Lapak Ekstraksi

LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM FITOKIMIA

EKSTRAKSI METABOLIT SEKUNDER DARI

SIMPLISISA TUMBUHAN OBAT

(Rhei Radix)

Disusun oleh :

Tatu Ratna Sari 260110090065

Sarah Zielda Najib 260110090066

Talitha Nurul Bulan 260110090067

M. Garda Pakerti 260110090069

Rahajeng H.R.S 260110090070

Ita Puspitasari 260110090071

Ilham Jumadil Putra 260110090072

Nia Ari Pratiwi 260110090073

LABORATORIUM FITOKIMIA

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2011

EKSTRAKSI METABOLIT SEKUNDER DARI

SIMPLISIA TUMBUHAN OBAT

(Rhei Radix)

I. TUJUAN

1. Melakukan penyarian metabolit sekunder dari simplisia Rhei radix menggunakan

metode ekstraksi dengan alat soxhlet.

2. Mengetahui kualitas ekstrak dilihat dari sifat fisik dan kandungan kimianya

(pemeriksaan parameter ekstrak).

II. PRINSIP

1. Ekstraksi

Metode penarikan suatu senyawa dari bahan mentah atau setengah murni

dengan perlakuan menggunakan pelarut yang sesuai. Dalam hal ini ekstraksi

simplisia tumbuhan obat dilakukan dengan metode ekstraksi yaitu soxhlet.

Like Dissolve Like

” Suatu senyawa cenderung mudah larut dalam pelarut yang memiliki

kepolaran yang relatif sama ”

2. Bobot Jenis

Perbandingan kerapatan zat terhadap kerapatan air.

3. Dinamolisis

III. TEORI

I. TINJAUAN BOTANI

Rheum officinale

Divisi : Spermatophyta

Su divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledonae

Bangsa : Polygonales

Suku : Polygonaceae

Marga : Rheum

Jenis : Rheum officinale Baill

Sinonim (Syn): Rhubarb

Nama umum : Kelembak

Nama daerah : Kelembak (Melayu), Kaiemba (Sunda), Kalembak (JawaTengah)

Kelembak (Madura) (Bambang, 2009).

Kalembak ini biasanya hidup (habitat) di daerah semak tahunan sedang

berasal dari China,Tibet ,tingginya dapat mencapai 25-28cm. Tergolong jenis

terna, yaitu perdu /pohon dengan daun tersebar dan selaput bumbung yang

membalut batang. Bentuk batang dari tanaman ini terlihat pendek,beralur

melintang dan tertanam dalam tanah, juga berbentuk masif dan berwarna coklat.

Batangnya biasanya berasa pahit. Daun dari kalembak ini berjenis daun

tunggal,bentuknya bulat telur tapi pada pangkalnya berbentuk jantung, daun ini

diselimuti bulu-bulu halus, ujung daun berbentuk runcing dan tepi daun

bergigi/utuh(rata). Rata-rata tanaman ini beranting 10-40 cm, tangkai daunnya juga

terlihat memeluk batang, panjang daunnya sendiri sekitar 10-35cm, dan lebarnya 8-

30cm,tentunya warna daun ini tidak berbeda dari tanaman lain. Bagian atas tanah

terdiri dari daun-daun bertangkai yang keluar dari rimpangnya, tunas pendukung

juga keluar dari rimpang tersebut. Dilihat dari sisi bunganya , tanaman ini dapat

tergolong hermaprodit / kelamin ganda/banci tapi juga ada yang hanya berkelamin

satu, aktinomorf. Bunga berwarna putih kehijauan/ putih kemerahan itu bergabung

menjadi satu malai bercabang. Bunganya memiliki tenda bunga, mahkotanya terdiri

dari 6 helai yang tersusun dalan lingkaran, bunga ini memiliki 9 benang sari,tangkai

putik yang melengkung, kepala putik yang tebal, dan bakal buahnyA dikelilingi

cakram, mempunyai 2-3 tangkai putik, beruang 1 dengan bakal biji pada dasar yang

dapat atrop /anatrop. Buahnya mirip padi tapi sedikit bulat telur,punya 3 sayap dan

berwarna merah. Buahnya keras, pipih, bersegi 3 sering dibalut oleh tenda bunga/

sisa-sisa hiasan bunga. Bijinya memounyai endosperm tanpa perisperm. Sedang

mengenai akarnya, tergolong tunggang, lunak,berbentuk

bulat, dan berwarana coklat muda, tumbuh menyebar. Tumbuhan ini terkenal

dengan rimpang serta akarnya, yang bernama Rhei Radix (Bambang, 2009).

Anatomi

Dari tampak makroskopiknya potongan akar terlihat padat, keras,berat,

bentuknya hampir silindrik, serupa kerucut atau bentuk kubus cekung, pipih, dan

tidak beraturan. Kadang berlubang, panjangnya 5cm sampai 15cm, lebar 3 cm-10

cm, permukaan yang terkupas agak bersudut,umumnya diliputi serbuk berwarna

kuning kecoklatan terang, bagian dalam berwarna putih keabuan dengan garisgaris

coklat kemerahan. Pada penampang melintang akar tampak jaringan gabus,

berdinding tipis, bentuk segi 4 memanjang , letaknya teratur. Sel parenkim korteks

berdinding tipis,berisi butir pati, bentuknya bundar atau setengah bundar

mempunyai hilus, tunggal/berkelompok ,juga terdapat kristal kalsium oksalatbentuk

ronset besar dan tersebar.

Floemnya terdiri dari sel parenkim floem dan lebih kecil dari sel parenkim korteks,

jari-jari empulur terdiri dari 1-2 lapis sel.

Bagian endodermisnya terdiri dari 1 sampai beberapalapis sel berdinding tipis,

pada parenkim floem juga terdapat butir pati dan Kristal kalsium oksalat bentuk

roset besar. Xilem terdiri dari sel parenkim xylem berdinding tipis, berisi butir pati

dan Kristal oksalat besar, trakea besar bernoktah,jari-jari empulur terdiri dari 1-2

baris (Bambang, 2009).

Tanaman ini mmiliki manfaat untuk :

Purgatif, antipiretik, antispamodik, stomakik antimutagen, tonik, astringent,

antiinflammatory, antikolesterol, antiseptic, anti-hipertensi antitumor

dan antioksidan. Banyak digunakan untuk memudahkan air besar dan sebagai

pencahar. Masing-masing manfaat terperinci tiap bagiannya adalah sebagai

berikut; batangnya dapat mengobati malaria, sariawan dan batuk, Akarnya

mengandung glikosida adstringent yang berkelakuan sebagai zat penyamak. Pada

akarnya pula mengandung antrkuinon yang berefek purgative,dan tannin yang

berefek melawan astringen atau dapat disebut sebagai adstringent,tapi dalam

jumlah kecil efek astringen juga dibutuhkan, tapi jika terlalu banyak maka dapat

menimbulkan efek laksatif (Bambang, 2009).

II. TINJAUAN KIMIA

Secara umum tanaman ini mengandung kandungan :

Asam krisofat, krisofanin, rien-emodin, aloe-emodin, reokristin, alizarin,

glukogalin, tetrazin, katekin, saponin, tannin 11,80%, amilum dan kuinon. Setiap

bagian bagian tubuhnya mengandung zat-zat kimia yang berbeda. Akar dan daunnya

mengandung flavonoida, di samping itu akarnya juga mengandung glikosida

Reumemodin, krisofanol, rafontisin dan saponin, sedangkan daunnya sendiri

mengandung polifenol , antraglikosida dan frangula-emodin. Pada batangnya

mengandung asam krisofhanat , emodian dan rhein (Bambang, 2009).

III. TINJAUAN FITOKIM

(KUINON DAN STRUKTUR BELUM ADA)

IV. TINJAUAN METODE

4.1. Ekstraksi

Ekstraksi adalah penyarian zat-zat aktif dari bagian tanaman obat. Adapun tujuan dari

ekstraksi yaitu untuk menarik komponen kimia yang terdapat dalam simplisia. Tujuan

ekstraksi adalah untuk menarik semua komponen kimia yang terdapat dalam simplisia.

Ekstraksi ini didasarkan pada perpindahan massa komponen zat padat ke dalam pelarut

dimana perpindahan mulai terjadi pada lapisan antar muka, kemudian berdifusi masuk

ke dalam pelarut (Sudjadi, 1986).

Secara umum, terdapat empat situasi dalam menentukan tujuan ekstraksi:

1. Senyawa kimia telah diketahui identitasnya untuk diekstraksi dari organisme.

Dalam kasus ini, prosedur yang telah dipublikasikan dapat diikuti dan dibuat

modifikasi yang sesuai untuk mengembangkan proses atau menyesuaikan dengan

kebutuhan pemakai (Sudjadi, 1986).

2. Bahan diperiksa untuk menemukan kelompok senyawa kimia tertentu, misalnya

alkaloid, flavanoid atau saponin, meskipun struktur kimia sebetulnya dari senyawa

ini bahkan keberadaannya belum diketahui. Dalam situasi seperti ini, metode umum

yang dapat digunakan untuk senyawa kimia yang diminati dapat diperoleh dari

pustaka. Hal ini diikuti dengan uji kimia atau kromatografik yang sesuai untuk

kelompok senyawa kimia tertentu (Sudjadi, 1986).

3. Organisme (tanaman atau hewan) digunakan dalam pengobatan tradisional, dan

biasanya dibuat dengan cara, misalnya Tradisional Chinese medicine (TCM)

seringkali membutuhkan herba yang dididihkan dalam air dan dekok dalam air

untuk diberikan sebagai obat. Proses ini harus ditiru sedekat mungkin jika ekstrak

akan melalui kajian ilmiah biologi atau kimia lebih lanjut, khususnya jika tujuannya

untuk memvalidasi penggunaan obat tradisional (Sudjadi, 1986).

4. Sifat senyawa yang akan diisolasi belum ditentukan sebelumnya dengan cara

apapun. Situasi ini (utamanya dalam program skrining) dapat timbul jika tujuannya

adalah untuk menguji organisme, baik yang dipilih secara acak atau didasarkan pada

penggunaan tradisional untuk mengetahui adanya senyawa dengan aktivitas biologi

khusus (Sudjadi, 1986).

Proses pengekstraksian komponen kimia dalam sel tanaman yaitu pelarut organik

akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat

aktif, zat aktif akan larut dalam pelarut organik di luar sel, maka larutan terpekat

akan berdifusi keluar sel dan proses ini akan berulang terus sampai terjadi

keseimbangan antara konsentrasi cairan zat aktif di dalam dan di luar sel (Sudjadi,

1986).

4.1.1 Prinsip ekstraksi

Prinsip Maserasi

Penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam

cairan penyari yang sesuai selama tiga hari pada temperatur kamar terlindung dari

cahaya, cairan penyari akan masuk ke dalam sel melewati dinding sel. Isi sel akan

larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di

luar sel. Larutan yang konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh

cairan penyari dengan konsentrasi rendah ( proses difusi ). Peristiwa tersebut

berulang sampai terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di

dalam sel. Selama proses maserasi dilakukan pengadukan dan penggantian cairan

penyari setiap hari. Endapan yang diperoleh dipisahkan dan filtratnya dipekatkan.

( Alam, Gemini dan Abdul Rahim. 2007.)Penuntun Praktikum Fitokimia.

UIN.Alauddin: Makassar. 24-26.

Prinsip Perkolasi

Penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara serbuk simplisia dimaserasi selama 3

jam, kemudian simplisia dipindahkan ke dalam bejana silinder yang bagian

bawahnya diberi sekat berpori, cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui

simplisia tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif dalam sel-sel simplisia

yang dilalui sampai keadan jenuh. Gerakan ke bawah disebabkan oleh karena

gravitasi, kohesi, dan berat cairan di atas dikurangi gaya kapiler yang menahan

gerakan ke bawah. Perkolat yang diperoleh dikumpulkan, lalu dipekatkan. ( Alam,

Gemini dan Abdul Rahim. 2007.)

Prinsip Soxhletasi

Penarikan komponen kimia yang dilakukan dengan cara serbuk simplisia

ditempatkan dalam klonsong yang telah dilapisi kertas saring sedemikian rupa,

cairan penyari dipanaskan dalam labu alas bulat sehingga menguap dan

dikondensasikan oleh kondensor bola menjadi molekul-molekul cairan penyari yang

jatuh ke dalam klonsong menyari zat aktif di dalam simplisia dan jika cairan penyari

telah mencapai permukaan sifon, seluruh cairan akan turun kembali ke labu alas

bulat melalui pipa kapiler hingga terjadi sirkulasi. Ekstraksi sempurna ditandai bila

cairan di sifon tidak berwarna, tidak tampak noda jika di KLT, atau sirkulasi telah

mencapai 20-25 kali. Ekstrak yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan. ( Alam,

Gemini dan Abdul Rahim. 2007.)

Prinsip Refluks

Penarikan komponen kimia yang dilakukan dengan cara sampel dimasukkan ke

dalam labu alas bulat bersama-sama dengan cairan penyari lalu dipanaskan, uap-uap

cairan penyari terkondensasi pada kondensor bola menjadi molekul-molekul cairan

penyari yang akan turun kembali menuju labu alas bulat, akan menyari kembali

sampel yang berada pada labu alas bulat, demikian seterusnya berlangsung secara

berkesinambungan sampai penyarian sempurna, penggantian pelarut dilakukan

sebanyak 3 kali setiap 3-4 jam. Filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan. (

Alam, Gemini dan Abdul Rahim. 2007.)

Prinsip Destilasi Uap Air

Penyarian minyak menguap dengan cara simplisia dan air ditempatkan dalam labu

berbeda. Air dipanaskan dan akan menguap, uap air akan masuk ke dalam labu

sampel sambil mengekstraksi minyak menguap yang terdapat dalam simplisia, uap

air dan minyak menguap yang telah terekstraksi menuju kondensor dan akan

terkondensasi, lalu akan melewati pipa alonga, campuran air dan minyak menguap

akan masuk ke dalam corong pisah, dan akan memisah antara air dan minyak atsiri.

( Alam, Gemini dan Abdul Rahim. 2007.)

Prinsip Rotavapor

Proses pemisahan ekstrak dari cairan penyarinya dengan pemanasan yang

dipercepat oleh putaran dari labu alas bulat, cairan penyari dapat menguap 5-10º C

di bawah titik didih pelarutnya disebabkan oleh karena adanya penurunan tekanan.

Dengan bantuan pompa vakum, uap larutan penyari akan menguap naik ke

kondensor dan mengalami kondensasi menjadi molekul-molekul cairan pelarut

murni yang ditampung dalam labu alas bulat penampung. ( Alam, Gemini dan Abdul

Rahim. 2007.)

Prinsip Ekstraksi Cair-Cair

Ekstraksi cair-cair (corong pisah) merupakan pemisahan komponen kimia di antara 2

fase pelarut yang tidak saling bercampur di mana sebagian komponen larut pada

fase pertama dan sebagian larut pada fase kedua, lalu kedua fase yang mengandung

zat terdispersi dikocok, lalu didiamkan sampai terjadi pemisahan sempurna dan

terbentuk dua lapisan fase cair, dan komponen kimia akan terpisah ke dalam kedua

fase tersebut sesuai dengan tingkat kepolarannya dengan perbandingan konsentrasi

yang tetap. ( Alam, Gemini dan Abdul Rahim. 2007.)

Prinsip Kromatografi Lapis Tipis

Pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip adsorbsi dan partisi, yang

ditentukan oleh fase diam (adsorben) dan fase gerak (eluen), komponen kimia

bergerak naik mengikuti fase gerak karena daya serap adsorben terhadap

komponen-komponen kimia tidak sama sehingga komponen kimia dapat bergerak

dengan kecepatan yang berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya, hal inilah yang

menyebabkan terjadinya pemisahan. ( Alam, Gemini dan Abdul Rahim. 2007.)

4.1.2. jenis –jenis ekstraksi

Ekstraksi dengan pelarut dapat dilakukan dengan cara dingin dan cara panas. Jenis-jenis

ekstraksi tersebut sebagai berikut:

Cara Dingin

o Maserasi, adalah ekstraksi menggunakan pelarut dengan beberapa kali

pengadukan pada suhu kamar. Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan

prinsip metoda pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi

kinetic berarti dilakuakn pengadukan kontinyu. Remaserasi berarti dilakukan

pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan ekstraksi maserat

pertama dan seterusnya. Keuntungan dari metode ini adalah peralatannya

sederhana. Sedang kerugiannya antara lain waktu yang diperlukan untuk

mengekstraksi sampel cukup lama, cairan penyari yang digunakan lebih

banyak, tidak dapat digunakan untuk bahan-bahan yang mempunyai tekstur

keras seperti benzoin, tiraks dan lilin.

Metode maserasi dapat dilakukan dengan modifikasi sebagai berikut :

Modifikasi maserasi melingkar

Modifikasi maserasi digesti

Modifikasi Maserasi Melingkar Bertingkat

Modifikasi remaserasi

Modifikasi dengan mesin pengaduk

o Perkolasi, adalah ekstraksi pelarut yang selalu baru sampai sempurna yang

umumnya pada suhu ruang. Prosesnya didahului dengan pengembangan

bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penampungan

ekstrak) secara terus menerus samapai diperoleh ekstrak perkolat yang

jumlahnya 1-5 kali bahan

Cara Panas

Reflux, adalah ekstraksi pelarut pada temperature didihnya selamawaktu

tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relative konstan dengan adanya

pendingin balik.

Keuntungan dari metode ini adalah digunakan untuk mengekstraksi

sampel-sampel yang mempunyai tekstur kasar dan tahan pemanasan langsung.

Kerugiannya adalah membutuhkan volume total pelarut yang besar dan

sejumlah manipulasi dari operator.

o Soxhlet, adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru

menggunakan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah

pelarut relative konstan dengan adanya pendingin balik.

o Digesi, adalahmaserasi kinetic pada temperature lebih tinggi dari temperature

kamar sekitar 40-50 C

o Destilasi uap, adalah ekstraksi zat kandungan menguap dari bahan dengan

uap air berdasarkan peristiwa tekanan parsial zat kandungan menguap

dengan fase uap air dari ketel secara kontinyu sampai sempurna dan diakhiri

dengan kondensasi fse uap campuran menjadi destilat air bersama kandungan

yang memisah sempurna atau sebagian.

o Infuse, adalah ekstraksi pelarut air pada temperature penangas air 96-98 C

selama 15-20 menit. (Rizky Kurnia,2010)

Pelarut yang baik untuk ekstraksi adalah pelarut yang mempunyai daya melarutkanyang

tinggi terhadap zat yang diekstraksi. Daya melarutkan yang tinggi ini berhubungan

dengan kepolaran pelarut dan kepolaran senyawa yang diekstraksi. Terdapat

kecenderungan kuat bagi senyawa polar larut dalam pelarut polar dan sebaliknya.

Pemilihan pelarut pada umumnya dipengaruhi oleh:

Selektivitas, pelarut hanya boleh melarutkan ekstrak yang diinginkan.

Kelarutan, pelarut sedapat mungkin memiliki kemampuan melarutkan ekstrak yang

besar.

Kemampuan tidak saling bercampur, pada ekstraksi cair, pelarut tidak boleh larut

dalam bahan ekstraksi.

Kerapatan, sedapat mungkin terdapat perbedaan kerapatan yang besar antara

pelarut dengan bahan ekstraksi.

Reaktivitas, pelarut tidak boleh menyebabkan perubahan secara kimia pada

komponen bahan ekstraksi.

Titik didih, titik didh kedua bahan tidak boleh terlalu dekat karena ekstrak dan

pelarut dipisahkan dengan cara penguapan, distilasi dan rektifikasi.

Kriteria lain, sedapat mungkin murah, tersedia dalam jumlah besar, tidak beracun,

tidak mudah terbakar, tidak eksplosif bila bercampur udara, tidak korosif, buaka

emulsifier, viskositas rendah dan stabil secara kimia dan fisik.

Karena tidak ada pelarut yang sesuai dengan semua persyaratan tersebut, maka untuk

setiap proses ekstraksi harus dicari jenis pelarut yang paling sesuai dengan kebutuhan.

( Rizki Kurnia,2010)

4.2. Parameter Ekstrak

3.2.1 Organoleptik ekstrak

Pemeriksaan menggunakan pancaindera meliputi bau, bentuk, warna dan rasa

ekstrak (Muhtadi, 2008).

3.2.2 Rendemen ekstrak

Hasil ekstraksi setelah dikeringkan diperoleh sebagai rendemen, yaitu

perbandingan berat ekstrak yang diperoleh dengan berat simplisia awal. (Muhtadi,

2008).

3.2.3 Berat Jenis Ekstrak

Berat jenis untuk penggunaan praktis lebih sering didefinisikan sebagai

perbandingan massa dari suatu zat terhadap massa sejumlah volume air yang

sama pada suhu 4° atau temperatur lain yang tertantu. Notasi berikut sering

ditemukan dalam pembacaan berat jenis: 25°/25°, 25°/4°, dan 4°/4°. Angka yang

pertama menunjukkan temperatur udara saat zat ditimbang, angka yang

berikutnya menunjukkan temperatur air yang digunakan (Martin, et. al., 1983).

Berat jenis larutan etanol dapat diukur dengan piknometer. Berat jenis larutan

etanol semakin kecil, maka kadar etanol dalam larutan tersebut semakin besar.

Hal ini dikarenakan etanol mempunyai berat jenis lebih kecil daripada air sehingga

semakin kecil berat jenis larutan berarti jumlah atau kadar etanol semakin banyak.

(Mardoni, 2005)

Bobot jenis ekstrak dihitung dengan menggunakan piknometer. Ekstrak yang

digunakan adalah ekstrak yang telah diencerkan 5% dan 10% menggunakan etanol

96% sebagai pelarut. Dimana didapatkan hasil sebesar 0, 8293 m/v ± 2.10-4 untuk

pengenceran 5% dan 0,8489 m/v ± 5.10-5 untuk pengenceran 10%. Ini

menggambarkan besarnya massa persatuan volume untuk memberikan batasan

antara ekstrak cair dan ekstrak kental, bobot jenis juga terkait dengan kemurnian

dari ekstrak dan kontaminasi (Departemen Kesehatan RI, 2000).

4.2.4 Kadar Air Ekstrak

Penetapan kadar air ekstrak dapat dilakukan dengan beberapa cara, misalnya

dengan titrasi langsung atau tidak langsung (pereaksi Karl-Fischer), destilasi atau

gravimetri (Departemen Kesehatan RI, 2000).

Pereaksi dan larutan yang digunakan peka terhadap air, hingga harus dilindungi

dari pengaruh kelembapan udara. Cara penetapan, dapat dilakukan dengan titrasi

dan destilasi. Titrasi dapat dilakukan dengan titrasi langsung dan titrasi tidak

langsung, pereaksi yang digunakan Karl Fischer dan larutan baku airmetanol.

Sedangkan cara destilasi menggunakan pereaksi toluene (Departemen Kesehatan

RI, 1980).

a. Titrasi Langsung

Kecuali dinyatakan lain, masukkan lebih kurang 20 ml metanol P ke dalam labu

titrasi. Titrasi dengan pereaksi Karl Fischer hingga titik akhir tercapai. Masukkan

dengan cepat sejumlah zat yang ditimbang seksama yang mengandung 10-50 mg

air, ke dalam labui titrasi, aduk selama 1 menit. Titrasi dengan pereaksi Karl

Fischer yang telah diketahui kesetaraan airnya (Departemen Kesehatan RI, 1980).

b. Titrasi Tidak Langsung

Masukkan lebih kurang 20 ml metanol P ke dalam labu titrasi. Titrasi dengan

pereaksi dari Karl Fischer hingga titik akhir tercapai. Masukkan dengan cepat

sejumlah zat ditimbang seksama yang mengandung 10-50 mg air, campur.

Tambahkan pereaksi Karl Fischer berlebih dan yang diukur seksama, biarkan

selama beberapa waktu hingga reaksi sempurna. Titrasi kelebihan pereaksi

dengan larutan baku air-metanol (Departemen Kesehatan RI, 1980).

c. Destilasi

Bersihkan tabung penerima dan pendingin dengan asam pencuci, bilas dengan air,

keringkan dalam lemari pengering. Ke dalam labu kering masukkan sejumlah zat

yang ditimbang seksama yang mengandung 2-4 ml air. Jika zat berupa pasta,

timbang dalam sehelai lembaran logam dengan ukuran yang sesuai dengan leher

labu. Untuk zat yang dapat menyebabkan gejolak mendadak, tambahkan dengan

pasir kering yang telah dicuci secukupnya hingga mencukupi dasar labu atau

sejumlah tabung kapiler, panjang lebih kurang 200 ml toluen ke dalam labu,

hubungkan alat. Tuang toluen ke dalam tabung penerima melalui alat pendingin.

Panaskan labu hati-hati selama 15 menit (Departemen Kesehatan RI, 1980).

Setelah toluen mendidih, suling dengan kecepatan lebih kurang 2 tetes tiap detik,

hingga sebagian besar air tersuling, kemudian naikkan kecepatan penyulingan

hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air tersuling, cuci bagian dalam pendingin

toluen, sambil dibersihkan dengan sikat tabung yang disambungkan dengan kawat

tembaga dan telah dibasahi dengan toluen. Lanjutkan penyulingan selama 5

menit. Biarkan tabung penerima pendingin hingga suhu kamar. Jika ada tetes air

yang melekat pada pendingin tabung penerima, gosok dengan karet yang

diikatkan pada sebuah kawat tembaga dan basahi dengan toluen hingga tetesan

air turun. Setelah iar dan toluen memisah sempurna, baca volume air

(Departemen Kesehatan RI, 1980).

4.2.5 Kromatografi Lapis Tipis

Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Egon Stahl dengan

menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan lapisan tipis.

Sistem ini segera popular karena memberikan banyak keuntungan, misalnya

peralatan yang diperlukan sedikit, murah, sederhana, waktu analisis cepat dan

daya pisah cukup baik (Sudjadi, 1988).

Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung

beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat adalah :

Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan)

Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus

(adsorpsi/penjerapan)

Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap

(keatsirian) (Gritter et. al., 1991).

Sekarang kromatografi mencakup beberapa macam proses didasarkan pada

distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel antara dua fasa. Salah satu

fasa yang tinggal dalam sistem dinamai fasa diam (stationary phase), fasa lain

yang melalui fasa diam dinamai fasa gerak (mobile phase). Pergerakan dari fasa

gerak menimbulkan migrasi diferensial komponen-komponen dalam sampel

(Tjokronegoro, 2000).

Fasa diam

Kondisi optimum suatu pemisahan merupakan hasil kecocokan antara fasa diam dan

fasa gerak. Dalam KLT fasa diam harus mudah didapat. Fasa diam berupa lapisan tipis

(tebal 0,1-2 mm) yang terdiri atas bahan padat yang dilapiskan pada permukaan

penyangga datar yang biasanya terbuat dari kaca, tetapi dapat pula terbuat dari pelat

polimer atau logam. Lapisan melekat kepada permukaan dengan bantuan bahan

pengikat biasanya kalsium sulfat atau amilum (Gritter, 1991).

Jenis-jenis fasa diam yang dapat digunakan :

Silika gel :

Silika gel dengan pengikat

Silika gel dengan pengikat dan indikator fluorosensi

Silika gel tanpa pengikat dengan indikator fluorosensi

Silika gel tanpa pengikat

Silika gel untuk preparatif

o Alumina

o Keiselguhr

o Selulosa (Sudjadi, 1988)

Fasa Gerak

Untuk fasa diam yang menggunakan silika gel, alumina, dan fasa diam lainnya, pemilihan

pelarut mengikuti aturan kromatografi kolom serapan. Sistem tak berair paling banyak

digunakan, yang meliputi (sifat hidrofob menaik) methanol, asam asetat, etanol, aseton,

etil asetat, eter, kloroform (perlu diperhatikan pada kloroform yang distabilkan dengan

etanol), benzene, sikloheksan dan eter petroleum. Campuran pelarut yang terdiri dari

dua atau tiga pelarut dapat pula digunakan. Penyusunan sistem pelarut dapat dipilih

sesuai dengan kemampuannya membentuk ikatan hydrogen dalam satu seri dari hidrofil

sampai ke hidrofob. Kombinasi pelarut yang mempunyai sifat berbeda memungkinkan

didapatnya sistem pelarut yang cocok (Sudjadi, 1988).

Faktor Retensi (Rf)

Derajat retensi pada kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai faktor retensi

Rf:

Jarak yang telah ditempuh pelarut dapat diukur dengan mudah dan jarak tempuh

cuplikan diukur pada pusat bercak itu, atau pada titik kerapatan maksimum (Sudjadi,

1988).

4.2.6 Dinamolisis

Dinamolisis adalah suatu metode yang digunakan untuk identifikasi zat

berdasarkan diameter. Dinamolisis dapat dilakukan dengan cara kertas saring

Whatman diameter 10 cm, titik pusatnya dilubangi kemudian dipasang sumbu

yang terbuat dari kertas saring. Kertas saring bersumbu ini kemudian ditutupkan

pada cawan petri yang berisi maserat atau ekstrak cair. Kemudian dibiarkan

sampai terjadi proses difusi sirkular selama kurang lebih 10 menit

(DepartemenKesehatan RI, 2000).

4.3 Kromatografi Cair Vakum

Kromatografi kolom cair dapat dilakukan pada tekanan atmosfer atau pada

tekanan lebih besar dari atmosfer dengan menggunakan bantuan tekanan luar misalnya

gas nitrogen. Untuk keberhasilan praktikan di dalam bekerja dengan menggunakan

kromatografi kolom vakum cair, oleh karena itu syarat utama adalah mengetahui

gambaran pemisahan cuplikan pada kromatografi lapis tipis (Harris, 1982).

Kromatografi vakum cair dilakukan untuk memisahkan golongan senyawa

metabolit sekunder secara kasar dengan menggunakan silika gel sebagai absorben dan

berbagai perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat : metanol (elusi gradien) dan

menggunakan pompa vakum untuk memudahkan penarikan eluen (Helfman, 1983).

Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen

campuran dimana cuplikan berkesetimbangan di antara dua fasa, fasa gerak yang

membawa cuplikan dan fasa diam yang menahan cuplikan secara selektif. Bila fasa gerak

berupa gas, disebut kromatografi gas, dan sebaliknya kalau fasa gerak berupa zat cair,

disebut kromatografi cair (Hendayana, 1994).

Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas

kering (biasanya dengan penjerap mutu KLT 10-40 μm) dalam keadaan vakum agar

diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya

rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai

kering dan sekarang siap dipakai (Hostettman, 1986).

4.4. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi

komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip

ini. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi

cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui

fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran.

Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Kita akan

membahasnya lebih lanjut.

Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau

alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras.

Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis

seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar

ultra violet, alasannya akan dibahas selanjutnya. Fase gerak merupakan pelarut atau

campuran pelarut yang sesuai. Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom

silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun,

pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada

permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan

bagian kecil dari permukaan silika.

Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk

ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana

halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.

Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom

aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel

silika kemudian digunakan serupa untuk alumina.

Apa yang memisahkan senyawa-senyawa dalam kromatogram?

Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan

senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-

senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya

pergerakan pelarut.

Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada

lempengan, tergantung pada:

Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada

bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.

Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Hal ini

tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan jel silika.

Anggaplah bercak awal mengandung dua senyawa, yang satu dapat membentuk ikatan

hidrogen, dan yang lainnya hanya dapat mengambil　bagian interaksi van der Waals

yang lemah.

Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika

lebih kuat dibanding senyawa lainnya. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap

lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu

ikatan dari satu substansi pada permukaan.

Penjerapan bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari

molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan

dalam pelarut.

Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama

waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara

waktu proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti

bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas

lempengan.

Dalam contoh yang sudah kita bahas, senyawa yang dapat membentuk ikatan

hidrogen akan menjerap lebih kuat daripada yang tergantung hanya pada interaksi van

der Waals, dan karenanya bergerak lebih jauh pada lempengan.

Bagaimana jika komponen-komponen dalam campuran dapat membentuk

ikatan-ikatan hidrogen?

Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan

dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan

atraksi antara senyawa dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga

merupakan hal yang penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa

ditarik pada larutan keluar dari permukaan silika.

( Jim Clark,2007)

IV. ALAT dan BAHAN

Alat :

Alat soxhlet

Beaker glass besar

Botol bening besar

Botol coklat

Cawan penguap

Cawan petri

Gelas ukur

Kertas saring whatman

Lemari pendingin

Pelat silika gel

Piknometer

Pipa kapiler

Rotavapor

Timbangan

Spektroskopi UV 254 dan 366 nm

Bahan :

Etanol 70%

Larutan pengembang = benzena : etil asetat : asam asetat glasial (75:24:1)

Penampak bercak (uap ammonia)

Simplisia Rhei radix

Gambar Alat :

alat soxhlet

Destilator Rotavapor

Bejana Kromatografi

Lampu UV

V. PROSEDUR

5.1. Ekstraksi Dengan Alat Soxhlet

Tuangkan 750 ml pelarut etanol 70% ke dalam labu alas bulat atau sampai kurang lebih

1/2 - 2/3 bagian volume labu dan ditambahkan batu didih. Serbuk simplisia sebanyak

120 gram disiapkan dalam kertas saring whatman dan dimasukkan ke dalam tabung

soxhlet. Alat soxhlet dipasang sesuai tempatnya. Serbuk simplisia dibasahkan dengan

etanol 70% sebanyak 100 ml dan heating mantle dinyalakan sampai suhu mencapai titik

didih pelarut. Ekstraksi simplisia sampai pelarut hampir tidak berwarna. Kemudian

ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan rotavapor sehingga menjadi ekstrak kental.

5.2. Rendemen Ekstrak

Diambil 20 ml ekstrak yang diperoleh dari hasil rotavapor, dimasukkan ke cawan

penguap dan diuapkan di atas penangas air sampai diperoleh bobot yang tetap. Berat

ekstrak ditentukan setelah penguapan dengan mengurangkan dengan bobot cawan

kosong, kemudian dihitung rendemen ekstrak (% b/b).

5.3. Dinamolisis

Disiapkan kertas saring whatman berdiameter 10 cm. Lalu titik pusat kertas whatman

tersebut dilubangi dan dipasang sumbu yang terbuat dari kertas saring. Ekstrak cair

sebanyak 20 ml dituang ke dalam cawan petri. Cawan petri ditutup oleh kertas whatman

yang telah disiapkan dan dibiarkan sampai terjadi difusi sirkular selama 10 menit.

5.4. Penetapan Bobot Jenis Ekstrak

Ditimbang piknometer dalam keadaan kosong, lalu piknometer diisi penuh dengan air

dan ditimbang kembali, kemudian dihitung kerapatan air. Setelah itu piknometer

dikosongkan dan dikeringkan kembali dan diisi penuh dengan ekstrak encer hasil refluks,

lalu ditimbang. Melalui berat ekstrak yang mempunyai volume tertentu, dapat dihitung

kerapatan ekstrak.

5.5. Kromatografi Lapis Tipis

Disiapkan pelat silika gel sebagai penyerap berukuran 10 x 2 cm. Lalu pelat tersebut

ditandai dengan cara memberi dua buah garis yang masing- masing berjarak 1 cm dari

ujung bawah dan atas. Kemudian disiapkan larutan pengembang untuk simplisia Rhei

radix yaitu benzena, etil asetat, dan asam asetat glasial dengan perbandingan 75 : 24 : 1.

Pengembang ditempatkan pada wadah yang telah disediakan. Tinggi pengembang dari

dasar wadah tidak lebih daripada 1 cm. Kemudian wadah ditutup dan ditunggu hingga

larutan pengembang jenuh dan ditandai dengan hangatnya suhu di dalam wadah.

Setelah itu pipa kapiler yang telah disediakan dibersihkan dengan ditotolkan ke dalam

metanol lalu dikeringkan. Setelah itu ekstrak hasil ekstraksi ditotolkan pada pelat silika

gel yang telah disiapkan. Silika gel ditempatkan di wadah berisi pengembang. Dan

perambatan spot diamati. Setelah jarak rambat pengembang mencapai batas ujung

pelat, pelat diangkat dari wadah. Pelat kemudian disemprot dengan penampak bercak.

Lalu spot diamati secara berturut-turut di bawah sinar biasa, sinar UV 254 nm dan 366

nm. Kemudian dihitung Rf dari tiap-tiap spot lalu dibandingkan dengan literatur.

5.6.Kadar Air Ekstrak

Dimasukkan sejumlah 2 gram ekstrak kental ke dalam labu bersih dan kering kemudian

ditambahkan 200 ml toluen, dan alat dihubungkan. Toluen dituangkan ke dalam labu

penerima melalui alat pendingin dan dipanaskan selama 15 menit. Setelah toluen

mendidih, suling dengan kecepatan lebih kurang 2 tetes tiap detik, hingga sebagian air

tersuling, kemudian naikkan kecepatan penyulingan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah

semua air tersuling, biarkan tabung penerima mendingin hingga suhu kamar. Setelah air

dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dan dihitung kadar air dalam % v/b.

VI. DATA PENGAMATAN

EKSTRAKSI METABOLIT SEKUNDER DARI SIMPLISIA TUMBUHAN OBAT

Nama simplisia : Rhei radix

Metode ekstraksi : refluks

Hasil percobaan :

1. Organoleptik ekstrak

Bentuk : cair

Warna : cokelat-kehitaman

Bau : tidak enak

Rasa : sepat/kelat

2. Rendemen ekstrak

Volume ekstrak kental : 35,4 ml

Berat cawan kosong : 88,45 g

Berat cawan+ekstrak (setelah penguapan) : 98,59 g

Berat simplisia awal : 250 g

Rendemen ekstrak : 4,056 % b/b

3. Bobot jenis ekstrak

Berat piknometer kosong : 12,95 g

Berat piknometer+air : 23,39 g

Berat air : 10,44 g

Volume piknometer : 10 ml

Kerapatan air : 1,044 g/ml

Berat piknometer+ekstrak : 24,19 g

Volume piknometer : 10 ml

Berat ekstrak : 11,24 g

Kerapatan ekstrak : 1,124 g/ml

Bobot jenis ekstrak : 1,044

4. Kadar air ekstrak

Berat ekstrak uji : 2,08 g

Volume air : 1 ml

Kadar air : 0,481 % v/b

5. Pola kromatogram lapis tipis

No bercak RfPengamatan

Sinar tampak UV 254 nm UV 366 nm

1 0,025 hijau biru biru

2 0,1 cokelat muda - biru

3 0,2875 cokelat-hijau cokelat biru

4 0,33 kuning biru ungu

5 0,3625 cokelat ungu -

6 0,4625 kuning biru -

7 0,75 kuning-jingga - -

8 0,8375 pink ungu biru-ungu

9 0,875 kuning orange orange

6. Pola dinamolisis

Keterangan :

Diameter 1 : 1,8 cm ; warna : cokelat

Diameter 2 : 2,2 cm ; warna : kuning

Diameter 3 : 2,4 cm ; warna : bening

METODE PEMISAHAN EKSTRAK

Komposisi larutan eluen :

n-Heksana (mL) Etil asetat (mL)

100 0

90 10

80 20

70 30

60 40

50 50

40 60

30 70

20 80

10 90

0 100

Hasil percobaan :

1. Data fraksi :

Fraksi Warna Fraksi Warna

1 bening 7 kuning

2 bening 8 kuning

3 bening 9 kuning

4 kuning 10 kuning

5 kuning 11 kuning

6 kuning

2. Data Rf:

Penjerap : silika gel

Pengembang : metanol - etil asetat – air

Penampak bercak : KOH

3. Pola kromatogram

No bercak RfPengamatan

Sinar tampak UV 254 nm UV 366 nm

4 0,9 kuning cokelat cokelat

5 0,9 kuning cokelat -

6 0,9 kuning cokelat -

7 0,9 kuning - -

VII. PEMBAHASAN

Pada percobaan kali ini dilakukan ekstraksi simplisia Rhei radix untuk memperoleh

metabolit sekunder. Metode ekstraksi yang dipakai adalah metode ekstraksi cara panas.

Metode ekstraksi cara panas memiliki keuntungan yaitu jumlah pelarut yang digunakan

tidak boros (karena ekstraksi berulang) dan prosesnya lebih cepat tetapi kelemahannya

adalah dapat merusak metabolit yang bersifat termolabil. Metode ekstraksi cara panas

yang digunakan dalam ekstraksi simplisia Rhei radixadalah reflux. ??? mpe rotavapor

Terhadap ekstrak Rhei radix kemudian dilakukan pemeriksaan parameter ekstrak.

Terdapat 6 pemeriksaan parameter ekstrak yang perlu dilakukan untuk mengetahui

kualitas dari ekstrak Rhei radix.

Pemeriksaan parameter ekstrak yang pertama dilakukan yaitu pemeriksaan

organoleptik ekstrak Rhei radix. Pemeriksaan ini dilakukan dengan menggunakan

pancaindera untuk mendeskripskan bentuk, warna, bau dan rasa. Ekstrak Rhei radix

yang didapat dari hasil ekstraksi dengan alat soxhlet berupa cairan berwarna coklat yang

memiliki bau khas dengan rasa yang pahit.

Pemeriksaan parameter ekstrak yang kedua yaitu melakukan pemeriksaan

terhadap rendemen ekstrak. Untuk menetapkan rendemen ekstrak, sebanyak 188 ml

ekstrak kental yang didapat dari hasil evaporasi disimpan ke dalam cawan penguap.

Sebelumnya cawan penguap ditimbang, didapat berat kosong cawan penguap yaitu

88,45 g. Volume ekstrak kental juga ditimbang, didapat beratnya yaitu 35,4ml.

Kemudian ekstrak kental Rhei radix dalam cawan penguap diuapkan di atas penangas air

dengan temperature 40-50oC sampai didapat bobot tetap.

Setelah itu, berat cawan penguap+ekstrak setelah penguapan ditimbang, didapat

beratnya 98,59 g. Untuk menghitung persentase rendemen ekstrak Rhei radix, berat

ekstrak total Rhei radix dan berat simplisia awal harus diketahui, berat ekstrak total

didapat dari hasil pengurangan antara berat cawan penguap+ekstrak setelah penguapan

dengan berat cawan penguap kosong, didapat berat ekstrak Rhei radix total yaitu 10,14

g, sedangkan berat simplisia awal yaitu 250 g. Dengan menggunakan rumus :

% Rendemen = berat ekstrak total x 100%

berat simplisia

didapat persentase rendemen ekstrak Rhei radix sebesar 4,056%. Besarnya persentase

rendemen ini menunjukan bahwa dari berat total simplisia Rhei radix sebanyak 250 g

hanya terkandung ekstrak Rhei radix sebesar 4,056%. Banyaknya rendemen yang

dihasilkan ternyata tergantung dari keadaan tanaman simplisia dan proses ekstraksi

yang dilakukan. Untung mendapatkan rendemen yang tinggi, tanaman simplisia harus

bermutu baik selain itu proses ekstraksi yang dilakukan pun haruslah baik.

Selanjutnya dilakukan pemeriksaan parameter ekstrak yang ketiga, yaitu

penetapan bobot jenis ektrak Rhei radix.Bobot jenis adalah perbandingan bobot zat

terhadap air volume yang sama ditimbang di udara pada suhu yang sama. Penentuan

bobot jenis berlangsung dengan piknometer, areometer, timbangan hidrostatik

(timbangan Mohr-Westphal) dan cara manometris. Namun pada praktikum kali ini,

bobot jenis ditentukan dengan piknometer.

Pinsip metode ini didasarkan atas penentuan massa cairan dan penentuan

ruangan yang ditempati cairan ini. Ruang piknometer dilakukan dengan menimbang

air.Ketelitian metode piknometer akan bertambah sampai suatu optimum tertentu

dengan bertambahnya volume piknometer. Optimum ini terletak sekitar isi ruang 30 ml.

Ada dua tipe piknometer, yaitu tipe botol dengan tipe pipet. Pada praktikum kali ini

yang digunakan adalah piknometer tipe botol.

Untuk mengetahui bobot jenis ekstrak Rhei radix, pertama-tama berat

piknometer kosong ditimbang, didapat beratnya yaitu 12,95 g. Pada saat akan ditimbang

piknometer tidak boleh dipegang langsung oleh tangan, harus menggunakan tisu,

karena pada tangan terdapat minyak atau lemak yang akan ikut tertimbang pada saat

penimbangan sehingga berat piknometer tidaklah akurat. Kemudian piknometer

ditambahkan dengan air, ditimbang beratnya, didapat berat piknometer + air sebesar

23,39 g. Kerapatan air dapat ditetapkan dengan menggunakan rumus :

ρair = berat air

volume air

berat air 10,44 g didapat dari hasil pengurangan berat piknometer+air dengan berat

piknometer kosong, sedangkan volume air sama dengan volume piknometer yaitu 10

ml. Dari data yang telah disebutkan didapat kerapatan air yaitu 1,044 g/ml.

Kemudian piknometer dikosongkan dan diisi penuh dengan ekstrak Rhei radix,

ditimbang, didapat berat piknometer+ekstrak sebesar 24,19 g.

Kerapatan ekstrak ditetapkan dengan menggunakan rumus :

ρekstrak = berat ekstrak

volume ekstrak

berat ekstrak 11,24 g didapat dari hasil pengurangan berat piknometer+ekstrak dengan

berat piknometer kosong, sedangkan volume ekstrak sama dengan volume piknometer

yaitu 10 ml. Dari data yang telah disebutkan didapat kerapatan ekstrak yaitu 1,124 g/ml.

Setelah diketahui kerapatan air dan kerapatan ekstraknya, bisa didapat bobot

jenis ekstrak menggunakan rumus :

Bobot jenis ekstrak = kerapatan ekstrak

Kerapatan air

dari hasil perhitungan didapat bobot jenis ekstrak yaitu sebesar 1,044.

Pemeriksaan parameter ekstrak yang selanjutnya dilakukan adalah menentukan

kadar air dalam ekstrak. Prosesnya, masukkan toluen sebanyak 200 mL ke dalam labu

dasar bulat. Setelah itu tambahkan ekstrak cair sebanyak 3 mL dan batu didih. Lalu

dipanaskan sampai air terpisah dari ekstrak. Toluen digunakan dalam proses ini karena

bersifat non-polar. Toluen berfungsi sebagai pelarut anethol yang juga bersifat non-

polar. Pada saat proses pemanasan, air yang bersifat polar akan memisah dengan

anethol yang terlarut dalam toluen. Toluen bersifat mudah menguap sehingga dapat

mempercepat pemisahan air dan ekstrak. Penggunaan batu didih bertujuan untuk

mencegah bumping dan menjaga agar pemanasan merata karena batu didih memiliki

pori-pori sehingga gelembung gas yang terbentuk kecil.

Pengukuran parameter ekstrak selanjutnya adalah pola kromatografi lapis tipis.

Kromatografi Lapis Tipis ( KLT) dilakukan dengan fasa diam silica gel GF 254 dan fasa

gerak pengembang dengan perbandingan yang cocok. Cairan pengembang yang dipakai

adalah campuran antara methanol ; etil asetat dan air dengan perbandingan 13,5 ; 100 ;

10. Pada penentuan pola KLT, ekstrak Rhei Radix yang didapat dari ekstraksi dengan alat

refluks berupa ekstrak cair digunakan sebagai sampel.Sampel yang ditutulkan sebanyak

dua buah dengan kepekatan yang berbeda.Hal tersebut dilakukan untuk mencegah

terlalu pekatnya sampel yang ditutulkan atau sebaliknya sehingga diperoleh pemisahan

komponen senyawa dalam sampel terjadi dengan baik.

Prosedurnya adalah ekstrak cair ditutulkan pada garis awal dengan menggunakan

pipa kapiler, dibiarkan beberapa saat hingga pelarutnya menguap.Pelat silica kemudian

dimasukkan ke dalam wadah yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan cairan

pengembang.Penempatan pelat pada pengembang tidak boleh melebihi garis yang

ditentukan pada pelat dan harus tegak lurus terhadap pengembang agar pergerakan

noda dan pembacaan harga Rf menjadi akurat. Proses kromatografi dihentikan sampai

cairan pengembang sampai garis depan. Kemudian pola kromatogram diamati dibawah

sinar tampak, lampu UV 254 dan 366 nm dan dihitung Rf serta hRf setiap bercak yang

teramati. Hasil kromatografi lapis tipis untuk ekstrak cair Rhei Radix yang dilihat pada

sinar tampak hanya terlihat dua buah bercak dengan warna kuning dan orange.Ketika

pelat diamati dibawah lampu UV 254 dan 366 nm terlihat tiga buah bercak dengan

warna yang khas namun tidak jelas.Hal itu terjadi karena cairan pengembang kurang

jenuh saat dipakai sehingga pola pada kromatogram sulit diamati.Setelah itu pelat

disemprot dengan penampak bercak dengan menggunakan penampak bercak

KOH.Setelah pelat disemprot, pola yang terjadi terlihat jelas dan tampak terdapat

sembilan buah bercak. Pada nilai Rf 0,025 didapat warna hijau , pada nilai Rf 0,1 didapat

warna coklat muda, pada nilai Rf 0,2875 didapati warna coklat hijau, pada nilai Rf 0,33

didapat warna kuning, pada nilai Rf 0,3625 didapat warna coklat, pada nilai Rf 0,4025

didapat warna kuning, pada nilai Rf 0,75 didapat warna kuning-jingga, pada nilai Rf

0,8375 didapat warna merah muda, pada nilai Rf 0,875 didapat warna kuning. Pada UV

254nm terlihat warna biru pada Rf 0,025, warna coklat pada Rf 0,2875, warna biru pada

nilai Rf 0,33 dan 0,4025, warna ungu pada Rf 0,3625 dan 0,8375, warna jingga pada Rf

0,875.

Pemeriksaan parameter ekstrak yang selanjutnya dilakukan adalah pola

dinamolisis. Metode dinamolisis dianalogikan sebagai kromatografi sirkuler. Prinsip

metode dinamolisis adalah difusi sirkuler. Pertama-tama ekstrak cair sebanyak 5 mL

dituangkan ke dalam cawan petri bersih. Kemudian buat lingkaran diatas kertas saring

Whatman berdiameter sebesar 10 cm lalu digunting. Bagian pusat lingkaran dilubangi

kemudian ditutup dengan kertas saring yang dibentuk seperti sumbu. Kemudian kertas

saring tersebut ditutupkan ke cawan petri yang berisi ekstrak cair sehingga ekstraknya

berdifusi melalui sumbu. Sumbu harus menyentuh dasar cawan petri agar menyentuh

ekstrak cair dan tidak boleh terlalu timbul karena dapat mengurangi keakuratan hasil

dinamolisis. Dan dari hasil difusi tersebut diperoleh 3 lingkaran dengan warna yang

berbeda. Warna pada diameter terkecil adalah putih kehijauan, warna pada diameter

sedang adalah hijau, dan warna pada diameter terbesar adalah putih kekuningan.

Warna yang dihasilkan ini menunjukkan komponen senyawa yang tekandung pada

ekstrak tersebut.

KCV dan KLT biasa

PEMBAHASAN KCV

Pertama-pertama, dilakukan preparasi kolom untuk fast chromatography. Kolom

berbentuk silinder dengan panjang kurang lebih 10 cm dan diameter kurang lebih 5 cm.

Pada dasar kolom telah terpasang kaca masir yang merupakan suatu penyangga berpori

yang berfungsi untuk menahan fasa diam. Kemudian dimasukkan fasa diam berupa silika

gel sebanyak 30 gram secara hati-hati dan disebar secara merata. Ketersebaran ini akan

sangat mempengaruhi dari efisiensi pemisahan yang akan dilakukan karena bila pada

fasa terdapat udara ataupun ketidaksamaan fasa diam seperti tidak samanya

kemampatan akan membuat derajat retensi dan kecepatan gerak dari eluen tidak stabil

sehingga akan mengakibatkan kecepatan gerak sampel tidak merata.

Setelah kolom siap, dimasukan eluen yang bersifat non-polar yaitu n-heksana

sebanyak 100 mL. Penggunaan n-heksana dengan volume sebanyak ini ditujukan

sebagai eluen non-polar sekaligus sebagai pembasah silika yang akan menghasilkan

bubur penjerap (silika gel) yang homogen sebelum dilakukan penghisapan

menggunakan pompa vakum. Pompa vakum pada dasarnya bekerja melalui mekanisme

mengurangi takanan udara di dalam kolom sehingga akibat perbedaan tekanan ini,

proses pergerakan eluen dalam kolom meningkat dengan pesat. Penjerap (silika gel)

perlu dibuat dalam bentuk bubur agar dihasilkan kolom yang baik dan tidak mudah

retak. Kolom yang dielusi dengan larutan pengelusi juga dimaksudkan untuk

memperoleh kolom yang stabil. Kolom yang stabil diperoleh apabila tetesan yang

dihasilkan sudah konstan. Setelah dihasilkan kolom yang mantap dijaga agar penjerap

tidak kering agar kolom tidak retak.

Setelah silika gel siap, maka dimasukkan 1 gram ekstrak yang telah terlebih dahulu

digerus dengan 10 gram silika. Penggerusan ini dimaksudkan untuk mengeringkan dan

menghomogenkan ekstrak dengan silika sehingga bila diletakkan pada kolom,

pemisahan dapat terjadi secara efektif. Penggerusan ekstrak dengan fasa diam ini pun

merupakan salah satu metode pemisahan yaitu metode pemisahan ekstrak kering. Silika

yang mengandung ekstrak kemudian dimasukkan diatas silika gel kolom secara merata.

Setelah itu, bagian atas ekstrak kemudian ditutup menggunakan kertas saring Whatman

yang telah disesuaikan diameternya dengan diameter kolom. Penggunaan kertas saring

ini ditujukan agar pelarut tidak mengabrasi ekstrak. Setelah itu labu Erlenmeyer

dibawah kolom dihubungkan dengan pompa vakum. Diperhatikan keberadaan silika gel

sebagai penjerap di semua tempat dalam kolom, karena adanya rongga-rongga udara

atau ketidakbersamaan penjerap dalam kolom akan berpengaruh buruk pada proses

pemisahan.

Larutan pengelusi disiapkan yaitu methanol air dan etil asetat dengan

perbandingan yang disusun pada 11 komposisi yang berbeda dengan kepolaran yang

terus dinaikkan. Pada kromatografi kolom, pemisahan pada dasarnya terjadi akibat

perbedaan migrasi diferensial melalui kolom yang berisi fasa diam. Ekstrak pada bagian

atas kolom kemudian dielusi menggunakan pelarut yang bertindak sebagai fasa gerak. Di

dalam kolom, komponen-komponen ekstrak akan terpisah sebagai pita-pita yang pada

elusi seterusnya akan keluar meninggalkan kolom sebagai fraksi-fraksi komponen yang

terpisah. Larutan fraksi komponen yang keluar dari kolom ditampung sebagai eluat yang

kemudian dianalisis lebih lanjut.

Perbedaan migrasi dalam kolom pada dasarnya dipengaruhi oleh kombinasi

beberapa faktor, namun faktor yang akan sangat berpengaruh ialah kepolaran eluen,

kepolaran komponen ekstrak dan jenis fasa diam. Sesuai dengan prinsip like dissolve

like, komponen ekstrak yang bersifat nonpolar akan lebih terikat pada eluen nonpolar

serta sebaliknya. Penggunaan pelarut non-polar dilakukan terlebih dahulu untuk

memisahkan komponen non-polar terlebih dahulu. Penambahan pelarut polar dilakukan

secara bertahap selain untuk meningkatkan kepolaran, juga untuk memudahkan proses

induksi polaritas dari eluen menjadi lebih polar.

Praktikum metode pemisahan ekstrak dari Rhei Radix pada dasarnya dilakukan

dengan metode fast chromatography dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan metabolit

sekunder dilakukan melalui dua tahap yaitu fraksinasi menggunakan kromatografi

kolom dipercepat atau fast chromatography menggunakan elusi gradien dengan

kepolaran eluen yang terus ditingkatkan serta untuk menganalisis metabolit sekunder

dari simplisia digunakan kromatografi lapis tipis.

Secara prosedural, pertama-tama dilakukan preaparasi kolom untuk fast

chromatography. Kolom berbentuk silinder dengan panjang kurang lebih 10 cm dan

diameter kurang lebih 5 cm. Pada dasar kolom telah terpasang kaca masir yang

merupakan suatu penyangga berpori yang berfungsi untuk menahan fasa diam. Setelah

kolom dibersihkan dan dibilas menggunakan eluen, bagian dasar kolom diatas kaca

masir dilapisi terlebih dahulu menggunakan kertas saring Whatman sesuai dengan

diameter kolom. Penggunaan kertas saring ini ditujukan agar fasa diam dapat tersusun

secara kompak dan merata.

Fasa diam berupa silika gel kemudian dimasukan secara hati-hati dan disebar

secara merata. Ketersebaran ini akan sangat mempengaruhi dari efisiensi pemisahan

yang akan dilakukan karena bila pada fasa terdapat udara ataupun ketidaksamaan fasa

diam seperti tidak samanya kemampatan akan membuat derajat retensi dan kecepatan

gerak dari eluen tidak stabil sehingga akan mengakibatkan kecepatan gerak sampel tidak

merata.

Setelah silika gel siap, maka dimasukkanekstrak yang telah terlebih dahulu digerus

menggunakasilika dengan perbandingan 1:1. Penggerusan ini dimaksudkan untuk

mengeringkan dan menghomogenkan ekstrak dengan silika sehingga bila diletakkan

pada kolom, pemisahan dapat terjadi secara efektif. Penggerusan ekstrak dengan fasa

diam ini pun merupakan salah satu metode pemisahan yaitu metode pemisahan ekstrak

kering. Silika yang mengandung ekstrak kemudian dimasukkan diatas silika gel kolom

secara merata. Setelah itu, bagian atas ekstrak kemudian ditutup menggunakan kertas

saring Whatman. Penggunaan kertas saring ini ditujukan agar pelarut tidak mengabrasi

ekstrak. Setelah itu labu Erlenmeyer dibawah kolom dihubungkan dengan pompa

vakum.

Setelah kolom siap, dimasukan eluen yang bersifat non-polar yaitu n-heksana.

Penggunaan n-heksana dengan volume sebanyak ini ditujukan sebagai eluen non-polar

sekaligus sebagai pembasah silika sebelum dilakukan penghisapan menggunakan pompa

vakum. Pompa vakum pada dasarnya bekerja melalui mekanisme mengurangi takanan

udara di dalam kolom sehingga akibat perbedaan tekanan ini, proses pergerakan eluen

dalam kolom meningkat dengan pesat.

Elusi yang dipakai merupakan elusi bergradien dengan komposisi eluen n-

heksana : etil asetat (100:0) sampai n-heksana : etil asetat (0:100) yang disusun pada 11

komposisi yang berbeda dengan kepolaran yang terus dinaikan. Pada kromatografi

kolom, pemisahan pada dasarnya terjadi akibat perbedaan migrasi diferensial melalui

kolom yang berisi fasa diam. Ekstrak pada bagian atas kolom kemudian dielusi

menggunakan pelarut yang bertindak sebagai fasa gerak. Di dalam kolom, komponen-

komponen ekstrak akan terpisah sebagai pita-pita yang pada elusi seterusnya akan

keluar meninggalkan kolom sebagai fraksi-fraksi komponen yang terpisah. Larutan fraksi

komponen yang keluar dari kolom ditampung sebagai eluat yang kemudian dianalisis

lebih lanjut.

Perbedaan migrasi dalam kolom pada dasarnya dipengaruhi oleh kombinasi

beberapa faktor, namun faktor yang akan sangat berpengaruh ialah kepolaran eluen,

kepolaran komponen ekstrak dan jenis fasa diam. Sesuai dengan prinsip like dissolve

like, komponen ekstrak yang bersifat nonpolar akan lebih terikat pada eluen nonpolar

serta sebaliknya. Penggunan pelarut non-polar dilakukan terlebih dahulu untuk

memisahkan komponen non-polar terlebih dahulu. Penambahan pelarut polar dilakukan

secara bertahap selain untuk meningkatkan kepolaran, juga untuk memudahkan proses

induksi polaritas dari eluen menjadi lebih polar.

Sejumlah 11 fraksi kemudian didapatkan. Secara organoleptis, fraksi-fraksi

memiliki warna yang bergradien dari fraksi 1 bening , fraksi 2 bening , fraksi 3 bening,

fraksi 4 kuning, fraksi 5 kuning, fraksi 6 kuning, fraksi 7 kuning, fraksi 8 kuning, fraksi 9

kuning, fraksi 10 kuning, fraksi 11 kuning dengan bau n-heksana dan etil asetat dan bau

khas Rhei Radix. Fraksi-fraksi ini kemudian dianalisis lebih lanjut menggunakan

kromatografi lapis tipis.

KLT

Pemeriksaan parameter ekstrak selanjutnya adalah melihat kromatogram lapis

tipis untuk mengetahui senyawa apa saja yang terdapat pada simplisia Rhei radix

berdasarkan nilai Rf.

Hal pertama yang perlu dilakukan adalah menyiapkan pengembang (kombinasi

pelarut dengan perbandingan yang cocok) sebagai fasa gerak.Berdasarkan literature,

untuk analisis Rhei radix bisa digunakan campuran pelarutdengan perbandingan pelarut

etil asetat :methanol dan air (100:13,5:10). Sebelum pelarut tersebut dicampurkan ke

dalam bejana pengembang yang terbuat dari gelas, mulut bejana dilapisi dengan vaselin

hal ini dilakukan agar penjenuhan dapat sempurna dengan tidak adanya uap yang keluar

karena pelarut yang digunakan bersifat volatile.Penjenuhan dilakukan minimal 1 jam.

Hal ini dilakukan agar proses absorpsi bisa lebih cepat.

Hal kedua yang perlu disiapkan adalah silika gel sebagai fase diamnya.

Permukaan gel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan

hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya

van der Waals dan atraksi dipol-dipol. Plat diberi batas garis atas dan bawah masing

masing 1 cm dari ujung-ujungnya. Garis batas bawah sebagai titik awal ekstrak yang

akan di analisis untuk bergerak dan juga batas pelarut, jangan sampai pelarut

merendam plat melebihi batas karena akan mengganggu hasil kromatogram. Sedangkan

garis yang berada di ujung atas sebagai batas bergeraknya pelarut/fase gerak. Garis ini

disebut juga garis depan. Jadi garis depan adalah titik tertinggi yang dicapai fasa gerak/

pelarut pada fasa diam setelah pengembangan selesai. Faktor retensi Rf diperoleh

dengan membandingkan jarak tempuh noda/komponen terhadap jarak tempuh pelarut

(garis depan). Pada percobaan, noda terakhir berada tepat pada garis depan, sehingga

diperoleh harga Rf =1. Pada garis yang di ujung bawah, dibuat 2 tanda titik sebagai

tempat penotolan ekstrak Rhei radix. Kedua titik tersebut berjarak sama 0,5 cm dari

sampingnya. Hal ini dilakukan agar jarak bercak yang terbentuk dapat berada pada

kondisi yang sama.

Ekstrak cair yang telah diperoleh ditotolkan di atas titik yang telah ditandai pada

plat. Pada titik sebelah kiri, ekstrak cair yang ditotolkan sebanyak 5 kali dan setiap

penotolan diberikan jarak waktu ke penotolan berikutnya agar pelarut yang masih

terdapat pada ekstrak cair dapat menguap sehingga tidak terlalu menggangu hasil

kromatogram. Penotolan dilakukan dengan menggunakan pipa kapiler. Untuk titik

sebelah kanan, penotolan dilakukan sebanyak 10 kali.

1 cm = y

8 cm = z

0.5 0.5 1 cm= x

Setelah dirasa cukup jenuh, plat dimasikkan kedalam bejana gelas yang

campuran pelarut. Plat harus diletakkan tegak lurus agar pemisahan dapat terjdai

dengan baik. Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-

komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda

bergerak pada laju yang berbeda. Kejenuhan bisa ditandai dengan adanya rasa hangat

pada luar bejana jika disentuh dengan tangan. Diusahakan bejana berada pada tempat

yang datar dan tidak bergerak-gerak agar fase gerak juga tetap stabil sehingga tidak

mengganggu pemisahan. Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama

akan melarutkan senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis

dasar. Senyawa-senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi

sebagaimana halnya pergerakan pelarut.

Selama pengembangan, komponen yang lebih polar akan terikat lebih kuat pada

lapisan silica gel sehingga akan tertahan lebih lama, sedangkan komponen yang kurang

polar akan cepat bergerak bersama campuran pelarut (yang relatif kurang polar jika

dibandingkan dengan silica gel). Kromatogram yang diperoleh menunjukkan adanya 4

bercak yang terpisah, berarti bahwa komponen yang berada di garis depan adalah

komponen yang paling kurang polar di antara komponen-komponen lainnya. Dari

percobaan,nomor bercak 4,5,6,dan7 Rf 0,9 sinar tampak warna kuning pada Uv 254

didapat warna coklat kecuali pada nomor 7. Pada UV 366 yang hanya menghasilkan

warna adalah pada nomor 4 (warna coklat) . Seharusnya digunakan larutan baku

pembanding untuk mengidentifikasi metabolit sekunder apa yang terdapat dalam

simplisia. Bentuk noda yang ideal pada kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis

adalah yang benar-benar bulat sehingga luas dapat diukur, tetapi pada prakteknya tidak

selalu bulat karena beberapa hal :

o Zat yang ditotolkan terlalu banyak (volume besar atau konsentrasi tinggi)

o Pada waktu pengembangan, lapisan tipis mudah rusak sehingga elusi noda tidak

bersamaan

o Bila menggunakan lebih dari satu pelarut, maka terjadi lebih dari satu front, sehingga

noda berbentuk garis tipis

o Bila satu komponen dapat terjadi dalam lebih dari satu bentuk, akan terjadi dua noda.

Metode yang cukup umum digunakan untuk deteksi kromatogram adalah

penggunaan sinar UV panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, khususnya untuk noda

yang tidak berwarna. Karena noda pada kromatogram yang diperoleh berwarna, noda

dapat dideteksi pada tiga keadaan, yaitu pada sinar biasa, sinar UV 254 nm dan 366 nm.

Untuk fasa diam silica gel biasa, fluoresensi di bawah sinar UV hanya terjadi jika

senyawa tersebut berfluoresensi.Tapi bila yang digunakan adalah silica gel

berfluoresensi, noda muncul sebagai bercak hitam. Dari percobaan, noda yang timbul

pada pengamatan disinar UV 254 nm (biasa) berwarna coklat sedangkan pada UV 366

nm terdapat bercak warna coklat

Jika didiamkan beberapa lama, noda pada kromatogram dapat hilang, untuk itu

digunakan suatu penyemprot bercak agar noda tetap terlihat.Penyemprot bercak yang

digunakan adalah KOH.KOH merupakan suatu penampak bercak yang umum digunakan.

Reaksi ini dapat terbentuk dengan pemanasan pelat pada 0-120°C. Dasarnya adalah

bahwa dengan pemanasan sampai 100°C, senyawa organik akan hangus/menjadi

karbon (arang) dan tampak berupa bercak hitam pada latar belakang putih. Karena itu

metode ini hanya cocok untuk fasa diam yang benar-benar berupa bahan anorganik

seperti silica gel maupun alumina, dan tidak dapat digunakan jika fasa diamnya adalah

bahan organik atau pelat yang menggunakan pati sebagai pengikat. Dari percobaan

terdapat warna kuning.

KLT preparative

Pada Praktikum ini dilakukan pemisahan tahap lanjut dari zat aktif pada ekstrak

setelah fast kromatografi.Sebelumnya telah dilakukan fast kromatografi dengan

menggunakan variasi pelarut sebanyak 11 fraksi. Namun yang akan digunakan untuk

tahap pemisahan lebih lanjut hanya satu yaitu yang paling baik pemisahannya. Pada

praktikum ini yang fraksi yang dipilih untuk tahap pemisahan selanjutnya adalah fraksi

ke empat, lima, enam dan tujuh yaitu dengan menggunakan pelarut n-heksan : etil

asetat = 1 : 10. sebab pada fraksi ini terdapat empat buah bercak bewarna kuning yang

jelas pada serapan UV 254. sehingga diperkirakan bahwa dengan pelarut tersebut, zat-

zat yang terdapat pada ekstrak Rhei Radix terpisahkan dengan baik.

Pemisahan tahap lanjut yang akan dilakukan adalah kromatogafi preparatif. Pada

kromatografi ini prinsipnya sama dengan kromatografi lapis tipis. Namun yang

membedakan adalah pada kronatografi ini plat silika gel yang dipakai lebih besar dan

lebih tebal. Hal ini dimaksudkan untuk memperoleh zat aktif lebih banyak. Sebab hasil

kromatografi yang diperoleh akan dikerok untuk dilakukan uji lanjut. Perbedaan yang

terdapat pada tempat penotolannya. Pada kromatografi preparatif ini tempat

penotolannya berupa garis, bukan berupa titik.

Fraksi yang akan diuji lebih lanjut tersebut kemudian diuapkan terlebih dahulu

untuk memperoleh fraksi yang lebih kental. Hal ini ditujukan agar fraksi tidak terlalu

encer. Sebab jika terlalu encer, jumlah fraksi yang harus ditotolkan akan menjadi

semakin banyak sehingga membutuhkan waktu yang lebih lama. Disamping itu resiko

kurangnya jumlah penotolan juga besar sehingga kemungkinan pita yang kita harapkan

pun menjadi tidak jelas. Namun, penguapan ini tidak boleh dilakukan terlalu lama.maka

fraksi yang diperoleh akan terlalu encer sehingga tidak dapat meresap kedalm silica gel

dan tidak dapat dilakukan KLT.

Selanjutnya fraksi yang telah dipekatkan tersebut ditotolkan di sepanjang garis

yang telah dibuat pada silika gel. Penotolan hendaklah dilakukan secara merata pada

sepanjang garis agar kromatogram yang diperoleh bagus dan tidak berbelok-belok.

Disamping itu penotolan jangan terlalu sedikit dan jangan terlalu banyak. Jika penotolan

terlalu sedikit maka kromatogram yang diperoleh akan menjadi tidak jelas dan zat yang

terpisahkan pun menjadi sangat sedikit. Namun jika penotolan yang dilakukan terlalu

banyak sehingga melebihi kapasitas plat, maka zat akan menjadi tidak terpisahkan. Oleh

sebab itu setelah penotolan dilihat pada sinar tampak apakah penotolan sudah cukup

atau belum. Garis penotolan tidak boleh terlalu dekat dengan dasar silika. Sebab jika

terlalu dekat dengan dasar silika, cairan fraksi akan telarut pada cairan pengembang.

Kemudian pengembang disiapkan dalam suatu chamber. Pengembang yang

digunakan adalah campuran n- heksan dan etil asetat dengan perbandingan 10 : 1.

Campuran cairan pengembang harus dihomogenkan agar memperoleh kepolaran yang

diinginkan. Selanjutnya plet kromatografi yang telah ditotolkan sampel diletakkan di

atas cairan pengembang. Kemudian dibiarkan sampai fasa gerak naik hingga garis batas

fasa gerak. Pada praktikum ini pita kromatografi yang dihasilkan tidak berbentuk lurus

melainkan berkelok-kelok. Hal ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya :

Permukaan chamber tidak rata sehingga dengan pengaruh gravitasi menyebabkan

perbedaan kecepatan naiknya pita.

Ketebalan silika gel yang tidak sama pada setiap sisi sehingga menyebabkan interaksi

silika dan zat berbeda antara satu sisi dengan sisi yang lain.

Penotolan yang tidak sama banyak pada sepanjang garis penotolan sehingga bagian

yang penotolan yang lebih sedikit akan bermigrasi lebih cepat (lebih jauh)

Pengembang belum jenuh benar sehingga daya tarik fasa gerak berbeda-beda pada

setiap sisi.

Memasukkan plat silika gel ke dalam chamber tidak vertical.

Hasil preparatif yang dikerok pita 1 kemudian setelah itu dimasukan kedalam

botol fial kemudian direndam dengan metanol samapai ada 2 fasa , yang fasa yang

bening yang didekantasi kemudian diuapkan , setelah itu di klt kembali . hasilnya :

Bomer bercak 1 Rfnya dihitung tiap titik 0, 270, 250, 230,240,260,290,35 sinar

tampak orange , di uv orange , penampak bercak uap amonia warnanya merah .

Pada KLT preparatif ini diperoleh tiga pita. Namun yang diambil hanya satu.

Sebab pita yang lan tidak bewarna maupun berflourosensi sehingga kemungkinan

hanya mengandung silika gel saja. pita tersebut kemudian dikerok dan hasil kerokan

dilarutkan dalam metanol untuk tahap pemisahan yang lebih lanjut hingga terbagi 2

fasa.

Uji tahap lanjut dari pemurnian Rhei radix ini adalah KLT dan KLT dua arah.

Kelima isolat yang telah dilarutkan dan disaring ditotolkan pada plat KLT. Jarak

penotolan antar isolat perlu dijaga agar bercak yang dihasilkan tidak saling tumpang

tindih satu sama lain pada saat kromatografi.

Dari hasil KLT biasa didapatkan hasil bercak nomor 1 dengan Rf yang dihitung

setelah disinarilampu UV 254nm masing-masing 0,27, 0,25, 0,23,0,24, 0,24, 0,26, 0,29,

0,35. kemudian pada isolat tiga terdapat hanya satu bercak jingga yaitu pada Rf ???

Kemudian untuk melakukan KLT dua arah kita membutuhkan plat yang

berukuran 4x4cm. Masing-masing jarak dari pinggir diberi batas 1cm sebagai batas awal

pergerakan pengembang dan batas akhir pengembangan. Lali ditutulkan isolat no dua

yang tadi telah diuji menggunakan KLT biasa, namun diketahui bahwa masih terdapat

dua bercak yang berarti isolat tersebut belum murni. Namun mengapa digunakan isolat

dua dengan beberapa pertimbangan, yang pertama, saat dilakukan penyemprotan

dengan uap amonia dalam metanol hanya terdapat satu bercak ungu yaitu pada Rf ??.

lalu alasan kedua digunakan isolat kedua adalah isolat kedua tersebut memberikan

bercak dengan posisi yang sangat berdekatan bahkan berhimpitan. Selain itu alasan

digunakan isolat dua dan bukan isolat 4, karena bercak yang dihasilkan isolat 4 berwarna

sangat pudar sehingga saat disemprotkan uap amonia dalam metanol warna bercak

tersebut hilang.

Kemudian setelah ditotolkan pada KLT dua arah dan kemudian dilakukan

pengembangan setelah beberapa menit dengan pengembang pertama, yaitu Toluen :

etil asetat (7 : 3), bercak tersebut naik mambentuk satu bercak berwarna jingga namun

setelah dilakukan pengembangan kedua dengan pengembang n-Heksan : etil asetat = 7

: 3 bercak tersebut naik perlahan dan menghasilkan dua buah bercak dengan hasil yang

berhimpitan. Maksud dari penggunaan pelarut yang berbeda pada kedu pengembangan

adalah agar mendapatkan hasil yang yang baik, maksudnya adalah pada pengembangan

kedua didapatkan pemisahan yang sempurna pada kdua bercak. Jika pengembang yang

digunakan pada kedua pengembangan, maka kedua bercak tersebut tidak memberikan

pemisahan.

Setelah disinari UV 254nm diperoleh bercak ungu dan jingga yang berhimpit dan

didapat Rf masing-masing 0,21 an 0,2. dari hasil yang diperoleh ini diketahui bahwa

isolat ke dua hasil KLT preparatif tidak murni, dapat dilihat dari hasil KLT dua arah yang

menghasilkan dua bercak bersinggungan dengan Rf yang mirip yaitu 0,21 dan 0,2.hal ini

juga berarti bahwa isolat kedua dari hasil KLT preparatif merupakan senyawa yang mirip

karena memiliki Rf yang mirip pula.

DAFTAR PUSTAKA

Alam, Gemini dan Abdul Rahim. 2007.Penuntun Praktikum Fitokimia. UIN.Alauddin:

Makassar. 24-26

Bambang. 2009. Rincian Simplisia Rhei Radix (Akar Kelembak). http://www.

farmasi.usd.ac.id/projects/simplisia/index.php/detail_simplisia/26

Departemen Kesehatan RI. 1980. Materia Medika Indonesia. Edisi IV.

Departemen Kesehatan RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan

Obat. Edisi I. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan,

Direktorat Pengawasan Obat Tradisional.

Harris, et.al. 1982. AN INTRODUCTION TO CHEMICAL ANALYSIS, Savders College

Publishing Philadelpia, Holt-Savders Japan.

Heftmann, E. 1983. STEROIDSDALAM KROMATOGRAFI, Fundamentals and Aplication,

Amsterdam.

Hendayana, Sumar, dkk. 1994. KIMIAANALITIK INSTRUMENTASI, IKIP Semarang Press,

Semarang.

Hostettmenn, K, dkk. 1986. CARA KROMATOGRAFI PREPARATIF, ITB, Bandung

Jim ,C.2007. Kromatografi Lapis

Tipis.http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/

kromatografi_lapis_tipis/

Mardoni, M.M. 2005. Perbandingan Metode Kromatografi Gas Dan Berat Jenis

Pada Penetapan Kadar Etanol Dalam Minuman Anggur. Tersedia

di:http://www.usd.ac.id/06/publ_dosen/far/mardoni.pdf

Sudjadi, Drs.1986,.Metode Pemisahan. UGM Press. Yogyakarta

Tjokronegoro, R. 2000. Teknik Pemisahan Kimia. Bandung: Jurusan Kimia

FMIPA UNPAD