L4 dna veranderen met revolutionaire precisie sylvia de pater

1Bij ons leer je dewereldkennen

DNA veranderen met revolutionaire precisie

Sylvia de Pater | Lunteren 13-1-2017

2Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen

CRISPR/Cas in de mediade Volkskrant sept 2016

Nobelprijs


CRISPR/Cas in de mediaDe Volkskrant 31-12-2016

Dankzij CRISPR/Cas kunnen we alles genetisch veranderen

Malariamug

Doodeng


Presentatie overzicht

1.Wat is CRISPR/Cas?2.Historie nucleasen3.DNA herstel in eukaryoten

•NHEJ•HR

4.Mutagenese mbv CRISPR/Cas in praktijk

5.Voorbeelden6.Gene drive


Wat is CRISPR/Cas?


CRISPR/Cas• CRISPR/Cas: Clustered regularly interspaced short palindrome repeats

(CRISPR) / CRISPR associated (Cas) proteins• Adaptief immuun systeem in bacteriën en archaea tegen vreemd DNA dat de

bacteriecel binnendringt

•Biotechnologie toepassing: - maken van dubbelstrengs breuken op bijna elke willekeurige plek- Herstel kan verandering van DNA volgorde veroorzaken


CRISPR/Cas in bacteriënA. Faag DNA komt

bacterie binnen

B. DNA wordt herkend en geprocessed door aantal Cas eiwitten

C. en ingebouwd

D. in CRISPR array

E. CRISPR array RNA en TRACR RNA worden overgeschreven en geprocessed

F. RNAs vormen complex met Cas9

G. Faag DNA met dezelfde volgorde als het CR RNA wordt herkend

H. en wordt gekniptRatner et al.CSH protocols 2016


Evolutie CRISPR/Cas

Nishimasu (2016) Curr Opin Struc Biol


Evolutie CRISPR RNP complexen

Mohanraju et al. Science 2016;353:aad5147

Klasse 1

Klasse 2


Type II Cas9 effector complexen

Nishimasu (2016) Curr Opin Struc Biol

Verschillende typen uit verschillende bacteriën:• Cas9 type II uit

Streptococcus pyogenes heeft 3’PAM NGG

• Cpf1 type II uit Francisella novicida heeft 5’PAM TTN


Cas9 domeinen

Cavanagh & Garrity, “CRISPR Mechanism”, CRISPR/Cas9, Tufts University, 2014.https://sites.tufts.edu/crispr/ (2-3-2017)


sgRNA



Cas9-sgRNA• Interactie met sgRNA geeft een

conformatieverandering in Cas9



Cas9-sgRNA-DNA


• Cas9-sgRNA zoekt homologie in ds-DNA

• DSB wordt gemaakt 3bp van PAM


Historie nucleasen


DSB-geïnduceerde mutaties• Maken van DSB-en op specifieke plekken in genoom was al langer mogelijk

• Specifieke nucleasen maken is lastig en/of duur• Vaak niet zo actief of specifiek

• CRISPR/Cas is erg makkelijk, goedkoop en snel• Zeer efficient


Nucleasen• Mega-nucleasen

- Microbiele DNA nucleasen die 20-40 bp herkennen

- Selfish DNA elementen

- Tijdrovend en duur om specificiteit van DNA binding te veranderen

• Zink-vinger nucleasen- 3-6 ZF domein dat 9-18 bp herkent

- gekoppeld aan FokI nuclease domein

• TALE-nucleasen- 15-20 TALE repeat domein dat 15-20 bp herkent

- gekoppeld aan FokI nuclease domein

• CRISPR/Cas nucleasen- Cas9-sgRNA complex dat 20 bp herkent

- Zeer eenvoudig om 20bp in sgRNA te veranderen

- Enorme toename van onderzoek en toepassingen

Baltes (2015) Trends in Biotech 33, 120–131


CRISPR/Cas variaties• Twee nuclease domeinen: RuvC

en HNH

• Beide DNA strengen worden geknipt

• Mutatie in nuclease domein geeft enkelstrengsbreuk

Barrangou (2012) Nature Biotech 30: 836


Verbeteren specificiteit

Komor et al. Cell (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.10.044


Veranderen epi-genetische informatie


Activatie genexpressie Repressie genexpressie


DNA herstel in eukaryoten


DNA schade en herstel

Hakem (2008) EMBO J 27, 589


Reparatie van dubbelstrengsbreuken

(geinduceerd) DSBChromosoom

HRHomoloog DNANHEJ

variabele deleties en inserties exacte mutaties


Eiwitten voor herstel van DSBen

geen foutenspecifieke mutaties

veel foutenweinig fouten

Wood (2016) DNA Repair 44, 22–32


Mutagenese mbv CRISPR/CasEen praktijkvoorbeeld


Mutaties maken in planten

1. Plek kiezen in genoom waar je mutaties wilt maken

2. Voorwaarden: - PAM (NGG, onderstreept) moet aanwezig zijn naast deze DNA volgorde

- Restrictie site (ROOD) in de buurt van de knipplaats

AGGAGACTATCTGCAGCATGAGG of TTGCTGTTGAACTACATTGGCGG

3. On line oligo-nucleotiden bestellen

4. Kloneren in plasmide (2 stappen) en in Agrobacterium transformeren

5. (Agrobacterium) transformatie van bv Arabidopsis (zandraket)

6. Analyse van gemuteerde planten

7. In de volgende generatie planten zoeken die in alle cellen dezelfde mutatie hebben


Transgene planten• Agrobacterium transformatie• Selectie van transgene planten• Nakomelingen opgroeien• Protoporphyrinogenoxidase (PPO) is

essentieel gen

veel mutaties weinig mutaties

Shen et al (2017) doi:10.1534/g3.116.035204


Analyse van mutaties• DNA isolatie uit 1 of meerdere

planten• Polymerase chain reaction (PCR)

rond de te verwachtte mutaties• Knippen met restrictie enzym

• Resistent banden isoleren en kloneren

• DNA volgorde (laten) bepalen van PCR producten die resistent zijn voor restrictie enzym

Mutaties 100% 75% 25% 0%Gel -

+


Mutaties in Arabidopsis (zandraket)WT (Cas9-CRU)

WT CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTGCAGCATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT PstI -3 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTGCA---TGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT (3) -4 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCT----CATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT -4+1 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATC--C-GCATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT -6 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATC------ATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT -7 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTAT-------ATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT -10 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGAC----------ATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT -14 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGAC--------------GGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT -14+6 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTGCA----TTTTAT----GAGAACATTGACGACCCTGCT (2) -18+6 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTG-------ACGTGT-----GAACATTGACGACCCTGCT -22+1 CCACAGGGCAACGG-----------A----------ATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT -41 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTGCA--------------------------------GAC WT (Cas9-PPO) WT CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACATTGGCGGGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA

FauI/PAM -2 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACATT--CGGGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -4 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACAT----GGGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -5 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACAT-----GGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -6 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTAC------GGGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -7 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTAC-------GGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -11 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAA-----------GGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -14 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACAT--------------ACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -14 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACA--------------AACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA (2) -17 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTA-----------------ACACCGGAGTTCTGTCCAAGGTAAAAA -17 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAAC-----------------AAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA (3) -18 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACAT------------------CGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -18 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACA------------------CCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -30 CGG------------------------------GTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -89+26 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACA---GCTTTATTCAACCACGTACACCTAAA------AACTGAT

Aantal mutaties is zeer variabel: <1% tot 100%

Shen et al (2017) doi:10.1534/g3.116.035204


Volgende generatie• Kleine plantjes met mutatie in PPO gen:• Allemaal ‘T’ insertie: Mutant plant. CRISPR/Cas construct uitkruisen

WT TTGCTGTTGAACTACATTGGCGGCas9 TTGCTGTTGAACTACATTTGGCGGCas9 TTGCTGTTGAACTACATTTGGCGGCas9 TTGCTGTTGAACTACATTTGGCGG


Voorbeelden


CRISPR/Cas expressie in planten• Agrobacterium transformatie met T-DNA met CRISPR/Cas gen• DNA transformatie met plasmide DNA met CRISPR/Cas gen• Virale infectie met plantenvirus met CRISPR/Cas gen• Tijdelijke expressie van CRISPR/Cas zonder integratie in genoom

• Transfectie met gezuiverd Cas9 eiwit en sgRNA

Lengte en gewicht van tarwekorrel veranderen.Zhang et al 2016 Nat. Comm. 7,12617

Mutaties in Arabidopsis, tabak, rijstWoo et al 2015 Nat. Biotech. 33, 1162


Droogte-tolerant mais

Droogte-tolerant dmv CRISPR/Cas• ARGOS8 is negatieve regulator van ethyleen respons (stress hormoon).• Verhoogde expressie van ARGOS8 maakt planten minder gevoelig voor ethyleen en

geeft verhoogde opbrengst onder droogte stress.

• Mbv CRISPR/Cas is de promoter uitgewisseld met andere (activere) promoter.Shi et al (2016) Plant Biotech J doi:10.1111/pbi.12603.

droogte-tolerant droogte-gevoelig

http://www.google.nl/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwimnL-VsrLRAhUFtBoKHSaTA20QjRwIBw&url=http://wpar12.iita.org/?p%3D1485&psig=AFQjCNGMy1Ppd3m9Ih0MmKrgfVcjvgJpPA&ust=1483959447592773

http://www.google.nl/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwi0q9qTs7LRAhVG6xoKHYFbAjQQjRwIBw&url=http://www.slideshare.net/CIMMYT/remote-sensing-based-drought-tolerant-maize-targeting-in-ssa&psig=AFQjCNGvrT3MD_pUXodp-3-NMxz05X8v6g&ust=1483959659111345


Zetmeel veranderen in aardappel• Aardappelzetmeel bestaat uit amylose en amylopectine. • Voor sommige doeleinden wordt alleen amylopectine gebruikt.• Aardappel heeft 4 genomen; mutatie van 4 genes noodzakelijk.• Transient expressie CRISPR/Cas: amylose-vrije aardappels.

Wild type 3 mutant allelles GBSS 4 mutant allelles GBSS

amylose amylose NO amylose

Andersson et al Plant Cell Rep 2016


Mutagenese in druif• Tartaarzuur (wijnsteenzuur) is belangrijk voor de smaak,

mondgevoel en de bewaarcapiciteit van wijn.• CRISPR/Cas mutagenese van tartaarzuur biosynthese gen

in Chardonnay celsuspensie.

Ren, C. et al. (2016) Sci. Rep. 6, 32289; doi: 10.1038/srep32289.


CRISPR/Cas testen in muizen• Toedienen dmv virus (adenovirus,

AAV lentivirus), nanodeeltjes (sgRNA met Cas9 eiwit of mRNA) of injectie met plasmide DNA of RNA

• Voorbeelden waarbij mutaties in genen zijn aangebracht:

• Green Fluorescent Protein (GFP)• Genen gerelateerd aan ziekten zoals

kanker, hoog cholesterol, spierziekte



CRISPR/Cas therapie voor spierziekte• Duchenne muscular dystrophy (DMD) is een dodelijke spierziekte • Mutations in the dystrophin gen • Adenovirus voor toediening van CRISPR/Cas9 in mdx muizen• Verwijderen van exon 23 uit het dystrophin gen • Expression (gedeeltelijk) functional dystrophin gen• Verbetering van spierontwikkeling

Nelson et al. Science 2016;351:403-407


CRISPR/Cas therapie voor longkanker• Bepaal welke genetische afwijking

een kanker patient heeft (bv in epidermal growth factor receptor; EGFR)

• Ontwerp CRISPR/Cas om gen te herstellen of te compleet uit te schakelen

• Toediening dmv virus

Tang et al; EMBO Molecular Medicine (2016) DOI 10.15252/emmm.201506006 emmm.201506006


CRISPR testen in mens• Wedloop USA en China• China heeft als eerste

gemodificeerde cellen ingespoten in longkanker patiënten

Cyranovski 2016) Nature 539, 479

Uitschakelen van het PD-1 gen in immuun cellen (rond) zodat ze kanker cellen beter kunnen aanvallen.


CRISPR/Cas therapie in varkens

• Bescherming tegen porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)

• Receptor CD163 is nodig voor het binnenkomen van het virus in de cel

• Varkens worden niet meer ziek na uitschakeling van receptor CD163 dmv CRISPR/Cas

Whitworth, et al; Nature Biotechnology 34, 20–22 (2016) doi:10.1038/nbt.3434

Wild type CRISPR/Cas


Malariamug met CRISPR Gene Drive

Jim Gathany/CDC Anopheles stephensi mug, verspreider van malaria in Azie, die een mens steekt.


Malariabestrijding

• Uitschakelen van genen waardoor vrouwtjes muggen onvruchtbaar worden, waardoor populaties muggen kleiner worden en malaria niet verspreidt.

(Hammond et al; Nature Biotechnology (2016) DOI:doi:10.1038/nbt.3439)

• Verspreiden van antimalaria-gen, waardoor malaria parasiet niet kan verspreiden.

(Gantz et al; PNAS (2015) DOI/10.1073/pnas.1521077112)

Mutaties snel verspreiden door populatie: gene drive

Bloedcel geinfecteerd met Plasmodium vivax


Gene drive


Wat is een gene drive?• Toepassing in de biotechnologie gebaseerd op CRISPR-Cas9. • Snel en efficiënt verspreiden van een genetische eigenschap in een populatie. • Verspreiding in organismen die een korte generatietijd hebben. • Toepassing in organismen die zich geslachtelijk kunnen voortplanten.

Mutatie verspreiding via wetten van Mendel

Mutatie verspreiding dmv Gene Drive: alle nakomelingen krijgen mutatie

Omar S. Akbari et al. Science 2015;349:927-929


Gene drive of mutatie-kettingreactie (MCR) • A-C Insertie van CRISPR/Cas in locus• D-E kopieëren naar andere chromosoom

Gantz and Bier (2015) Science;348:442-444

Dicarlo et al (2015) Nature Biotech 33, 1250–1255

• DSB in homoloog chromosoom• DNA herstel via homologe recombinatie


Gene drive in gist en fruitvlieg• Ade mutatie geeft rode kleur gist kolonie

Gantz and Bier (2015) Science;348:442-444

Dicarlo et al (2015) Nature Biotech 33, 1250–1255

• Yellow mutatie geeft gele kleur aan vlieg


Veiligheid gene drive experimenten• Geen regelgeving over gene drive• Gene drive experimenten nu alleen in labcondities in het buitenland

Akbari et al. (2015) Science 349:927-929


Anti-CRISPR• Bacteriofaag anti-CRISPR eiwit

inactiveren Listeria monocytogenes CRISPR-Cas9

• Deze eiwitten voorkomen binding van Cas9 aan de DNA target

• Inhibitie van genome editing in E.coli en menselijke cellen

Rauch et al., 2017, Cell 168, 1–9


Regelgeving en politiek• Discussie over GMO regelgeving (methode (EU) vs product (USA)).• CRISPR/Cas technologie vraagt om debat over aanpassing van regelgeving.• CRISPR/Cas gemodificeerde organismen (bv landbouw gewas) zijn niet of moeilijk te

onderscheiden van planten die op een andere manier veredeld zijn.

Montage van DNA neemt hoge vlucht De ‘verbeterde mens’ is er in 2017 nog niet, maar het debat over crispr-cas, een genetische modificatietechniek, kan losbarsten.

Wim KöhlerNRC 6 januari 2017


SchoolTV video en lesbrief• NTR heeft video over CRISPR/Cas gemaakt (spierziekte FSHD). • Link naar video en lesbrief komen ter beschikking op website.• http://schooltv.nl/video/de-kennis-van-nu-in-de-klas-gentechnologie/#autoplay

http://schooltv.nl/video/de-kennis-van-nu-in-de-klas-gentechnologie/

51Bij ons leer je dewereldkennen

[email protected]