk pencegahan hal
tersebut
adalah dengan penggunaan marker untuk deteksi dini pre-DM dan
DM. Marker
tersebut diharapkan dapat digunakan sebagai prediktor pre-DM dan
DM,
sehingga dapat menurunkan angka kejadian pre-DM dan DM. Single
nucleotide
polymorphisms (SNPs) merupakan variasi sekuen DNA yang dapat
dihubungkan
dengan kerentanan seseorang terhadap suatu penyakit seperti
DM.
Penelitian ini ingin mengetahui hubungan variasi gen dan kadar
protein
terkait terhadap kejadian DM dan pre DM pada suatu populasi,
yaitu populasi .
yang sama dengan studi kohor untuk faktor risiko penyakit tidak
menular (FR-
PTM). Dimana studi kohor FR-PTM ini merupakan studi berbasis
masyarakat
yang dilakukan Badan Litbangkes sejak tahun 2011 untuk mengamati
penyakit
stroke, jantung koroner (PJK), DM dan hipertensi. Data dasar
berupa hasil
wawancara berisi riwayat, gejala penyakit, perilaku dan
frekuensi diet, serta hasil
pemeriksaan fisik berupa antropometri, tekanan darah,
elektrokardiografi, rontgen
dada dan neurologi sudah terkumpul dalam studi kohor FR-PTM
sebelumnya.
Penelitian ini, berupa marker genetik DM diharapkan dapat
melengkapi data studi
tersebut.
Biomarker yang dianalisis dalam studi ini adalah single
nucleotide
polymorphisms (SNPs) pada 8 gen yaitu gen UCP2 rs660339,
DUSP9/MKP4
rs5945326, SLC30A8 rs13266634, Resistin (RETN) rs3745367,
IGF2BP2
-
xiii
rs16860234, KCNQ1 rs2237892, ADIPOQ rs6773957 dan KLF14
rs972283.
Selain itu, penelitian ini dilengkapi dengan pengamatan ekspresi
variasi biomarker
genetik gen-gen tersebut berupa pengukuran kadar protein
resistin, insulin,
c-peptide dan adiponektin.
Hasil penelitian menunjukkan alel gen DUSP9/MKP4, RETN,
ADIPOQ
dan KLF14 mutan meningkatkan risiko timbulnya DM yang lebih
tinggi
dibandingkan alel asal. Gen IGF2BP2, UCP2 dan KCNQ1 alel asal
justru
meningkatkan risiko menjadi DM dibandingkan alel mutannya.
Sementara itu,
ketidakseimbangan hukum Hardy-Weinberg dijumpai pada semua gen.
Dengan
demikian, sebagian alel mutan dan alel asal menjadi faktor
risiko timbulnya DM
dan terindikasi sudah berevolusi.
Gangguan kadar protein sudah dijumpai pada individu prediabetes,
yaitu
protein adiponektin, resistin dan insulin. Kadar protein
c-peptide paling rendah
dijumpai pada kelompok DM. Perubahan ekspresi sebagian protein
yang paling
mencolok pada kelompok prediabetes dapat digunakan sebagai
penanda genetik.
Biomarker tersebut dapat dikembangkan lebih lanjut sebagai
prediktor dini
prediabetes.
-
xiv
ABSTRACT
Prevalence of type 2 diabetes mellitus (DM) continues to
increase in
worldwide, including Indonesia based on Riskesdas 2007 and 2013
data. A
number of studies indicate genetic marker variations being
determinants of blood
sugar metabolism impairment and some developed countries have
started using
such biomarker screening as early detection or prevention. This
research was
conducted to identifythose biomarkers and use them as DM
predictor, hopefully
decreasingits incidence rate. This study used a cohort sample
population in Bogor,
West Java. The biomarkers analyzed in this study were single
nucleotide
polymorphisms (SNPs) on UCP2 rs660339, DUSP9/MKP4 rs5945326,
SLC30A8
rs13266634, Resistin (RETN) rs3745367, IGF2BP2 rs16860234,
KCNQ1
rs2237892, ADIPOQ rs6773957 and KLF14 rs972283 gene. Protein
level of
resistin, insulin, c-peptide and adiponectin were also measured
to complement the
findings on these genetic biomarker variation expression. RETN,
DUSP9/MKP4,
IGF2BP2, ADIPOQ and KLF14 mutant gene alleles increased risk of
developing
DM, at least compared to their normal counterparts. Meanwhile,
Hardy-
Weinberg's inequilibriumwas found in all genes. Impaired protein
levels are found
particularly in prediabetes individuals, except the lowest
levels of c-peptide found
in the DM group. Thus, some mutant alleles became risk factors
for DM and
seemed to evolve. However, the protein expression changes were
most prominent
in the prediabetes group.Hence,thosebiomarker genetic markers
can also be
further developed as prediabetes early predictors.
Keywords: diabetes mellitus, kohort, single nucleotide
polymorphisms (SNPs),
Hardy-Weinberg, protein, Bogor
-
xv
ABSTRAK
Peningkatan prevalensi diabetes melitus (DM) tipe 2 terus
terjadi di seluruh
dunia, termasuk di Indonesia. Berdasarkan data Riskesdas terjadi
peningkatan dari
1,1% (tahun 2007) menjadi 2,1% (tahun 2013). Sejumlah studi
menunjukkan
adanya variasi penanda genetik yang menjadi determinan timbulnya
gangguan
metabolisme gula darah. Penelitian ini dilakukan untuk
identifikasi biomarker
timbulnya DM dan digunakan sebagai prediktor DM untuk menurunkan
angka
kejadian DM. Studi ini menggunakan populasi sampel studi kohor
faktor risiko
Penyakit Tidak Menular (FR-PTM) di Bogor, Jawa Barat. Biomarker
yang
dianalisis adalah single nucleotide polymorphisms (SNPs) pada
gen UCP2
rs660339, DUSP9/MKP4 rs5945326, SLC30A8 rs13266634, Resistin
(RETN)
rs3745367, IGF2BP2 rs16860234, KCNQ1 rs2237892, ADIPOQ rs6773957
dan
KLF14 rs972283. Selain itu pengukuran kadar protein resistin,
insulin, c-peptide
dan adiponektin dilakukan untuk melengkapi temuan adanya
ekspresi variasi
biomarker genetik gen-gen tersebut. Alel mutan gen RETN
rs3745367,
DUSP9/MKP4 rs5945326, ADIPOQ rs6773957 dan KLF14 rs972283
meningkatkan risiko timbulnya DM yang lebih tinggi dibandingkan
alel normal.
Namun sebaliknya, gen IGF2BP2 rs16860234, UCP2 rs660339 dan
KCNQ1
rs2237892 alel asal justru meningkatkan risiko menjadi DM yang
lebih tinggi
dibandingkan alel mutan. Ketidakseimbangan hukum Hardy-Weinberg
dijumpai
pada semua gen. Gangguan kadar protein adiponektin, resistin dan
insulin sudah
dijumpai pada individu prediabetes. Dengan demikian, sebagian
alel mutan atau
bahkan alel asal dapat menjadi faktor risiko timbulnya DM dan
terindikasi
berevolusi. Namun, perubahan ekspresi sebagian protein paling
mencolok pada
kelompok prediabetes sehingga penanda genetik biomarker tersebut
dapat juga
dikembangkan lebih lanjut sebagai prediktor dini
prediabetes.
Kata kunci: diabetes melitus, kohort, single nucleotide
polymorphisms (SNPs),
Hardy-Weinberg, protein, Bogor
-
xvi
DAFTAR ISI
SUSUNAN TIM PENELITI
.................................................................................
vii
PERSETUJUAN ETIK
..........................................................................................
ix
KATA PENGANTAR
...........................................................................................
xi
RINGKASAN EKSEKUTIF
................................................................................
xii
ABSTRACT
...........................................................................................................
xiv
ABSTRAK
.............................................................................................................
xv
DAFTAR ISI
........................................................................................................
xvi
DAFTAR TABEL
..............................................................................................
xviii
PENDAHULUAN
...................................................................................................
1
I.1. Latar Belakang
...............................................................................................
1
1.2. Perumusan Masalah
......................................................................................
2
I.3. Tujuan Penelitian
...........................................................................................
2
I.3.1. Tujuan Umum
.........................................................................................
2
I.3.2. Tujuan Khusus
........................................................................................
2
I.4. Manfaat dan Luaran Penelitian
......................................................................
2
TINJAUAN PUSTAKA
..........................................................................................
3
METODE PENELITIAN
.........................................................................................
8
III.1. Kerangka
Teori............................................................................................
8
III.2. Kerangka Konsep
........................................................................................
8
III.3. Desain dan Jenis Penelitian
.........................................................................
9
III.4. Tempat dan Waktu
......................................................................................
9
III.5. Populasi dan Sampel
...................................................................................
9
III.5.1. Populasi
................................................................................................
9
III.5.2. Sampel
................................................................................................
10
III.5.3. Kriteria Inklusi dan Eksklusi
..............................................................
10
III.5.4. Estimasi Besar Sampel, Cara Pemilihan dan Penarikan
Sampel ....... 10
III.5.5. Variabel
..............................................................................................
10
III.5.6. Definisi
Operasional...........................................................................
11
III.6. Alur Penelitian
..........................................................................................
11
III.7. Bahan dan Prosedur Kerja
.........................................................................
11
III.7.1. Bahan dan alat
....................................................................................
11
III.7.2. Prosedur
kerja.....................................................................................
12
-
xvii
III.8. Manajemen dan Analisis Data
..................................................................
20
III.9. Pertimbangan Etik Penelitian
....................................................................
21
III.10. Pertimbangan Izin Penelitian
..................................................................
21
HASIL PENELITIAN
............................................................................................
22
PEMBAHASAN
....................................................................................................
49
KESIMPULAN & SARAN
...................................................................................
54
VI.1. Kesimpulan
...............................................................................................
54
VI.2. Saran
.........................................................................................................
55
UCAPAN TERIMA KASIH
..................................................................................
56
DAFTAR PUSTAKA
............................................................................................
57
LAMPIRAN
...........................................................................................................
59
-
xviii
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre
DM pada gen
UCP2 rs660339.
......................................................................................
40
Tabel 2. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre
DM pada gen
KCNQ1 rs2237892.
................................................................................
40
Tabel 3. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre
DM pada gen
RETN rs3745367.
...................................................................................
41
Tabel 4. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre
DM pada gen
DUSP9/MKP4 rs5945326.
.....................................................................
41
Tabel 5. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre
DM pada gen
SLC30A8 rs13266634.
...........................................................................
41
Tabel 6. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre
DM pada gen
IGF2BP2 rs16860234.
............................................................................
42
Tabel 7. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre
DM pada gen
ADIPOQ rs6773957.
..............................................................................
42
Tabel 8. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre
DM pada gen
KLF14 rs972283.
....................................................................................
42
Tabel 9. Larutan Standar Kadar C-peptide.
.......................................................... 43
Tabel 10. Hasil Pemeriksaan Protein.
...................................................................
44
Tabel 11. Larutan Standar Adinponektin.
.............................................................
45
Tabel 12. Hasil Pemeriksaan Kadar Adiponektin dalam Plasma
Darah
Responden.
............................................................................................
45
Tabel 13. Larutan Standar Insulin.
........................................................................
46
Tabel 14. Hasil Pemeriksaan Insulin.
....................................................................
47
Tabel 15. Larutan Standar Resistin.
......................................................................
47
Tabel 16. Hasil Pemeriksaan Protein Resistin.
..................................................... 48
-
xix
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada gen UCP2
rs660339 pada
responden DM, Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor
tahun
2016.
....................................................................................................
23
Gambar 2. Distribusi alel a/a, a/g dan g/g pada gen ucp2
rs660339 pada responden
normal, Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor, 2016.
............ 23
Gambar 3. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada gen UCP2
rs660339 pada
responden dengan pre DM, Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota
Bogor, 2016.
........................................................................................
24
Gambar 4. Distribusi alel T/T, C/T dan C/C pada gen KCNQ1
rs2237892 pada
responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun
2016.
.............................................................................................................
25
Gambar 5. Distribusi alel T/T, C/T dan C/C pada gen KCNQ1
rs2237892 pada
responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor
tahun
2016.
....................................................................................................
25
Gambar 6. Distribusi alel T/T, C/T dan C/C pada gen KCNQ1
rs2237892 pada
responden dengan pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota
Bogor
tahun 2016.
..........................................................................................
26
Gambar 7. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen RETN
rs3745367 pada
responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun
2016.
.............................................................................................................
27
Gambar 8. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen RETN
rs3745367 pada
responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor
tahun
2016.
....................................................................................................
27
Gambar 9. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen RETN
rs3745367 pada
responden dengan pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota
Bogor
tahun 2016.
..........................................................................................
28
Gambar 10. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen
DUSP9/MKP4
rs5945326 pada responden DM, studi kohor faktor risiko PTM,
kota
Bogor tahun 2016.
...............................................................................
29
Gambar 11. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen
DUSP9/MKP4
rs5945326 pada responden normal, studi kohor faktor risiko PTM,
kota
Bogor tahun 2016.
...............................................................................
29
Gambar 12. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen
DUSP9/MKP4
rs5945326 pada responden pre DM, studi kohor faktor risiko
PTM,
kota Bogor tahun 2016.
.......................................................................
30
Gambar 13. Distribusi genotipeC/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8
rs13266634
pada responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor
tahun
2016.
....................................................................................................
31
-
xx
Gambar 14. Distribusi alel C/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8
rs13266634
pada responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota
Bogor
tahun 2016.
..........................................................................................
31
Gambar 15. Distribusi alel C/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8
rs13266634
pada responden pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota
Bogor
tahun 2016.
..........................................................................................
32
Gambar 16. Distribusi genotipe A/A, A/C dan C/C pada Gen
IGF2BP2
rs16860234 pada responden DM, studi kohor faktor risiko PTM,
kota
Bogor tahun 2016.
...............................................................................
33
Gambar 17. Distribusi genotipe A/A, A/C dan C/C pada Gen
IGF2BP2
rs16860234 pada responden normal, studi kohor faktor risiko
PTM,
kota Bogor tahun 2016.
.......................................................................
33
Gambar 18. Distribusi genotipe A/A, A/C dan C/C pada Gen
IGF2BP2
rs16860234 pada responden pre DM, studi kohor faktor risiko
PTM,
kota Bogor tahun 2016.
.......................................................................
34
Gambar 19. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden DM,
studi
kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
.............................. 35
Gambar 20. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden
normal, studi
kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
.............................. 35
Gambar 21. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden pre
DM, studi
kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
.............................. 36
Gambar 22. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada
responden DM,
studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
..................... 37
Gambar 23. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada
responden normal,
studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
..................... 38
Gambar 24. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada
responden pre DM,
studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
..................... 39
Gambar 25. Kurva Standar C-peptide.
..................................................................
44
Gambar 26. Kurva Standar Adiponektin.
..............................................................
45
Gambar 27. Kurva standar Insulin.
.......................................................................
46
Gambar 28. Kurva Standar Resistin
......................................................................
47
-
xxi
DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN
PTM : Penyakit Tidak Menular
DM : Diabetes Mellitus
Pre DM : Kondisi gangguan metabolisme sebelum masuk pada
kondisi DM
TGT : Toleransi Glukosa Terganggu
GDPT : Glukosa Darah Puasa Terganggu
SNP : Single Nucleotide Polymorphisms
RT PCR : Real Time Polimerase Chain Reaction
Isolated IFG : Isolated Impaired Fasting Glucose; keadaan
ketika
kadar glukosa darah puasa di atas normal tetapi tidak
cukup tinggi untuk memenuhi kriteria DM (GDP = 100-
125 mg/dL) tetapi kadar glukosa darah 2 jam pasca
pembebanan masih dalam kisaran normal (OGTT < 140
mg/dL)
Isolated IGT : Isolated Impaired Glucose Tolerance; keadaan
ketika
kadar glukosa darah 2 jam pasca pembebanan di atas
normal tetapi tidak cukup tinggi untuk memenuhi
kriteria DM (OGTT = 140-199 mg/dL) tetapi kadar
glukosa darah puasa masih dalam kisaran normal (GDP
< 100 mg/dL
-
1
BAB I
PENDAHULUAN
I.1. Latar Belakang
Diabetes Melitus (DM) tipe 2 merupakan ibu dari beberapa
penyakit
degeneratif lainnya, sehingga merupakan masalah kesehatan yang
serius. Kondisi
gangguan metabolisme tubuh yang ditandai dengan kenaikan kadar
gula darah
melebihi nilai ambang, dikenal dengan prediabetes. Pada kondisi
ini risiko
terhadap penyakit kardiovaskuler dan kematian total juga
meningkat hampir dua
kali lipat, karena dikaitkan dengan adanya komplikasi
mikrovaskular.
Menurut data Riset Kesehatan Dasar (RKD) 2013 terdapat
peningkatan
prevalensi DM dibandingkan dengan data sebelumnya (RKD 2007).
Pada tahun
2007 prevalensi DM di area perkotaan Indonesia dari 5,7% dan
menjadi 6,8%
pada tahun 2013 pada seluruh wilayah Indonesia.
Faktor risiko DM tipe 2 terutama disebabkan oleh pola hidup yang
kurang
sehat serta riwayat DM dalam keluarga, sehingga dimungkinkan
erat kaitannya
dengan faktor genetik. Oleh karena itu, upaya pencegahan perlu
dilakukan sedini
mungkin dengan perubahan gaya hidup atau pengendalian faktor
risiko yang
sudah ada.
Beberapa studi di negara maju sudah mempertimbangkan
penggunaan
biomarker sebagai salah satu upaya skrining pencegahan awal
penyakit metabolik,
mulai dari penanda genetik sampai protein. Penanda genetik yang
digunakan
antara lain adanya Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), yang
merupakan
variasi sekuen DNA yang dapat dihubungkan dengan kerentanan
seseorang
terhadap suatu penyakit, antara lain DM tipe-2. Namun, hasil
sejumlah penelitian
menunjukkan adanya variasi marker tersebut yang dapat disebabkan
perbedaan
etnis atau gaya hidup yang menyertainya.
-
2
1.2 Perumusan Masalah
Hasil penelitian SNPs pada berbagai etnis / daerah menunjukkan
hasil yang
berbeda terhadap risiko kejadian DM. Perbedaan variasi alel pada
SNPs dapat
dijadikan sebagai prediktor DM yang khas untuk populasi
Indonesia. Hasil
penelitian ini diharapkan dapat menganalisis kandidat 8 gen SNPs
yang diperiksa
dengan membandingkan SNPs yang dimiliki antar kelompok individu
dengan
kriteria kadar glukosa darah normal, prediabetes dan DM.
I.3 Tujuan Penelitian
I.3.1. Tujuan Umum:
Menentukan marker genetik yang berpotensi sebagai prediksi
kejadian DM.
I.3.2 Tujuan Khusus:
1. Menentukan prevalensi variasi genetik gen-gen pengkode faktor
resiko
DM pada populasi studi kohor faktor risiko PTM.
2. Mendapatkan besaran asosiasi polimorfisme gen-gen tersebut
terhadap
kejadian penyakit DM pada populasi studi kohor faktor risiko
PTM.
3. Melengkapi data studi kohor faktor risiko PTM dari faktor
risiko
genomik dan identifikasi protein penanda DM / pre DM.
I.4. Manfaat dan Luaran Penelitian
1. Dapat memberikan gambaran epidemiologi genetik yang
berbasis
masyarakat di Kecamatan Bogor Tengah, Kota Bogor.
2. Data yang diperoleh dapat digunakan sebagai masukan untuk
merancang program pencegahan dan pengendalian PTM, khususnya
DM dengan mempertimbangkan aspek genomik.
-
3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Diabetes melitus (DM) tipe 2 merupakan ibu dari beberapa
penyakit
degeneratif lainnya, sehingga merupakan masalah kesehatan yang
serius. Menurut
Konsensus Pengendalian dan Pencegahan DM tipe 2 di Indonesia
tahun 2011,
kriteria DM apabila:
1. Terdapat gejala klasik DM, yaitu polifagia (banyak makan),
polidipsi (banyak
minum) dan poliuria (banyak buang air kecil) dan kadar glukosa
plasma > 126
mg/dL, atau
2. Kadar glukosa plasma pada TTGO (tes toleransi glukosa oral
dengan
pembebanan glukosa 75 g) > 200 mg/dL
Kondisi gangguan metabolisme tubuh yang ditandai dengan kenaikan
kadar
gula darah melebihi nilai normal namun belum mencapai tahap DM,
dikenal
dengan prediabetes. Prediabetes meliputi Impaired Fasting
Glucose (IFG) atau
Gula Darah Puasa Terganggu (GDPT)dan Impaired Glucose Tolerance
(IGT) atau
Toleransi Glukosa Terganggu (TGT). Kriteria TGT yaitu kadar gula
darah puasa
100-125 mg/dL dan 2 jam setelah pembebanan glukosa 140 – 199
mg/dL (ADA,
2011). Sedangkan prediabetes eksklusif meliputi Isolated
Impaired Glucose
Tolerance/Isolated IGT atau TGT tersendiri dan Isolated Impaired
Fasting
Glucose/Isolated IFG atau GDPT tersendiri, dengan kriteria:
1. Isolated IGT atau TGT tersendiri, yaitu glukosa plasma 2 jam
setelah
pembebanan antara 140-199 mg/dL dan GDPT
-
4
prevalensi TGT sebesar 19,4%. Diperkirakan terdapat 314 juta
orang dengan
prediabetes diseluruh dunia dan akan meningkat menjadi 418 juta
pada tahun
2025 (Manaf,2013).
Kondisi risiko terhadap penyakit kardiovaskuler dan kematian
total juga
meningkat hampir dua kali lipat karena dikaitkan dengan adanya
komplikasi
mikrovaskular. Komplikasi baik prediabetes maupun DM berawal
dari kerusakan
mikro maupun makrovaskular, sehinggaakan menampilkan komplikasi
yang
multiple danyang menjadi penyebab kematian tersering adalah
penyakit
kardiovaskular (Manaf 2013).
Faktor risiko DM tipe 2 terutama disebabkan oleh pola hidup yang
kurang
sehat serta riwayat DM dalam keluarga, sehingga dimungkinkan
erat kaitannya
dengan faktor genetik. Prediabetes juga merupakan faktor risiko
yang kuat
terhadap DM.Prediabetes dapat berkembang menjadi DM, hipertensi,
penyakit
jantung koroner, stroke dll. Siraj MAT (2010) dalam reviu
artikel memperlihatkan
kira-kira sepertiga TGT menjadi DM, konversi diestimasi 5,8%
pertahun.
Menurut hasil penelitian Zyriak dkk. (2013), individu dengan
prediabetes secara
signifikan berhubungan dengan DM tipe 2. Sekitar 5-10% individu
prediabetes
yang tidak tertangani akan berkembang menjadi diabetes atau
menjadi normal
kembali (Zyriak, 2013).
Komplikasi tersebut merupakan beban bagi individu maupun
masyarakat
dan pemerintah, maka dari itu pencegahan dari prediabetes
menjadi DM sangat
penting.Karena itu, upaya pencegahan perlu dilakukan sedini
mungkin dengan
perubahan gaya hidup atau pengendalian faktor risiko yang sudah
ada.
Salah satu cara yang sedang dikembangkan untuk pencegahan
tersebut
adalah penggunaan marker yang dapat dipercaya untuk deteksi dini
DM. Marker
tersebut diharapkan dapat digunakan sebagai prediktor DM
sehingga dapat
menurunkan angka kejadian prediabetes dan DM.
Salah satu penemuan dalam Human Genome Project adalah Single
Nucleotide Polymorphisms (SNPs). SNPs merupakan alel minor
dengan
keberadaannya lebih dari 1%. Apabila SNPs terjadi pada gene
coding regions bisa
mengakibatkan synonymous (tidak menyebabkan perubahan asam
amino) atau
non synonymous. Akan tetapi pada penelitian beberapa tahun
terakhir SNP
-
5
synonymous mendorong terjadinya evolusi yang mendorong
terjadinya suatu
penyakit (Komar, 2009). SNP synonymous dapat mengubah struktur,
fungsi dan
ekspresi protein. Polimorfisme synonymous dapat menyebabkan
splicing RNA,
stabilitas dan struktur protein dapat rusak. Perubahan ini dapat
menyebabkan efek
signifikan pada fungsi protein dan perubahan respon seluler.
Sebagian besar SNPs
merupakan non coding region yang merupakan dasar variasi genetik
pada manusia
dan mengacu pada perbedaan basa tunggal antar individu (Kwook,
2003).
Zachavora dkk. mendapatkan SNPs +45 T/G dan +276 G/T dari
gen
adiponektin sebagai prediktor untuk konversi TGT menjadi DM.Pada
individu
dengan DM akan mempunyai nilai adiponektin dalam darah yang
rendah.
Hipoadiponektinemia berhubungan dengan resistensi insulin dan
disfungsi
endotelium vaskuler, dan menyebabkan peningkatan stres oksidatif
yang menjadi
penyebab penting aterosklerosis dan berlanjut pada kejadian
penyakit
kardiovaskuler. Gen pengkode protein adiponektin adalah ADIPOQ,
berlokasi di
kromosom 3q27. Gen ADIPOQ bervariasi pada posisi 11377 (11377
C>G) dan
diidentifikasi sebagai lokus yang rentan untuk sindrom
metabolisme, DM dan
penyakit kardiovaskuler. Variasi tipe ADIPOQ telah diteliti
berhubungan dengan
risiko kardiovaskular. Pada penelitian di Malaysia oleh Lau CH,
et al. bahwa
SNP+1212A>G (rs6773957) berhubungan bermakna dengan penurunan
kadar
adiponektin. Peningkatan kadar protein yang berhubungan dengan
DM tipe 2
adalah Leptin dan Interleukin-6.
Lau CH, et al. (2009) juga melaporkan bahwa gen resistin (RETN)
pada
+299(G>A) (rs3745367) berhubungan bermakna dengan
hiperresistinemia.
Resistin menekan diferensiasi adiposit yang diduga berakibat
penumpukan
ektopik asam lemak dan lipotoksisitas terhadap jaringan
non-adiposit. Pada Studi
potong lintang di Singapura oleh Tan JT, et al. (2009) sebanyak
3734 responden
usia 18-69 tahun (2520 ras Tiongkok, 693 ras Melayu dan 521 ras
India),
polimorfisme gen KCNQ1 (Rs 2237892, 2237892 dan 2283228)
bermakna pada
ras Melayu. Hal ini sejalan dengan penelitian Genome Wide
Association Study
(GWAS) oleh Saif-Ali R, et al. (2011) di Malaysia yang
menggunakan 411
responden berusia 30-70 tahun (234 responden dengan DM dan 177
responden
normal).
-
6
Studi kasus kontrol menggunakan 620 sampel kontrol (254 ras
Melayu, 204
ras Tiongkok, 162 ras India) dan 1107 responden DM yang
mempunyai hasil
negatif untuk antibodi terhadap glutamic acid decarboxylase,
terdapat asosiasi
kuat pada rs7651090, rs16860234 dan rs6777038 gen IGF2BP2 pada
ras
Tiongkok. Gen IGF2BP2 diduga mengatur fungsi sel beta pankreas.
Sementara
pada ras Melayu hanya rs16860234 yang bermakna (Saleem SD,
2012).
Penelitian polimorfisme gen yang berhubungan dengan DM
pernah
dilakukan oleh kolaborasi peneliti dari Eijkman, Jakarta dan
Universitas Udayana,
Bali di Bali. Penentuan Bali sebagai pilot project dengan alasan
masyarakat Bali
cenderung tertutup, kebanyakan orang menikah dengan sesama suku
Bali. Pada
pemeriksaan polimorfisme pada gen Uncoupling protein 2 (UCP2),
tim peneliti
melaporkan bahwa polimorfisme gen UCP2 Ala55Val (C544T)
berhubungan
dengan DM di Legian, Kuta, Bali (n=287) (Saraswati MR, 2012).
Subjek yang
berada pada perkotaan dan memiliki polimorfisme pada gen
UCP2G(âˆ‟866)A
and Ala55Val juga mempunyai body mass index (BMI) yang lebih
tinggi
dibandingkan dengan subjek yang memiliki genotip yang sama namun
berada
pada pedesA/An. Penelitian ini menunjukkan adanya kerentanan
seseorang
terhadap kejadian DM dan obesitas jika individu tersebut
melakukan gaya hidup
perkotaan (Oktavianthi, 2012). Peneliti mengakui penelitian ini
belum sempurna
dan baru merupakan pilot project karena baru terbatas pada Bali
dan dengan
jumlah sampel yang masih sedikit 603 responden (278 urban dan
325 rural).
Berbagai penelitian melaporkan bahwa variasi genetik ini
berhubungan
dengan variasi etnik dan jenis kelamin. Skrining dilakukan
berdasarkan penelitian
sebelumnya yang menyatakan bahwa variasi genetik berhubungan
dengan variasi
etnik dan jenis kelamin (Gainer JV, et.al. 2001 & Palmer BR,
et.al. 2003), maka
untuk populasi masyarakat Indonesia perlu dilakukan skrining
terlebih dahulu.
Dengan mengetahui variasi genetik pada populasi di Indonesia,
efektifitas kontrol
faktor-faktor risiko DM diharapkan dapat diprediksi. Data ini
akan menjadi
masukan yang bermanfaat dalam merancang strategi yang tepat pada
program
pencegahan dan pengendalian PTM, khususnya DM. Dengan demikian
biaya
pengobatan dan kontrol faktor-faktor risiko DM dapat ditangani
dengan lebih baik,
sehingga angka morbiditas dan mortalitasnya dapat ditekan.
-
7
Penelitian ini ingin diketahui bagaimana marker prediktor DM
pada
populasi studi kohor FR-PTM.Penelitian ini bertujuan mencari
besarnya
hubungan antara faktor penyakit DMyang tidak dapat diubah yaitu
faktor genetik,
dalam hal ini adalah polimorfisme gen yang berkaitan dengan
kejadian DM,
dengan kejadian penyakit DM. Penelitian ini juga bertujuan
mendapatkan besaran
asosiasi polimorfisme gen-gen tersebut terhadap kejadian
penyakit DM. Untuk itu,
karena DM merupakan penyakit yang sangat dipengaruhi oleh faktor
lingkungan,
seperti gaya hidup berupa aktifitas fisik, pola makan, riwayat
merokok dan minum
alkohol, maka data-data tersebut diperlukan untuk dapat mengukur
besaran
asosiasi pengaruh gen terhadap kejadian DM. Munculnya penyakit
atau faktor
risiko lain yang mempunyai pencetus yang sama juga sangat
berpengaruh
terhadap prediksi kejadian DM, antara lain obesitas, terutama
obesitas sentral,
hipertensi dan dislipidemia.
Studi kohor FR-PTM merupakan studi kohor prospektif untuk
melihat
faktor-faktor risiko PTM (stroke, PJK, DM, hipertensi) berbasis
masyarakat yang
dilakukan di Kota Bogor Tengah dan telah dimulai sejak tahun
2011 dengan
responden yang akan terus diikuti sampai dengan tahun 2019. Data
yang
dikumpulkan berupa demografi, riwayat penyakit, faktor risiko
perilaku,
kebiasaan makan, riwayat penyakit keluarga, pemeriksaan
antropometri, tekanan
darah, elektrokardiografi, saraf, rontgen torak dan laboratorium
(gula darah,
kolesterol total, LDL, HDL dan trigliserida) setiap dua tahun
sekali. Jumlah
responden sebanyak sekitar 5000 responden dibagi menjadi 2 tahap
(baseline data
tahap 1 dimulai tahun 2011 sebanyak 2100 responden dan tahap 2
tahun 2012
sebanyak 2900 responden). Sehingga penelitian ini dibagi dalam 2
tahap
pengambilan sampel, yaitu tahap 1 tahun 2015 yang dihadiri 1173
responden dan
tahap 2 pada tahun 2016 dihadiri oleh 2172 responden.
Hasil uji multinomial regresi logistik pada penelitian Variasi
Marker
Genetik Prediktor DM tahun 2015 menunjukkan bahwa individu
dengan alel
homozigot mutan A/A untuk SNP rs972283 pada gen KLF14 dan
rs3745367
dalam gen RETN (resistin), serta genotipe G/G pada rs5945326
gen
DUSP9/MKP4 memiliki kecenderungan untuk menjadi DM sekitar 2
kali lipat
dibandingkan dengan individu alel homozigot asal.
-
8
BAB III
METODE PENELITIAN
III.1. Kerangka Teori
Keterangan: Karakteristik individu dan gaya hidup akan memicu
faktor risiko
penyakit. Penelitian akan dilakukan dengan memeriksa gen-gen
pemicu dan yang berhubungan dengan DM.
III. 2. Kerangka Konsep
Keterangan: Individu normal dan prediabetes diantaranya
mempunyai genetik
yang rentan terhadap DM, menjadi faktor resiko genetik.
Faktor
risiko lain seperti umur, jenis kelamin, merokok, aktifitas
fisik,
asupan makanan, sosial ekonomi, obesitas, hipertensi dan
dislipidemia, tidak dianalisis dalam penelitian ini karena
sudah
diteliti oleh studi kohor PTM. Namun data penelitian ini
akan
dihubungkan dengan data studi kohor PTM terutama yang
terkait
dengan DM dan data genomik dan marker protein ini akan
Gen KCNQ1, IGF2BP2,
DUSP9/MKP4 Gangguan sekresi insulin
Gen UCP2, KLF14
Karakteristik individu Lifestyle
Jenis kelamin, usia,
TB/BB, Pekerjaan, Genetik Kurang olah raga, pola makan
tinggi kalori dan lemak
Gen RETN, SLC30A8
Obesitas DM
Resistensi insulin
Hipoadiponektinemia
Gen ADIPOQ
Gangguan metabolisme pada
jaringan adiposa
Gen Leptin Pengaturan rasa lapar
Pre-DM
Studi Kohor PTM:
- Identifikasi PTM dan faktor risiko PTM
- Data demografi, riwayat penyakit, pemeriksaan fisik,
EKG, rontgen & laboratorium
Studi Marker Genetik Prediktor
DM PBTDK:
- Pemeriksaan gen petanda DM
- Pemeriksaan protein penanda DM
Normal
DM
Output:
data faktor
risiko PTM
-
9
melengkapi dan memperkaya data studi kohor faktor risiko PTM
Badan Litbangkes.
III.3 Desain dan Jenis Penelitian
Penelitian ini dirancang menggunakan desain potong lintang
non
eksperimental pada responden studi kohor PTM. Penelitian
berbasis laboratorium
biologi molekular.
III.4 Tempat dan Waktu
Pemeriksaan menggunakan bahan biologis tersimpan (BBT) di
Laboratorium Penelitian Penyakit Infeksi (PPI) P3BTDK, Jakarta
yang
merupakan sampel Studi Kohor FR-PTM.
III.5 Populasi dan Sampel
III.5.1. Populasi
Populasi penelitian ini adalah semua responden studi kohor
faktor risiko
PTM (laki-laki dan perempuan umur 25 – 65 tahun).
Penelitian studi kohor PTM telah berjalan sejak tahun 2011
dengan
pengambilan sampel secara 2 tahap. Tahap pertama 2100 responden
(direkrut
tahun 2011, kemudian diikuti kesehatannya dan dilakukan
pemeriksaan
kesehatan pada tahun 2013 dan 2015). Tahap kedua 2900 responden
(direkrut
tahun 2012, kemudian diikuti kesehatannya dan dilakukan
pemeriksaan
kesehatan pada tahun 2014 dan 2016). Namun karena ada beberapa
responden
drop out karena pindah domisili atau menolak dilakukan
pemeriksaan
kesehatan), maka jumlah responden studi kohor PTM yang
dilakukan
pemeriksaan kesehatan pada tahun 2015 berkurang menjadi 1173
responden
dan 2016 sebanyak 2172 responden.
Pemeriksaan marker genetik pada penelitian studi Variasi marker
genetik
prediktor DM (tahap I) diambil dari responden studi kohor PTM
tahap ke-1
tahun 2015 dan Studi Marker Protein Prediktor DM Pada Individu
Dengan Pre-
Diabetes diambil dari responden studi kohor PTM tahap ke-2 tahun
2016.
-
10
III.5.2 Sampel
Responden studi kohor PTM yang menderita diabetes atau pre
diabetes
dan kontrol normal (responden dengan kadar gula darah normal)
yang dipilih
secara acak sesuai presentase jumlah diabetes dan pre
diabetes.
III.5.3. Kriteria Inklusi dan Eksklusi
III.5.3.1. Kriteria Inklusi
Sampel responden studi kohor PTM yang tersimpan.
III.5.3.2. Kriteria Eksklusi
- Sampel rusak/ tidak mencukupi kadar/volumenya
- Tidak tersedia data kesmas (data gula darah/ riwayat DM)
III.5.4 Estimasi Besar Sampel, Cara Pemilihan dan Penarikan
Sampel
Pemeriksaan genotyping pada seluruh sampel DM dan pre DM,
serta
sebagian sampel normal sebagai kontrol, dengan jumlah seimbang.
Karena
berdasarkan pemeriksaan gula darah didapatkan presentase DM
sekitar 10%
dari jumlah populasi dan pre DM sekitar 30%, maka diambil
kontrol normal
sebanyak 40% dari populasi. Sehingga dilakukan pemeriksaan
genotyping pada
seluruh sampel DM dan pre DM, serta 40% dari sampel normal yang
dipilih
secara acak. Total sebanyak 1475 sampel untuk pemeriksaan
polimorfisme
pada gen UCP2 rs660339, DUSP9/MKP4 rs5945326, SLC30A8
rs13266634,
Resistin (RETN) rs3745367, IGF2BP2 rs16860234 dan KCNQ1
rs2237892.
Pemeriksaan protein resistin, insulin, c-peptide dan
adiponektin
dilakukan pada sebagian sampel DM, pre DM dan normal, diambil
secara acak
dengan total sampel 744 plasma.
III.5.5 Variabel
Variabel bebas/independen: individu normal, pre diabetes dan
DM
Variable terikat/dependen:
- Marker genetik, yaitu: adanya SNP pada gen UCP2 rs660339,
DUSP9/MKP4 rs5945326, SLC30A8 rs13266634, Resistin (RETN)
-
11
rs3745367, IGF2BP2 rs16860234, KCNQ1 rs2237892, ADIPOQ
rs6773957 dan KLF14 rs972283.
- Marker protein, yaitu: kadar protein resistin, insulin,
c-peptide dan
adiponektin
III.5.6 Definisi Operasional
Definisi operasional yang digunakan dalam penelitian ini
adalah:
Diabetes
melitus
Kadar glukosa setelah 2 jam beban glukosa >200 mg/dL atau
pernah diagnosis DM
Prediabetes Yang tergolong TGT (Kadar glukosa plasma 2 jam
setelah beban
antara 140 – 199 mg/dL) dan GDPT (Kadar glukosa plasma
puasa antara 100 – 125 mg/dL dan 2 jam beban glukosa
-
12
pemeriksaan kadar protein menggunakan kit elisa dari Sygma,
pembacaan
menggunakan elisa reader dan berbagai bahan habis pakai.
III.7.2. Prosedur kerja
III.7.2.1. Pengambilan sampel
Sampel berupa Bahan Biologi Tersimpan (BBT) dari sampel
studi
kohor FR-PTM yang telah diambil tahun 2016 dan diolah
menjadi
buffycoat, DNA dan plasma, serta telah disimpan di
biorepository
laboratorium penelitian penyakit infeksi Badan Litbangkes.
III. 7.2.2. Pengukuran kadar dan kemurnian DNA
Sampel DNA didapatkan dari biorepository Puslitbang Biomedis
dan
Teknologi Dasar Kesehatan. Masing-masing sampel DNA yang
akan
diperiksa, diambil 2µL untuk diukur konsentrasi dan kemurniannya
dengan
alat kalkulator DNA NanoVue spectrofotometer (GE, USA).
Tahapan
pemeriksaan ini dilakukan sebelum pemeriksaan polimorfisme gen.
Tujuan
pemeriksaan untuk melakukan pengecekan terhadap kemurnian
dan
konsentrasi DNA. Tahapan ini penting untuk melihat kemurnian
DNA
terhadap kontaminan hasil ekstraksi. Selain itu, untuk
mendapatkan hasil
konsentrasi dari DNA untuk menentukan pengenceran terhadap DNA
untuk
pemeriksaan polimorfisme gen.
III.7.2.3. Persiapan Sampel
Sampel yang akan diperiksa harus diencerkan dulu konsentrasi
DNAnya sehingga dalam kisaran 1-10 ng/µl. Pengenceran dilakukan
dengan
menambahkan nuclease free water dan menyamakan konsentrasi
menjadi 5
ng/µl. Sampel yang memiliki konsentrasi DNA rendah (
-
13
III.7.2.4. Pemeriksaan Variasi Genetik (Polimorfisme)
Sebelum dilakukan pemeriksaan sampel dilakukan optimasi
sampel
terlebih dahulu dengan mengambil beberapa sampel untuk
diperiksa. Hal ini
dilakukan untuk menghindari hasil pemeriksaan yang buruk dan
tidak
terbaca.
Pemeriksaan polimorfisme gen-gen yang dituju dilakukan
dengan
menggunakan metode SNP TaqMan genotyping assay (Applied
Biosystem,
USA). Dalam assay tersebut DNA responden akan direaksikan
dengan
sepasang primer yang meliputi titik dimana nukleotida bermutasi,
sepanjang
sekitar 100 basa. Di dalam reaksi SNP genotyping tersebut juga
terkandung
dua (2) tipe probe, dimana keduanya mempunyai ikatan
reporter
fluorochrome yang berbeda dan akan terikat pada target yang
spesifik untuk
masing-masing probe; satu probe akan terikat pada alel asli
(alel wild type)
dan probe lainnya pada alel yang telah bermutasi (alel mutan).
Reaksi SNP
genotyping akan berjalan dalam mesin real time PCR, dengan
menggunakan
enzim DNA polymerase dan suplai dNTPs. Hasil reaksi tersebut
akan
berupa grafik yang akan menunjukkan type gen berdasarkan titik
mutasi
nukleotida yang telah ditentukan untuk masing-masing gen. Sampel
yang
digunakan adalah DNA hasil ekstraksi dengan konsentrasi 5 ng/ul
sehingga
digunakan 10ng tiap reaksi dengan paduan master mix dan SNP
genotyping
assay sesuai instruksi manual dari produk.
Analisa hasil reaksi SNP genotyping assay akan dilakukan
dengan
memanfaatkan perangkat lunak dalam mesin real time PCR
(Applied
Biosystem, USA) dan Taqman Genotyper.
Persiapan bahan
Master mix
Taqman genotyping assay master mix 12,5µl
Taqman genotyping SNP 1,25µl
RT PCR grade water 9,25µl
Sampel
Sampel yang telah diencerkan dengan nuclease free water 2 µl
Total volume persampel 25µl
-
14
Prosedur pemeriksaan :
Masukkan master mix terlebih dahulu 24,8µl ke dalam mikroplate
96
well 0,1 ml, kemudian sampel 0,2µl
Hindari terbentuknya bubble saat memasukkan master mix
maupun
sampel
Atur alat sesuai ketentuan dalam kit
Baca hasil
Gen-gen yang akan diperiksa adalah sebagai berikut:
No. Gen Fungsi
1. ADIPOQ Mengatur produksi hormone adiponektin yang
menginisiasi
pembakaran lemak dan proses penggunaan glukosa yang
berperan pada penurunan lemak dan peningkatan sensitivitas
insulin. Diperkirakan berkaitan dengan resistensi insulin
dan
disfungsi endotel
SNP+1212A>G (rs6773957).
2. KLF14 Master regulator ekspresi gen pada jaringan adipose
rs972283
3. Uncoupling
protein 2
(UCP2) gene
Peran UCP berhubungan degan metabolisme energi dan
obesitas. UCP1 terekspresi di jaringan lemak coklat, UCP2 di
sistem limfe dan pankreas, berkaitan dgn pengaturan sekresi
insulin. UCP3 di otot rangka, berkaitan dgn metabolisme
lipid.
rs660339
4. DUSP9/MKP4 Dual specificity Phosphatase atau
mitogen-activatedprotein
kinase phosphatase-4, berfungsi sebagai negative regulator
pada
pathway insulin-stimulated
rs5945326
5. SLC30A8 Solute carrier family 30 (zinc transporter) member
8,
merupakan gen yang mengkode transporter zink yang
berhubungan dengan sekresi insulin pada manusia
rs13266634
6. Resistin
(RETN)
Mengkode hormon (adipokin) resistin yang dihasilkan jaringan
lemak putih. Resistin menekan diferensiasi adiposit yang
diduga
-
15
berakibat penumpukan ektopik asam lemak dan lipotoksisitas
terhadap jaringan non-adiposit.
SNP+299(G>A) (rs3745367).
7. IGF2BP2 gen ini diduga mengatur fungsi sel beta (IGF2BP2 and
obesity
interaction analysis for type 2 diabetes mellitus in Chinese
Han
population, Wu HH et al. 2014).
Ras Melayu: rs16860234
8. KCNQ1. Mengkode subunit α kanal kalium, yang terutama
terekspresi di
jantung, tetapi juga terekspresi di organ lain seperti
pankreas.
Melayu: rs2283228 dan rs2237892 (C>T)
III.7.2.5. Pemeriksaan Protein
Pemeriksaan protein dilakukan pada plasma responden dengan
pre
diabetes dengan normal dan DM sebagai kontrol. Pemeriksaan
protein
dilakukan dengan metode elisa menggunakan kit komersial dari
Sigma
Aldrich berdasarkan petunjuk dari produsen dan hasil optimasi.
Protein
yang diperiksa: Adiponektin, resistin, c-peptide, insulin.
Petunjuk penyimpanan, isi komponen kit dan pengenceran
buffer
sama pada semua protein. Berikut ini contoh metode pengenceran
buffer
yang diambil dari kit pemeriksaan protein insulin.
Keterangan produk:
Kit ELISA Insulin manusia untuk serum, plasma dan supernatan
sel kultur. Nomor Produk : RAB 0327. Lot No : 0313E0259.
Penyimpanan :
Kit disimpan pada freezer -20ºC. Masa aktif 1 tahun.
Hindarkan
dari pengulangan thawing. Standar harus di simpan pada suhu
-20ºC atau
70ºC (disarankan -70ºC ). Microplate strips atau reagen yang
sudah
terbuka bisa disimpan sampai dengan 1 bulan pada suhu 2-8ºC.
Taruh
kembali wells yang tidak terpakai pada kemasan yang bersih dan
kering
dan tutup rekat sepanjang tepinya.
-
16
Komponen :
1. Human Insulin Antibody-coated ELISA Plate (Item A) –
RAB0327A-
EA; 96wells (12 stripsx8 wells) coated with anti-Human
Insulin.
2. 20x Wash Buffer (Item B) – RAB WASH4
3. Lyophilized Human Insulin Protein Standar (Item C) –
RAB0327C-
1VL
4. Biotinylated Human Insulin DeteC/Tion Antibody (Item F) –
RAB0327D-1VL
5. HRP-Streptavidin (Item G) – RABHRP5
6. ELISA Colorimetric TMB Reagent (HRP Substrate, Item H) –
RABTMB3
7. ELISA Stop Solution (Item l) – RABSTOP3
8. ELISA 1x Assay/Sample Diluent Buffer A (Item D1) –
RABELADA-
30ML
9. ELISA 5x Assay/Sample Diluent Buffer B (Item E1) –
RABELADB-
15ML
Susun peta sampel di mikroplate yang akan digunakan untuk
reaksi.
Sampel dan reagen yang akan digunakan sebaiknya ditempatkan
pada
suhu ruang (18-250C). Letakkan reagen pada es selama persiapan
reagen.
Biarkan plate pada suhu ruang sebelum membuka penutupnya
(Persiapan,
langkah 1).
Pengenceran buffer untuk sampel/cairan assay (Persiapan,
langkah2):
Assay/sampe buffer diluent B (item E1) harus diencerkan 5 kali
dengan
air distillasi sebelum digunakan.
Pengenceran buffer untuk sampel / cairan assay (Persiapan,
langkah 3):
Pengenceran buffer sampel A (item D1) digunakan untuk
pengenceran dari serum atau sampel plasma. Persiapan untuk
dilusi
sampel. Sampel yang akan diuji memiliki konsentrasi yang
berbeda-
beda. Saran pengenceran untuk serum/plasma normal adalah 2 – 10
kali
(Insulin), 20-200 kali (Resistin), dan 20.000 kali
(Adiponektin). Untuk
pemeriksaan protein C-peptide, encerkan sampel dengan buffer
sampel A
dan biotinylated C-peptidesebanyak 4 kali pengenceran dengan
-
17
menambahkan 2,5 µL biotinylated C-peptide yang telah diencerkan
10
kali, 185 µL buffer A dan 62,5 µL sampel.
Keterangan : level protein bisa bervariasi antara sampel yang
berbeda.
Faktor pengenceran optimal dari tiap sampel harus
ditentukan oleh peneliti.
Hasil optimasi pengenceran sampel:
- Protein Insulin: Plasma tidak diencerkan.
- Protein Adiponektin: Pengenceran plasma dilakukan sebanyak
20000
kali. Urutan langkah yang dilakukan adalah: tambahkan 2 µl
plasma
ke dalam tube dengan 398 µl larutan Human Acrp 30 antibody
coated
elisa plate untuk menyiapkan pengenceran sampel sebanyak 200
kali.
Campur perlahan dan ambil 2 µl dari sampel yang sudah
diencerkan
sebanyak 200 kali tersebut. Masukkan juga 198 µl larutan
Human
Acrp 30 antibody coated elisa plate untuk mengencerkan
sampel
menjadi 20000 kali.
- Protein Resistin: Pengenceran plasma dilakukan sebanyak 200
kali.
Urutan langkah yang dilakukan adalah: tambahkan 1 µl plasma
ke
dalam tube antibody coated elisa plate dengan 198 µl larutan
buffer A
untuk menyiapkan pengenceran sampel sebanyak 200 kali.
- Protein C-peptide: Plasma tidak diencerkan. Sebanyak 62,5 µL
sampel
plasma ditambahkan 2,5 µL biotinylated C-peptide yang telah
diencerkan 10 kali dan 185 µL Buffer A.
Pengenceran masing- masing reagen yang akan digunakan, yaitu
Wash buffer,Enzyme conjugate, Biotnylated DeteC/Tion Antibody,
dan
HRP- Streptavidin concentrate.
Penyiapan bahan standar (Persiapan, langkah 4):
Lakukan pemutaran (sentrifugasi) sebanyak satu buah vial item
C,
tambahkan 400µl cairan assay A (untuk sampel serum/plasma) atau
1x
cairan assay B (untuk supernatan sel kultur) ke dalam vial item
C untuk
membuat 1400 µlU/ml standar. Larutkan bubuk seluruhnya dan
lakukan
pencampuran secara lembut. Tambahkan 150 µl standar insulin
(1400
µlU/ml) dari vial item C, ke dalam tabung dengan 550 µl cairan
assay A
-
18
atau 1x cairan assay B untuk mempersiapkan larutan standar.
Pipet
sebanyak 300 µl cairan assay A atau 1x cairan assay B ke dalam
tiap
tabung. Gunakan larutan standar sebanyak 300 µl untuk
memproduksi
seri pengenceran/larutan (seperti pada gambar. Campur setiap
tube
keseluruhan sebelum berpindah. Cairan assay A atau 1x cairan
assay B
bertindak sebagai standar nol (0 µlU/ml).
Persiapan deteksi antibody Biotinylates (Persiapan, langkah 5)
:
Lakukan pemutaran vial deteksi antibodi (ITEMF) sebelum
digunakan. Tambahkan 100 µl fari 1x cairan buffer B (Item E1) ke
dalam
vial untu persiapan cairan konsentrat deteksi antibodi. Pipet
dengan
menarik dan lepas untuk mencampur secara lembut (konsentrat
dapat di
simpan pada suhu 4ºC selama 5 hari). Konsentrat deteksi antibodi
harus
diencerkan 80 kali dengan 1x cairan Buffer B (Item E1) dan
digunakan
pada prosedur, langkah 4.
Pengenceran HRP-Streptavidin konsentrat (persiapan, langkah 6)
:
Lakukan pemutaran vial konsentrat HRP-Streptavidin dan
campur
secara lembut menggunakan pipet sebelum digunakan, karena
lapisan
endapan bisa terbentuk saat penyimpanan. Konsentrat
HRP-Streptavidin
harus diencerkan 500 kali dengan 1x cairan buffer B (item
E1).
Sebagai contoh : lakukan pemutaran vial (Item G) dan campur
dengan pipet secara lembut. Tambahkan 30 µl konsentrat HRP-
Streptavidin ke dalam tabung dengan 15 ml 1x cairan Assay B
untuk
mempersiapkan pengenceran sebanyak 500 kali larutan HRP-
-
19
Streptavidin (jangan menyimpan larutan untuk digunakan
keseokan
harinya). Campurlah dengan merata.
Prosedur Kerja:
1. Susun peta sampel pada masing- masing mikroplate
2. Pipet sebanyak 25 μL dari insulin standar, kontrol, dan sera
dalam
masing- masing well
3. Tambahkan 100 μL dari “ Working Insulin Enzyme Conjugate”
1X
pada masing- masing well
4. Di canpurkan selama 10 detik
5. Inkubasi selama 60 menit pada suhu ruang (18-260C).
6. Buang cairan dari semua well dan cuci sebanyak 3 kali
dengan
300μL dengan menggunakan 1x Wash Buffer.
7. Tambahkan 100 μL TMB Substrat pada masing- masing well
8. Inkubasi selama 15 Menit pada suhu ruang
9. Tambahkan 50 μL “Stop Solution” pada masing- masing well
dan
dihomogenkan
10. Baca Absorban di Elisa Reader pada panjang gelombang 450
nm.
Typical Data
Sensitifitas :
Minimun dosis untuk deteksi human insulin yang ditentukan
adalah
4 µlU/ml.
Dosis minimum yang dapat di deteksi didefinisikan sebagai
konsentrasi analit yang menghasilkan absorbansi yaitu 2 standar
deviasi
yang lebih tinggi dari pada blanko (cairan buffer).
-
20
Recovery (perbaikan) :
Perbaikan ditentukan dengan mengacu pada level dari human
insulin yang bervariasi pada type sampel seperti pada daftar
berikut.
Rata-rata perbaikan sebagai berikut :
Linearitas
Spesifisitas :
Kit ELISA ini tidak menunjukan reaktifitas silang dengan
cytokine
yang sudah diuji yaitu : Human BDNF, BLC, ENA-78, IL-1 alpha,
IL-1
beta, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12p70,
IL-
12p40,IL13,IL-15, I-309, IP-10, G-CSF, GM-CSF, IFN-gamma,
Leptin
(OB), MCP-1, MCP-2, MCP-3, MDC, MIP-1 alpha, MIP-1 beta,
MIP-1
delta, PARC, PDGF, RANTES, SCF, TARC, TGF-beta, TIMP-1, TNF-
alpha, TNF-beta, TPO, VEGF.
III.8. Manajemen dan Analisis Data
Data identitas, demografi dan riwayat penyakit serta hasil
pemeriksaan
laboratorium akan didapatkan dari studi kohor PTM. Analisa data
akan dilakukan
dengan mengunakan perangkat lunak SPSS dan Taqman Genotyper.
Analisis
Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) dan odds ratio menggunakan
software
online dari www.oege.org. Tingkat kemaknaan () ditentukan pada
nilai
probabilitas (p) kurang dari 5%.
http://www.oege.org/
-
21
III.9. Pertimbangan Etik Penelitian
Data sosiodemografi dan spesimen darah diperoleh dari data dan
spesimen
responden studi Kohor PTM, Badan Litbangkes. Dalam studi Kohor
PTM,
responden telah dimintakan persetujuan setelah penjelasan dan di
dalamnya telah
menyebutkan kesedeiaan diambil darah dan dilakukan pemeriksaan
faktor risiko
genomik PTM, termasuk DM.
Persetujuan etik didapatkan dari Komisi Etik Penelitian
Kesehatan Badan
Litbangkes No. LB.02.01/2/KE.235/2017tanggal 19 Juni 2017.
III.10. Pertimbangan Izin Penelitian
Tidak memerlukan izin penelitian khusus karena merupakan
penelitian
laboratorium dan dikerjakan di laboratorium PPI, P3BTDK dengan
sampel studi
Kohor PTM tahun 2016.
-
22
BAB IV
HASIL PENELITIAN
Spesimen darah yang diterima dari Studi kohort faktor risiko PTM
sebanyak
2173 dan diproses menjadi plasma dan buffycoat. Spesimen
buffycoat yang
terkumpul dilakukan ekstraksi DNA untuk dilakukan tahap
pemeriksaan
selanjutnya. DNA dan buffycoat disimpan di repository Puslitbang
Biomedis dan
Teknologi Dasar Kesehatan. Penelitian ini dilakukan terhadap
spesimen tersimpan
dari responden yang menderita DM, pre DM dan sampel normal
sebagai kontrol.
Pemeriksaan genotyping dilakukan pada seluruh responden dengan
DM, pre
DM dan sebagian responden dengan gula darah normal yang dipilih
secara acak,
sehingga berjumlah 1475 sampel. Namun tidak seluruh sampel
menampilkan hasil
genotyping, sehingga jumlah data yang dianalisis pada tiap gen
berbeda-beda.
Jumlah sampel DM sebanyak 199, pre DM 633 dan normal sebanyak
643 sampel.
Pemeriksaan protein resistin, insulin, c-peptide dan adiponektin
dilakukan pada
sampel DM, pre DM dan kontrol normal dengan jumlah sampel DM
sebanyak 88,
pre DM 280 dan normal sebanyak 376 sampel, total sampel 744
plasma.
Hasil Ekstraksi DNA
Nilai rerata konsentrasi DNA hasil ekstraksi adalah 213 ng/ul
dan
kemurniannya 1,85. Hasil konsentrasi ini dijadikan rujukan untuk
melakukan
pengenceran hingga 10 ng/ul untuk melakukan pemeriksaan SNP
genotyping.
Nilai konsentrasi dan kemurnian tertuang dalam Lampiran 1.
Polimorfisme Gen UCP2 rs660339
Gen UCP2, yaitu salah satu gen yang berperan dalam metabolisme
energi
dan terjadinya obesitas. UCP2 terekspresi di sistem limfe dan
pankreas, berkaitan
dengan pengaturan sekresi insulin. Dijumpai polimorfisme G>A
pada rs660339.
-
23
Gambar 1. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada gen UCP2
rs660339 pada responden DM,
Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor tahun 2016.
Gambar 1 menyajikan distribusi alel homozygot wildtype dan mutan
serta
heterozygot pada rs660339 gen UCP2 pada kasus DM. Proporsi
genotipe Gen
UCP2 dengan polimorfisme G>A pada responden DM terbesar
adalah A/G
45,50%, dikuti G/G 36%, lalu A/A (mutan) 18,5%. Frequensi alel A
adalah 41,3%
dan G 58,7%. Tidak ada perbedaan bermakna antara ketiga genotipe
dengan p
value 0,413.
Gambar 2. Distribusi alel a/a, a/g dan g/g pada gen ucp2
rs660339 pada responden normal,
Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor, 2016.
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
-
24
Gambar 2 menyajikan distribusi alel homozygot wildtype dan mutan
serta
heterozygot pada rs660339 gen UCP2 pada populasi normal.
Terlihat proporsi
genotipe A/A paling sedikit, sebanyak 19%, G/G33,5% dan
heterozygot A/G
paling banyak pada kelompok normal, yaitu sebesar 47,5%.
Frekuensi alel A
42,8% dan alel G 57,2%. Tidak ada perbedaan bermakna antara
ketiga genotipe
dengan p value sebesar 0,449.
Gambar 3. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada gen UCP2
rs660339 pada responden
dengan pre DM, Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor,
2016.
Gambar 3 menyajikan distribusi alel homozygot wild dan mutan
serta
heterozygot pada rs660339 gen UCP2 pada populasi pre DM.
Proporsi homozygot
A/A paling sedikit sebesar 14,3%, heterozygot A/G 38,8%,
sedangkan homozygot
G/G terbesar, yaitu 46,9%. Frekuensi alel A 33,7% dan G 66,3%.
Nilai p value
0,008, menunjukkan terdapat perbedaan bermakna antara ketiga
kelompok alel
tersebut pada kelompok pre DM.
Polimorfisme Gen KCNQ1 rs2237892
Gen KCNQ1 yang diduga mengatur fungsi sel beta pankreas
mempengaruhi
produksi insulin. Dijumpai polimorfisme C>T pada rs2237892.
Frekuensi
polimorfisme pada gen KCNQ1 rs2237892 pada kelompok DM disajikan
dalam
Gambar 4.
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
-
25
Gambar 4. Distribusi alel T/T, C/T dan C/C pada gen KCNQ1
rs2237892 pada responden
DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Tampak dalam Gambar 4 frekuensi homozygot T/T paling sedikit,
yaitu
10,1%, diikuti heterozygot C/T 32,3% dan yang paling banyak
adalah homozygot
C/C (wildtype) pada kelompok DM, lebih dari separuh populasi
yaitu 57,6%.
Frekuensi alel C 73,7% dan T 26,3%. Dengan nilai p sebesar 0,036
menunjukkan
terdapat perbedaan bermakna proporsi genotipe pada kelompok
DM.
Gambar 5. Distribusi alel T/T, C/T dan C/C pada gen KCNQ1
rs2237892 pada responden
normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun
2016.
Keterangan:
Biru : T/T
Hijau : C/T
Merah : C/C
Keterangan:
Biru : T/T
Hijau : C/T
Merah : C/C
-
26
Gambar 5 menyajikan distribusi alel homozygot wild dan mutan
serta
heterozygot pada rs2237892 Gen KCNQ1 pada responden normal.
Terlihat
proporsi homozygot mutan T/T paling sedikit yaitu 15,6%, diikuti
C/C 37,3% dan
heterozygot C/T paling banyak pada kelompok normal, yaitu 47,1%.
Frekuensi
alel C 60,8% dan T 39,2%. Nilai p sebesar 0,6 menunjukkan tidak
ada perbedaan
bermakna proporsi ketiga genotipe pada kelompok normal.
Gambar 6 menyajikan distribusi alel homozygot wild dan mutan
serta
heterozygot pada rs2237892 Gen KCNQ1 pada reponden dengan pre
DM.
Terlihat proporsi homozygot mutan T/T paling sedikit, yaitu
16,3%, diikuti C/T
sebesar 32,4% dan homozygot C/C paling banyak pada kelompok pre
DM, yaitu
51,3%. Frekuensi alel C 67,5% dan T 32,5%. Nilai p pada kelompok
ini sebesar
0,0 menunjukkan terdapat perbedaan bermakna antara ketiga
genotipe.
Gambar 6. Distribusi alel T/T, C/T dan C/C pada gen KCNQ1
rs2237892 pada responden
dengan pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun
2016.
Polimorfisme Gen RETN rs3745367
Gen RETN, yaitu gen yang mengkode resistin, suatu sitokin atau
faktor
sekretorik yang spesifik dihasilkan jaringan adiposa. Resistin
diduga berperan
pada timbulnya obesitas dan diabetes melitus tipe 2. Dijumpai
polimorfisme G>A
pada rs3745367. Frekuensi polimorfisme gen RETN rs3745367 pada
penderita
DM disajikan dalam Gambar 7.
Keterangan:
Biru : T/T
Hijau : C/T
Merah : C/C
-
27
Gambar 7. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen RETN
rs3745367 pada responden
DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Apabila dilihat proporsinya pada penderita DM, maka terlihat
frekuensi
terbesar penderita DM pada studi ini adalah mempunyai genotipe
A/G, yaitu
47,2%, diikuti G/G sebesar 40,7% dan terkecil genotipe A/A,
yaitu 12,1%.
Frekuansi alel A pada kelompok DM sebesar 35,7% dan G 64,3%.
Nilai p sebesar
0,681. Tidak terdapat perbedaan bermakna antara ketiga genotipe
pada kelompok
DM. Sedangkan pada kelompok normal dan pre DM ditampilkan pada
Gambar 8
dan 9.
Gambar 8. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen RETN
rs3745367 pada responden
normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun
2016.
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
-
28
Gambar 8 menunjukkan proporsi terbesar pasangan alel pada Gen
RETN
rs3745367 pada responden normal adalah heterozygot A/G yaitu
sebesar 55%,
sekitar separuh responden normal. Diikuti genotipe homozygot G/G
sebesar
38,2% dan A/A terkecil yaitu 6,8%. Terdapat perbedaan bermakna
antara ketiga
genotipe pada kelompok normal, dengan nilai p 0,0. Frekuensi
alel A pada
kelompok normal sebesar 34,3% dan G sebesar 65,7%. Gambar 9
menyajikan
distribusi alel pada responden pre DM.
Gambar 9 menunjukkan proporsi terbesar pada kelompok pre DM
adalah
heterozygot A/G, yaitu hampir separuh dari responden 54,5%.
Diikuti G/G
sebesar 35,3% dan A/A 10,3%. Gambaran ini hampir sama dengan
kelompok
normal, namun terdapat pola kecenderungan proporsi genotipe A/A
semakin kecil
pada kelompok normal dan paling besar pada kelompok DM.
Frekuensi alel A
37,5% dan G 62,5%. Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat
perbedaanyang bermakna
antara ketiga genotipe pada responden pre DM.
Gambar 9. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen RETN
rs3745367 pada responden
dengan pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun
2016.
Polimorfisme gen DUSP9/MKP4 rs5945326
Salah satu gen yang berperan sebagai regulator negatif pada
jalur stimulasi
penghasil insulin, yaitu gen DUSP9/MKP4. Terdapat polimorfisme
A>G pada
rs5945326. Frekuensi pasangan alel pada rs5945326 gen DUSP9/MKP4
pada
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
-
29
kelompok DM disajikan dalam Gambar 10. Sedangkan pada kelompok
normal
disajikan dalam Gambar 11.
Gambar 10. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen DUSP9/MKP4
rs5945326 pada
responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun
2016.
Pada Gambar 10 terlihat proporsi terbesar pada kelompok DM
adalah
genotipeG/G yaitu 48,7% hampir separuh responden. Diikuti A/A
37% dan A/G
14,3%. Frekuensi alel A 44,2% dan G 55,8%. Nilai p sebesar 0,0
menunjukkan
terdapat perbedaan bermakna antara kelompok genotipe pada
responden DM.
Gambar 11. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen DUSP9/MKP4
rs5945326 pada
responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor
tahun 2016.
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
-
30
Gambar 11 menyajikan distribusi alel pada Gen DUSP9/MKP4
rs5945326
pada responden normal. Proporsi terbesar adalah genotipe G/G,
yaitu 57,7% lebih
dari separuh responden. Diikuti A/G 33% dan A/A 29%. Nilai p 0,0
menunjukkan
terdapat perbedaan bermakna pada ketiga genotipe ini pada
responden normal.
Frekuensi alel A 35,6% dan G 64,4%.
Gambar 12. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen DUSP9/MKP4
rs5945326 pada
responden pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor
tahun 2016.
Gambar 12 menyajikan distribusi genotipe DUSP9/MKP4 rs5945326
pada
responden pre DM. Terlihat proporsi terbesar adalah genotipe
G/G, yaitu 53,1%
lebih dari separuh responden. Diikuti A/A 30,2% dan A/G 16,8%.
Nilai p 0,0
menunjukkan terdapat perbedaan bermakna pada ketiga genotipe ini
pada
responden pre DM. Frekuensi alel A 38,5% dan G 61,5%.
Polimorfisme Gen SLC30A8 rs13266634
Gen SLC30A8, yaitu transporter ion seng (Zn) yanng merupakan
solute
carrier family 30 member 8, merupakan gen yang mengkode
transporter Zn yang
berhubungan dengan sekresi insulin pada manusia. Dijumpai
polimorfisme C>T
pada rs13266634. Distribusi genotipe gen SLC30A8 rs13266634 pada
kelompok
DM disajikan dalam Gambar 13, sedangkan pada kelompok normal
disajikan
dalam Gambar 14. Terlihat genotipe terbesar pada kelompok DM
adalah C/T,
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
-
31
yaitu 40,7%. Diikuti C/C 31,9% dan T/T 27,4%. Nilai p 0,03
menunjukkan
terdapat perbedaan bermakna pada ketiga genotipe ini pada
responden DM.
Frekuensi alel C 52,2% dan T 47,8%.
Gambar 13. Distribusi genotipeC/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8
rs13266634 pada
responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun
2016.
Terlihat pada Gambar 14 bahwa genotipe terbesar pada kelompok
normal
pada gen SLC30A8 rs13266634 adalah C/C, yaitu 37,6%. Diikuti C/T
33,7% dan
T/T 28,7%. Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat perbedaan bermakna
antara ketiga
genotipe ini pada responden normal. Frekuensi alel C 54,5% dan T
45,5%.
Gambar 14. Distribusi alel C/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8
rs13266634 pada
responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor
tahun 2016.
Keterangan:
Biru : T/T
Hijau : C/T
Merah : C/C
Keterangan:
Biru : T/T
Hijau : C/T
Merah : C/C
-
32
Gambar 15 menyajikan variasi genotipe SLC30A8 rs13266634
pada
kelompok responden dengan pre DM. Terlihat bahwa genotipe
terbanyak pada
kelompok pre DM adalah C/C, yaitu 39,2%. Diikuti C/T 36,8% dan
T/T 24,1%.
Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat perbedaan bermakna pada ketiga
kelompok
genotipe ini pada responden pre DM. Frekuensi alel C 57,5% dan T
42,5%.
Gambar 15. Distribusi alel C/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8
rs13266634 pada
responden pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor
tahun 2016.
Polimorfisme Gen IGF2BP2 rs16860234
Gen IGF2BP2 yang diduga mengatur fungsi sel beta pankreas
mempengaruhi produksi insulin. Dijumpai polimorfisme A>C pada
rs16860234.
Distribusi genotipe pada gen IGF2BP2 rs16860234 disajikan dalam
Gambar 16
untuk kelompok DM, Gambar 17 pada kelompok normal dan Gambar 18
pada
kelompok pre DM.
Keterangan:
Biru : T/T
Hijau : C/T
Merah : C/C
-
33
Gambar 16. Distribusi genotipe A/A, A/C dan C/C pada Gen IGF2BP2
rs16860234 pada
responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun
2016.
Gambar 16 menyajikan variasi gen IGF2BP2 rs16860234 pada
kelompok
responden dengan DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada
kelompok DM
adalah A/C, yaitu 47,6%. Diikuti A/A 41,9% dan C/C 10,5%. Nilai
p 0,429
menunjukkan tidak terdapat perbedaan bermakna pada ketiga
kelompok genotipe
ini pada responden DM. Frekuensi alel A 65,7% dan C34,4%.
Gambar 17. Distribusi genotipe A/A, A/C dan C/C pada Gen IGF2BP2
rs16860234 pada
responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor
tahun 2016
Keterangan:
Biru : C/C
Hijau : AC
Merah : A/A
Keterangan:
Biru : C/C
Hijau : AC
Merah : A/A
-
34
Gambar 17 menyajikan variasi genotipe IGF2BP2 rs16860234pada
kelompok responden normal. Terlihat bahwa genotipe terbanyak
pada kelompok
normal adalah A/C, yaitu 49,7%. Diikuti A/A 44,2% dan C/C 6,1%.
Nilai p 0,449
menunjukkan tidak terdapat perbedaan bermakna pada ketiga
kelompok genotipe
ini pada responden DM. Frekuensi alel A 69,0% dan C 31,0%.
Gambar 18. Distribusi genotipe A/A, A/C dan C/C pada Gen IGF2BP2
rs16860234 pada
responden pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor
tahun 2016.
Gambar 18 menyajikan variasi genotipe IGF2BP2 rs16860234pada
kelompok responden dengan pre DM. Terlihat bahwa genotipe
terbanyak pada
kelompok pre DM adalah A/C, yaitu 38,9%. Diikuti A/A 52,4% dan
C/C 8,6%.
Nilai p 0,430 menunjukkan tidak terdapat perbedaan bermakna pada
ketiga
kelompok genotipe ini pada responden pre DM. Frekuensi alel A
71,9% dan C
28,1%.
Polimorfisme Gen KLF14 rs972283
Gen KLF14, yaitu salah satu gen yang berperan sebagai master
regulator
ekspresi gen pada jaringan adipose pada rs972283 dijumpai
polimorfisme A>G.
distribusi genotipe pada gen KLF14 rs972283 di kelompok
responden dengan DM
disajikan dalam Gambar 19.
Keterangan:
Biru : C/C
Hijau : AC
Merah : A/A
-
35
Gambar 19. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden DM,
studi kohor faktor
risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Gambar 19 menyajikan variasi genotipe KLF14 rs972283 pada
kelompok
responden DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok DM
adalah
A/G, yaitu 43,2%, hampir separuh responden DM. Diikuti G/G37,9%
dan
A/A18,9%. Nilai p 0,136 menunjukkan tidak terdapat perbedaan
bermakna pada
ketiga kelompok genotipe ini pada responden DM. Frekuensi alel A
40,5% dan
G59,5%.
Gambar 20. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden
normal, studi kohor faktor
risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
-
36
Gambar 20 menyajikan variasi genotipe KLF14 rs972283 pada
kelompok
responden normal. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada
kelompok normal
adalah A/G, yaitu 53,3%, lebih dari separuh responden normal.
Diikuti G/G
35,9% dan A/A 10,6%. Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat perbedaan
bermakna
pada ketiga kelompok genotipe ini pada responden normal.
Frekuensi alel A
37,4% dan G 62,6%.
Gambar 21 menyajikan variasi genotipe KLF14 rs972283 pada
kelompok
responden dengan pre DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada
kelompok pre
DM adalah G/G, yaitu 65,1%. Diikuti A/G 20,6% dan A/A14,3%.
Nilai p 0,0
menunjukkan terdapat perbedaan bermakna pada ketiga kelompok
genotipe ini
pada responden pre DM. Frekuensi alel A 24,6% dan G75,4%.
Gambar 21. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden pre
DM, studi kohor
faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Polimorfisme Gen ADIPOQ rs6773957
Gen ADIPOQ, mengatur produksi hormon adiponektin yang
menginisiasi
pembakaran lemak dan proses penggunaan glukosa yang berperan
pada penurunan
lemak dan peningkatan sensitivitas insulin. Diperkirakan
berkaitan dengan
resistensi insulin dan disfungsi endotel. Dijumpai polimorfisme
A>G pada
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
-
37
rs6773957. Distribusi genotipe pada gen ADIPOQ rs6773957
disajikan dalam
Gambar 22 untuk responden DM, Gambar 23 untuk responden normal
dan
Gambar 24 untuk responden pre DM.
Gambar 22. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada
responden DM, studi kohor
faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Gambar 22 menyajikan variasi genotipe ADIPOQ rs6773957 pada
kelompok responden DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada
kelompok DM
adalah A/A, yaitu 38,4%. Diikuti A/G 33,8% dan A/A 27,8%. Nilai
p 0,0
menunjukkan terdapat perbedaan bermakna pada ketiga kelompok
genotipe ini
pada responden DM. Frekuensi alel A 55,3% dan G 44,7%.
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
-
38
Gambar 23. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada
responden normal, studi
kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Gambar 23 menyajikan variasi genotipe ADIPOQ rs6773957 pada
kelompok responden normal. Terlihat bahwa genotipe terbanyak
pada kelompok
normal adalah A/A, yaitu 56,3%, lebih dari separuh responden
normal. Diikuti
A/G 25,4% dan G/G18,3%. Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat
perbedaan
bermakna pada ketiga kelompok genotipe ini pada responden
normal. Frekuensi
alel A 69% dan G 31%.
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
-
39
Gambar 24. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada
responden pre DM, studi
kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Gambar 24 menyajikan variasi genotipe ADIPOQ rs6773957pada
kelompok
responden dengan pre DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada
kelompok pre
DM adalah A/A, yaitu 56%. Diikuti A/G 28,3% dan G/G15,7%. Nilai
p 0,0
menunjukkan terdapat perbedaan bermakna pada ketiga kelompok
genotipe ini
pada responden pre DM. Frekuensi alel A 70,2% dan G 29,8%.
Analisis Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) dan Odds Ratio
Analisis Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) dan odds ratio
menggunakan
software online dari www.oege.org. Seluruh gen yang diperiksa
pada populasi
Studi Kohor Faktor Risiko PTM tidak dalam kesetimbangan HWE.
Dimana nilai
p pada rs660339 dan rs16860234 sebesar 0,001-0,005; pada
rs2237892,
rs3745367, rs5945326, rs6773957, rs972283 dan rs13266634 p
-
40
Tabel 1. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre
DM pada gen UCP2
rs660339.
Test Odds Ratio 95% CI Chi sq p TestOdds
Ratio95% CI Chi sq p Test
Odds
Ratio95% CI Chi sq p
Het vs
Common
Hz
0,88 0,62-1,25 0,49 >0,05
Het vs
Common
Hz
0,58 0,46-0,74 18,65 0,05
Rare Hz vs
Het0,95 0,71-1,28 0,10 >0,05
Rare Hz vs
Common
Hz
0,91 0,58-1,42 0,19 >0,05
Rare Hz vs
Common
Hz
0,54 0,39-0,75 13,78
-
41
Tabel 3. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre
DM pada gen RETN rs3745367.
Test Odds Ratio 95% CI Chi sq p TestOdds
Ratio95% CI Chi sq p Test
Odds
Ratio95% CI Chi sq p
Het vs
Common
Hz
0,80 0,58-1,12 1,64 >0,05
Het vs
Common
Hz
1,07 0,84-1,36 0,29 >0,05
Het vs
Common
Hz
0,99 0,79-1,23 0,01 >0,05
Rare Hz vs
Het2,07 1,21-3,54 7,37 0,005-0,01
Rare Hz vs
Het1,54 1,02-2,32 4,25 0,01-0,05
Rare Hz vs
Het1,67 1,14-2,44 7,13 0,005-0,01
Rare Hz vs
Common
Hz
1,67 0,97-2,87 3,44 >0,05
Rare Hz vs
Common
Hz
1,64 1,07-2,51 5,30 0,01-0,05
Rare Hz vs
Common
Hz
1,65 1,12-2,44 6,40 0,01-0,05
Normal vs DM SNP374 Normal vs PreDM SNP374 Normal vs (PreDM+DM)
SNP374
Hasil analisis OR gen DUSP9/MKP4 rs5945326 menunjukkan
genotipe
mutan G/G berisiko 1,5x lebih besar daripada genotipe A/A untuk
menjadi DM,
dengan p yang bermakna. Hal ini disajikan dalam Tabel 4.
Tabel 4. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre
DM pada gen
DUSP9/MKP4 rs5945326.
Test Odds Ratio 95% CI Chi sq p TestOdds
Ratio95% CI Chi sq p Test
Odds
Ratio95% CI Chi sq p
Het vs
Common
Hz
1,25 0,78-2,01 0,87 >0,05
Het vs
Common
Hz
1,37 0,99-1,9 3,72 >0,05
Het vs
Common
Hz
1,34 0,99-1,81 3,69 >0,05
Rare Hz vs
Het1,21 0,74-1,99 0,58 >0,05
Rare Hz vs
Het0,82 0,58-1,17 1,17 >0,05
Rare Hz vs
Het0,92 0,66-1,27 0,27 >0,05
Rare Hz vs
Common
Hz
1,52 1,08-2,14 5,73 0,01-0,05
Rare Hz vs
Common
Hz
1,13 0,88-1,46 0,91 >0,05
Rare Hz vs
Common
Hz
1,23 0,98-1,55 3,13 >0,05
Normal vs DM SNP594 Normal vs PreDM SNP594 Normal vs (PreDM+DM)
SNP594
Hasil analisis OR genotipeSLC30A8 rs13266634terhadap kejadian
DM
maupun pre DM menunjukkan tidak ada yang bermakna, dengan nilai
p >0,05 dan
95%CI melewati angka 1. Hal ini disajikan dalam Tabel 5.
Tabel 5. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre
DM pada gen SLC30A8
rs13266634.
Test Odds Ratio 95% CI Chi sq p TestOdds
Ratio95% CI Chi sq p Test
Odds
Ratio95% CI Chi sq p
Het vs
Common
Hz
1,44 0,99-2,08 3,72 >0,05
Het vs
Common
Hz
1,05 0,81-1,37 0,15 >0,05
Het vs
Common