Laboratoryjne metody wykrywania wirusów i ich przydatność w monitoringu terenowym Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Federal Federal na Agencja Środowiska, na Agencja Środowiska, Berlin, Berlin, Niemcy Niemcy EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
32
Embed
Laboratory jne metod y wykrywania w irus ów i ich przydatność w monitoringu terenowym
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka. Laboratory jne metod y wykrywania w irus ów i ich przydatność w monitoringu terenowym. Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, - PowerPoint PPT Presentation
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Komunikowanie ryzyka *Interaktywna wymiana informacji i opinii w zakresie ryzyka
Źródło:Źródło: WHO Food Safety WHO Food Safety
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Struktura ramowa analizy ryzyka
odpowiednie metody
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Dzisiaj nie będę mówić o…
Liczba kolonii DIN EN ISO 6222E. coli DIN EN ISO 9308-1 DIN EN ISO 9308-3
DIN EN ISO 9308-1 Enterococci DIN EN ISO 7899-2 DIN EN ISO 7899-1 DIN EN ISO 7899-2Pseudomonas DIN EN 12780aeruginosa
Parametr Dyr. UE dot. wody pitnej Dyr. UE dot. wody w kąpieliskach
... ale raczej o:
starych – ale reaktywowanych i w międzyczasie wystandaryzowanych – oraz nowych obiecujących metodach stosowanych w mikrobiologii wody i molekularnej wirusologii
(wzbogacaniu i oczyszczaniu wirusów z próbek wody, badaniu zakaźności bakteriofagów i wirusów, lub metodach wykrywania wirusów w oparciu o PCR…)
- badania liczebności i zakaźności bakteriofagów
DNA i RNA
- pobieranie próbek wody do analizy wirusów
- oczyszczanie wirusów z próbek wody przy użyciu
filtra z włókna szklanego
- ekstrakcja kwasu nukleinowego do analizy genomu wirusa
- rola inhibitorów środowiskowych
- wykrywanie wirusów metodami PCR
- badanie zakaźności wirusów w kulturze komórkowej
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
MS2
Fag138
PhiX174
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
PRD1
Morfologia płytek bakteriofagów
Próbki uzyskane z brudnych wód powierzchniowych:
zaleca się dodanie kwasu nalidyksowego, aby zapobiec wzrostowi innych bakterii
Morfologia płytek bakteriofagów
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
C.Fuchs
Badanie bakteriofaga – karta testu jakościowego
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
„Karta przewodnia” Kolifag somatyczny PhiX 174 Ar + Bri
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
20
.4.0
8
10
.5.0
8
30
.5.0
8
19
.6.0
8
9.7
.08
29
.7.0
8
18
.8.0
8
7.9
.08
27
.9.0
8
17
.10
.08
6.1
1.0
8
26
.11
.08
16
.12
.08
Data
pfu
/ m
l
x-3s x-2s x x+2s x+3s
Kontrolna seria z wzorcowym fagiem w tych badaniach jest na poziomie 45 pfu/ml
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Monitorowanie wirusów – pobieranie prób
Związki chemiczne
Wirusy
Rozkład statystyczny
Skupiska!
Próbobranie
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Ogólny zarys wykrywania wirusów w wodzie surowej
próbka
wody surowej
100 µl oczyszczonych kwasów nukleinowych wirusów
Próbka 10 ml odpowiednia dla biologii molekularnej i wirusologii
( DNA / RNA )
Infectivity assays
Wykrywanie wirusa metodą PCR
10-litrowa próba wody
1. Pobieranie prób wody o dużej objętości 2. Zmniejszenie objętości próbek (1:1000)3. Ekstrakcja kwasów nukleinowych wirusów 4. Testy wykrywające wirusy
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Klasyczne metody wzbogacania wirusów w próbkach wody
• Komórki A549 potraktowane próbkami wody z pozytywnym wynikiem testu Real-time PCR na obecność adenowirusa
• zakażone komórki wykazują efekty cytopatyczne (CPE) po 2-14 dniach
• następnie próbki poddaje się kolejnemu badaniu PCR „Integrated Cell Culture PCR“ (ICC-PCR)
Badanie zakaźności adenowirusa
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
(A. Heim)
Metody wykrywania wirusa
O zwiększonej czułości
Wykrywa żywe wirus nie nadające się do hodowli
Wykrywa jedynie żywe organizmy
Wykrywa zakaźnego wirusa
Skraca czas wykrywania
ICC-PCRRT-PCRHodowla komórkowa
Metoda wykrywania
Odporna na wpływ substancji hamujących PCR
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
a) Test TCID50 b) Test łysinkowy
Badanie zakaźności enterowirusa
kontrolna CVB3
Potwierdzenie obecności zakaźnych wirusów przez wyliczenie jednostek tworzących łysinki (pfu/ml) na komórkach HeLa. Charakterystyka wariantów wirusa Coxcakie B3 (CVB3) na wybranych liniach komórkowych
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Podstawowe techniki monitorowania wirusów
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka