Kul I Bakteri Air Smt 4

Toksin BakteriGenetika bakteriMikro Flora Normal (MFN) manusiaPenyebaran Bakteri (Air, tanah, udara, makanan & minuman)Pemeriksaan air, makanan & minumanPemeriksaan MPN & TPC air, makn dan minumanINOS (Inf Nosokomial); bakt udara, usap alat, usap lantaiBakteri anaerob

AM sesuai KEPMENKES No. 492/MENKES/PER/IV/2010AB, AKR sesuai PERMENKES No. 416/Menkes/Per/ IX/1990BA sesuai dengan PP No 82 th 2001AL sesuai dengan Kep. Gub KalTim No. 2 th 2011

Pemeriksaan Air, Makanan dan minuman, dan pemeriksaan susu Segar (ASS =sapi, kambing, domba)

= untuk mencegah terjadinya gangguan-gangguan thd kesehatan serta meluasnya penyakit :bawaan air (water borne disease), bawaan susu (Milk Borne Disease),penyakit keracunan makanan (food poisoning ) penyakit bawaan makanan (food borne diseases)

Mikroorganisme yang terdapat dalam air :a. Normal Flora airPseudomonasSerratiaeMicrococcib. Soil BacteriaBacillus megateriumBacillus subtilisBacillus mycoidesKlebsiellac. Sewage BacteriaGol Coliform bacteria (E. coli, Aerobacter, Klebsiella)Kuman yg habitatnya memang disini (Chlostridium, Proteus, Streptococcus faecalis)Kuman-kuman patogen (Salmonella, Shigella)d. Parasit (Protozoa, amuba)e. Virus-virus

Syarat air minum yg baik adalah air tidak mengandung c , d & e karena dapat menyebabkan water borne disease misalnya : Typhoid fever, Shigellosis, Hepatitis infectiosa, Poliomyelitis, Cholera, dll.

MPN = perkiraan terdekat jumlahBakteri koliform = bakteri gol coli, yg ditandai dengan kemampuan bakteri itu menguraikan laktosa menjadi asam dan gas didalam media BGLB pada suhu 35-37oC 48 jam (mis. Genus Klebsiella, Enterobacter, Escherichia).Coliform tinja = Coliform yg mampu tumbuh pada suhu 44,5 oC 24 jam

1. Air Kran (air ledeng) Cara : Bersihkan kran dr setiap benda yg menempel dan mungkin mengganggu (debu/kotoran) dg kain bersih,Pipa ledeng dipanasi selama 5 menit, selanjutnya kran dibuka selama 5 menit dan biarkan terbuang (tidak ditampung).

Jika kran dari plastik, bisa digunakan alkohol 70 % untuk membersihkannya.Selanjutnya ditampung dalam botol berukuran 250 ml, isi air 200 ml secara aseptik (3/4 bag botol), tutup dg kertas pembungkus dan ikat dg tali pada leher botol.Wadah/botol sebelumnya ditambahkan 5 tetes cairan Sodium thiosulfat 10 %, untuk menetralisir sisa chlor (Cl2 ) yg ada didalam air kran.

2. Air Sumur Wadah tanpa pemberian sod thiosulfat. Pada bag dasar botol diberi pemberat yg dikaitkan dg kawat, pd leher botol diikatkan tali dg pjg 20 m. Semua disteril (botol, tali dan pemberat)Bilas tangan dg alkohol 70 %, buka bungkus botol, letakkan tutup botol ditempat kertas pembungkus tadi, dg posisi mulut botol menghadap keatas, ulurkan botol scr perlahan2 jangan sp menyentuh ddg sumur, ulurkan tali sp ke dasar,

Tarik botol yg telah terisi penuh, kmd buang bg dr air yg ada dlm botol tsb.Tutup botol, dan bungkus dg kertas steril serta ikat tali pd bag leher botol.Beri label.

3. Air badan air/ sumber air yg terbuka (sungai, danau, dll )Botol steril dipegang pd bag bawah, celupkan kedlm air dg leher botol menghadap miring kebawah, celupkan botol tsb hingga mencapai kedalaman 20 cm. Bila perlu mulut botol berhadapan dg arah aliran air.Sth botol terisi air, (3/4 bag) dan bungkus kembali dg kertas steril dan ikat dg tali.

4. Air kolam renang wadah penampung diberi sod thiosulfat 10 % sebanyak 5 tetes.Digunakan botol dg tali, celupkan seluruh permukaan botol kedalam air kolam renang sp mencapai dasar, jangan sp menyentuh ddg kolam .Isi penuh , kmd buang bag, tutup spt yg lain.

Indikator : Sebagai indikator air sudah tercemar atau belum adalah dengan ditemukan Escherichia coli.Escherichia coli dipakai sebagai indikator dengan alasan bahwa kuman ini paling lama tahan hidup selama 2 hari dalam air sehingga menunjukkan kontaminasi yang baru.

Bakteri gol coli :bersifat Gram negatiftidak membentuk sporameragikan laktosa pada suhu 35oC-37oC, dengan menghasilkan asam dan gas dalam 24-48 jam.Bertoleransi pada suhu 44oC 45oCPada metil red test (+), Indol (+), Simon s Cytrat (-).

Kuman kuman tsb dibawah ini tidak dapat digunakan sebagai indikator :Chlostridium tetani : kuman ini membentuk spora yang tahan lama sehingga tak menunjukkan kontaminasi baruStreptococcus faecalis : kuman ini pertumbuhannya sering terdesak oleh kuman lain .

Untuk penilaian kualitas air minum dan air bersih dari segi Mikrobiologi parameter yang dipakai (sesuai Kep menkes AM sesuai KEPMENKES No. 492/MENKES/PER/IV/2010) :Bakteri gol ColiformBakteri gol Coliform tinjaJumlah kuman/100 ml air

Air minum :MPN bakteri Koliform tinja = 0/100 ml airMPN bakteri gol Koliform = 0/100 ml airAir bersihMPN bakteri gol Koliform = 10/100 ml air untuk yg berasal dari perpipaan (sumur Bor) ; 50/100 ml utk air bersih non perpipaan (sumur gali)

Air kolam renangMPN bakteri gol Koliform = 0/100 ml airAir badan air ( PP no 082 th 2001 )MPN bakteri gol Koliform = 1000/100 ml airE. coli 100/ 100 ml airAir limbah sesuaidengan Kep. Gub KalTim No. 2 th 2011 mis. Limbah rumah sakit = MPN bakteri gol Koliform =10.000 /100 ml air

Secara kualitatifAda 3 tahap :Presumtive test ( test perkiraan = test pendahuluan) Media : laktosa broth ; Lauryl tryptose broth atau Mac Conkey brothConfirmed test (confirmation test = test penegasan)Digunakan media BGLB (Brilliant Green Lactosa Bile Broth) atau EC Broth (Escherichia coli broth)Complete test. media EMB agar/MC agar/Endo agar/Tergitol agar, inkubasi 37oC 24 jam

Ragam yang digunakan untuk test perkiraan :Yang biasa digunakan : 2 ragam yaitu ragam 15 tabung dan 7 tabung, untuk ragam 9 tabung digunakan jika tab utk rgm 15 tab kurang.Ragam I : 7 tabung tdd :5 tab LB (double/triple strength) + 10 ml air1 tabung LB (single strength) + 1 ml air1 tabung LB (single strength) + 0,1 ml air

Ragam 15 tabung tdd :5 tab LB (triple/double strength) 5 ml+ 10 ml air5 tabung LB (single strength) 10 ml + 1ml air5 tabung LB (single strength) 10 ml + 0,1 ml air

Ragam I (7 tabung) :Untuk spesimen yg sudah diolah, atau spesimen yg diperkirakan kepadatan bakteri indikatornya rendah.

Cara kerja : 5 tabung yang masing2 berisi 10 ml media laktosa berkekuatan ganda (double SB) atau 5 ml triple strength lactosa broth ) + 10 ml sampel air.1 tabung yg berisi 10 ml media laktosa (single strength lactosa broth) + 1 ml sampel air1 tabung yang berisi 10 ml media lactosa single strength + 0,1 ml sampel airSemua tabung media dan sampel tadi diberi tabung durham atau tabung Eyckman yg diletakkan terbalik.Agar sampel menyebar keseluruh bagian media, isi tabung diisap dan dilepaskan berulang kali.Inkubasi pada suhu 35 oC-37 oC selama 2x24 jamAmati masing2 tabung untuk melihat ada tidaknya gas dalam tabung durham.Jika gas (+) berarti test perkiraan (+); tetapi belum pasti adanya bakteri gol Koliform atau Koliform tinja, karena laktosa dpt juga diragikan oleh bakteri lain selain coliform. Jadi harus dilanjutkan ke test penegasan.

Ragam 2 (15 tabung)Untuk spesimen yang belum diolah dan angka kumannya diperkirakan tinggi ( air sumur gali, air sungai, air mata air, air hujan, air kolam renang, dsb) Cara kerja : Spesimen air tanpa diencerkan ditanam pada media :5 tabung LB (5 ml) triple strength masing2 10 ml5 tabung LB single strength masing-masing 1 ml5 tabung LB single strength masing-masing 0,1 ml (jika perlu sp 0,01 ml)inkubasi 35-37 oC 24-48 jamLB yg positif dilanjutkan ke test penegasan

Dari tiap-tiap tabung yang positif pada test perkiraan , ambil 1-2 ose kedalam tabung konfirmatif (penegasan) yang berisi 5 ml BGLB.Dari masing-masing tabung presumtif diinokulasikan kedalam 2 tabung BGLB atau 1 tab BGLB dan 1 tab EC broth 5 mlSatu seri tabung BGLB diinkubasikan pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam, (untuk memastikan adanya Coliform). Dan satu seri yang lain (BGLB at EC) diinkubasikan pada suhu 44 oC selama 24 jam (untuk memastikan adanya coli tinja)

Pembacaan dilakukan setelah 24-48 jam dengan melihat jumlah tabung BGLB/EC broth yang positif adanya gas.Untuk mendapatkan index MPN coliform, digunakan tabel MPN berdasarkan tabung-tabung BGLB positif gas.

Catatan :jika sampel kepadatan bakteri indikatornya tinggi (mis. Air limbah, air sungai) dapat kita buat pengenceran misalnya : 0,1 ml; 0,01 ml; 0,001 ml. Dengan menggunakan PZ atau aquadest steril; dari pengenceran ini kita ambil masing2 1 ml dan masukkan kemedia LB.

Catat jumlah tabung confirmatif (tab BGLB) yg menunjukkan positif gasAngka yang diperoleh dicocokkan dg tabel MPNIndeks MPN coliform utk tabung yg diinkubasi 35 oC - 37 oC; dan indeks MPN Coli tinja untuk tab yg diink. 44 oC (0,5 oC)

Contoh pembacaan hasil :Ragam I : Tab 5 x 10 ml BGLB (+) gas =3Tab 1 x 1 ml BGLB (+) gas = 1Tab 1 x 0,1 ml BGLB (+) gas = 0Lihat tabel : 511 ; kmd lihat bag 310 : index MPN = 12Untuk ragam 2, 3 sama, hanya tabel yg digunakan berbeda.

V O L U M E (ml)MPN/100 ml1010,1002Dst3Dst 010

1111

0247,5

12

Penghitungan index MPN dpt dilakukan dengan formula THOMAS: (A + B +C) x (SxN) -1 x 100 = ...........A = jumlah tabung (+) gas penanaman kelp IB = jumlah tabung (+) gas penanaman kelp 2C = jumlah tabung (+) gas penanaman kelp 3S = jumlah ml sampel yg ditanamN = jumlah ml sampel yg negatifContoh (3+1+0) (51,1 x20,1) -1 x 100 = 400/32,046 = 12,48

Misalnya :Dari penanaman dg vol 10 ml diperoleh 5 tab BGLB (+) gasDari penanaman dg vol 1 ml diperoleh 5 tab BGLB (+) gasDari penanaman dg vol 0,1 ml diperoleh 5 tab BGLB (+) gasJika dijumpai keadaan demikian dimana pada tabel ragam II (5.5.5) 2400; maka jumlah tabung ditambah dg seri 5 x 0,01 ml dan 5x0,001 ml

Bila contoh/sampel dipipet kedlm tab sebanyak 1 ml, 0,1 ml, 0,01 ml maka MPN coliform/100 ml dihtg dg rumus :MPN(APM/JPT) :MPN dlm tabel x 10Jumlah ml yg terbsr dipipetContoh = jlh tab pos : 5-2-1; pd tab = 70Maka MPN coliform/100 ml :70 x 10 = 700 1

Bila :Dari penanaman dg vol 1 ml & 0,1 ml diperoleh 5 tab (+) gasDari penanaman dg vol 0,01 ml diperoleh 4 tab BGLB (+) gasDari penanaman dg vol 0,001 ml diperoleh 1 tab (+) gasMaka angka yang diambil adalah : 5.4.1 (5x0,1 ml; 4x0,01 ml; 1x0,001 ml )Nilai MPN yg diperoleh dari tabel harus dikalikan 100 untuk mendapatkan hasil MPN yg sebenarnya. Maka nilai MPN/100 ml utk sampel ini adalah 113x100 = 11300.

Cth V o l u m eRagam yg dipilihFaktor perkalian10,10,010,0010,00011234555550553512405001030000105-2-05-4-15-3-05-3-10-1-010010010100010

Dari hasil Test penegasan gas(+), dilanjutkan ke complete test.Masing2 dari tabung BGLB yang positif ditanam pada media EMB agar/MC agar/Endo agar/Tergitol agar, inkubasi 37oC 24 jamKoloni yg tersangka E.coli ditanam pada SIM/MIO/MIU; Simons cytrat dan TSI agar.Inkubasi 37oC 24 jamDicatat hasil pertumbuhan, untuk memastikan apakah benar E.coli atau bukan. Kemudian dicari pada tabel MPN untuk menentukan index MPN coli.

Biasanya untuk sampel :air kolam renang (utk spl air lain atas permintaan)Bahan harus diperiksa < 24 jam setelah pengambilan.Untuk ma-mi hrs diperiksa < 4 jam Media & reagensia yg digunakan : Media Plate Count Agar /Nutrien agarGaram fosfat buffer pH 7,2Aquadest steril

Alat yg digunakan :OvenAutoclaveInkubatorWaterbathTimbangan Lampu speritusOseTabung reaksi + rakColony counterErlenmeyer, beaker glass, pipetpH meter/indikator pH

1. pengenceran sampelpengenceran dilakukan thd sampel yg diperkirakan jumlah kumannya banyak, bertujuan supaya dapat dihitung jumlah koloni tiap-tiap kuman.

2. Penuangan media Plate Count AgarMasing2 pengenceran sampel diambil 1 cc, masukkan kedalam petridish steril yg sdh diberi tanda no sampel, pengc dan tgl pelaksanaan pemeriksaan.Utk test sterilitas alat, reagensia, ruangan dan cara kerja perlu dibuat kontrol yaitu petridish diisi pelarut steril (aqudest/b. fosfat) sebanyak 1 cc.Tuangkan agar cair (suhu 45oC-50oC) sebanyak 15-20 cc.Biarkan membeku, kmd dibalik dan inkubasi 35 - 37oC.

idealnya jumlah koloni per plate yg boleh dihitung antara 30-300 cfu (colony form unit)Koloni besar, kecil, menjalar, dianggab berasal dari satu koloni.Penghitungan dapat dilakukan secara manual dengan memberi tanda titik dengan spidol pada petridish bg koloni yg sdh dihitung/ dg colony counterTiap2 plate dari pengenc berbeda dihitung jumlah koloninyaDgn mengalikan pengencerannya akan diperoleh angka/jumlah kuman /bakteri per gram /1cc sampel yg diperiksa.

Contoh penghitungan dan pelaporan Penghitungan koloni/plate misalnya diperoleh angka :

No Plate Pengec kolAngka kmn/ cc1.2.3.4.kontrol1 x10 x100 x1000 x1 x4652713981-27003800--

Angka kuman/TPC untuk sampel yg diperiksa :(271 1) x 10 + (39 -1 ) x 100 2= 3250cfu/cc = 3,25 x 103 cfu/cc at g

Catatan : Untuk menghitung bakteri spora, sampel yg sdh diencerkan 10 x didihkan 10 menit, kmd diencerkan dan dikerjakan spt diatas.Cara ini dipk hanya untuk menghitung bakteri yg hidup sajaJumlah koloni pada plate kontrol digunakan utk mengurangi jumlah koloni pd plate pengenc, sebelum dikalikan dg pengenc utk mendapatkan jumlah bakteri per gram/cc, jumlah koloni plate kontrol tdk boleh > 5.

Sekian, terima kasih

*