Profesor Patrocinante Dr. Bredford Kerr Fuentes Centro de Estudios Científicos Profesor Co-Patrocinante Dra. Claudia Torres Farfán Instituto de Anatomía, Histología y Patología Facultad de Medicina LA AUSENCIA DE MECP2 PRODUCE UN AUMENTO DEL PESO CORPORAL Y ALTERA LA EXPRESIÓN DE GENES ASOCIADOS AL BALANCE ENERGÉTICO Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico RODRIGO ALEXIS MOLDENHAUER VERA VALDIVIA – CHILE 2013
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LA AUSENCIA DE MECP2 PRODUCE UN AUMENTO DEL PESO CORPORAL …
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Profesor Patrocinante
Dr. Bredford Kerr Fuentes
Centro de Estudios Científicos
Profesor Co-Patrocinante
Dra. Claudia Torres Farfán
Instituto de Anatomía, Histología y Patología
Facultad de Medicina
LA AUSENCIA DE MECP2 PRODUCE UN AUMENTO DEL
PESO CORPORAL Y ALTERA LA EXPRESIÓN DE GENES
ASOCIADOS AL BALANCE ENERGÉTICO
Tesis de Grado presentada como parte de
los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
RODRIGO ALEXIS MOLDENHAUER VERA
VALDIVIA – CHILE
2013
“...Un hombre se levanta / Con una lupa / Busca en el mapa /
Un lugar en el que nunca ha estado...”
(Ai Qing, fragmento de “Cabo de Chile”).
Dedicado a mi padre, Jaime
A mi tía, Isolda
A la Patagonia libre e independiente
Con todo mi cariño y esfuerzo
AGRADECIMIENTOS
Ha sido un auténtico placer el haber recorrido este camino con todas las personas que de
una u otra forma participaron en mi crecimiento espiritual e intelectual. El desarrollo de este
trabajo es el cierre de una etapa de mi vida, quizás la más importante hasta ahora.
En primer lugar quisiera agradecer al Dr. Bredford Kerr, por confiar en mí y haberme
dado la oportunidad de formar parte de su grupo de trabajo. Sin duda ha sido una experiencia
muy enriquecedora, tanto en lo personal como en lo profesional. Agradezco su entrega, paciencia
y entusiasmo, siempre incentivándome a ir un poco más allá de lo que se nos pide. Gracias por tu
enorme disposición para la discusión de resultados, papers y temas que escapan a la ciencia.
Quiero agradecer también a mi padre, Jaime, y a mi tía, Isolda, quienes me han apoyado
de manera incondicional durante todas las etapas de mi vida. Gracias por valorar mis logros, y
por mostrarme siempre que la vida es hermosa y que vale la pena vivirla. Ustedes son el pilar
fundamental en el cual se afirma todo lo que soy. Agradezco sus enseñanzas y consejos, con todo
mi corazón.
Finalmente quisiera agradecer a mis grandes amigos y hermanos, sin distinción de
ninguno, por brindarme siempre una mano y apoyarme en todo. En especial, me gustaría
agradecer a Mirtha Rios, por su amistad incondicional, y por haberme soportado durante tantos
años de amistad.
Este trabajo fue realizado en el Centro de Estudios Científicos (CECs) y fue financiado
por el proyecto FONDECYT Nº 1100821.
i
ÍNDICE GENERAL
1. RESUMEN 1
1.1. SUMMARY 2
2. INTRODUCCIÓN 3
2.1. MECP2 3
2.2. Síndrome de Rett 7
2.3. Modelos murinos de Síndrome de Rett 11
2.4. Balance energético corporal 13
2.5. Planteamiento del problema, propuesta de trabajo 16
2.6. Hipótesis del trabajo 16
2.7. Objetivo general 17
2.8. Objetivos específicos 17
3. MATERIALES Y MÉTODOS 18
3.1. MATERIALES 18
3.1.1. Reactivos y kits utilizados 18
3.1.2. Partidores 19
3.1.3. Animales de experimentación 21
ii
3.2. MÉTODOS 22
3.2.1. Aislamiento de ADN genómico para genotipificación 22
3.2.2. Genotipificación de animales mediante PCR 22
3.2.3. Registro de peso corporal 25
3.2.4. Determinación de la ingesta de comida 25
3.2.5. Método de eutanasia y extracción de tejidos 26
3.2.6. Extracción de ARN total de hipotálamo y tejido adiposo 26
3.2.7. Síntesis de ADNc mediante RT-PCR (Transcripción reversa) 27
3.2.8. PCR en tiempo real 27
3.2.9. Análisis de expresión para Mecp2 en tejido adiposo por PCR convencional 29
3.2.10. Extracción de proteínas para Western blot 29
3.2.11. Análisis de Western blot para Mecp2 en tejido adiposo 30
3.2.12 Herramientas bioinformáticas y softwares utilizados 31
3.2.13. Análisis estadísticos 31
4. RESULTADOS 33
4.1. Obtención y genotipificación de ratones WT y KO para Mecp2. 33
iii
4.2. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en el peso corporal no asociado a una
mayor ingesta de comida. 35
4.3. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en la cantidad de tejido adiposo en
relación a sus hermanos WT. 39
4.4. Los niveles de expresión de leptina en tejido adiposo blanco se encuentran incrementados en
ratones KO para Mecp2. 41
4.5. La expresión relativa de los principales genes que controlan el balance energético corporal a
nivel central se encuentra desregulada en ratones KO para Mecp2. 43
4.6. Los ratones KO para Mecp2 fallan en responder adecuadamente a la administración exógena
de leptina. 47
4.7. La expresión relativa de genes asociados a termogénesis se encuentra incrementada en
ratones KO para Mecp2. 51
4.8. La proteína Mecp2 no es expresada en tejido adiposo blanco y tejido adiposo pardo 53
5. DISCUSIÓN 55
6. BIBLIOGRAFÍA 67
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura del gen MECP2 y sus productos proteicos. 4
Figura 2. Conjunto y progresión de características clínicas en pacientes con RTT. 8
Figura 3. Esquema de alineamiento de partidores para la reacción de genotipificación. 24
Figura 4. Detección de los alelos WT y KO para Mecp2 mediante PCR convencional. 34
Figura 5. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en el peso corporal en relación a
sus hermanos WT. 36
Figura 6. El aumento del peso corporal en los ratones KO para Mecp2 no es producto de una
mayor ingesta de comida. 38
Figura 7. La cantidad de tejido adiposo blanco y pardo se encuentra incrementada en ratones KO
para Mecp2. 40
Figura 8. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en los niveles de expresión de
leptina en relación a sus hermanos WT. 42
Figura 9. Los ratones KO para Mecp2 presentan una alteración en la expresión de genes claves
para la regulación central del balance energético corporal. 44
Figura 10. Los niveles de expresión de los principales receptores involucrados en la regulación
de la homeostasis energética se encuentran alterados en ratones KO para Mecp2. 46
Figura 11. Los ratones KO para Mecp2 no responden a leptina con una disminución en el
consumo de alimento. 48
v
Figura 12. Los ratones KO para Mecp2 no responden a leptina con un aumento en la expresión
hipotalámica de Pomc. 50
Figura 13. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en la expresión de los
principales genes que regulan el gasto energético en iBAT. 52
Figura 14. Mecp2 no se expresa en los tejidos adiposos blanco y pardo. 54
vi
LISTADO DE ABREVIATURAS
ADNc ADN complementario
AdrRβ3 Receptor adrenérgico β-3
AgRP Péptido relacionado a agouti
ARC Núcleo arcuato del hipotálamo
ARNm ARN mensajero
A / T Adenina / timina
ATG Codón de inicio de la traducción
BLAST Herramienta para la búsqueda de alineamiento de secuencias
CART Transcrito relacionado con cocaína y anfetamina
CpG Citosina fosfato guanina
CREB Elemento de unión en respuesta a cAMP
C-terminal Extremo carboxilo terminal
Cyc Ciclofilina 1
DNMT1 ADN metiltransferasa 1
dNTPs Desoxinucleótidos trifosfato
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético
vii
EE Error estándar
HDAC Histona deacetilasa
Htl Hipotálamo
iBAT Tejido adiposo pardo interescapular
InsR Receptor de insulina
iWAT Tejido adiposo blanco inguinal
KO Ratón mutante nulo
LepR2 Isoforma larga del receptor de leptina
MBD Dominio de unión a ADN
MC3R Receptor de melanocortinas 3
MC4R Receptor de melanocortinas 4
MECP2 Proteína de unión a islas CpG metiladas 2
Mecp2+/-
Hembras heterocigotas para Mecp2
Mecp2308/y
Ratón que expresa una forma truncada de Mecp2
MSH Hormona melanocito estimulante
NLS Señal de localización nuclear
NPY Neuropéptido Y
viii
pb Pares de bases
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
POMC Proopiomelanocortina
PVN Núcleo paraventricular del hipotálamo
rpm Revoluciones por minuto
RTT Síndrome de Rett
SDS Dodesil sulfato de sodio
SPF Área libre de patógenos específicos
Tm Temperatura de alineamiento de partidores
TRD Dominio de represión transcripcional
UCP Proteína desacoplante mitocondrial
3`UTR Región no traducible 5`
UV Luz ultravioleta
XCI Inactivación del cromosoma X
WT Ratón silvestre
1
1. RESUMEN
MECP2 es una proteína nuclear que se une a secuencias de ADN metilado en CpG,
regulando de esta manera la actividad transcripcional de sus genes blanco. Mutaciones en
MECP2 son la principal causa del Síndrome de Rett (RTT), un desorden del neurodesarrollo
asociado a retardo mental y características autistas en mujeres. Las pacientes y los modelos
murinos de RTT presentan alteraciones asociadas a la homeostasis energética, principalmente a
nivel de la regulación del peso corporal, sugiriendo que MECP2 juega un rol esencial en el
mantenimiento del balance energético corporal. Sin embargo, la base molecular y fisiológica que
lleva a esta desregulación no ha sido descrita a la fecha.
Para determinar el impacto de la deleción de Mecp2 en el mecanismo central y periférico
que regula el balance energético corporal, analizamos el fenotipo y los patrones de expresión
exhibidos por ratones KO para Mecp2. Nosotros observamos que estos animales presentan un
incremento en el peso corporal en relación a sus hermanos WT, el cual no está asociado a una
mayor ingesta de comida. Además, la ausencia total de Mecp2 en este modelo de RTT alteró los
patrones de expresión de genes asociados a homeostasis energética, tanto a nivel central (Htl)
como periférico (tejido adiposo). Por otra parte, los ratones KO para Mecp2 presentaron un
aumento en la cantidad de iWAT e iBAT, lo que se correlacionó con un aumento en la expresión
de leptina y de genes que participan de la regulación de la termogénesis, respectivamente.
Nuestros resultados muestran las primeras evidencias de alteraciones moleculares y fisiológicas
que podrían dar cuenta del sobrepeso exhibido en ausencia de Mecp2, sugiriendo un rol de esta
proteína como un factor epigenético esencial para el control del peso corporal.
2
1.1. SUMMARY
MECP2 is a nuclear protein that binds to methylated DNA sequences in CpG, regulating
the transcriptional activity of their target genes. Mutations in MECP2 are the main cause of Rett
Syndrome, a neurodevelopmental disorder associated with mental retardation and autistic features
in women. Both patients and murine models of RTT exhibit alterations associated with energetic
homeostasis, mainly in the regulation of body weight, suggesting that MECP2 plays an essential
role in the maintenance of body energy balance. However, the molecular and physiological basis
leading to this deregulation has not been described to date.
In order to determine the impact of Mecp2 deletion in the central and peripheral
mechanism that regulates body energy balance, we analyzed the phenotype and gene expression
pattern exhibited by Mecp2 KO mice. We observed that these animals developed an increased
body weight compared with WT animals, which is not associated with an alteration in food
intake. In addition, the lacking of Mecp2 in this RTT model altered both central (Htl) and
peripheral (iWAT and iBAT) expression patterns of genes associated with energy homeostasis.
Moreover, Mecp2 KO mice showed an increased amount of iWAT and iBAT, which correlated
with a higher expression of leptin and genes involved in thermogenesis regulation, respectively.
Our results show the first evidences of molecular and physiological alterations that could account
for the overweight exhibited in the absence of Mecp2, supporting the role of this protein as an
essential epigenetic factor for the control of body weight.
3
2. INTRODUCCIÓN
2.1. MECP2
La proteína de unión a islas CpG metiladas 2 (MECP2) es una proteína nuclear que regula
la expresión de genes a través de la unión a secuencias de ADN metilado en residuos CpG (Lewis
et al., 1992; Nan et al., 1997). El gen que codifica para esta proteína está ubicado en el brazo
largo del cromosoma X y su secuencia consta de 4 exones y un 3´UTR inusualmente extenso con
4 señales de poliadenilación (Quaderi et al., 1994). Estructuralmente posee un dominio
conservado de unión al ADN (MBD) que permite la interacción con residuos CpG metilados
especialmente en regiones adyacentes a motivos ricos en A/T (Free et al., 2001; Hendrich y Bird,
1998; Wakefield et al., 1999), un dominio de represión transcripcional (TRD), un dominio C-
terminal y 2 señales de localización nuclear (NLS). El dominio TRD está involucrado en el
silenciamiento de la expresión génica a través del reclutamiento de co-represores y complejos de
remodelamiento de la cromatina, mientras que el dominio C-terminal facilita la unión de MECP2
al ADN desnudo y a las estructuras nucleosomales (Jones et al., 1998; Nan et al., 1998).
MECP2 tiene 2 isoformas generadas por corte y empalme alternativo, MECP2e1 y
MECP2e2, las que se diferencian en su extremo amino terminal. Como se indica en la Figura 1,
la isoforma e1 contiene 496 aminoácidos, está codificada por los exones 1, 3 y 4, y el codón de
inicio de la traducción (ATG) se encuentra en el exón 1. Por otra parte, la isoforma e2 posee 486
aminoácidos, y utiliza el ATG presente en el exón 2 como sitio de inicio de la traducción
(Kriaucionis y Bird, 2004; Mnatzakanian et al., 2004).
4
Figura 1. Estructura del gen MECP2 y sus productos proteicos. A: Esquema simplificado del
gen que codifica para MECP2. Se indican los 4 exones y los sitios de poliadenilación. B: Proceso
de corte y empalme alternativo que origina las 2 isoformas de MECP2. La isoforma MECP2e1
excluye el exón 2, por lo tanto el inicio de la traducción toma lugar en la secuencia ATG del exón
1, mientras que para MECP2e2 el sitio de inicio de la traducción (ATG) es en el exón 2, aun
cuando el exón 1 está presente. (Modificado de Soto-Covasich, J.M. (2010)).
5
MECP2 se expresa en todos los tejidos humanos y murinos evaluados, pero en ratones
adultos su expresión se incrementa principalmente en cerebro –incluyendo neuronas y células
gliales- pulmón y bazo. Este aumento de la proteína a nivel cerebral se correlaciona con el
desarrollo del sistema nervioso central (Ballas et al., 2009; Lasalle et al., 2001; Shahbazian et al.,
2002a). En relación a esto, la isoforma e1 es la más abundante en cerebro, presentando una alta
expresión durante el desarrollo embrionario, seguido de una disminución postnatal y un posterior
incremento en la edad adulta (Pelka et al., 2005). Además, ha sido demostrado que en ratones las
isoformas e1 y e2 presentan distribución diferencial entre el tálamo dorsal y el hipotálamo
durante el desarrollo post natal del cerebro (Dragich et al., 2007). Sin embargo, a pesar de estas
diferencias en los patrones de distribución, experimentos de re-expresión transgénica han
mostrado que no existen diferencias funcionales entre las dos isoformas de MECP2 (Adkins y
Georgel, 2011; Kerr et al., 2012). Por otra parte, se ha visto que el aumento de la expresión de
MECP2 en la corteza cerebral se correlaciona con el desarrollo cortical, y además, que la
expresión de MECP2 en el epitelio olfatorio coincide con la maduración de las neuronas
receptoras del epitelio olfatorio (Cohen et al., 2003), sugiriendo que MECP2 juega un rol
importante tanto en la maduración neuronal como en el desarrollo del sistema nervioso central.
La función de MECP2 como un represor transcripcional fue sugerida inicialmente en base
a evidencias de experimentos in vitro, en los cuales MECP2 fue capaz de inhibir específicamente
la transcripción a partir de promotores metilados (Nan et al., 1997). El mecanismo involucra la
unión de MECP2 a dinucleotidos CpG metilados a través de su dominio MBD y posterior
reclutamiento del co-represor Sin3A y el complejo Histona deacetilasa (HDAC) 1 y 2 y la
compactación de la cromatina (Jones et al., 1998; Nan et al., 1998). Además, ha sido demostrado
que MECP2 puede interactuar con otros complejos que modifican la cromatina, como SWI/SNF,
6
ADN metiltransferasas DNMT1, histona metiltransferasas, entre otros (Fuks et al., 2003;
Harikrishnan et al., 2005; Kimura y Shiota, 2003). Aunque las consecuencias funcionales de estas
interacciones aún no se conocen (Chahrour y Zoghbi, 2007), evidencias recientes muestran que
ratones mutantes nulos para Mecp2 presentan una disminución en la expresión de gran cantidad
de genes a nivel hipotalámico, y además, que la sobreexpresión de MECP2 genera el efecto
contrario, incrementando la expresión de estos genes, sugiriendo que MECP2 también podría
participar como un activador transcripcional. En esta misma línea, sólo existe un estudio en el
cual ha sido demostrado que MECP2 co-inmunoprecipita con CREB-1, y que ambos se unen al
promotor del gen que codifica para somatostatina activando su expresión (Chahrour et al., 2008).
Además de las funciones mencionadas, ha sido reportado que MECP2 participa en los procesos
de corte y empalme de los ARN, ya sea a través de una interacción directa con las moléculas de
ARN o mediante un complejo proteína-ARN (Jeffery y Nakielny, 2004; Young et al., 2005),
sugiriendo que MECP2 además juega un rol importante en el mecanismo que regula el
procesamiento post transcripcional de los ARN.
En resumen, todas estas evidencias muestran que MECP2 es una proteína multifuncional
capaz de actuar como un factor remodelador de la estructura de la cromatina, y como un
regulador de la transcripción y del procesamiento de los ARN (Adkins y Georgel, 2011; Hite et
al., 2009).
7
2.2. Síndrome de Rett
Mutaciones en el gen que codifica para MECP2 son la principal causa del síndrome de
Rett (RTT), un desorden del neurodesarrollo asociado a retardo mental y desarrollo de
características autistas principalmente en mujeres (Amir et al., 1999; Hagberg et al., 1983; Rett,
1966). Las pacientes con RTT presentan un desarrollo aparentemente normal durante los
primeros 6-18 meses de edad, pudiendo aprender a caminar e incluso decir algunas palabras.
Luego, entran en una etapa de cese del neurodesarrollo, caracterizada por la interrupción en la
adquisición de nuevas habilidades, llegando finalmente a una fase de regresión, en la cual se
pierden las habilidades adquiridas previamente. El más temprano indicador de compromiso
neurológico es la desaceleración en el crecimiento de la cabeza y microcefalia aproximadamente
a los 2 años de vida. Esta interrupción en el desarrollo continúa con retardo general del
crecimiento, pérdida de peso e hipotonía muscular. Otras complicaciones características que
presentan estas pacientes son problemas de interacción social (características autistas), trastornos
de ansiedad, anormalidades cardiacas y respiratorias, graves problemas motores y de aprendizaje,
desarrollo de movimientos estereotipados en las manos y pérdida del lenguaje, entre otros
(Chahrour y Zoghbi, 2007). En la Figura 2, se muestra un esquema de la progresión de la
enfermedad a lo largo de los años y el fenotipo asociado a cada etapa.
8
Figura 2. Conjunto y progresión de características clínicas en pacientes con RTT. Esquema
simplificado donde se indican los principales eventos que caracterizan el desarrollo de la
enfermedad a lo largo de los años. Luego de un aparente desarrollo normal, se observa un
estancamiento del neurodesarrollo, después comienzan a aparecer progresivamente distintas
alteraciones que llevan a un deterioro neurológico y motor gradual, dependiendo de la severidad
con la que se presente la enfermedad. (Modificado de Chahrour y Zoghbi, 2007).
9
El síndrome de Rett tiene una incidencia en la población de alrededor de 1:10.000 mujeres
nacidas vivas, y más del 95% de los casos clásicos de RTT son producidos por mutaciones en
MECP2. La severidad con que se puede presentar este síndrome depende del tipo de mutación
presente en la paciente, existiendo variantes atípicas de la enfermedad donde la aparición de los
síntomas resulta ser más tardía (Zapella et al., 2001). En base a este punto, ha sido reportado que
mutaciones que afectan las señales de localización nuclear causan un fenotipo mucho más severo
de la enfermedad, mientras que deleciones que afectan el extremo C-terminal de la proteína
generan manifestaciones más suaves y atenuadas de RTT (Smeets et al., 2005).
La variabilidad fenotípica observada entre las pacientes puede ser explicada, en parte, por
las diferentes mutaciones que pueden afectar al gen que codifica para MECP2, y por otra, debido
al patrón de inactivación del cromosoma X (XCI). En mujeres, sólo uno de los dos cromosomas
X se encuentra activo en cada célula, y la determinación de este es aparentemente un proceso
azaroso. Por lo tanto, una mujer que presenta una mutación en MECP2 tendrá mosaicismo,
debido a que algunas de sus células expresarán el alelo silvestre y otras el alelo mutado (Bourdon
et al., 2001). En pacientes hombres, la mayoría de las mutaciones son letales por ser hemicigotos
para la mutación. Sin embargo, evidencias recientes muestran que existe un fenotipo heterogéneo,
que va desde retardo mental hasta la muerte prematura del neonato debido a encefalopatía
congénita severa (Bienvenu y Chelly, 2006). En estos casos, la heterogeneidad fenotípica
observada, así como la severidad de la enfermedad, puede ser explicada a través de la existencia
de mosaicismo somático, o bien debido a la presencia de otros síndromes, como ha sido
observado en casos de pacientes con XXY (Síndrome de Klinefelter) y que a la vez presentan
mutaciones en MECP2. Además, existe un grupo importante de pacientes hombres que presentan
mutaciones puntuales en el gen que codifica para MECP2 que no ha sido reportadas en mujeres, y
10
que recapitulan algunas de las características clínicas clásicas de RTT, generando
manifestaciones de la enfermedad menos severas y que son compatibles con la vida dado que la
función de la proteína no es afectada mayormente. Sin embargo, es importante mencionar que la
mayoría de las mutaciones en MECP2 observadas en hombres son asociadas a retardo mental
más que a la generación de RTT propiamente tal (Villard, 2007).
Uno de los más intrigantes descubrimientos en cuanto a la relación de RTT con MECP2,
es el hecho de que un aumento en la dosis de MECP2 resulta en un desorden neurológico
clínicamente similar. La duplicación de Xq28 (locus donde se encuentra MECP2) también
conocida como síndrome de duplicación de MECP2, ha sido reportada en pacientes hombres con
fenotipos neurológicos similares a RTT, incluyendo retardo mental, desaceleración en el
crecimiento de la cabeza, movimientos estereotipados de las manos y muerte prematura (Friez et
al., 2006; Meins et al., 2005; Van Esch et al., 2005). Además, ratones transgénicos que expresan
el doble de la dosis normal de MECP2, desarrollan un fenotipo neurológico similar al observado
en pacientes con RTT (Collins et al., 2004), indicando que tanto la pérdida de función como un
aumento de la dosis de la proteína genera alteraciones asociadas a RTT (Chahrour y Zoghbi.,
2007).
11
2.3. Modelos murinos de Síndrome de Rett
En la actualidad, varios modelos murinos portadores de diferentes mutaciones en el gen
que codifica para Mecp2 han sido generados para el estudio del RTT. En el año 2001, dos grupos
independientes liderados por A. Bird y R. Jaenisch generaron ratones mutantes nulos (KO) para
Mecp2 mediante la utilización del sistema de recombinación Cre-LoxP (Sauer, 1998; Sauer,
2002; Smedley et al., 2011). Estos animales presentan una deleción del exón 3 (Chen et al.,
2001), o bien, de los exones 3 y 4 (Guy et al., 2001), que son los que codifican para los dominios
funcionales y la mayor parte de la proteína. En ambos modelos se observó signos característicos
de la enfermedad, comenzando con un periodo de desarrollo normal hasta las 3-6 semanas de
edad, seguido por problemas de hipoactividad, coordinación motora, temblores, entre otros, para
finalmente mostrar una disfunción neurológica severa y progresiva, con la consiguiente muerte de
los animales alrededor de las 8-10 semanas de edad. Si bien esta caracterización fue realizada en
ratones machos, hembras heterocigotas para la mutación también presentaron anormalidades en
el comportamiento asociadas a RTT, solo que de inicio más tardío (Chahrour y Zoghbi, 2007).
Además de los animales mutantes nulos, existe un modelo en el cual se introdujo un
codón de término prematuro en la secuencia codificante para Mecp2, generando una proteína
truncada en el aminoácido 308 (Mecp2308/y
), que por lo tanto carece del extremo C-terminal pero
conserva los dominios funcionales MBD, TRD y NLS (Shahbazian et al., 2002b). Estos ratones
se desarrollan normalmente hasta las 6 semanas de edad y muestran un deterioro neurológico
progresivo con características similares a las observadas a las pacientes con RTT.
12
Por otra parte, ha sido desarrollado un modelo en el cual se sobreexpresa la isoforma
humana de MECP2. Este ratón presenta características fenotípicas más severas pero de inicio más
tardío, apareciendo alrededor de las 10 semanas de edad (Collins et al., 2004).
Todos los modelos de la enfermedad generados a la fecha, así como las investigaciones
desarrolladas a partir de ellos, han recapitulado las características típicas observadas en pacientes
con RTT, demostrando ser herramientas experimentales muy útiles para el estudio de la
enfermedad. Además, han permitido avanzar en el entendimiento de las bases celulares y
moleculares del RTT, que sin duda apoyan la idea de que la presencia de Mecp2, principalmente
en la etapa post natal, es crítica y determinante para un adecuado desarrollo y una correcta
función neuronal (Bienvenu y Chelly, 2006; Calfa et al., 2011; Chahrour y Zoghbi, 2007).
Por otro lado, tanto las pacientes con RTT como los modelos murinos de esta enfermedad
desarrollan alteraciones asociadas a la homeostasis energética. Por ejemplo, ratones KO para
Mecp2 presentan una alteración del peso corporal, ya sea un aumento o disminución dependiendo
del background genético de los animales (Chen et al., 2001; Guy et al., 2001; Pelka et al., 2006).
En esta misma línea, ratones KO condicionales que carecen de Mecp2 exclusivamente en
neuronas del núcleo paraventricular del hipotálamo desarrollan obesidad (Fyffe et al., 2008),
mientras que ratones hipomorfos para Mecp2 también exhiben un fenotipo de sobrepeso (Kerr et
al., 2008). Si bien la mayoría de las pacientes con RTT clásico presentan bajo peso corporal, las
pacientes portadoras de mutaciones que generan un fenotipo no invalidante, que les permite
mantener su autonomía pudiendo alimentarse por sí solas, desarrollan obesidad (Zapella et al.,
2001). En conjunto, todas las evidencias presentadas en relación a alteraciones en el control del
peso corporal, ya sea en pacientes o modelos murinos de RTT, sugieren un importante rol de
13
MECP2 en la regulación del balance energético corporal, como uno de los factores claves que
podría estar involucrado en la modulación de este proceso frente a cambios ambientales.
2.4. Balance energético corporal
La regulación de la homeostasis energética corporal se encuentra determinada por dos
procesos fisiológicos fundamentales: la ingesta de comida y el gasto energético. El balance
correcto entre estos dos parámetros es lo que finalmente lleva a un adecuado control del peso
corporal (Morton et al., 2006; Schwartz et al., 2000).
El principal circuito que regula la homeostasis energética a nivel cerebral es conocido
como sistema de las melanocortinas (Gantz y Fong, 2003; Garfield et al., 2009). Este circuito
neuronal parte en el núcleo arcuato del hipotálamo (ARC), donde existen dos poblaciones
neuronales, las neuronas que expresan proopiomelanocortina (POMC) y el transcrito relacionado
con cocaína y anfetamina (CART), y las neuronas que expresan el péptido relacionado con
Agouti (AgRP) y neuropéptido Y (NPY), cuya actividad genera un efecto antagónico sobre el
balance energético (Wynne et al., 2005). La activación de las neuronas POMC induce la
expresión del precursor proopiomelanocortina, el cual es post-traduccionalmente procesado a α-
MSH y -endorfina, para ser liberados en los terminales axónicos de estas neuronas en el núcleo
paraventricular del hipotálamo (PVN) (Bicknell, 2008; Zhou et al., 1993). Las neuronas POMC
proyectan al PVN donde contactan neuronas de segundo orden que expresan los receptores para
melanocortinas (MC4R y MC3R), siendo el MC4R el principal receptor involucrado en la
regulación del peso corporal (Coll y Loraine Tung, 2009). La activación de los receptores de
melanocortina a través de α-MSH induce una disminución en la ingesta de comida y un aumento
en el gasto energético. Este circuito neuroanatómico se denomina via anorexigénica.
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En paralelo a la vía anorexigénica, existe la vía orexigénica compuesta por las neuronas
AgRP, las cuales también se ubican en el núcleo arcuato del hipotálamo y expresan y liberan la
hormona AgRP desde sus terminales axónicos en el PVN, la cual es un antagonista de los
receptores MC4R, disminuyendo la actividad del receptor por un mecanismo independiente de la
unión de α-MSH, y gatillando un aumento de la ingesta de comida y una disminución del gasto
energético (Nijenhuis et al., 2001; Tolle y Low, 2008).
Dentro de los efectores que llevan a la activación de las neuronas POMC hipotalámicas,
se encuentran señales producidas a nivel periférico como la insulina, glucosa y leptina, siendo los
efectos de esta última hormona los más conocidos por afectar y regular la expresión de POMC
(Belgardt et al., 2007). La leptina es una hormona peptídica producida principalmente por el
tejido adiposo blanco (white adipose tissue, WAT), y en menor cantidad por la glándula pituitaria
(Crane et al., 2007). La expresión y posterior liberación de leptina es proporcional a la cantidad
de tejido graso existente. Las neuronas POMC expresan la isoforma larga del receptor de leptina
(LepR2), el cual a través de una cascada de transducción de señales activa la vía JAK2-STAT3 e
induce un aumento en la expresión de POMC a nivel hipotalámico. Esta preprohormona es
procesada a α-MSH, y liberada en el PVN, desencadenando una disminución de la ingesta de
comida y un aumento en el gasto energético. Por otra parte, la leptina es capaz de inhibir a las
neuronas AgRP/NPY y por ende el tono orexigénico, lo que impacta aún más sobre el efecto
anorexigénico mediado por esta hormona (Cowley et al., 2001; Sahu, 2011; Varela y Horvath,
2012).
Hasta hace algunos años, se creía que la regulación de la ingesta de comida y el gasto
energético estaba mediada por un mismo mecanismo paralelo dependiente del receptor de
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melanocortina 4 (MC4R), lo que permitió plantear la idea que una disminución en la ingesta de
comida necesariamente inducía un aumento del gasto energético con el objetivo de mantener el
correcto equilibrio en el balance energético corporal. Sin embargo, estudios de re-expresión
condicional del receptor en un modelo murino mutante nulo para Mc4R, específicamente a nivel
del PVN y amígdala, mostraron que si bien la re-expresión del receptor era capaz de rescatar el
fenotipo de obesidad a través de la disminución de la ingesta de comida, fallaba en desencadenar
un aumento en el gasto energético, lo que llevó a proponer que existe una divergencia en la vía de
las melanocortinas, que lleva finalmente a regular de manera diferencial la ingesta de comida y el
gasto energético (Balthasar et al., 2005).
En lo que respecta al gasto energético, el tejido adiposo pardo (BAT, brown adipose
tissue) es uno de los principales determinantes de la termogénesis adaptativa en mamíferos
pequeños y en recién nacidos. Su función fisiológica es el mantenimiento de la temperatura
corporal, por lo que está directamente relacionado con el gasto energético, siendo uno de los
principales tejidos involucrados en su regulación. El BAT se encuentra ubicado principalmente
en la cavidad interescapular. Este tejido graso expresa el receptor adrenérgico β3 (AdrRβ3) y es
inervado por el sistema nervioso simpático. La liberación de catecolaminas y activación de
AdrRβ3 aumentan la expresión de la proteína desacoplante 1 (UCP-1, uncoupling protein 1), la
que forma un poro en la membrana mitocondrial interna a través del cual se movilizan protones a
favor de gradiente, lo que se traduce en generación de calor y reducción de la síntesis de ATP, y
por lo tanto, en un aumento del gasto energético (Cannon y Nedergaard, 2004).
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2.5. Planteamiento del problema, propuesta de trabajo
Estudios previos acerca del Síndrome de Rett y su relación con MECP2 han mostrado que
los pacientes y los modelos murinos de la enfermedad presentan una alteración en los
mecanismos que regulan el balance energético, principalmente asociada al control del peso
corporal. En esta misma línea, ha sido reportado que ratones hipomorfos para Mecp2 desarrollan
sobrepeso en comparación a sus respectivos controles (Kerr et al., 2008). Además, se ha
demostrado que ratones mutantes nulos para Mecp2 presentan una alteración en el control del
peso corporal (Chen et al., 2001; Guy et al., 2001; Pelka et al., 2006), y que la deleción
condicional de Mecp2 en neuronas del PVN expresando Sim1 induce un incremento en el peso
corporal (Fyffe et al., 2008), sugiriendo un importante rol de Mecp2 en la regulación del balance
energético corporal. Sin embargo, el mecanismo molecular y fisiológico que lleva a esta
regulación defectuosa del peso corporal producto de la ausencia total o parcial de Mecp2 no ha
sido dilucidado a la fecha.
2.6. Hipótesis del trabajo
En base a los antecedentes antes mencionados, se planteó la siguiente hipótesis:
“El aumento del peso corporal exhibido por ratones mutantes nulos para Mecp2 está asociado a
un desbalance en el patrón de expresión de genes asociados al control del peso corporal.”.
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Para contrastar la hipótesis propuesta, se plantearon los siguientes objetivos:
2.7. Objetivo general
Analizar el efecto de la deleción de Mecp2 en el mecanismo central y periférico que
regula el balance energético corporal.
2.8. Objetivos específicos
a) Evaluar el fenotipo de sobrepeso corporal en los ratones KO para Mecp2, y determinar si
este es producto de una mayor ingesta de comida.
b) Determinar si existe un desbalance en la expresión de genes asociados al control del
balance energético en hipotálamo, iBAT e iWAT de ratones KO para Mecp2.
c) Determinar la expresión de Mecp2 en tejido adiposo (iBAT e iWAT).
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. MATERIALES
3.1.1. Reactivos y kits utilizados
Gene Ruler 100 pb DNA ladder (Fermentas), Gene Ruler 1 Kb DNA ladder (Fermentas),
Taq DNA polimerasa (elaboración casera), dNTPs (Promega), 5X Green Go Taq Reaction Buffer
(Promega), Proteinase K (Bioline), Agarosa grado analítico (Lafken), 6X DNA Loading Dye