La Resonancia Magntica Nuclear (RMN) es la herramienta analtica
que proporciona mayor informacin estructural y estereoqumica en un
tiempo asequible. La tcnica no es destructiva y tiene aplicaciones
en todas las reas de la Qumica y en algunas de la Biologa.
Disponiendo de accesorios adecuados permite la observacin de
tejidos (accesorio de microimagen). Con otros tipos de instrumentos
es una tcnica de diagnstico en Medicina. Esta multidisciplinariedad
y el coste de los instrumentos, fuera del alcance de cualquier
Departamento, hacen a la RMN objeto de un servicio general en todas
las Universidades modernas.La Resonancia Magntica Nuclear es una
espectroscopia de absorcin cuyo fundamento es la absorcin de energa
(radiofrecuencias) por un ncleo magnticamente activo, que est
orientado en el seno de un campo magntico, y que por efecto de esa
energa cambia su orientacin. Las partes fundamentales de un
espectrmetro de RMN son un imn, actualmente una bobina
superconductora, que suministra el campo magntico principal, un
oscilador de radiofrecuencias que suministra la energa necesaria
para cambiar la orientacin de los ncleos, una bobina detectora que
recibe las seales y un sistema informatizado que gobierna todo el
aparato y que incluye un sistema de amplificacin y registro.Entre
los ncleos ms frecuentes en los compuestos orgnicos son
magnticamente activos el protn (1H), carbono (13C), nitrgeno (15N),
fsforo (31P) y flor (19F).Las muestras, generalmente, son
disoluciones en disolventes que no tengan tomos de protio (1H).
Frecuentemente se usan el deuterocloroformo,
hexadeuterodimetilsulfxido, xido de deuterio, deuterobenceno,
deuteropiridina y otros.Los espectros ms comunes son
representaciones de la intensidad de absorcin frente a la
frecuencia de resonancia (generalmente a travs del parmetro ) y
presentan seales cuya posicin, forma y tamao estn ntimamente
relacionadas con la estructura molecular. El anlisis detallado de
estos espectros proporciona valiosa informacin estructural y
estereoqumica. Espectros bidimensionales permiten relaciones entre
distintos ncleos o distintas magnitudes del mismo ncleo.Adems, el
equipamiento del servicio permite el estudio de muestras en estado
slido. La RMN en estado slido es una tcnica adecuada y cada vez ms
utilizada para el estudio de las propiedades estructurales de una
amplia variedad de materiales amorfos o poco cristalinos. A
diferencia de las muestras en disolucin, las muestras en estado
slido dan lugar a espectros con seales anchas, resultado de la suma
de diversos factores. Estos espectros, sin embargo, contienen
informacin nica acerca de la estructura y la dinmica de los
materiales estudiados.Las interacciones responsables del
ensanchamiento de las seales son la anisotropa del desplazamiento
qumico, los acoplamientos dipolares (homo y heteronucleares) y el
acoplamiento cuadrupolar. Se han desarrollado tcnicas que permitan
obtener espectros de alta resolucin conservando en lo posible la
informacin que aportan estas interacciones: giro con ngulo mgico
(MAS, Magic Angle Spinning), polarizacin cruzada (CP, Cross
Polarization) o secuencias multipulso especficas para slidos
(CRAMPS, Combined Rotation and Multiple Pulse Spectroscopy).El
desarrollo de los mtodos indicados anteriormente ha permitido el
uso de la RMN en estado slido para el estudio estructural de
sustancias poco solubles, como polmeros, vidrios, cermicas,
resinas, etc., siendo una alternativa muy interesante para
materiales de baja cristalinidad que no pueden ser estudiados por
tcnicas de difraccin. Tambin permite el estudio de factores
dinmicos difcilmente observables por otras vas. Existe, as mismo,
gran nmero de estudios realizados sobre materiales biolgicos:
virus, molculas fibrilares (seda, colgeno, celulosa), protenas,
carbohidratos...o compuestos con fines farmacuticos (estudio de
polimorfos).La tcnica aporta una informacin complementaria a otras
ms convencionales en la caracterizacin de fases condensadas. Por
una parte, permite el estudio a corto alcance de materiales
estructuralmente desordenados y, por otra, diferencia tomos con
nmeros atmicos similares.Finalmente, indicar que este es un
servicio abierto que puede usar cualquier organismo pblico o
privado interesado en el anlisis estructural
qumico.https://investigacion.us.es/scisi/sgi/servicios/rmnFundamento
de la Tcnica
La Resonancia Magntica Nuclear (RMN) es una tcnica
espectroscpica no destructiva, basada en las propiedades magnticas
de la materia y aplicada a cualquier sustancia qumica en estado
lquido o slido que contenga ncleos con espines nucleares. La
Resonancia Magntica Nuclear es una de las tcnicas espectroscpicas
ms utilizadas en la actualidad que permite resolver diversos
problemas de la investigacin qumica y de control de
calidad.Aplicaciones
La tcnica de Resonancia Magntica Nuclear comprende aplicaciones
como son: elucidacin estructural, determinacin conformacional,
establecimiento de equilibrios qumicos, cinticas qumicas,
cuantificacin de mezclas, control de calidad, anlisis
conformacionales y estereoqumicos, entre otros.Los ensayos se
realizan en solucin con muestras solubles en disolventes
deuterados, o bien se puede realizar RMN de slidos para muestras
insolubles.Existe tambin, la posibilidad de realizar ensayos a
temperatura variable cuando la investigacin as lo
requiere.Servicios
En el Laboratorio de Resonancia Magntica Nuclear del Instituto
de Qumica, se cuenta con equipo y personal capacitado que permite
ofrecer un servicio de calidad en la obtencin de los
espectros.Entre otros se pueden obtener: Espectros en una dimensin
deH yC y DEPT Espectros en dos dimensiones: COSY NOESY HSQC HMBC
HETCOR ROESY TOCSY DOSY Espectros en solucin, de ncleos como:P,F,Sn
yB Espectros de RMN de slidos deC,Si yAl Espectros a temperatura
variable.Servicios Especiales
Nuestro Laboratorio cuenta tambin con Servicios Especializados
que contribuyen satisfactoriamente en la resolucin de problemas en
el mbito de la industria qumica, en instituciones educativas,
gubernamentales o de investigacin. Algunos de estos servicios son:
Orientacin sobre los ensayos requeridos para dar solucin al
problema planteado. Tratamiento qumico previo de las muestras que
van a ser analizadas por RMN. Interpretacin de espectros.
Tratamiento de datos y elaboracin de informe de
resultados.Requerimientos de las muestras
Con el propsito de ofrecerles un mejor servicio el Laboratorio
de Resonancia Magntica Nuclear solicita a sus usuarios ciertos
requerimientos en las muestras que entregan para ser
analizadas:Para experimentos en solucin, las muestras debern ser
solubles en 0.5 a 0.85 mL de disolvente deuterado (CDCl3, DMSO-d6,
CDOD, Acetona-d6, DO, Tolueno-d8, CD, THF-d8, CDCN).Para los
experimentos de deteccin de ncleos de alta abundancia isotpica
(H,P,F...) se recomienda entregar como mnimo 5 mg de muestra.Para
los experimentos de deteccin de ncleos de baja abundancia isotpica
(C,N...), se recomienda entregar como mnimo 25 mg de muestra.Los
experimentos se podrn llevar a cabo con menor cantidad de muestra
pero en estos casos los tiempos de entrega sern mayores.Para los
experimentos de RMN de slidos se requieren como mnimo 150 mg de
muestra seca y pulverizada.Las muestras se recibirn en viales de
vidrio de 4 ml con tapa.Para los usuarios del Instituto de Qumica,
los viales debern ser etiquetados con los siguientes datos: nombre
del investigador, nmero de laboratorio, clave de la muestra y nmero
de registro correspondiente de acuerdo con la bitcora de recepcin
de
muestras.http://www.iquimica.unam.mx/index.php/labdeserviciosiq-alias/espectrosrmn-alias
Espectrometra de resonancia magntica nuclearLaespectrometra de
resonancia magntica nuclear(RMN), ms comnmente conocida como
espectrometra RMN, es una tcnica que explota las propiedades
magnticas de ciertos ncleos. Las aplicaciones ms importantes para
su uso en qumica orgnica son la espectrometra RMN de protones y la
de carbono-13. En principio, la RMN es aplicable a cualquier ncleo
que posea espn.
Pueden obtenerse muchos tipos de informacin mediante un espectro
RMN. Al igual que se utiliza laespectrometra de infrarrojospara
identificar grupos funcionales, el anlisis de un espectro RMN
unidimensional proporciona informacin sobre el nmero y tipo de
entidades qumicas en una molcula.
El impacto de la espectrometra RMN en las ciencias naturales ha
sido sustancial. Puede utilizarse, entre otras cosas, para estudiar
mezclas de analitos, para comprender efectos dinmicos como el
cambio en la temperatura y los mecanismos de reaccin, y es una
herramienta de valor incalculable para la comprensin de la
estructura y funcin de lasprotenasy los cidos nucleicos. Este tipo
de espectrometra se puede aplicar a una amplia variedad de
muestras, tanto en solucin como en estado slido.TCNICAS BSICAS DE
ESPECTROMETRA RMN
Cuando se sitan dentro de un campo magntico, los ncleos activos
de RMN (como el 1 H, o el 13 C) absorben a una frecuencia
caracterstica del istopo. La frecuencia de resonancia, la energa de
la absorcin y la intensidad de la seal son proporcionales a la
fuerza del campo magntico. Por ejemplo, en un campo magntico de 21
Tesla, los protones resuenan a 900 MHz. Es comn referirse a un imn
de 21 T como imn de 900 MHz, aunque distintos ncleos resuenan a una
frecuencia diferente en este campo.
En el campo magntico terrestre, los mismos ncleos resuenan en
frecuencias de audio. Este efecto se utiliza en los espectrmetros
RMN y otros instrumentos. Debido a que estos instrumentos son
fciles de transportar y baratos, a menudo se utilizan para la
enseanza y el trabajo de campo.
Desplazamiento qumicoDependiendo del entorno qumico local, los
diferentes protones en una molcula resuenan a frecuencias
ligeramente diferentes. Dado que tanto este desplazamiento como la
frecuencia de resonancia fundamental son directamente
proporcionales a la fuerza del campo magntico, el desplazamiento de
frecuencia se convierte en un campo independiente de valor
adimensional conocido como desplazamiento qumico. El desplazamiento
qumico se reporta como una medida relativa de algunas frecuencias
de resonancia de referencia. (Para los ncleos 1 H, 13 C, y 29 Si,
se usa como referencia el tetrametilsilano o TMS.) Esta diferencia
entre la frecuencia de la seal y la frecuencia de la referencia se
divide por la frecuencia de la seal de referencia para obtener el
desplazamiento qumico. Los desplazamientos de frecuencia son muy
pequeos en comparacin con la frecuencia RMN fundamental. Un
desplazamiento de frecuencia tpico podra ser de 100 Hz, en
comparacin con una frecuencia RMN fundamental de 100 MHz, por lo
que el desplazamiento qumico se expresa generalmente en partes por
milln (ppm).
Mediante la comprensin de los diferentes entornos qumicos, el
desplazamiento qumico puede ser utilizado para obtener informacin
estructural sobre la molcula en una muestra. La conversin de los
datos en bruto a esta informacin se llama asignacin del espectro.
Por ejemplo, para el espectro 1H-RMN del etanol (CH3CH2OH), cabra
esperar tres seales especficas en tres desplazamientos qumicos
especficos: uno para los grupos CH3, uno para el grupo CH2 y otro
para el grupo OH. Un grupo CH3 tpico tiene un desplazamiento de
alrededor de 1 ppm, un CH2 adjunto a un OH tiene un desplazamiento
de alrededor de 4 ppm y un OH tiene un desplazamiento en torno a
2-3 ppm, dependiendo del disolvente utilizado.
A causa del movimiento molecular a temperatura ambiente, los
tres protones metilo alcanzan un promedio durante el curso del
experimento RMN (que normalmente requiere unos pocos milisegundos).
Estos protones se degeneran y forman un pico al mismo
desplazamiento qumico.
La forma y el tamao de los picos son indicadores de la
estructura qumica. En el ejemplo anterior -el espectro de protones
de etanol-, el pico de CH3 sera tres veces ms grande que el OH. Del
mismo modo, el pico de CH2 sera el doble en tamao al pico de OH,
pero slo 2/3 del tamao del pico de CH3.
El software de anlisis moderno permite analizar el tamao de los
picos para comprender cmo muchos protones dan lugar al pico. Esto
se conoce como integracin, un proceso matemtico que calcula el rea
bajo un grfico (lo que, en esencia, es unespectro). El analista
debe integrar el pico y no medir su altura, porque los picos tambin
tienen anchura y, por ende, su tamao depende de su rea y no de su
altura. Sin embargo, cabe mencionar que el nmero de protones, o
cualquier otro ncleo observado, es slo proporcional a la
intensidad, o integral, de la seal RMN, en los experimentos RMN
unidimensionales ms simples. En experimentos ms elaborados, como
los que suelen utilizarse para obtener el espectro RMN del
carbono-13, la integral de las seales depende de la tasa de
relajacin del ncleo, y de sus constantes de acoplamiento escalar y
dipolar. Muy a menudo, estos factores son poco conocidos, por lo
que la integral de la seal RMN es muy difcil de interpretar en los
experimentos ms complicados.Acoplamiento-JParte de la informacin ms
til para determinar la estructura en un espectro RMN unidimensional
proviene del acomplamiento-J o acoplamiento escalar (un caso
especial de acoplamiento espn-espn) entre los ncleos activos de
RMN. Este acoplamiento surge de la interaccin de los diferentes
estados espn a traves de los enlaces qumicos de una molcula, y
resulta en la divisin de seales RMN. Estos patrones de divisin
pueden ser complejos o simples y, del mismo modo, pueden ser
interpretables o engaosos. Este acoplamiento proporciona informacin
detallada sobre la conectividad de los tomos en una molcula.
El acoplamiento a ncleos equivalentes n (espn ) divide la seal
en un multiplete n + 1 con ratios de intensidad que siguen el
tringulo de Pascal. El acoplamiento a espines adicionales conducir
a nuevas divisiones de cada uno de los componentes del multiplete;
por ejemplo, el acoplamiento a dos ncleos diferentes de espn , con
constantes de acoplamiento muy distintas, conducir a un doblete de
dobletes (abreviatura: dd). Hay que tener en cuenta que el
acoplamiento entre ncleos que son qumicamente equivalentes (es
decir, que tienen el mismo desplazamiento qumico) no tiene efecto
de los espectros RMN, y los acoplamientos entre ncleos que son
distantes (por lo general ms de 3 enlaces en molculas flexibles)
suelen ser demasiado pequeos para observar divisiones. Los
acoplamientos de largo alcance, de ms de tres enlaces, se observan
a menudo en compuestos aromticos y cclicos, conduciendo a patrones
de divisin ms complejos.
Por ejemplo, en el espectro de protones para el etanol que se ha
descrito anteriormente, el grupo CH3 se divide en un triplete con
una relacin de intensidad de 1:2:1 mediante los dos protones CH2
vecinos. Del mismo modo, el CH2 se divide en un cuarteto con una
relacin de intensidad de 1:3:3:1 mediante los tres protones CH3
vecinos. En principio, los dos protones CH2 tambin se dividen de
nuevo en un doblete para formar un doblete de cuartetos mediante el
protn hidroxilo, pero el intercambio intermolecular del protn
hidroxilo acdico a menudo resulta en una prdida de informacin del
acoplamiento.
El acoplamiento a cualquier ncleo de espn , tal como el
fsforo-31 o el flor-19, funciona de esta manera (aunque las
magnitudes de las constantes de acoplamiento pueden ser muy
diferentes). Pero los patrones de divisin difieren de los descritos
anteriormente para los ncleos con espn superior a debido a que el
nmero cuntico de espn tiene ms de dos valores posibles. Por
ejemplo, para el acoplamiento al deuterio (un ncleo de espn 1)
divide la seal en un triplete 1:1:1, porque el espn 1 tiene tres
estados de espn. Del mismo modo, un ncleo de espn 3/2 divide una
seal 1:1:1:1 en un cuarteto y as sucesivamente.
El acoplamiento combinado con el desplazamiento qumico (y la
integracin de protones) nos dice no slo el entorno qumico de los
ncleos, sino tambin el nmero de ncleos activos RMN vecinos en la
molcula. En los espectros ms complejos, con mltiples picos en
desplazamientos qumicos similares, o en el espectro de ncleos
distintos del hidrgeno, el acoplamiento es a menudo la nica manera
de distinguir ncleos diferentes.
Acoplamiento de segundo orden (o fuerte)La descripcin anterior
asume que la constante de acoplamiento es pequea en comparacin con
la diferencia en frecuencias RMN entre los espines inequivalentes.
Si la separacin del desplazamiento disminuye (o la fuerza del
acoplamiento aumenta), los patrones de intensidad del multiplete se
distorsionan, y luego se vuelven ms complejos y difciles de
analizar (especialmente si ms de dos espines estn involucrados). La
intensificacin de algunos picos en un multiplete se logra a
expensas del resto, que a veces casi desaparece en el ruido de
fondo, aunque el rea integrada bajo los picos se mantenga
constante. En la mayora de RMN de alto campo, sin embargo, las
distorsiones suelen ser modestas y las distorsiones caractersticas
(techo) pueden ayudar a identificar los picos.
Los efectos de segundo orden disminuyen cuando la diferencia de
frecuencia entre multipletes aumenta, por lo que el espectro RMN de
alto campo (es decir, de alta frecuencia) muestra menos distorsin
que los espectros de frecuencia menor. Los primeros espectros a 60
MHz eran ms propensos a la distorsin que los espectros de mquinas
posteriores que operan en frecuencias de 200 MHz o superiores.
Inequivalencia magnticaPueden ocurrir efectos ms sutiles si los
espines qumicamente equivalentes (es decir, ncleos relacionados por
simetra y con la misma frecuencia RMN) tienen diferentes relaciones
de acoplamiento respecto a los espines externos. Los espines que
son qumicamente equivalentes pero no son indistinguibles (sobre la
base de sus relaciones de acoplamiento) se denominan espines con
inequivalencia magntica. Por ejemplo, los sitios 4 H del
1,2-diclorobenceno se dividen en dos pares qumicamente equivalentes
por simetra, pero un individuo miembro de uno de los pares tiene
diferentes acoplamientos a los espines que componen el otro par. La
inequivalencia magntica puede dar lugar a espectros muy complejos
que slo pueden ser analizados mediante modelado computacional.
Estos efectos son ms comunes en los espectros RMN de sistemas
aromticos y otros no flexibles, mientras que el promedio
conformacional de los enlaces CC en molculas flexibles tiende a
igualar los acoplamientos entre protones en carbonos adyacentes,
reduciendo los problemas con la inequivalencia
magntica.ESPECTROMETRA DE CORRELACINLa espectrometra de correlacin
es uno de los diversos tipos de espectrometra de resonancia
magntica nuclear (RMN) bidimensional. Este tipo de experimento RMN
es mejor conocido por su acrnimo, COSY. Otros tipos de
espectrometra RMN bidimensional son la espectrometra-J, la de
intercambio (EXSY), la de efecto Overhauser nuclear (NOESY), la de
correlacin total (TOCSY), y experimentos de correlacin
heteronuclear como el HSQC, HMQC y HMBC. Los espectros
bidimensionales RMN proporcionan ms informacin acerca de una
molcula que los espectros RMN unidimensionales, y son especialmente
tiles para determinar la estructura de la molcula, en particular
para molculas que son demasiado complicadas para la RMN
unidimensional. El primer experimento bidimensional, COSY, fue
propuesto por Jean Jeener, un profesor de la Universit Libre de
Bruxelles, en 1971. Este experimento fue posteriormente
implementado por Walter P. Aue, Enrico Bartholdi y Richard R.
Ernst, que publicaron sus trabajos en 1976.
RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR DE ESTADO SLIDOUna variedad de
circunstancias fsicas impide que las molculas sean estudiadas en
solucin, ni tampoco mediante otras tcnicas espectroscpicas a un
nivel atmico. En los medios de fase slida, tales como cristales,
polvos microcristalinos, geles, soluciones anisotrpicas, etc, se da
en particular el acoplamiento dipolar y la anisotropa de
desplazamiento qumico, que se convierten en dominantes para el
comportamiento de los sistemas de espn nuclear. En la espectrometra
RMN convencional en estado de solucin, estas interacciones
adicionales daran lugar a una ampliacin considerable de las lneas
espectrales. Diversas tcnicas permiten establecer condiciones de
alta resolucin, que pueden, al menos para los espectros de 13 C,
ser comparables a los espectros RMN en estado de solucin.
Dos conceptos importantes para la alta resolucin en la
espectrometra RMN de estado slido son la limitacin de la posible
orientacin molecular mediante orientacin de la muestra, y la
reduccin de las interacciones magnticas nucleares anisotrpicas
mediante giro de la muestra. De este ltimo enfoque, destaca el
mtodo del giro rpido en torno al ngulo mgico, cuando el sistema est
compuesto por ncleos de espines 1/2. Una serie de tcnicas
intermedias, con muestras de alineamiento parcial o movilidad
reducida, se estn utilizando tambin en espectrometra RMN.
Las aplicaciones de la RMN de estado slido suelen utilizarse en
investigaciones sobre protenas de la membrana, fibrillas de
protenas, todo tipo de polmeros, anlisis en qumica inorgnica, y
tambin otras ms "exticas" como las hojas de plantas y las pilas de
combustible.ESPECTROMETRA RMN APLICADA A PROTENASGran parte de la
reciente innovacin dentro de la espectrometra RMN se ha dado en el
campo de estudio de las protenas, y se ha convertido en una tcnica
muy importante en la biologa estructural. Un objetivo comn de estas
investigaciones es obtener una alta resolucin de las estructuras
tridimensionales de las protenas, similar a lo que puede lograrse
por cristalografa de rayos X. En contraste con la cristalografa de
rayos X, la RMN se limita sobre todo a las protenas relativamente
pequeas, de menos de 35 kDa, aunque los avances tcnicos permiten la
resolucin de estructuras ms grandes. La espectrometra RMN es a
menudo la nica manera de obtener informacin de alta resolucin, en
todo o en parte, de protenas no estructuradas.
Las protenas son varios rdenes de magnitud ms grandes que las
pequeas molculas orgnicas que se mencionaron anteriormente en este
artculo, pero la misma teora se aplica a la RMN. Debido al mayor
nmero de elementos presentes en la molcula, los espectros
unidimensionales bsicos se ven solapados con la superposicin de
seales, hasta el punto de que el anlisis resulta imposible. Por lo
tanto, se realizan experimentos multidimensionales (2, 3 o 4D) para
hacer frente a este problema. Para facilitar estos experimentos, es
conveniente marcar isotpicamente la protena con 13 C y 15 N, debido
a que los istopos 12 C predominantes de forma natural no son
activos a la RMN, mientras que el momento cuadrpolo nuclear del
istopo 14 N predominante de forma natural impide que se pueda
obtener informacin de alta resolucin a partir de este istopo de
nitrgeno. El mtodo ms importante utilizado para la determinacin de
la estructura de las protenas utiliza experimentos NOE para medir
las distancias entre pares de tomos dentro de la molcula.
Posteriormente, las distancias obtenidas se utilizan para generar
una estructura 3D de la molcula usando un programa de
ordenador.