i Université de Montréal La tagatose-1,6-bisphosphate aldolase et la fructose-1,6-bisphosphate aldolase de classe I : mécanisme et stéréospécificité. par Clotilde Low-Kam Département de Biochimie Faculté de Médecine Thèse présentée à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Philosophiae Doctora en Biochimie Août 2015
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Université de Montréal
La tagatose-1,6-bisphosphate aldolase et
la fructose-1,6-bisphosphate aldolase de classe I :
mécanisme et stéréospécificité.
par Clotilde Low-Kam
Département de Biochimie
Faculté de Médecine
Thèse présentée à la Faculté des études supérieures
en vue de l'obtention du grade de
Philosophiae Doctora en Biochimie
Août 2015
ii
Clotilde Low-Kam 2015
Université de Montréal
Faculté des études supérieures
Cette thèse intitulée:
La tagatose-1,6-bisphosphate aldolase et
la fructose-1,6-bisphosphate aldolase de classe I :
mécanisme et stéréospécificité
présentée par :
Clotilde Low-Kam
a été évaluée par un jury composé des personnes suivantes :
Pascal Chartrand, président rapporteur
Jurgen Sygusch, directeur de recherche
Gerardo Ferbeyre, membre du jury
Casimir Blonski, évaluateur externe
Javier di Noia, représentant du doyen
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Résumé
La tagatose-1,6-bisphosphate aldolase de Streptococcus pyogenes est une aldolase qui
fait preuve d'un remarquable manque de spécificité vis à vis de ses substrats. En effet,
elle catalyse le clivage réversible du tagatose-1,6-bisphosphate (TBP), mais également
du fructose-1,6-bisphosphate (FBP), du sorbose-1,6-bisphosphate et du psicose-1,6-
bisphosphate, quatre stéréoisomères, en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et en
glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Aldolase de classe I, qui donc catalyse sa réaction
en formant un intermédiaire covalent obligatoire, ou base de Schiff, avec son susbtrat, la
TBP aldolase de S. pyogenes partage 14 % d’identité avec l’enzyme modèle de cette
famille, la FBP aldolase de muscle de mammifère. Bien que le mécanime catalytique de
la FBP aldolase des mammifères ait été examiné en détails et qu’il soit approprié d’en
tirer des renseignements quant à celui de la TBP aldolase, le manque singulier de
stéréospécificité de cette dernière tant dans le sens du clivage que celui de la
condensation n’est toujours pas éclairci. Afin de mettre à jour les caractéristiques du
mécanisme enzymatique, une étude structurale de la TBP aldolase de S. pyogenes, un
pathogène humain extrêmement versatile, a été entreprise. Elle a permis la résolution
des structures de l’enzyme native et mutée, en complexe avec des subtrats et des
inhibiteurs compétitifs, à des résolutions comprises entre 1.8 Å et 2.5 Å. Le trempage
des cristaux de TBP aldolase native et mutante dans une solution saturante de FBP ou
TBP a en outre permis de piéger un authentique intermédiaire covalent lié à la Lys205,
la lysine catalytique. La determination des profils pH de la TBP aldolase native et
mutée, entreprise afin d'évaluer l’influence du pH sur la réaction de clivage du FBP et
iv
TBP et ìdentifier le(s) résidu(s) impliqué(s), en conjonction avec les données
structurales apportées par la cristallographie, ont permis d’identifier sans équivoque
Glu163 comme résidu responsable du clivage. En effet, le mode de liaison sensiblement
différent des ligands utilisés selon la stéréochimie en leur C3 et C4 permet à Glu163,
équivalent à Glu187 dans la FBP aldolase de classe I, d’abstraire le proton sur
l’hydroxyle du C4 et ainsi d’amorcer le clivage du lien C3-C4. L’étude du mécanimse
inverse, celui de la condensation, grâce par exemple à la structure de l’enzyme native en
complexe avec ses substrats à trois carbones le DHAP et le G3P, a en outre permis
d’identifier un isomérisme du substrat G3P comme possible cause de la synthèse des
isomères en C4 par cette enzyme. Ce résultat, ainsi que la decouverte d’un possible
isomérisme cis-trans autour du lien C2-C3 de la base de Schiff formée avec le DHAP,
identifié précedemment, permet de cerner presque complètement les particularités du
mécanisme de cette enzyme et d’expliquer comment elle est capable de synthétiser les
quatres stéréoisomères 3(S/R), 4(S/R). De plus, la résolution de ces structures a permis
de mettre en évidence trois régions très mobiles de la protéine, ce qui pourrait être relié
au rôle postulé de son isozyme chez S. pyogenes dans la régulation de l’expression
génétique et de la virulence de la bactérie.
Enfin, la résolution de la structure du mutant Lys229→Met de la FBP aldolase de
muscle en complexe avec la forme cyclique du FBP, de même que des études
cristallographiques sur le mutant équivalent Lys205→Met de la TBP aldolase de S.
pyogenes et des expériences de calorimétrie ont permis d’identifier deux résidus
particuliers, Ala31 et Asp33 chez la FBP aldolase, comme possible cause de la
v
discrimination de cette enzyme contre les substrats 3(R) et 4(S), et ce par encombrement
stérique des substrats cycliques.
La cristallographie par rayons X et la cinétique enzymatique ont ainsi permis d'avancer
dans l'élucidation du mécanisme et des propriétés structurales de cette enzyme aux
La tritration calorimetrique isothermique, (IsoThermal Calorimetry, ITC), est l’une des
méthodes les plus couramment utilisées pour étudier les interactions entre
macromolécules biologiques. Simplement, elle consiste à mesurer la chaleur libérée ou
absorbée lors de la liaison d’un ligand à un récepteur, et ce grâce à l’utilisation d’un
microcalorimetre très précis, comprenant deux cellules (Figure 38).
94
A. B.
Figure 38: Calorimétrie isotherme. A. Schéma d’un microcalorimètre. B. Courbe
isotherme type (Adapté de pharmaxchange.info)
L’une de ces cellules sert de référence et ne contient que de l’eau, alors que la seconde
contient l’échantillon d’intérêt. L’appareil maintient en tout temps ces deux cellules à
une température parfaitement égale en compensant, dans un sens ou dans l’autre, toute
différence de chaleur détectée. Le récepteur, ou protéine d’intérêt, est placé dans la
cellule de mesure, alors que le ligand dont on cherche à analyser la liaison au récepteur
est contenu dans une seringue controlée par un système d’injection automatique et
95
précis. Le ligand est injecté en une série de petits volumes dans la cellule de mesure. Si
liaison, et donc libération ou absorbtion de chaleur il y a, ces variations calorimétriques
seront détéctées par l’appareil, mesurées et compensées. Au fur et à mesure des
injections, les sites de liaison du ligand au récepteur sont occupés, jusqu'à leur
saturation : il n’y a plus alors d’échange de chaleur mesurable. La mesure de ce transfert
thermique permettra de determiner les constantes de liaison (KD), la stoechiométrie (n),
l’enthalpie (∆H) et l’entropie (∆S) de la réaction.
∆ = ∆ − ∆ Équation 8 ∆ = Équation 9
∆G : Energie libre de Gibbs ∆H : Variation d’enthalpie ∆S : Variation d’entropie T : Température en Kelvin R : Constante des gaz parfaits Kd : Constante de dissociation
Plusieurs données expérimentales peuvent ainsi être obtenues à partir d’une unique
expérience : la constante de dissociation, renseignant sur l’affinité du composé pour son
récepteur, mais aussi les contributions respectives de l’enthalpie et de l’entropie à
l’énergie de liaison, qui peuvent en éclaircir les modalités (rôle des ponts hydrogènes,
de l’expulsion de molécules d’eau, de changements conformationnels etcetera).
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CHAPITRE 2 : Article 1
Nous avons entrepris la résolution des structures de la TBP aldolase de Streptococcus
pyogenes native et mutée en complexe avec le TBP, le FBP et deux inhibiteurs
compétitifs analogues au FBP, le hexitol-P2 et le talitol-P2. Le piégeage de
l'intermédiaire FBP-iminium avec l'enzyme native et le mutant Glu163Gln a permis
d'observer les résidus impliqués dans la liaison du substrat et les changements
structuraux qui l'accompagnent. Nous avons donc pu observer que Glu163 interagit
avec l’hydroxyle du FBP C4, ce qui suggère que ce résidu soit responsable de
l'abstraction du proton menant du clivage du FBP.
Les résultats de cette étude ont été présentés dans un article intitulé «NON-
STEREOSPECIFIC SUBSTRATE CLEAVAGE BY TAGATOSE-BISPHOSPHATE
CLASS I ALDOLASE», soumis dans le Journal of Biological Chemistry.
J’ai produit et purifié toutes les aldolases, natives et mutantes, mentionnées dans
l’article. J'ai effectué toutes les collectes de données cristallographiques, mis à part celle
de la TBP aldolase native en complexe avec le DHAP-G3P, qui a été collectée par
Brigitte Liotard en 2006. J'ai résolu et exécuté les affinements de toutes les structures, et
j'ai procédé à l'analyse finale des structures et leur déposition dans la Protein Data
Bank. J’ai effectué la totalité des expériences cinétiques et celles d’isothérmie
calorimétrique. J’ai également réalisé les figures et rédigé le manuscrit avec le Dr.
Jurgen Sygusch.
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NON-STEREOSPECIFIC SUBSTRATE CLEAVAGE BY
TAGATOSE-BISPHOSPHATE CLASS I ALDOLASE
A CONSERVED CATALYTIC MECHANISM RESPONSIBLE FOR BOTH
4(R)-FBP AND 4(S)-TBP CLEAVAGE
Clotilde Low-Kam, Brigitte Liotard and Jurgen Sygusch1
From the Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Université de Montréal,
Montréal H3C 3J7, Québec, Canada
1Correspondance to: Jurgen Sygusch, CP 6128, Station Centre Ville, Montréal H3C 3J7, QC, Canada.
The Schiff base forming class I tagatose-1,6-biphosphate (TBP) aldolase from Streptococcus
pyogenes exhibits a remarkable lack of chiral discrimination, and is nonspecific with respect to the
epimeric configuration of hydroxyl groups at C3 and C4 positions of substrates. To elucidate the
enzymatic mechanism capable of generating chiral diversity from common substrates, high
resolution crystal structures were determined of TBP aldolase in complex with diastereoisomers,
fructose-1,6-bisphosphate (FBP) and TBP, and with competitive inhibitors, hexitol-1,6-
bisphosphate and talitol-1,6-bisphosphate. TBP aldolase in complex with FBP and with TBP was
cryotrapped as covalent Schiff-base intermediates under acid conditions to minimize substrate
turnover. In both Schiff base intermediates, the same active site residues make identical
interactions with both diastereoisomers, differing marginally in the attachment geometries of their
hydroxyl moieties. Binding geometry of competitive inhibitors, trapped as Michealis complexes at
pH 7.5, mimicked the covalent carbinolamine precursor. Structural and enzymological data
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support a reaction mechanism that implicates proton transfers catalyzed by the conjugate base of
Glu163 leading to C3-C4 bond cleavage in 4(S)-TBP and 4(R)-FBP. A Schiff base intermediate
formed with FBP cryotrapped at physiological pH in crystals of the catalytically compromised
mutant Glu163Gln corroborated the reaction mechanism. The active site architecture promotes
rotational isomerization in both aldehyde and ketone substrates. Equilibration of the rotamer
populations prior to C3-C4 bond formation forms the mechanistic basis for diastereoisomer
formation in the active site. Calorimetric measurements supported differential desolvation as a
basis for tighter ligand binding by the specific mammalian class I FBP aldolase compared to TBP
aldolase.
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Introduction
Aldolases are functionally important enzymes of sugar catabolism in living organisms due to
their essential role in metabolic pathways such as gluconeogenesis and glycolysis. Their ability to control
the stereochemistry of the carbon-carbon bond formation makes them models for de novo preparation of
carbohydrates (1), and ideal alternatives to traditional methods in synthetic organic chemistry (2, 3, 4).
Aldolases have thus been the focus of much interest as green biocatalysts and have been used successfully
to generate mono- and oligo-saccharides (5,6), enzyme inhibitors [1] or pharmaceutical intermediates (7,
8). Tagatose-1,6-bisphosphate (TBP) aldolase is an inducible enzyme, a component of the tagatose 6-
phosphate pathway used by Gram-positive bacteria to metabolize lactose and galactose (9).This enzyme
exhibits greatest affinity for D-tagatose-1,6-bisphosphate but uses also the bisphosphorylated D-hexose
stereo-isomers sorbose-P2, psicose-P2 and fructose-P2 as substrate (10) which are diastereoisomers and
differ in stereochemistry at carbon 3 and at carbon 4 with respect to the configuration of their hydroxyl
groups. The cleavage of the four phosphorylated sugars produces D-glyceraldehyde 3-phosphate (G3P)
and dihydroxyacetone phosphate (DHAP), while the condensation of G3P and DHAP produces a mixture
of the four D-hexoses in Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes (10, 11).
Mechanistically, two distinct classes of aldolases capable of catalyzing the same chemical reaction
can be recognized. Class I aldolases form Schiff-base intermediates in the active site (12, 13, 14) and
class II aldolases use a divalent transition metal ion cofactor, which acts as a Lewis acid to polarize the
substrate ketose in the active site (15, 16). Bacterial TBP aldolase is a class I aldolase and shares a
common (α/β)8 -TIM barrel fold with class I FBP mammalian aldolases as well as a high homology
among active site residues (11). Of all aldolases, the mechanism of the highly specific mammalian class I
FBP aldolase from rabbit muscle has been the most extensively studied (17, 18, 19, 20, 21, 22, 23) and is
summarized in Scheme I.
100
Scheme I : Intermediates of the catalytic mechanism of the class I FBP aldolase (23).
In the forward reaction (Scheme I), C3-C4 bond cleavage involves three essential catalytic residues.
Lys229 carries out the nucleophilic attack on the C2 ketone of the incoming FBP, yielding a neutral
carbinolamine species (1). Dehydration of the intermediate then produces the protonated iminium form of
the Schiff base (2). Glu-187 acts as a conjugate base that abstracts the proton of the C4 hydroxyl,
initiating C3-C4 bond cleavage following electron rearrangement (22, 23). An additional catalytic role of
Glu-187 has been postulated from kinetic and structural data (23) where Glu-187 mediates proton
transfers in carbinolamine formation. Lys-146 serves to stabilize the developing negative charge at the
C4-hydroxyl upon proton abstraction (23). Following G3P release from the active site; the enamine (3)
undergoes stereospecific proton transfer resulting in a new Schiff base that, following hydrolysis,
dissociates as DHAP, thereby regenerating the active site. Structures reported of rabbit muscle aldolase
bound to FBP and mannitol-P2 (MBP) (23) showed that the enzyme, albeit strictly specific for the 3(S)-
4(R)-FBP isomer in both the aldol and reverse-aldol reactions (24), was nevertheless capable of
promiscuous attachment by bisphosphorylated substrate analogues as long as the distance between
phosphates corresponded to the distance between the aldolase's P1 and P6 binding sites (23, 25, 26, 27).
Although binding of TBP, which competitively inhibits rabbit muscle aldolase, was observed
crystallographically, only densities for the P1 and P6 phosphate moieties were visible in the electron
density maps (23), corroborating the strict stereospecificity of the muscle isozyme.
The specificity of class I TBP aldolase from S. pyogenes was altered in a study (28) in which mutants
L275S and L165E and double mutant L165E/L275S alluded to substrate preference for FBP instead of
101
TBP; however substrate preference was derived on basis of activities measured at a single substrate
concentration1. One of the first enzyme used to establish the capability to alter the stereochemical
conclusion of an aldolase reaction was a class II bacterial TBP aldolase [2], whose natural and strict
(99:1) preference towards TBP was switched to a 4:1 preference towards FBP via directed evolution, after
structure-based mutagenesis of active site residues had failed to yield significant results. The changes
introduced by directed evolution (P256L and H26Y) were thought to induce subtle rearrangement of a
crucial arginine, Arg257, thought to bind the G3P moiety of the hexoses substrates, bringing about the
changes in discrimination observed. However, structural data to underpin this interpretation was not
reported.
Racemic aldol condensation products with respect to the configuration at C4 have been noted in a
number of aldolases. In 2-keto-4-hydroxyglutarate aldolase (29) and in L-fuculose-1-phosphate aldolase,
racemisation occurs at C4 of the condensation products, resulting from random orientation of the
aldehyde during stereofacial attack (30), and from its chemical nature (31). In contrast, configuration at
both C3 and C4 is not retained in the catalytic mechanism of the class I TBP aldolase from S. aureus (10)
and S. pyogenes (11) as aldol condensation yields a mixture of sorbose-P2, psicose-P2, fructose-P2 and
tagatose-P2. Attempts have been made to switch specificity of class II TBP aldolases; however these have
been met with limited success (32, 33).
Recent developments in the field of stereochemistry engineering have made progress and modified
the broad substrate specificity of the stereochemically promiscuous class I enzyme 2-keto-3-
deoxygluconate aldolase (KDGA), which normally produces a 55:45 mixture of D-2-keto-3-deoxy-
gluconate (KDGlu): D-2-keto-3-deoxy-galactonate (KDGal). The enzyme was altered to create a pair of
(Thr157Val/Ala198Leu/Asp181Gln) through structurally informed mutagenesis (34). More recently, the
stereochemical preference of the class II 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase BphI from Burkholderia
1 Our kinetic data for the mutant L275S stands in contradistinction with strong preference for TBP as substrate rather than FBP. The kcat values for both TBP and FBP substrates were 0.61 and 0.005 s-1 respectively and Km values of 1.68 mM and 3.50 mM respectively.
102
xenovorans was switched using site-directed mutagenesis from a strict preference for 4(S)-hydroxy-2-
oxopentanoate to both the 4(S)-enantiomer and the 4(R)-enantiomer 4(R)-hydroxy-2-oxopentanoate in
two variants, and to a strict preference for the 4(R)-enantiomer in the double mutants (35). In this study,
steric interference between the 4(R)-enantiomer of the substrate and Tyr290 was alleviated by mutating
the latter residue to phenylalanine and Leu87 to Asp or Trp. Since no structure of BphI was available, the
mutations were carried out using prior knowledge gained from the X-rays structure of its orthologue,
DmpG from Pseudomonoas putida.
Mechanistic insight into the loss of stereospecificity at the C3 position in the condensation reaction
was gained from a structural and kinetic analysis of S. pyogenes aldolase, highly homologous to S. aureus
aldolase (11). In this study, the loss of stereospecificity at C3 during condensation with the aldehyde
substrate was not due to degeneracy in active site recognition of DHAP, but was rather a consequence of
rotational isomerization in the carbanion intermediate around the DHAP C2-C3 bond. The isomerization
in the carbanionic intermediate enabled stereospecific proton transfer at the C3 position by a conserved
water molecule on both the carbanion si and re face, leading to the formation of both the 3(R) and the 3(S)
products. To investigate the mechanism of how the same enzyme generates enantiomeric promiscuity, but
at the C4 position, crystallographic and kinetic studies were undertaken of the class I TBP aldolase from
S. pyogenes.
We thus determined high resolution structures of the native TBP enzyme in complex with natural
substrates, FBP and TBP. As TBP aldolase crystals are catalytically active, covalent reaction
intermediates of native TBP aldolase formed with substrates were trapped under acidic conditions to
minimize single turnover. To ensure that the acidic cryotrapping conditions did not compromise structural
integrity, the crystal structures of the native enzyme in complex with competitive inhibitors, hexitol-P2
and talitol-P2, were also determined to high resolution under physiological conditions. The structural
studies were supported by pH-profile measurements to corroborate the identification of active site
residues responsible for nonspecific substrate cleavage in the Schiff-base adduct. In particular, the kinetic
103
studies sought to address whether the same or a different reaction mechanism mediated cleavage of the
C4 epimers in TBP aldolase.
The data analysis uncovered Glu163 and Lys125, homologous to Glu187 and Lys146, respectively, in
mammalian FBP aldolase, as the catalytic residues responsible for substrate cleavage. Their respective
contribution to enzymatic activity of TBP aldolase was then probed kinetically using isosteric mutants
Glu163Gln and Lys125Met, and crystal structures of the mutant structures were determined and assessed
to validate structural integrity of the mutant protein active sites. The very slow turnover of FBP by the
TBP mutant Glu163Gln at neutral pH made it possible to cryotrap 4(R)-FBP in complex with the mutant
enzyme in the crystal structure under physiological conditions, which served to validate the active site
architecture corresponding to incipient proton transfer during substrate cleavage. The structural analysis
of TBP aldolase crystals into which D-G3P and DHAP were diffused provided the conceptual basis for
understanding diastereoisomer formation by TBP aldolase.
Finally, given the high similarity of active site residues between the discriminating class I mammalian
FBP aldolase and the promiscuous TBP aldolase, calorimetric analysis using competitive inhibitors,
hexitol-P2 and talitol-P2 as probes was undertaken to assess the structural basis for large differences in
thermodynamic binding affinities of these two enzymes. In the specific mammalian enzyme, active site
ligand binding displaces a large number of tightly bound water molecules (23) while in the non-
discriminating TBP aldolase, water molecules participate in active site ligand binding, suggesting a
contributing role by water molecules in the modulation of binding affinity.
Experimental Procedures:
TBP, hexitol-P2 and talitol-P2 were a generous gift of Dr W. D. Fessner (University of Darmstadt).
Prior to use, the TBP cyclohexylammonium ion was exchanged for the sodium ion using a strong cationic
exchanger and neutralised with NaOH. TBP sodium salt was used in all experiments described. Hexitol-
1,6-bis(phosphate) and Talitol-1,6-bis(phosphate) were prepared by NaBH4 reduction of FBP as described
104
previously and yields a mixture of two diastereoisomers: (2R)-mannitol-1,6-bis(phosphate) and (2S)-
glucitol-1,6-bis(phosphate) (36) while reduction of TBP yielded 2(R)-talitol-1,6-bis(phosphate) and 2(S)-
allitol-1,6-bis(phosphate).
D-G3P, FBP, DHAP and TIM/GDH were obtained from Sigma-Aldrich.
Purification: Native and mutant TBP aldolase from S. pyogenes was expressed and purified as
reported previously [3, 4]. Briefly, plasmid pKK-223-3 coding for the enzyme and the corresponding
point mutants was transformed and overexpressed using the JM109 strain (Promega) in Escherichia coli.
Recombinant TBP aldolase was purified to homogeneity by a combination of three chromatographic steps
consisting of ion exchange (DEAE Sepharose Fast Flow), followed by hydrophobic affinity (Phenyl
Sepharose, Amersham Biosciences), and lastly a gel filtration column for final cleanup (SuperdexTM 200,
Amersham Biosciences).
Native FBP aldolase from rabbit muscle was also purified as described previously (23). Plasmid
ppB14 containing the recombinant gene for the enzyme was transformed and overexpressed in the BL21
star strain (Promega). FBP aldolase was then purified using an anion exchange chrmotagraphy (DEAE
Sepharose Fast Flow), followed by a CM cation exchanger (Sepharose Fast Flow), and polished by size
237.4 Space group P 21 21 21 P 21 21 21 P 21 21 21 P 21 21 21 Refinement Number of atoms Protein 10248 10415 10305 10312 Water 1238 1288 1326 1278 Hetero 5 Ca, 19 FBP,6
a Values in parentheses are given for the highest resolution shell. b Rsym = Σhkl Σi|Ii(hkl) - Ii(hkl)|/ Σhkl ΣiIi(hkl) with i running over the number of independent observations of reflection hkl. c Rpim = Σhkl √(1/(n−1)) Σi (|Ii−Imean|)/ Σhkl Σi(Ii) d Rmeas = Σhkl √(n/(n−1)) Σi (|Ii−Imean|)/ Σhkl Σi(Ii) e Rcryst = Σhkl||Fo(hkl)| - |Fc(hkl)||/Σhkl|Fo(hkl)| f Rfree = Σhkl∈T|| Fo(hkl) - |Fc(hkl)||/Σhkl∈T|Fo(hkl)| where T is a test data set randomly selected from the observed reflections prior to
refinement. Test data set was not used throughout refinement and contains 5% of the total unique reflections.
144
e Analyzed by MolProbity.
145
Table I. b: Data collection and refinement statistics for Glu163Gln mutant TBP aldolase
Unliganded FBP TBP hexitol-P2 talitol-P2 Data collection
a Values in parentheses are given for the highest resolution shell. b Rsym = Σhkl Σi|Ii(hkl) - Ii(hkl)|/ Σhkl ΣiIi(hkl) with i running over the number of independent observations of reflection hkl. c Rpim = Σhkl √(1/(n−1)) Σi (|Ii−Imean|)/ Σhkl Σi(Ii) d Rmeas = Σhkl √(n/(n−1)) Σi (|Ii−Imean|)/ Σhkl Σi(Ii)
146
e Rcryst = Σhkl||Fo(hkl)| - |Fc(hkl)||/Σhkl|Fo(hkl)| f Rfree = ΣhklT|| Fo(hkl) - |Fc(hkl)||/ΣhklT|Fo(hkl)| where T is a test data set randomly selected from the observed reflections prior to
refinement. Test data set was not used throughout refinement and contains 5% of the total unique reflections for all structures.
e Analyzed by MolProbity.
147
Table II: R.m.s.d of the alignment of the wild-type with the Glu163Gln mutant TBP aldolase native, in complex with FBP, TBP, hexitol-P2
and talitol-P2. The calculations were done using all subunits, unless otherwise stated. The values in parenthesis are for the A subunit only and
indicated the residue with the most important displacement when indicated.
r.m.s.deviations (Å) All Residues 100-230 Region 1 (25-50) Region 2 (250-255) Region 3 (275-290) WT-TBP subunits 0.163 ± 0.03
Table S1: Parameters of binding of FBP, TBP, hexitol-P2 and talitol-P2 with FBP aldolase of rabbit
muscle and TBP aldolase of S. pyogenes as determined by calorimetric titration (see Material and
Methods section).
Ligand Enzyme n K (L mol-1)
∆H (cal mol-1)
∆S (cal K-1 mol1)
-T∆S(cal
mol1)
∆G (cal
mol-1)
DHAP FBP aldolase
1.06± 0.059 1.02*105± 2.65*104
-3002±217.5
12.9 -3.84*103
-6842
Hexitol-P2
FBP aldolase
1.05±0.047 1.74*105± 6.55*104
5168± 286.2
41.3 -12.3*103
-7132
TBP aldolase
1.1±0.06 4.9*104±1.4*103
-1044±83.8
18.0 -5.36*103
-6404
Talitol-P2
FBP aldolase
0.99±0.032 4.07*105± 1.61*105
4220± 78.3
39.8 -11.8*103
-7580
TBP aldolase
1.08±0.06 4.05*104±9.5*103
-1097±82.1
17.4 -5.18*103
-6278
150
References:
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153
CHAPITRE 3 : Article 2
Nous avons ensuite effectué une étude des différences de spécificité entre la FBP
aldolase de mammifère et la TBP aldolase de S. pyogenes. Pour ceci, la structure du
mutant K229M de la FBP aldolase de mammifère en complexe avec le FBP cyclique a
été résolue. En parallèle, les structures du mutant équivalent de la TBP aldolase,
K205M, en complexe avec les inhibiteurs compétitifs hexitol-P2 et talitol-P2 ont
également été determinées. Ces données structurales ont permis de mettre en évidence
les résidus Ala31 et Asp33 de la FBP aldolase comme causes de l’absence d’activité
aldolasique de cette dernière sur les isomères du FBP, et ce par encombrement stérique.
Les résultats de cette étude ont été présentés dans un article intitulé
Rmeasd 0.113 (0.650) 0.120 (0.440) Unit cell parameters a(Å), b(Å), c(Å) 63.7, 106.2, 238.5 64.1, 108.2, 238.7 Refinement Number of atoms Protein 10248 10192 Water 2336 2597 Hetero - FBP atoms Sigma cutoff; I/σ(I) > 1 1 Rcryst (%)c 17.5 16.1 Rfree (%)d 21.8 19.9 Root mean square deviation
Bond length (Å) 0.005 0.004 Bond angle (˚) 0.929 0.869 Average B-factor (Å ) 32.75 22.22 Ramachandran analysis e (%)
Favoured 96.3 97.1 Allowed 3.7 2.9
a Values in parentheses are given for the highest resolution shell. b Rsym = Σhkl Σi|Ii(hkl) - Ii(hkl)|/ Σhkl ΣiIi(hkl) with i running over the number of independent observations of
reflection hkl. c Rpim = Σhkl √(1/(n−1)) Σi (|Ii−Imean|)/ Σhkl Σi(Ii) d Rmeas = Σhkl √(n/(n−1)) Σi (|Ii−Imean|)/ Σhkl Σi(Ii) e Rcryst = Σhkl||Fo(hkl)| - |Fc(hkl)||/Σhkl|Fo(hkl)| f Rfree = Σhkl∈T|| Fo(hkl) - |Fc(hkl)||/Σhkl∈T|Fo(hkl)| where T is a test data set randomly selected from the
observed reflections prior to refinement. Test data set was not used throughout refinement.
186
e Analyzed by MolProbity.
Table II: Parameters of binding of FBP, TBP, hexitol-P2 and talitol-P2 with K229M mutant
FBP aldolase of rabbit muscle as determined by calorimetric titration (see Material and
Methods section).
Ligand n K (L mol-1)
∆H (cal mol-1)
∆S (cal K-1 mol1)
T∆S (cal mol1)
∆G (cal mol-1)
FBP 0.898± 0.0077
1.16*106± 1.86*105
3318±49.4 38.9 11.6*103 -8274
TBP 1.26± 0.015
1.84*106± 5.29*105
1877±37.8 35.0 10.4*103 -8553
Hexitol-P2 0.825± 0.022
9.45*105± 2.87*105
4134±153.4 41.2 12.3*103 -8144
Talitol-P2 1.39± 0.017
2.92*106± 1.56*106
1554±35.6 34.8 10.4*103 -8816
187
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190
CHAPITRE 4: Discussion et conclusions
Résumé : Nos recherches nous ont permis de découvrir que la TBP aldolase de S. pyogenes, peu
stéréospécifique, était en fait capable de cliver les quatre isomères FBP, TBP, sorbose-P2 et
psicose-P2 grâce à un même résidu Glu, conservé à travers de nombreuses espèces aussi
dissimilaires et éloignées que des bactéries Gram positive, des archae ou des mammifères. Nous
avons également relevé que la spécificité sévère de la FBP aldolase de mammifère serait en fait
due à une incapacité à accommoder et surtout à décycliser les différents stéréoisomères du FBP,
et ce du fait d’encombrements stériques provoqués par Ala31 et Asp33.
Nous avions entamé notre étude du mécanisme de la tagatose-1,6-bisphosphate aldolase
de Streptococcus pyogenes en déterminant la structure native de l’enzyme et celle
complexée à son substrat à trois carbones le DHAP. Les cinétiques de transfert de
proton réalisées en conjonction avec l’étude structurale ont permis d’établir que
l’enzyme, qui est capable de synthétiser les quatre stéréoisomères 3(S)-4(R)-fructose-
1,6-bisphosphate et 3(R)-4(R)-psicose-1,6-bisphosphate, ne pouvait démarquer que le
côté pro-(S) du DHAP tritié. La formation des isomères 3(R) nécessite pourtant
l’attaque du côté pro-(R) du DHAP déprotonné sur le G3P. Notre analyse de la structure
de l’enzyme native et liée au DHAP nous a permis de postuler un isomérisme cis-trans
autour du lien C2-C3 de l’intermédiaire covalent, qui ainsi isomérisé en solution après
191
déprotonation en C3, pourrait attaquer le G3P à partir des deux faces si et re de
l’intermédiaire aldolase-DHAP. La présence d’une molécule d’eau conservée à
proximité du C3 de l’intermédiaire à caractère carbanionique laisse suggérer un rôle de
cette molécule de solvant dans le transfert de proton.
La résolution des structures de la tagatose-1,6-bisphosphate aldolase de Streptococcus
pyogenes native et mutée en complexe avec ses substrats FBP et TBP a permis de
déposer dans la Protein Data Bank les structures tridimensionnelles d’une TBP aldolase
de classe I exhibant un intermédiaire covalent en son site actif. Les structures de la TBP
aldolase native et du mutant Glu163Gln en complexe avec les deux inhibiteurs hexitol-
P2 et talitol-P2 ont également été résolues et sont rapportées au Chapitre 2. Les
cinétiques en fonction du pH réalisées sur l’enzyme native de même que sur le mutant
ont permis de désigner le résidu Glu163, équivalent du Glu187 dans la FBP aldolase de
mammifère, comme responsable de l’abstraction du proton OH du C4 de l’intermédiaire
enzyme-hexose menant au clivage du lien C3-C4.
En outre, la liaison de la TBP aldolase avec les quatre composés 3(S)-4(S/R) utilisés
dans cette étude nous ont permis de confirmer que la TBP aldolase ne discrimine pas les
susbtrats/inhibiteurs au niveau de leur hydroxyle. En effet, chaque composé est capable
de lier la TBP aldolase de façon presque isostérique, avec les sites de liaison aux deux
phosphates comme « points d’ancrage » invariants. Nous avons constaté que la TBP
aldolase pouvait lier également l’hexitol-P2 et le talitol-P2, ce dernier dans deux
conformations alternatives, l’une comparable à celle adoptée par l’hexitol-P2, le FBP et
le TBP, et l’autre qui voit le phosphate P2 lier le site P1 de l’enzyme et vice versa.
192
Les expériences de calorimétrie isotherme effectuées sur la TBP aldolase et la FBP
aldolase toutes deux natives ont de plus permis de déterminer qu’elles lient toutes deux
le DHAP, l’hexitol-P2 et le talitol-P2 avec des affinités inégales, beaucoup plus grandes
chez la FBP aldolase (μM) que la TBP aldolase (mM). Cette disparité a été confirmée
par des expériences spectrophotomètriques de détermination des Ki des deux
inhibiteurs. De plus, elles le font de façon exothermique pour la TBP aldolase et
endothermique pour la FBP aldolase et le ΔH°, l’enthalpie de liaison, est défavorable
chez la FBP aldolase, alors que la contribution de l’entropie à l’énergie de liaison y est
favorable. Les paramètres thermodynamiques de la TBP aldolase montrent eux une
enthalpie et une entropie favorables, bien que beaucoup plus restreintes que pour la FBP
aldolase. Ces inégalités de liaison, notamment des amplitudes de ΔH° et de ΔS
beaucoup plus conséquentes chez la FBP aldolase que chez la TBP aldolase, pourrait
avoir un lien avec la contribution des molécules d’eau du site actif à la liaison aux
substrats ou inhibiteurs. En effet, les structures cristallographiques ont montré que celle-
ci s’accompagne chez la FBP aldolase de l’expulsion de nombreuses molécules d’eau
du site actif, alors qu’elle se fait chez la TBP aldolase via des molécules d’eau qui
restent dans la cavité même après liaison du substrat ou inhibiteur. La
solvatation/désolvatation du site actif pourrait donc expliquer en partie les inégalités
d’affinité des deux enzymes à leurs substrats/inhibiteurs.
La taille respective des sites actifs de la TBP aldolase de S. pyogenes et de la FBP
aldolase de mammifère apporte un premier élément de réponse quant au manque de
spécificité de la TBP aldolase. En effet, il est d’environ 30 % plus volumineux chez la
193
TBP aldolase que chez la FBP aldolase, et peut accommoder le G3P dans diverses
conformations, ce qui pourrait expliquer la façon dont le DHAP peut attaquer la face si
et re de l’aldhéhyde pour former les stéréoisomères 4(S) et 4(R). La structure
cristallographique de la TBP aldolase en complexe avec le DHAP et le G3P montre
d’ailleurs le G3P lié dans sa cavité mais présentant son carbonyle vers la sortie du site
actif. Cette même structure permet de s’apercevoir que le G3P, grâce à une
isomérisation autour de son C1-C2, pourrait former les deux stéréoisomères cis et trans
et ainsi, en étant attaqué soit sur sa face re soit sur la si par le DHAP, générer les
hexoses stéréoisomères en C4.
Le Chapitre 3 expose les résultats de la dernière partie de notre exploration de la TBP
aldolase de S. pyogenes. Le mutant K205M, c'est-à-dire le changement du résidu
responsable de la formation de la base de Schiff en méthionine, a été cristallisé. Sa
structure libre de tout ligand, de même que ses complexes avec les inhibiteurs
compétitifs hexitol-P2 et talitol-P2 ont été résolues. En parallèle, les structures du mutant
K229M de la FBP aldolase de mammifère libre et lié au FBP ont été résolues. C’est la
forme cyclique du FBP, ses deux anomères α et β, qui a été piégée au site actif des
quatre monomères de l’unité asymétrique, dans une conformation qui évoque un rôle
d’une molécule d’eau dans le mécanisme d’ouverture du cycle, et ce par catalyse acide.
Glu163, encore, serait en position idéale pour activer cette molécule d’eau qui pourrait
ensuite protonner l’O5 faisant le pont dans le cycle via activation par Glu187. Malgré
tous nos efforts, le mutant équivalent chez la TBP aldolase, K205M, ne nous a pas
permis de capter ni le FBP, ni le TBP, ni même le DHAP sous quelque forme que ce
soit, au site actif de l’enzyme. Les données d’expériences d’ITC recueillies, et qui
194
montrent une grande différence d’affinité de la TBP aldolase pour le DHAP, l’hexitol-
P2 et le talitol-P2 par rapport à la FBP aldolase, affinité qui est exothermique chez la
TBP aldolase et endothermique chez la FBP aldolase, ont également signalé que
K205M ne se liait ni au TBP, ni au FBP, ni même au DHAP dans les conditions de
l’expérience, ce qui confirme les données cristallographiques obtenues. Nous avons
relevé que les structures du mutant K205M de la TBP aldolase sont caractérisées par
une rigidité des trois régions mobiles de la protéine, qui semblent dans ce mutant
adopter la conformation fermée qui n’est observée dans la structure native que
lorsqu’elle est liée à un de ses substrats/inhibiteurs. Le mutant de la FBP aldolase
K229M, lui, s’est montré capable de liaison à tous les composés testés.
C’est l’analyse des structures obtenues des deux aldolases mutées sur leur lysine
catalytique qui nous a permis de pointer du doigt une autre possible explication des
différences entre les deux enzymes quant à leur stéréospécificité : alors que le site actif
de la TBP aldolase native s’accommode très bien du docking du TBP, FBP, sorbose-P2
et psicose-P2 sous forme cyclique, celui de la FBP aldolase semble beaucoup moins
conciliant et exhibe des encombrements stériques entre ses résidus et certains atomes du
TBP, sorbose-P2 et psicose-P2 sous forme cyclique. C’est surtout Ala31 dont la chaine
latérale, bien que peu volumineuse, semble entrer en contact avec le C4-OH des
composés 4(S). De même, Asp33 semble entraver le positionnement du C3-OH des
substrats 3(R). Lorsque les formes acycliques de ces hexoses sont « dockées » dans le
site actif de la FBP aldolase, sous forme d’intermédiaires covalents, aucun
empêchement stérique ou géométrique n’est observé, et les quatres sucres
195
bisphophorylés stéréoisomères peuvent être accomodés dans la cavité. L’ensemble de
ces résultats permet de supposer que c’est en fait au niveau de la décyclisation du
substrat, catalysé dans les deux aldolases par Glu187/Glu163 et une molécule d’eau
conservée, que se ferait la discrimination de la FBP aldolase contre les isomères du
FBP.
Mécanisme de clivage de la TBP aldolase de S. pyogenes.
Le cycle catalytique commence par la liaison de la TBP aldolase à l’anomère β du FBP
ou du TBP (ou sorbose-P2 et psicose-P2). Celui-ci est présent à raison de 98 % sous
forme cyclique en solution, et à 70-80 % sous sa forme β. Une fois le FBP/TBP
cyclique présent dans le site actif, l’enzyme s’emploie, grâce à des molécules d’eau, à
catalyser l’ouverture du cycle furanose par catalyse acide. Le lien intramoléculaire O5-
C2 du FBP cyclique va ainsi être clivé via protonation de l’O5 par une molécule d’eau
observée au site actif (Figure 39). La structure cristallographique d’une aldolase
bactérienne liée au FBP cyclique suggérait déjà un rôle d’une molécule d’eau conservée
au site actif dans le mécanisme d’ouverture du cycle (Lorentzen, 2005). Bien que cette
structure envisageait un rôle de l’oxyanion phosphate dans l’activation de la molécule
d’eau catalytique, il semble que nos structures indiquent préférentiellement Glu163 dans
cette fonction. C’est encore Glu163, Glu187 dans la FBP aldolase de mammifère, qui
déprotonnerait le O2 du FBP/TBP (Figure 37), ce que l’étude de Lorentzen et. al ne
prévoyait pas et que le piégage du FBP cyclique au site actif du mutant K229M de la
196
FBP aldolase confirme. Lys205, rendue nucléophile grâce à un transfert de proton vers
Glu163, peut ensuite attaquer nucléophiliquement le C2 du FBP/TBP acyclique.
Glu163, dans un rôle multiple, doit donc être capable d’échanger continuellement son
proton avec Lys205 et d’activer la lysine de facon à ce qu’elle puisse attaquer le C2
après la décyclisation amenée par l’abstraction du proton en O2 du FBP/TBP cyclique
par le Glu. Le FBP/TBP acyclique est ensuite attaqué de facon nucléophile par la
Lys205, ce qui conduit à la formation d’une carbinolamine transitoirement dipolaire. La
protonation de l’O2 par Glu163 va permettre, via déshydratation de l’intermédiaire, de
former l’intermédiare iminium. À ce stade, la stéréochimie du substrat en son C4, R
pour le FBP et S pour le TBP, n’est pas capitale pour le bon fonctionnement de
l’enzyme quant au clivage de ces deux hexoses. En effet, son site actif peut accomoder
les deux isomères et ne discriminera pas selon l’orientation de l’hydroxyle en C4, ou
même C3 puisqu’il tolère le psicose-P2 et sorbose-P2. La formation de la base de
Schiff/iminium protoné est ultimement effectuée afin de faciliter l’abstraction du proton
de l’hydroxyle en C4, qui est rendu d’autant plus acide grâce au puit d’électrons du C2
de l’intermédiaire. C’est encore une fois Glu163 qui, en catalyseur basique cette fois,
est capable d’abstraire le proton de géométrie à la fois R et S. En effet, nos structures
cristallographiques montrent ce résidu à distance et orientation idéales pour ôter le
proton OH-C4 des intermédiaires FBP- et TBP-enzyme.
Le lien C3-C4 une fois clivé par réarrangement des électrons, le G3P peut être libéré. La
structure de la TBP aldolase en complexe avec le DHAP-G3P, que nous avons déjà
résolue, montre le G3P lié dans sa cavité (celle du P2), mais dans une position non
conductive à la formation ou au clivage immédiat du lien C3-C4 entre les deux
197
substrats, et qui pourrait indiquer le « trajet » réactionnel emprunté par le G3P quand il
rentre/quitte le site actif.
Le DHAP est ensuite hydrolysé par le mécanisme inverse de la formation de
l’intermédiaire covalent et peut, également, être relâché dans le milieu.
Figure 39 : Mécanisme de décyclisation catalysé par la FBP aldolase de
mammifère. Glu187 (Glu163 dans la TBP aldolase), déprotonne l’hydroxyle du C2, et,
au centre d’un transfert de protons avec une molécule d’eau conservée, protonne le O5
pour permettre l’ouverture du cycle.
198
Un mécanisme conservé …
Figure 40 : Vue stéréo de la superposition des intermediaires base de Schiff formés
par diverses aldolase de classe I. En cyan, la D-2-deoxyribose-5-phosphate aldolase
(DERA) de E. coli; en vert, la transaldolase B de E. coli; en violet la FBP aldolase de T.
tenax; en rose la KDPG aldolase de E. coli. La FBP aldolase de mammifère est en jaune
et la TBP aldolase de S. pyogenes en bleu (St-Jean, Lafrance-Vanasse et al. 2005). Les
résidus responsables de l’abstraction en C4-OH et du clivage sont entourés.
La superposition des structures de base de Schiff dans diverses aldolases de classe I,
parmis lesquelles la D-2-deoxyribose-5-phosphate aldolase (DERA) de E. coli (code
Protein Data Bank 1JCJ), la transaldolase B de E. coli (code PDB 1UCW), la KDPG
199
aldolase, toujours d’E. coli, (code PDB 1EUA), avec celle de la TBP aldolase de S.
pyogenes (code PDB 3MHF) est présentée Figure 40. Elle illustre la conservation du
mécanisme de clivage en positionnant le C4-OH du substrat de chaque enzyme
représentée face à un possible accepteur de proton, un Glu dans la plupart des cas, mais
également une Tyr pour la FBP aldolase de T. tenax et une molécule d’eau coordonnée
à une Lys pour la DERA de E. coli. Le mécanisme de clivage, essentiellement identique
chez de nombreuses espèces, implique donc un résidu parfois différent, et semble
indiquer une solution distincte quoique similaire trouvée par ces organismes à un
problème commun (St-Jean, Lafrance-Vanasse et al. 2005).
Chez la TBP aldolase de S. pyogenes, comme de nombreuses autres espèces donc, le
résidu responsable du clivage est un Glu, mais ce dernier est également à même
d’abstraire le proton sur les deux stéréochimies possibles du C4.
… mais un site actif accommodant.
C’est donc le résidu Glu163, équivalent de Glu187 dans la FBP aldolase, qui semble
être responsable du clivage des substrats 4(S) et 4(R) chez la TBP aldolase. Cette
observation, surprenante et quelque peu décevante, permet de conférer le même rôle de
catalyseur basique au même résidu chez la TBP et la FBP aldolase, bien que cette
dernière ne puisse utiliser les substrats 4(S). Les sites actifs des deux enzymes étant très
similaires, nous sommes obligés d’en déduire que de subtiles disparités entre les deux
permettent à la TBP aldolase non seulement de lier les divers composés, ce que la FBP
aldolase semble également être capable de faire au vu des expériences d’ITC, mais
200
surtout d’employer le mécanisme canonique des aldolases de classe I pour les cliver.
Son site actif, moins « rigide » que celui de la FBP aldolase, permet à tous les substrats
3(R/S)-4(R/S) d’adopter une conformation ad hoc pour la déprotonation en C4-OH par
Glu163. Il doit donc exister chez la FBP aldolase de mammifère un obstacle à une
pareille malléabilité du mécanisme de clivage conservé chez les classes I, et la TBP
aldolase ne serait pas tant une TBP aldolase qu’une FBP/TBP aldolase dégénérée. Nous
proposons ici que cet obstacle chez la FBP aldolase se situe au niveau de l’ouverture du
cycle furanose, et des recherches supplémentaires seront nécessaires pour confirmer nos
propositions.
La taille de la cavité du site actif de la TBP aldolase de S. pyogenes, que ce soit son site
de liaison au G3P comme celui au DHAP, permet d’ailleurs de commencer à
comprendre son absence de spécificité dans le sens de la condensation, cette fois.
En effet, alors que la formation des isomères en C3 peut être expliquée par l’isomérisme
cis-trans probablement possible autour du lien C2-C3 de l’intermédiaire enzyme-
DHAP, ce qui permet à la face si comme re du DHAP de jouer le rôle de donneur de la
réaction de condensation aldolique (LowKam, Liotard et al. 2010), c’est le volume
relativement plus important du site de liaison au G3P qui nous a permis d’éclairer la
synthèse des isomères en C4. Le site actif de la TBP aldolase est près de 30 % plus
volumineux que celui de la FBP aldolase, suggèrant que la TBP aldolase concède plus
de liberté de mouvement au G3P que la FBP aldolase, et expliquant que le G3P puisse
présenter sa face re comme si au DHAP qui mène l’attaque nucléophile. Une
observation similaire avait déjà été faite dans une FBP aldolase de classe II, celle de
201
Termus caldophilus, donc la cavité de liaison au G3P est de 25 % plus large que celle de
la TBP aldolase et de la FBP de classe II d’E. coli, et pourrait éclaircir son manque de
spécificité vis-à-vis du FBP et du TBP, qu’elle clive et condense tous deux (Lee, Bae et
al. 2006).
Chez une autre bactérie, E. coli, on retrouve les deux classes de FBP aldolases (Stribling
and Perham 1973), de même qu’une TBP aldolase, de classe II seulement. La FBP
aldolase de classe I est encodée par fbaB et est inducible par l’adjonction de substrats
gluconéogéniques uniquement, alors que celle de classe II, encodée par fbaA, est
exprimée de façon constitutive, impliquant l’aldolase de classe I dans la gluconéogénèse
et celle de classe II dans la glycolyse préférentiellement (Scamuffa and Caprioli 1980),
et liant la croissance et la survie de la bactérie dans divers milieux à sa capacité à
adapter son métabolisme (voir section suivante). Sa FBP aldolase de classe II est
hautement spécifique à son substrat le FBP, mais sa TBP aldolase démontre peu de
contrôle sur l’issue de la réaction et est capable d’accepter le glycoaldéhyde, le L-
glyceraldéhyde, l’acétaldéhyde et l’isobutyraldéhyde comme accepteur aldéhyde, ce que
sa FBP aldolase ne fait pas. Une étude structurale de la TBP aldolase de classe II avait
du reste conclut que son manque relatif de stéréocontrôle était du à la plus grande liberté
de mouvement permise au G3P dans sa cavité, plus spacieuse que celle de la FBP
aldolase de classe II (Hall, Bond et al. 2002). Quatre mutations,
H26Y/D104G/V121A/P256L, ont été réalisées par évolution dirigée et ont permis de
renverser la spécificité de l’enzyme dans le sens de la condensation, d’un ratio 99:1 en
faveur du TBP dans l’enzyme native vers un ratio de 4:1 pour le FBP dans l’enzyme
202
mutée (Williams, Domann et al. 2003). Asp104 forme un réseau de ponts H avec His83,
l’une des trois histidines coordonnant le cation obligatoire, et Asp82, le résidu
responsable de la protonation/déprotonation en C4-OH. His26 est située entre le site
actif et une boucle contenant Pro256 et Arg257, responsables de la liaison au P6
phosphate. Les changements introduits par l’évolution dirigée ont donc permis de
subtilement repositionner les deux subtrats et ainsi produire les changements de
stéréochimie observés. Ces quatres mutations ne touchent pas de résidus directement
impliqués dans le mécanisme, que ce soit de clivage ou de condensation; d’ailleurs une
étude précédente, qui avait muté les résidus du site actif par mutagénèse dirigée basée
sur la structure (Zgiby, Thomson et al. 2000), n’avait pu parvenir à un résultat concluant
quant au renversement de la spécificité de la TBP aldolase de classe II. La mutagénèse
basée sur la structure seule n’est ainsi pas toujours efficace, et l’évolution dirigée
semble une méthode alternative avantageuse pour parvenir à introduire chez les
enzymes les caractéristiques désirées.
203
Signification microbiologique.
La voie du tagatose-6-phosphate est encodée par l’opéron lac (lacABCD) des bactéries à
acide lactique (Bissett and Anderson 1980). Cette voie, en lui permettant de cataboliser
le lactose et le galactose directement sans passer par la glycolyse, à l’inverse de la voie
de Leloir par exemple (Holden, Rayment et al. 2003), est essentielle à la survie de
Staphylococcus aureus dans les milieux riches en lactose comme le lait, puisque, si
inactivée, elle voit l’accumulation du galactose et du lactose et l’inhibition de la
croissance de la bactérie (Bettenbrock, Siebers et al. 1999). La bactérie ainsi mutée est
également incapable de croitre dans des milieux riches en fructose et en deux de ses
stéréoisomères en C2, le mannitol et le glucitol.
Chez Streptococcus bovis, la croissance se fait plus rapidement dans le glucose que dans
le lactose, et les quantités intracellulaires en FBP sont beaucoup plus faibles dans les
milieux riches en lactose (Bond, Tsai et al. 1998). Le glucose et la moitié glucose du
lactose étant métabolisés par la glycolyse, il en résulte des concentrations en FBP
élevées, intermédiaire métabolique que la voie du tagatose-6-phosphate, responsable de
la dégradation de la moitié galactose du lactose, ne produit normalement pas. Un mutant
capable de métaboliser simultanément le lactose (galactose) et le glucose s’est avéré
capable de croitre plus rapidement dans le glucose, et S. bovis sauvage peut croître sur
le galactose et le mélibiose, un mélange de sucres contenant une moitié galactose, mais
en mettant également à contribution la glycolyse via la galactokinase et la voie de Leloir
(Bond, Tsai et al. 1998). Les bactéries à acide lactique, qui démontrent une énorme
capacité à utiliser divers sucres comme source d’énergie tout en s’adaptant à différentes
204
conditions environnementales et en modifiant leur métabolisme, ont d’ailleurs prouvé
que leur abilité à co-métaboliser différents substrats carbonés était nécessaire à leur
survie. D’autres bactéries peuvent également métaboliser simultanément des substrats
glycolytiques et gluconéogéniques, c'est-à-dire entrant dans la glycolyse avant et après
la FBP aldolase respectivement, et cette capacité est essentielle par exemple à
Mycobacterium tuberculosis pour survivre in vitro et infecter in vivo (Puckett, Trujillo
et al. 2014).
Dans les faits, le lien entre disponibilité et variabilité des substrats sucrés et la
croissance des bactéries a été établi par des études qui se sont penchées sur les motifs
d’expression de gènes dans différentes milieux de croissance (Chaussee, Dmitriev et al.
2008, Sitkiewicz and Musser 2009). La glycolyse, voie métabolique préferentielle des
bactéries à acide lactique en croissance rapide, voit l’oxydation d’une molécule de
glucose aboutir en la formation de deux molécules d’ATP. Ce résultat, peu
énergiquement rentable, se fait via la réduction du NAD+ en NADH, co-facteur de la
glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase. Afin de conserver l’équilibre rédox de la
la cellule, deux molécules de cet accepteur d’éléctrons doivent donc être ré-oxydées par
molécule de glucose consommée, et cette régénération se fait grâce à la lactate
déshydrogénase. Cette enzyme tétramérique transforme les deux molécules de pyruvate
produites par la glycolyse en lactate, et a comme activateur allostérique puissant le FBP
(Crow and Pritchard 1977). L’enzyme de S. pyogenes est, des quatre bactéries à acide
lactique étudiées dans un récent article, celle qui est la plus sensible et donc dépendante
à l’activation par le FBP (Feldman-Salit, Hering et al. 2013). Il serait intéressant de se
205
demander si la capacité de la TBP aldolase de cet organisme à synthétiser le FBP de
même que son substrat préféré le TBP pourrait conférer un avantage à la bactérie en lui
permettant de conserver un flux rapide à travers la glycolyse et ainsi prospérer dans
divers milieux.
206
CHAPITRE 5: Perspectives
5.1 Stéréospécificité
En 2011, (Lee, Kim et al. 2011) a publié un article qui s’est attaché à étudier les
déterminants du manque de stéréospécificité de LacD.2 (notre TBP aldolase). Les
auteurs ont ainsi muté les deux résidus du site actif Leu165 et Leu275 en résidus
correspondant dans la FBP aldolase de mammifère, Glu189 et Ser300, et en ont conclu
que leurs mutants Leu165Glu et Leu275Ser ainsi que leur double mutant
Leu165Glu/Leu275Ser présentaient une préférence accrue pour le FBP par rapport à
l’enzyme native. Ayant nous-même synthétisé le mutant Leu275Ser, nous avons essayé
de reproduire ces résultats, sans aucun succès malheureusement. En effet, notre mutant
Leu275Ser exhibe au contraire une préférence encore plus marquée pour le TBP dans
nos essais enzymatiques, de l’ordre de 10:1 en faveur du TBP dans le mutant versus 4:1
environ dans l’enzyme native.
Ces expériences de mutagénèse dirigée dans le site actif à des fins de
renversement/contrôle de la spécificité de l’enzyme, à l’intérêt évident, sont donc
indéniablement à refaire et devraient être complétées par des mutations d’autres résidus
du site actif. Plusieurs candidats attrayants existent, comme Asp27, Gln28 et Leu98 qui
remplace la Lys107 de la FBP aldolase. Nous avons déjà résolu les structures de
Asp27Asn, Gln28Glu, Leu275Ser et Leu275Ala non liées et en complexe avec
207
différents substrats, et des explorations cinétiques, calorimétriques et bio-informatiques
seraient donc nécessaires pour compléter ces études structure/fonction de cette enzyme.
Il serait également envisageable d’entreprendre une campagne d’évolution dirigée de la
TBP aldolase, comme cela a déjà été pratiqué à de nombreuses reprises dans des
aldolases à spécificité dégénérée (voir partie 1.2 de cette thèse), et ce afin de peut-être
mettre à jour des déterminants de son manque de stéréospécificité et de son mécanisme
que seule la mutagénèse basée sur la structure n’a pas encore été capable de dévoiler.
5.2 Mouvements conformationnels
Un analyse de dynamique moléculaire sur les trois régions mobiles de la TBP aldolase a
l'entrée de son site actif serait également pertinente. En effet, nous avons vu que leur
position et leur stabilité dépendait de l’état de liaison au site actif, et que leurs
mouvements étaient beaucoup plus larges que ceux des régions correspondantes de la
FBP aldolase de mammifère. En outre, la résolution des structures de certains mutants
de résidus du site actif, notamment Lys205 et Leu275, nous a enseigné que ces
mutations au sein du site actif influaient sur la mobilité de ces trois régions, qui dans les
structures cristallographiques de Lys205Met et Leu275Ser non liées étaient plus rigides
et adoptaient la conformation fermée de la protéine même sans ligand au site actif. Une
analyse plus approfondie de ces résultats, de même que des dynamiques moléculaires
coarse grain par exemple, pourrait aider à mieux comprendre ce phénomène. Des
expériences in silico semblables ont par exemple permis de réaliser que les larges
mouvements conformationnels subis par la FBP aldolase et la TBP aldolase de E. coli
208
après liaison à ses substrats sont primordiales (Katebi and Jernigan 2015). Ils facilitent
en effet le mécanisme catalytique en aidant le recrutement du substrat dans la
conformation ouverte et en amenant les résidues du site actif dans leur conformation la
plus active.
Chez l’enzyme immédiatement en amont de la TBP aldolase dans l’opéron lactose et
dans la voie du tagatose-6-phosphate, LacC ou tagatose-6-phosphate kinase, des
mouvements conformationnels après liaison sont essentiels au mécanisme, et ce en
assistant le recrutement des co-facteurs obligatoires, le magnésium et l’ATP (Miallau,
Hunter et al. 2007).
5.3 Rôle dans la virulence de S. pyogenes
Pour terminer, au-delà de son activité purement métabolique, et par extension de ses
applications à la synthèse chimique, la TBP aldolase de S. pyogenes pourrait également
démontrer un rôle de senseur et par extension, de régulateur de virulence chez la
bactérie (Loughman et Caparon, 2006). Il est déjà connu que des enzymes
glycolytiques, comme l’hexokinase, la lactate déshydrogénase ou encore la
glyceraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, ont été adaptées afin de jouer un rôle de
régulation de l’expression génétique chez certains organismes (Kim et Dang, 2005).
209
Figure 41 : Alignement de séquence primaire entre LacD.1 (LACD1_STRP1) et
LacD.2 (LACD2_STRP1) de S. pyogenes. Les résidus identiques sont surlignés de gris
foncé; les similaires de gris clair.
L’autre isozyme de la TBP aldolase chez S. pyogenes, la TBP aldolase 1, ou LacD.1,
avec laquelle elle partage 72.6 % d’identité et 82 % de similarité de séquence (Figure
41), serait pour sa part capable de lier directement RopB, un facteur impliqué dans la
régulation du métabolisme du streptocoque, et dans l’activation de l’expression de
certains gènes impliqués dans sa virulence, dont celui codant pour SpeB (section 1.1)
(Loughman et Caparon, 2006; Loughman et Caparon, 2007 ;(Cusumano and Caparon
2013). Le gène codant pour cette protéase à cystéine est l’un des plus hautement
exprimé in vivo lors d’une infection par S. pyogenes, et répond à différents signaux
environnementaux. Or, le mutant LacD.1- n’est plus sensible à ces signaux, et présente
une expression aberrante de SpeB, phénotype complètement corrigé par l’introduction
210
d’un plasmide codant pour LacD.1. Dans le modèle proposé dans l’étude citée, la
liaison de LacD.1 à ses substrats, DHAP et G3P, en conditions d’excès d’énergie via la
glycolyse, y induirait un changement conformationnel qui lui permettrait de séquestrer
RopB, inhibant ainsi l’activation des gènes cibles de RopB, dont celui de SpeB. Ce rôle
de senseur métabolique et de régulateur de virulence serait donc subordonné aux
différents changements conformationnels adoptés par cette aldolase après liaison à son
(ses) substrat(s). La structure cristallographique de LacD.1 a récemment été résolue
(Lee, Kim et al. 2011), mais la co-structure de LacD.1 en complexe avec RopB serait
évidemment beaucoup plus excitante et pourrait ouvrir la voie à des tentatives de
modulation de cette interaction protéine-protéine par mutagénèse dirigée. Notre
laboratoire a déjà à sa disposition les plasmides codant pour la TBP aldolase LacD.1 et
RopB recombinants, et nous avons déjà effectué des essais de co-cristallisation.
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