UNIVERSIDAD AUTONDMA Y’TR3PuLITANA -177F\f’F\ l-n?F) ’CBS / /&- BroCoGZA INFORME DE SERVICIO SOCI4L JMODIFICACION DE LA ACTIVIDAD INTRACELULAR DEL CALCIO INDUCIDA POR HORMONAS ESTEROIDES EN EL MUSCULO UTERINO DE LA RATA I --. “CnRLOS HOYO VSDILLO Matricula: 78215635 I
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U N I V E R S I D A D AUTONDMA Y ’ T R 3 P u L I T A N A -177F\f’F\ l-n?F) ’ C B S / /&- BroCoGZA
I N F O R M E D E S E R V I C I O S O C I 4 L
JMODIFICACION DE LA ACTIVIDAD INTRACELULAR DEL CALCIO
I N D U C I D A POR HORMONAS E S T E R O I D E S
E N EL M U S C U L O U T E R I N O D E L A R A T A
I
--. “ C n R L O S HOYO V S D I L L O
Matricula: 78215635
I
I NT R 331J C C I ON
Los esteroides gonadales juegan un papel importante
en la regulación de la fisiología uterina. Entre otras
acciones, modifican el tono y la actividad contráctil
del miometrio. A~tualmente se conoce poco de l o s
mecanismos de acción de estas hormonas sobre la
actividad miometrial.
Control Hormonal: -
El movimiento del Útero desarrolla varias funciones,
tanto durante el ciclo estral con el transporte de l o s
Óvulos, como en el parto; sin embargo, su actividad
debe reducirse durante l a gestación (Reynolds,l939).
Las hormonas ováricas se clasifican en estrógenos,
andrógenos y progestinas. Los estrógenos aumentan la
contractilidad uterina (Frank y cols.,1929), mientras
que la Progesterona l a disminuye (Allen y .Corner,
1929), a s í como las progestinas y los andrógenos
(Kubli-Garfias y cols., 1979; 1980).
Contracción muscular:
Szent-Cyorgyi (1951) demostró que e? mecanismo
fundamental de la contracción es l a interac'ción entre
actina y miosina, en presencia de adenosfn trifosfato.
-1-
Se s a b e , que l o mismo o c u r r e en e l m ú s c u l o l i s 0
( C s a p o , 1 9 7 1 ; D i n i e l y Lodge , 1 9 7 3 ; C a r s t e n , 1971 ;
Hurwitz y S u r i a , 1971; Somiyo y Somlyo,1968).
E l m e c a n i s m o por e l c u a l e l p o t e n c i a l de a c c i ó n
desencadena una respuesta m e c á n i c a , r e c i b e e l nombre
de a c o p l a m i e n t o e lectromecánico. Aunque todavía no se
comprende bien como el e l p o t e n c i a l de a c c i ó n d i s p a r a
l a l i b e r a c i ó n de l o s iones de c a l c i o desde e l r e t í c u l o
sarcoplásmico, ( F i n n y P o r t e r , 1975) .
- ~i i ó n c a l c i o e s e s e n c i a l p a r a i a c o n t r a c c i ó n , ya
que h a c e p o s i b l e l a i n t e r a c c i ó n e n t r e a c t i n a y
miosina. La tropomiosina es una p r o t e í n a que cubre l o s
s i t i o s de i n t e r a c c i ó n d e l a a c t i n a con l a m i o s i n a . En
p r e s e n c i a de c a l c i o l a tropomiosina es s u s t i t u i d a por
t roponina , l a cua l hace p o s i b l e l a i n t e r a c c i ó n e n t r e
a c t i n a y m i o s i n a , además de aumentar l a a c t i v i d a d
ATPásica de l a miosina (F inn y P o r t e r , 1975) .
P o r o t r a p a r t e , l a r e l a j a c i ó n d e l mÚsculo
e s q u e l é t i c o s e debe a que e l r e t í c u l o s a r c o p l á s m i c o
r e t i r a a l c a l c i o d e l c i t o s o l . En ausencia de c a l c i o ,
l a tropomiosina obstruye de nuevo l o s s i t i o s de u n i ó n
e n t r e a c t i n a y miosina impidiendo l a contracc ión ( F i n n
y P o r t e r , 1975) . -
En e l músculo l i s o e l a c o p l a n i e n t o e l e c t r o m e c á n i c o
no e s t a b i e n d i l u c i d a d o . S i n embargo, se sabe que e l
I
!
- 2 -
m i o m e t r i o , d e p e n 3 e d e l c a l c i o e x t e r n o p a r a s u
c o n t r a c c i ó n ( F i l o y c o l s . , 1 9 5 0 ) . Además, l a s
c a r a c t e r í s t i c a s i n t r í n s e c a s d e l m i o m e t r i o , g r a n
espac io i n t e r c e i u l a r , tamaño c e l u l a r pequeño, r e t í c u l o
s a r c o p l á s m i c o r e d u c i d o y p r e s e n c i a de n u m e r o s a s
v e s i c u l a s p i n o c í t i c a s en l a membrana p l a m g t i c a
favorecen e l f á c i l i n t e r c a m b i o c e l u l a r con e l medio
externo.
Por l o a n t e r i o r , se podrá c o n s i d e r a r a l a membrana
p i a s m á t i c a como u n s i t i o i m p o - r t a n t e p a r a una
i n t e r a c c i ó n e s t e r o i d e - c a l c i o .
ANTECEDENTES.
En 1 9 7 1 , Anderson, F i d e l y S n y d e r m o s t r a r o n l a
e x i s t e n c i a d e una c o r r i e n t e de c a l c i o acompañada por
una de sodio para generar e l p o t e n c i a l de a c c i ó n en e l
m i o m e t r i o . E s t e t r a b a j o fue completado p o r Mironneau
( 1 9 7 6 1 , quien r e l a c i o n ó e s t a s c o r r i e n t e s de s o d i o y
c a l c i o con l a contracc ión de l a s f i b r a s miometr ia les .
E l c a l c i o puede e n t r a r a l a c é l u l a m i o m e t r i a l ,
fundamentalmente por dos t i p o s de c a n a l e s , los c a n a l e s
s e n s i b l e s a l v o l t a j e y los c a n a l e s operados por un
r e c e p t o r , ( B o l t o n , 1979) .
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!
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Los canales sensibles a 1 v o l t a j e permiten e l paso de
c a l c i o cusndo se abate e l potenc ia l de membrana (es
dec i r e l po tenc ia l d e reposo) , como ocurre en l a s
s o l u c i o n r s que t ienen elevada l a concsntración de
po t i s i o . Estas v í a s , pueden ser bloqueadas por l o s
antagonistas de ca lc io , (Bolton, 1979) .
Los canales operados por un receptor , responden a
l o s estímulantes, como 13 a d r r n a l i n a , son especí f icos
para cada trasmisor y por l o tanto producen diferentes
caabios en 13 permeabilidad a l ca lc io . Estos canales
pueden activarse aunque e l potenc ia l de membrana sea
b a j o y d i f í c i l m e n t e pueden ser bloqueados por l o s
antagonistas de ca lc io , (Bolton, 1979) .
La r e l a j a c i ón d e l músculo l i s o es producida por l a
disminución de l ca l c io intrace lu lar l i b r e ; t a n t o por
f i j ac ión intracelular del ca lc io (Janis y cols. 1977) ,
como por su expulsión de l a c é l u l a , (Hurwi tz y cols.,
1973) .
?fa y Bose ( 1 9 7 7 ) trabajando con l a taenia c o l i de
cobayo y e l útero de r a t a , han mostrado que l a s a l i d a
de c a l c i o (acoplada a una entrada de sodio ) es más
impor tan te p a r a p roduc i r l a r e l a j a c i ó n , que l a
f i j a c i ó n d e l c a l c i o en s i t i o s in t race lu la r es . Estos
autores, comprobaron (en l a taenia c o l i de cobayo y en
e l miometrio de r a t a ) , que l a ausencia de sodio es
-
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i
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capaz de producir una c~ntraición adicional a la q-20
produce la despolarización con potasio alto (mM).
Con respecto a las hormonas esteroides, se ha visto
que los metabolitos de la Progesterona pueden ser más
importantes en s u s acciones sobre la actividad
mecánica del Útero que ella misaa. Los metabolitos más
activos han sido sus derivados reducidos en la
posición 5, es decir los estereoisómeros 56, (ver
figura l), (Kubli-Garfias y cols., 1979).
S e s a b e que tanto la Progesterona como l a
Pregnandiona, la Epipresnanolona y la Pregnanolona son
antagonistas del calcio (Kubli-Yarfias y cols.,
enviado a publicación).
En base a lo anterior, se decidió utilizar dos
modelos, para estudiar la acción de estos esteroides.
En un modelo, se activan los canales sensibles al
voltaje y se observa el efecto relajante que tienen
estas hormonas; en e l otro modelo además de activar
los canales sensibles al voltaje, se activa el influjo
de calcio por el intercambiador sodio-calcio. Con
estos modelos, se esperaba discriminar la acción de
las hormonas estudiadas en ambos sistemas. Si las
relajaciones que se obtuvieran fueran parecidas, se
esperaría que la acción de las hormonas tambion sería
parecida.
.
c
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~ L O P R E G N A N O L O H A CH3 I HO H c=o
5ix-PREGNkNDIONA
O
3 a - H I D R O X I n PREGNAN-20
r - O I
crv' - 5 h - -0NA
y 3 c- o
CH3 I O
PROGESTERON A
O
~
EPIPREGNANOLON . Y
Figura 1 . Metabalitos 5 e y 5 B reducidos de 12 Progesterona. (De Kubli-Garfias y cols, 1979).
OSJETIVO:
1) Demostrar que e l e f e c t o Ú t e r o r e l a j a n t e d o l a s
p r o g e s t i n a s 5 e y 5 5 r e d u c i d a s s o b r e e l ú t e r o
contra ído por s o l u c i o n e s d e s p o l a r i z a n t e ( p o t a s i o a l t o ) - y sodio c e r o e s d i f e r e n t e .
MATERIAL Y METODOS:
Los e x p e r i m e n t o s se r e a l i z a r o n en r a t a s hembras
v í r g e n e s d e l a c e p a Sprague Dowley ( 1 5 0 - 2 0 0 g ) , en
fase de d i e s t r o , determinado por un exaaen h i s t o l ó g i c o
d e un f r o t i s v a g i n a l . Los animales se s a c r i f i c a r o n por
d e c a p i t a c i ó n , e x t i r p á n d o s e l e s rápidamente e l ú t e r o ,
p a r a d i s e c a r l o en medio de una s o l u c i j n Hepos normal
( v e r t a b l a 11, a t e m p s r a t u r a a a b i e n t e . Cada c u e r n o
u t e r i n o s e d i v i d i ó en dos p a r t e s i g u a l e s , l a s c u a l e s
s e co locaron en u n s i s t e m a c o n v e n c i o n a l de r e g i s t r o
i s o m é t r i c o , para t e j i d o s a i s l a d o s , en un baa0 de 5 m l ,
a una temperatura de 37OC y con un burbujeo c o n s t a n t e
de c a r b ó g e n o ( 9 8 % d e o x í g e n o y 2 % d e d i ó x i d o de
carbono). La a c t i v i d a d c o n t r á c t i l d e l músculo u t e r i n o
.
!
I
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TABLA 1
COMPOSICION DE LAS SOLUCIONES (my):
HEPES NORYAL DESPOLARIZANTE
Hepes 10 10
Glucosa 1 1 1 1
Sacarosa - - NaCl 135 9 9 . 6
KC1 4 . 6 40
MgC12 1.2 1 . 2
CaC12 2 . 2 2 . 2
O s m o l a r i d a d 3 2 0 . 4 m O s
320.4mOs
Fuerza iónica - 1 5 9 8 . I 5 9 8
HIPOSODICA
10
1 1
1 9 9 . 2
0 .0
4 0
1 .2
2 . 2
3 2 0 . 4 m O s
.O648
TABLA 2
DOSIS DE LAS HORMONAS UTILIZADAS: lis efectivas 8 4 :
HORgONA w / m l mM Relación
PROGESTERONA 32
EPIPREGNANOLONA 15
PREGNANDIONA 13
PRECNANOLONA a
molar a la
Progesterona
101 .7 1 .o0
4 7 . 1 . 4 6
4 1 . 1 . 4 0
2 5 . 1 . 2 5 .
c
(Datos de Kubli-Garfias y cols. 1979)
se registró, aodiantr? -I u s 3 2 9 u7 t r i q s s u i t o r á e
tensión FT03 en un polígrafo Grass rn3delo 7B en serie
con una microcomputadora Sol de Processor Technology,
que convierte la sena1 anaiógica en numeros para
grabarlos en un disco magnético.
La tensión a la que se somstió el tejido fué de un
gramo.
Las preparaciones, que generalmente desarrollaron
una actividad espontsnea regular casi inmediatamente a
que se ajustaba la tensión, se dejaron estabilizar por
lo menos 30 minutos antes de hacer ningún cambio. Una
vez estabilizada la actividad contráctil del músculo,
se hizo el cambio de solución. En cada experimento se
probó solo una solución y una hormona. La solución
contracturante, despolarizante o sodio cero (ver tabla
l), se dejó estabilizar cinco minutos, de modo que la
contracción alcanzara un valor constante, antes de
añadir la hormona.
En la solución despolarizante (potasio alto), se
mantuvo l a osmolaridad fisiológica bajando la
concentración de sodio l o necesario, mientras que en
la solución sodio cero se empleó sacarosa para
sustitiur al sodio y conservar la osmolaridad
fisiológica. ,
-
A posar de que la fuerza iónica es baja en la
-7-
solución sodio cero ( v e r tabla l ) , , s e 9 3 visto que
esto no produce una aumento e n la contracción (Ma y
( 3 a - h i d r o x i - 5 ~ p r e g n a n - 2 0 - o n a ) , Pregnandiona
( 5 a - p r e g n a n - 3 B t 2 0 8 - d i o l ) , y P r e g n a n o i o n a
(3 E-hidroxi-5 B-pregnan-20-ona).
Las hormonas se inyectaron a l interior del ballo en
un volumen de 0.05 ml de Propilen glicol. Para las
dosis, ver la tabla 2 (Yubli-Sarfias y cols. 1979).
La relajación s e midió comparando las áreas bajo
las curvas, en porcentajes con respecto a un área
control; la cual se calculaba como una extrapolación
del valor ya estabilizado de la contracción inducida
con ia solución respectiva. L a s áreas s e calcularon
por medio de la microcomputsdora con un programa en
BASIC. Este programa tuvo que ser adaptado a nuestras
condiciones de registro, y utilizó los valores
digitalizados de l a actividad contráctil del músculo
que la microcomputadora ya había capturado. - La relajación también se midió utilizando otros
parámetros. Por medio de otro programa en BASIC, la
microcornputadora buscó l o s tiempos (en minutos) en que
-8-
!
Figura 2. Sistema de registro y procesamiento de los datos.
A. Ball0 con el tejido uterino. B.Poligrafo. C. 0sciloscopio.D.
Microcomputsdora. E. Impresor. --.
I
s e a l c a n z a b a u n 5 3 % d i 1 v a l o r de l a c o n t r a c c i ó n a i
poner l a hormona (t iempos medios de r e l a j a c i j n ) .
U n t e r c e r parametro l o const i tuyeron los v a l o r e s de
una s e r i e de muestreos cada minuto (hechos también por
l a microcomputadora), d e l v a l o r de l a contracc ión .
Todos e s t o s p a r a m e t r o s s e compararon, para una
misna hormona, e n l o s dos t i p o s de s o l u c i o n e s , por
medio de pruebas de t de Student.
RESULTADOS.
La r e l a j a c i ó n u t e r i n a p r o d u c i d a p o r l a s d o s i s
e f e c t i v a s 8 4 d e l o s e s t e r o i d e s p r o b a d o s , f u e
s i g n i f i c a t i v a m e n t e ( p < . 0 5 ) d i f e r e n t e , c u a n d o s e
c o m p a r a r o n los p o r c e n t a j e s de i n h i b i c i ó n en l a s
s o l u c i o n e s c o n t r a c t u r a n t e s por p o t a s i o a l t o y p o r
s o d i o c e r o . Lo mismo o c u r r i ó a l comparar los tiempos
msdios de r e l a j a c i ó n , e x c e p t o para l a pregnandiona ,
donde l a p fue de .O71 ( n 3 s i g n i f i c a t i v a ) .
Cuando s e conparó e l v a l o r de l a contracc ión en cada
m i n u t o , s e o b s e r v a r o n d i f e r e n c i a s s i g n i f i c a t i v a s ,
e x c e p t o en dos c a s o s , e s t a s d i f e r e n c i a s s e f u e r o n
n a y o r e s a l a v a n z a r e l tiempo. Con l a Epipregnanolona
l a d i f e r e n c i a no fue s i g n i f i c a t i v a a l pr imer m i n u t o ,
pero s í a p a r t i r d e l segundo. Para l a Pregnanolona la
-_
-9-
significancia se presentó cies3e el sexto ninuto, por
lo tanto los tiempos medios de relajación para las dos
soluciones no fueron significavamente diferentes.
En las Tablas 3, 4 , 5, 6 , 7 y 8, se indican l o s
valores d e los tres parámetros así como s u s
desviaciones estándar (d.e.), los errores estándar , y el número de experimentos (n). En las figuras 3 a 6 ,
se muestran las gráficas de los valores de contracción
con respecto al tienpo.
Se obs2rvÓ que la relajación es mayor en l a
contractura por potasio alto que la relajación en la
solución con sodio cero.
!
1
I
DISCüSION.
Soluciones empleadas. La solución despolarizante es
una solución isotónica con un alto contenido de
potasio; lo cual, según la ecuación de Coldman, abate
el potencial de reposo. Las fuerzas iónicas de esta
solución y de la solución normal son iguales.
El efecto contracturante de la solución sodio cero,
fue observado por Katase y Tomita (19721, en la taenia
coli de cobayo. Ma y Bose (1977) l o corroboraron (en
taenia coli de cobayo) y mostraron que se debía
.
-10-
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MUESTREOS DEL VALOR DE L A CONTRACCION CADA M INUTO .
E n p o r c e n t a j e s c o n r e s p e c t o a 1 v a l o r d e l a c o n t r a c c i ó n e n e l m i n u t o c e r o ; p e s l a s i g n i f i c a n c i a s e g ú n l a p r u e b a d e t , s e s s i s n i f i c a t i v o y ns no s i g n i f i c a t i v o .
T A B L A 5
PRCIGESTERCINA
C o n t r a c c i ó n p r o d u c i d a p o r :
S O L U C I O N S O D I O M i n . P o r c e n t a j e 1 81.1 2 - 64.8 ~
3 54.0 4 46.8 5 41.8 6 37.5 7 34.7 8 31.9
CERCI E r r o r 1.4 2.0 2.8 3.2 3.6 3.7 3.9 4.2 4.1 4.2
S O L U C I O N D E S P O L A R I Z A N T E P o r c e n t a j e Error P
73.5 2.9 .o33 s 55.1 2.8 .o15 s 43.5 2-3 .o14 s 36.4 2.2 .o19 s 30.7 1.9 .O18 s 25.8 1.8 .o15 9 22.9 1.7 .O16 s 19.7 1.6 .O18 s 17.3 1.5 .o15 s 15.7 1.3 .O18 s
T A B L A 6
E P I P R E G N A N O L O N A .
S O L U C I O N S O D I O M i n . P o r c e n t a j e
S O L U C I O N D E S P O L A R I Z l N T E P o r c e n t a j e Error P
83.4 1.2 .lo5 ns
57.0 1.4 .O06 s 50.2 1.5 <.o01 s 43.8 1.7 39.0 35.4 1 . 5
68.0 1 ..5 .O18 s
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n 31 -9 28.8 1 :2 27.1 1.1 11
I
1
TABLA 7
PREGNANDIONA
C o n t r a c c i ó n p r o d u c i d a p o r :
SOLUC ION SODIO CERO SOLUCION D E S P O L I R I Z A N T E
M i n . P o r c e n t a j e Error P o r c e n t a j e E i ' r o r P 1 8 8 . 3 2.1 7 9 . 3 3 . 0 . o 2 9 2 7 3 . 9 2 . 5 6 0 . 2 3.0 . o 0 5 3 6 3 . 6 3 . 2 4 6 . 5 2 . 6 . o 0 2