La biocatalyse pour une chimie verte: enjeux et perspectives Colloque «Bioprocédés et Bioproduction», CNRS Paris, 10 juillet 2014 Pr. Laurence Hecquet Institut de Chimie de Clermont-Ferrand, UMR CNRS 6296, Equipe SEESIB Présidente du Club Bioconversion en Chimie Organique (CBSO)
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La biocatalyse pour une chimie verte:
enjeux et perspectives
Colloque «Bioprocédés et Bioproduction», CNRS Paris, 10 juillet 2014
Pr. Laurence Hecquet
Institut de Chimie de Clermont-Ferrand, UMR CNRS 6296, Equipe SEESIB
Présidente du Club Bioconversion en Chimie Organique (CBSO)
Plan
Défis de l’industrie chimique
Biocatalyse en synthèse organique
▪ Atouts
▪ Limites
▪ Leviers
Club Biocatalyse en Synthèse Organique (CBSO)
Enjeux et perspectives
2
Utilisation de matières premières renouvelables
Préserver l’équilibre environnemental
réduisant des rejets toxiques
et gaz à effets de serre
minimisant
les coûts de production
limitant les dépenses
en énergie
Nouveaux
procédés
chimiques
propres
Défis de l’industrie chimique
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3
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1998 : Paul Anastas et John Warner (USA) publient dans leur livre “Green
Chemistry: Theory and Practice” les 12 principes de la chimie verte
1. Limiter la pollution à la
source
2. Economie d’atomes
3. Synthèses chimiques
moins toxiques
4. Produits chimiques
plus sûrs
5. Réduire l’utilisation
de solvants et
d’auxiliaires 6. Dépenses
énergétique 7. Matières
premières
renouvelables
8. Réduire les produits
dérivés (groupes
protecteurs)
9. Catalyse
10. Conception de la
dégradation finale
11. Analyser en temps réel
pour prévenir la pollution
12. Minimiser le risque
d’accidents
12 principes de la chimie verte
Substrat Produit
Catalyseur
«Un catalyseur est une espèce, qui en
petite quantité, augmente la vitesse
d’une réaction sans figurer dans
l’équation de la réaction et sans modifier
la composition du système à l’état final.»
Les enzymes sont des catalyseurs
biologiques.
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Défis de l’industrie chimique
Substrat Produit
Enzyme
Biocatalyse en synthèse organique
Intérêts des enzymes
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5
La biocatalyse est l'utilisation d’enzymes, catalyseurs naturels, dans une
réaction de synthèse organique.
6
Obtention à partir de matières premières renouvelables
Conditions douces (température, pression, pH)
Sélectivité (régio-, stéréo-, énantiosélectivité)
Economie d’étapes et d’atomes
Biocatalyse en synthèse organique
Intérêts des enzymes
Substrat Produit
Enzyme
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6
Méthodes et techniques utilisant les matières et outils du monde
vivant pour la préparation de produits chimiques
Biotechnologie Blanche
Biocarburants Biopolymères Chimie de spécialités
Agroalimentaire Pharmacie
Chimie des intermédiaires Chimie de base
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Biocatalyse en synthèse organique
Positionnement de la biocatalyse dans le domaine des biotechnologies
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7
L’idée d’utiliser des biocatalyseurs n’est pas neuve !
1897
1908
1916
1936
1960
1980
1990 2000
Utilisation d’enzymes
isolées hors de la
cellule
Cyanhydrine par des
D-oxynitrilase
Immobilisation de l’invertase
Synthèse enzymatique d’ester
en présence de lipase
Production de protéases à grande
échelle par NOVO
Clonage et surexpression : commercialisation
d’une plus grande variété d’enzymes
Modification d’enzymes par mutagenèse
Evolution in vitro
Enoncé des 12 principes
de la chimie verte
Biocatalyse en synthèse organique
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8
9
9
Classification des enzymes
4600 enzymes répertoriées
de nombreuses autres non identifiées…
Biocatalyse en synthèse organique
EC 1. Oxydo-réductases
EC 2. Transférases
EC 3. Hydrolases
EC 4. Lyases
EC 5. Isomérases
EC 6. Ligases
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Protéases
Nitrilases
Lipases
Lyases
Oxygénases
Esterases
Autres
enzymes
Autres hydrolases
Lyases
HYDROLASES
Enzyme Catalysis, Ed. K. Drauz and H. Waldmann, Wiley-VCH verlag GmbH, Weinheim 2002
Hydrolyse ou formation d’esters
Hydrolyse ou formation d’amides
Hydrolyse d’époxydes
Hydrolyse de nitriles
Epoxydation,
hydroxylation
Oxydoréduction
d’alcools et de cétones
Formation de liaisons
C-C, C-N
Oxydo réductases
Biocatalyse en synthèse organique
Enzymes plus particulièrement employées en biocatalyse
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Substrat Produit
. Source microbienne
. Accessibilité (commerciale
ou produite au laboratoire)
Constantes cinétiques :
KM, Vm, kcat kcat/KM
Etude des conditions
réactionnelles (T°, pH,...)
Génie des bioprocédés
Approche intégrative des procédés biocatalytiques
Biocatalyse en synthèse organique
Immobilisation
Enzyme
Mise en œuvre
de la réaction à l’échelle
préparative
Choix
de l’enzyme
Essais
analytiques
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Extraction et
purification
du produit
Exemples de composés produits par biocatalyse à l’échelle industrielle
A. Schmid, J. S. Dordick, B. Hauer, . Kiener, M. Wubbolts, B. Witholt, Nature, 2001, 409, 258-268
Z. Aleksey, Current Opinion in Chemical Biology, 2001, 5, 130-136
S. Panke, M. Held, M. Wubbolts, Current Opinion in Biotechnology, 2004, 15, 272-279
Gist/brocades/Novo-Nordisk D-Fructose >250 000
Nitto Chemical Industry Acrylamide >30 000
Toray Industries Lysine 4 000
Lonza AG Vitamine B3 3 000
DSM aspartame > 2 000
Chem ferm Pénicillines hémisynthétiques 2 000
Amino GmbH acide malique 2 000
Zenca Acide (S)-chloroprpionique 2 000
Degussa-Hüls AG L-aminoacides 200
Hoechst Marion acide 7-amino céphalosporanique 200
BASF (R)-phényléthylamine >100
Monsanto acides aminés >10
Dupont 5-cyanovaléramide 10
Compagnie Production Tonnes/an
Gist/brocades/Novo-Nordisk D-Fructose >250 000
Nitto Chemical Industry Acrylamide >30 000
Toray Industries Lysine 4 000
Lonza AG Vitamine B3 3 000
DSM Aspartame > 2 000
Chem ferm Pénicillines hémisynthétiques 2 000
Amino GmbH acide malique 2 000
Zenca Acide (S)-chloroprpionique 2 000
Degussa-Hüls AG L-aminoacides 200
Hoechst Marion acide 7-amino céphalosporanique 200
BASF (R)-phényléthylamine >100
Monsanto Acides aminés >10
Dupont 5-cyanovaléramide 10
Compagnie Production Tonnes/an
Biocatalyse en synthèse organique
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Glucose isomérase isolée de divers sources microbiennes
Thermostables (50-60°), Immobilisées
D-fructose D-glucose
Pouvoir sucrant
Saccharose 1
D-glucose 0.7
D-frucrose 1.5
Biocatalyse en synthèse organique
Exemples de composés produits par biocatalyse à l’échelle industrielle
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Acrylamide Nitto chemical Industry > 30 000 tonnes/an
Cellules entières : Rhodococcus rhodocrous
Concentration du nitrile : 1000g/L
Rdt >99.9%
Biocatalyse en synthèse organique
Exemples de composés produits par biocatalyse à l’échelle industrielle
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Anticholestérol : médicament le plus vendu au monde 20 Md $ Lipitor (atorvastatine) Pfizer
N
H
O
N OH
O
F
OH OH
Lipitor (atorvastatine)
Biocatalyse en synthèse organique
DSM
- Une étape : Intermédiaire à 6 carbones
avec les deux centres asymétriques
- Faible coût des substrats :
chloroacetaldehyde et acetaldehyde
-Procédé très compétitif : production par
DSM à l’échelle industrielle.
Exemples de composés produits par biocatalyse à l’échelle industrielle
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Cependant…
Les enzymes sont-elles l’avenir de la chimie ?
Conditions douces : économes en énergie, écocompatibles
Efficacité : turn-over élevé et accélérations souvent >108
Sélectivité : régio-, stéréo-, énantiosélectivité
Accessibilité : nombreuses enzymes sont commerciales
La plus part des réactions utilisées en synthèse organique
pourraient être catalysées par des enzymes
Biocatalyse en synthèse organique
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• Instabilité des enzymes dans des conditions non physiologiques pH extrême, températures élevées, présence de solvants organiques
• Spécificité des enzymes peut devenir un inconvénient Faible affinité vis-à-vis des composés ayant des structures éloignées des substrats naturels
• Rendements dans certains cas inférieurs à ceux obtenus par voie chimique Réactions équilibrées
Concentration en substrat souvent de l’ordre de 10 à 100nM en raison de phénomène d’inhibition
Biocatalyse en synthèse organique
Les enzymes sont-elles l’avenir de la chimie ?
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Substrat Produit
Constantes cinétiques :
KM, Vm, kcat kcat/KM
Etude des conditions
réactionnelles (T°, pH,...)
Approche intégrative des procédés biocatalytiques
Biocatalyse en synthèse organique
Enzyme
Extraction et
purification
du produit
Mise en œuvre
de la réaction à l’échelle
préparative
Sélection
de l’enzyme
Essais
analytiques
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Substrat Produit
Constantes cinétiques :
KM, Vm, kcat kcat/KM
Etude des conditions
réactionnelles (T°, pH,...)
Approche intégrative des procédés biocatalytiques
Biocatalyse en synthèse organique
Enzyme
Extraction et
purification
du produit
Mise en œuvre
de la réaction à l’échelle
préparative
Sélection
de l’enzyme
Ingénierie
de l’enzyme
Essais
analytiques
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Ingé,
Ingénierie du biocatalyseur
Résistance aux solvants
Thermostabilité Amélioration ou modification
de la spécificité, de la sélectivité
Biocatalyse en synthèse organique
Substrat Produit Enzyme
Tests de criblage
Biologie
moléculaire
Modélisation
moléculaire
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20
Enzyme
optimisée
Géne
Création de
diversité
Banque de
nouveaux génes
Enzyme
Biocatalyse en synthèse organique
Ingénierie du biocatalyseur
Approche aléatoire Mutagenèse aléatoire
Approche rationnelle Mutagenèse dirigée
Métagénomique
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21
Géne
Banque de
nouvelles enzymes
Création de
diversité
Expression
Banque de
nouveaux génes
Enzyme
Nouvelle
Enzyme
Approche aléatoire Mutagenèse aléatoire
Approche rationnelle Mutagenèse dirigée
Métagénomique
Biocatalyse en synthèse organique
Ingénierie du biocatalyseur
L’enzyme
est-elle
optimisée ? NON OUI
Fin du
processus
Test de criblage
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Nouvelle
enzyme
Expression
Tes de criblage
Nouveau
gène
n cycles
(générations)
Approche aléatoire Mutagenèse
aléatoire
Approche rationnelle Mutagenèse
dirigée
Evolution
In vitro
Banque de
nouvelles enzymes
Création de
diversité
Banque de
nouveaux génes
Biocatalyse en synthèse organique
Ingénierie du biocatalyseur
L’enzyme
est-elle
optimisée ? NON OUI
Fin du
processus
Chen, K . and Arnold, F.H., PNAS, 1993 ; Stemmer, W.P.C, Nature, 1994
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Augmentation de la stabilité thermique de la subtilisine de Bacillus subtilis
Subtilisine
Tests de criblage colorimétrique
Génération 5 :
1 subtilisine mutée (9 mutations)
Génération
Ln
(d
em
i-vie
) à
65°C
StEP
StEP
DNA shuffling
DNA shuffling
DNA shuffling
200 fois plus active à 65°C
que l’enzyme sauvage
H. Zhao, F.H. Arnold, Protein Eng. 1999, 12, 47-53
HN
O
O HN
NO2
HN
OH
O
H2N NO2Succinyl-Ala-Ala-Pro +Succinyl-Ala-Ala-Pro
Biocatalyse en synthèse organique
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12, 47-53 (1999).
Amélioration de l’énantiosélectivité d’une lipase de Pseudomonas aeruginosa
0 1 2
Génération 3 :
1 lipase mutée (6 mutations)
E(S) > 51
E > 51
E = 32
E = 1,1
Cassette
mutagenesis
DNA shuffling ou
Cassette mutagenesis
E
M.T. Reetz et al, PNAS, 2004, 101, 5716-5722
Criblage de 8000 lipases mutées
1 2 3
Génération
Biocatalyse en synthèse organique
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Plan
Défis de l’industrie chimique
Biocatalyse en synthèse organique
▪ Atouts
▪ Limites
▪ Leviers
Club Biocatalyse en Synthèse Organique (CBSO)
Enjeux et perspectives
Un réseau de 15 laboratoires
français spécialisés en Biocatalyse
Des biotechnologies blanches pour une chimie verte
Club Biocatalyse en Synthèse Organique
Club Biocatalyse en Synthèse Organique
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Présidente
Laurence Hecquet – ICCF-Clermont-Ferrand
Secrétaire
Didier Buisson –MNHN-– Paris 5
Trésorier
Véronique Alphand– ISM2- Marseille
Membres industriels
Sandrine Moreau - Servier - Orléans
Sébastien Roy - Sanofi Aventis - Chilly Mazarin
Rob Ter Hall - Libragen - Toulouse
Membres acédémiques
Véronique de Bérardinis - Genoscope CEA-Evry
Bastien Doumèche - ICBMS- Lyon
Sandrine Morel- LISBP- Toulouse
Conseil d’administration
Club Biocatalyse en Synthèse Organique
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Ingénierie des enzymes (clonage, mutagenèse, évolution dirigée) Criblage de banques génomiques Etude des enzymes (cinétique, stabilité, activité en conditions non usuelles) Mise en oeuvre des réactions (déplacement d’équilibre, Immobilisation) Purification et caractérisation des produits Génie des bioprocédés
Colloques organisés tous les deux ans réunissant une centaine de participants venant de laboratoires académiques ou industriels pour favoriser les collaborations et le dialogue de scientifiques aux compétences complémentaires (biologie, chimie, génie des procédés).
Objectifs
Techniques
Actions
Partenaires
Industriels
Contrats
publics
Utilisation d’enzymes en tant que biocatalyseurs de réactions chimiques pour synthétiser
des composés de haute valeur ajoutée le plus souvent chiraux.
SCF (groupe chimie et biotechnologie) et de l’ADEBIOTECH