-
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
KUANTITAS MIKROBA : HITUNGAN CAWAN
Rabu, 1 April 2015
Kelompok 2
Rabu, Pukul 13.30 16.30 WIB
Nama NPM Tugas
Winda Ratna Pratiwi 260110130096 Alat dan Bahan, Prosedur,
Pembahasan
Femmi Anwar 260110130097 Tujuan, Prinsip, Teori Dasar
Mega Trinova Durika 260110130098 Editor, Data Pengamatan,
Pembahasan
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015
Nilai TTD
(Shintya) (Benedictus)
-
KUANTITAS MIKROBA : HITUNGAN CAWAN
I. Tujuan
1. Melatih melakukan pengenceran serial.
2. Menentukan konsentrasi suspensi bakteri dengan metode
hitungan cawan.
II. Prinsip
1. Teknik hitung cawan
Salah satu metode yang dapat digunakan untuk menghitung
jumlah
mikroba langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop
2. Metode pengenceran
Pengenceran adalah penambahan pelarut kedalam suatu larutan jadi
pada
prinsipnya jumlah mol zat sebelum dan sesudah diencerkan
tetap
3. Teknik aseptis
Teknik aseptis adalah suatu cara yang dilakukan agar tidak
adanya
mikroba yang dapt masuk kedalam tubuh yang kemungkinan besar
akan
mengakibatkan infeksi. Dalam hal ini, teknik aseptis bertujuan
untuk
mengurangi atau menghilangkan mikroorganisme yang terdapat
pada
permukaan benda hidup atau benda mati.
4. Inkubasi
Inkubasi adalah proses pertumbuhan biaakan bakteri atau
perbanyakan
biakan dengan menyediakan keadaan lingkungan yang sesuai.
Lingkungan dalam hal ini adalah suhu.
III. Teori Dasar
Metode hitungan cawan (TPC) merupakan metode yang paling
banyak digunakan dalam analisa, karena koloni dapat dilihat
langsung dengan
mata tanpa menggunakan mikroskop. Feliatra menyatakan bahwa
total
bakteri/Total Plate Count (TPC) merupakan salah satu metode yang
dapat
digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam bahan pangan.
Metode
-
hitungan cawan (TPC) merupakan metode yang paling banyak
digunakan
dalam analisa, karena koloni dapat dilihat langsung dengan mata
tanpa
menggunakan mikroskop. Untuk menghitung total bakteri dengan
metode
cawan digunakan Nutrient Agar (NA) (Sitorus, 2013).
Menurut Alaerts, G dan Santika, SS (1984), standard plate
count
dipergunakan untuk menentukan kerapatan bakteri aerob dan
anaerob
fakultatif heterotrop dari air. Penentuan dengan cara ini
merupakan
pengukuran empiris saja, oleh karena tiap spesies bakteri
membentuk koloni
tersendiri dalam pertumbuhannya. Semua bakteri dari sampel akan
tumbuh
pada media tertentu dan setiap golongan bakteri akan tumbuh
menjadi satu
koloni yang spesifik, sehingga jumlah bakteri dapat diketahui
dengan
menghitung jumlah koloni (Sitorus, 2013).
Media adalah suatu substrat untuk menumbuhkan bakteri yang
menjadi padat dan tetap tembus pandang pada suhu inkubasi
(Pelczar et
al.,1986). Alaerts juga menyatakan bahwa pada umumnya
dibutuhkan
pengenceran sampel, yang tergantung dari perkiraan populasi
bakteri.
Semakin tercemar suatu badan air, semakin tinggi konsentrasi
bakteri dan
semakin kecil volume sampel yang diperlukan, agar jumlah koloni
dapat
dihitung. Air pengencer yang digunakan harus selalu mengandung
garam
nutrient (Sitorus, 2013).
Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada bahan nutrient
yang
disebut medium. Banyak sekali medium yang tersedia, macamnya
yang
dipakai bergantung kepada banyak faktor, salah satu diantaranya
adalah
macam mikroorganisme yang akan ditumbuhkan. Jika kita ingin
mengisolasi
biakan murni bakteri dari mulut kita, maka air liur itu
diinokulasikan sedikit
saja pada medium yang cocok sedemikian rupa hingga sel-sel
mikroba
tumbuh terpisah-pisah pada medium tadi. Bahan yang
diinokulasikan pada
medium itu disebut inokulum. Dengan menginokulasi medium agar
nutrien
(nutrient agar) dengan metode cawan gores atau metode cawan
tuang, sel-
sel itu akan terpisah sendiri-sendiri. Setelah inkubasi, sel-sel
mikrobe
individu itu memperbanyak diri sedemikian cepatnya sehingga di
dalam
-
waktu 18-24 jam terbentuklah massa sel yang dapat dilihat dan
dinamakan
koloni. Koloni ini dapat dilihat oleh mata telanjang. Setiap
koloni yang
berlainan dapat mewakili macam organisme yang berbeda-beda,
setiap koloni
merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme. Jika dua sel
mikrobe
pada inokulum asal terlalu berdekatan letaknya pada medium agar,
maka
koloni yang terbentuk dari masing-masing sel dapat bercampur
dengan
sesamanya, atau paling tidak bersentuhan, jadi massa sel yang
dapat diamati
itu bukanlah suatu biakan murni (Sutton, 2006).
Pengukuran pertumbuhan mikroorganisme dilakukan dengan
metode
hitungan cawan. Prinsip dari metode ini adalah sel mikroba yang
masih hidup
ditumbuhkan pada medium sedemikian sehingga mikroba tersebut
akan
berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung
dan
dihitung tanpa menggunakan mikroskop (Ashad, dkk, 2006).
Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel
mikroba yang masih hidup pada metode agar, sehingga sel mikroba
tersebut
akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat
langsung
dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan
dapat
dibedakan atas dua cara yaitu: metode tuang (pour plate) dan
metode
permukaan/sebar (surface/spread plate) (Fardiaz, 1993).
Untuk memenuhi persyaratan statistik, cawan yang dipilih
untuk
dihitung mengandung 30-300 koloni. Untuk memenuhi persyaratan
tersebut
dilakukan sederatan pengenceran dan pencawan. Jumlah mikroba
dalam
sampel ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni dengan
faktor
pengenceran pada cawan yang bersangkutan. Satuan yang digunakan
untuk
menyatakan jumlah koloni atau bakteri adalah cfu/mL (cfu =
colony forming
units) (Waluyo 2008).
Jumlah koloni mikroorganisme dihitung berdasarkan Standar
Plate
Count (SPC). Metode ini cukup sensitive karena hanya sel
mikroorganisme
yang hidup yang dapat dihitung. Selain itu beberapa sel yang
berdekatan
dapat dihitun sekaligus sebagai suatu koloni (Ashad, dkk,
2006).
-
Tujuan pengenceran adalah supaya diperoleh isolat yang tidak
begitu
padat dan mewakili semua jenis bakteri yang terdapat pada sampel
(Pastra,
dkk, 2012). Semua dilakukan dalam kondisi aseptik dengan
menggunakan api
Bunsen (Pastra, dkk, 2012).
Metode cawan tuang untuk memperoleh koloni murni dari
populasi
campuran mikroba dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar
yang
telah disterilkan dan dicairkan kemudian didinginkan 50C yang
kemudian
dituang ke cawan. Karena kadar sel-sel mikroba di dalam spesimen
pada
umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu
dilakukan
beberapa tahap sehingga sekurangkurangnya satu di antara
cawan-cawan
tersebut mengandung koloni-koloni terpisah di atas permukaan
ataupun di
dalam agar. Metoda ini memboroskan bahan dan waktu, namun
tidak
memerlukan ketrampilan yang terlalu tinggi (USU digital library,
2004).
Sampel diinokulasi dengan metode agar tuang, diambil sebanyak 1
ml
untuk diinokulasi pada media NA dalam cawan petri 15 ml secara
aseptik
kemudian diinkubasi pada suhu 37C di dalam inkubator selama 2 x
24 jam
(Pastra, dkk, 2012).
Menurut Rukmi, MG.I., A.T. Lunggani, A. Suprihadi (2008),
bakteri
akan bereproduksi pada medium agar dan membentuk koloni setelah
18-24
jam inkubasi. Untuk menghitung jumlah koloni dalam cawan petri
dapat
digunakan alat colony counter yang biasanya dilengkapi dengan
pencatat
elektronik (Sitorus, 2013).
Perhitungan bakteri dengan metode cawan hitung ini dianggap
bahwa
setiap sel yang dapat hidup di dalam media akan tumbuh menjadi
suatu
koloni. Sehingga jumlah koloni yang tumbuh atau muncul pada
cawan
merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme bakteri yang dapat
hidup
yang terkandung didalam sampel. Pemilihan cawan yang digunakan
untuk
perhitungan koloni adalah yang mengandung antara 30-300 atau
25-250
koloni. Untuk memperoleh sekurang-kurangnya koloni dalam cawan,
maka
diperlukan adanya perlakuan pengenceran terhadapap sampel.
Jumlah
organisme yang terdapat didalam sampel asal ditentukan dengan
mengalikan
-
jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada
cawan yang
terkait (Sutton, 2006).
IV. Alat dan Bahan
4.1. Alat
1. Cawan petri
2. Kapas
3. Labu Erlenmeyer
4. Pembakar Spirtus
5. Pipet volume
6. Rak tabung reaksi
7. Tabung reaksi
4.2. Bahan
1. Aquadest
2. Media Agar
3. Sample uji air minum
4.3. Gambar alat
No. Nama Alat Gambar
1. Cawan Petri
2. Kapas
-
3. Labu
Erlenmeyer
4. Pipet volume
5. Tabung reaksi
7. Pembakar
Spirtus
V. Prosedur
Pada praktikum ini hal yang pertama dilakukan yaitu alat dan
bahan
disiapkan. Alat alat yang sudah disterilisasi yaitu 3 cawan
petri, 3 tabung
reaksi dan 1 pipet volume dan bahan bahan seperti sample yang
mengandung
bakteri dan aquadest disiapkan. Setelah itu, nyalakan pembakar
spirtus.
Dipipet aquadest dan dimasukan ke dalam 3 tabung reaksi masing
masing 9
ml. setelah ketiga tabung reaksi terisi aquadest, di ambil
tabung reaksi
-
pertama kemudian sample sebanyak 1 ml di masukan ke dalam
tabung
tersebut. Lalu di homogenkan. Kemudian dari tabung reaksi
pertama dipipet
sebanyak 1 ml dan di masukan kedalam tabung reaksi kedua . di
homogenkan
lagi. Selanjutnya di pipet kembali sebanyak 1 ml dari tabung
reaksi kedua
untuk dimasukan ka dalam tabung reaksi ketiga dan homogenkan.
Setelah
itu dari tiap tabung reaksi uji yang di duga mengandung bakteri
di pipet 1 ml
dan di masukan ke dalam cawan petri. Dari tabung reaksi pertama
dipipet
sebanyak 1 ml dan di masukan kedalam cawan petri pertama lalu
beri tanda.
Kemudian dari tabung reaksi kedua dipipet sebanyak 1 ml dan di
masukan ke
dalam cawan petri kedua dan beri tanda. Selanjutnya dipipet
sebanyak 1 ml
dari tabung reaksi ketiga lalu di asukan ke dalam cawan petri
ketiga dan beri
tanda. Semua perlakuan tersebut dilakukakn dekat dengan nyala
api. setelah
itu, ke dalam setiap cawan petri di tuangkan media agar lalu
homogenkan.
Setelah media tersebut padat cawan petri di balikan tujuannya
dan dibungkus
dengan menggunakan koran untuk di inkubasi.
VI. Data Pengamatan
No. Konsentrasi Setelah Inkubasi
1. 1 x 10-1
-
2. 1 x 10-2
3. 1 x 10-3
VII. Perhitungan
= (780 10) + (576 100) + (318 1000)
3
=7800 + 57600 + 3180000
3
=383400
3= 127800
VIII. Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan pengenceran dan menentukan
konsentrasi dengan metode cawan hitung. Metode hitungan cawan
diperlukan
untuk menghitung suatu koloni bakteri, sehingga diketahui jumlah
total
-
bakteri yang terkandung dalam suatu sampel air minum. Jumlah
bakteri yang
dapat tumbuh dalam medium ditunjukan dalam bentuk suatu koloni
atau CFU
(colony forming unit) dari suatu sel bakteri.
Perhitungan bakteri menggunakan sistem koloni, hal ini
disebabkan
koloni merupakan bagian terkecil yang bisa dihitung secara kasat
mata dari
bakteri, selain itu koloni adalah representasi dari bakteri yang
melakukan
pembelahan dan berkumpul di suatu tempat. Setelah di dapat
koloni yang
tumbuh pada media agar, kemudian dapat diketahui jumlah koloni
bakteri
setelah proses inkubasi selama 24 jam (pelchzar, 2006).
Pada praktikum kali ini alat alat yang di gunakan harus di
sterilisasi
dengan menggunkan autoklaf. Sterilisasi dalam mikrobiologi ialah
suatu
proses untuk mematikan semua organism yang terdapat pada atau
didalam
suatu benda. Hal ini diperlukan agar mikroba yang ingin diamati
dan diisolasi
terbebas dari mikroba lain. Suatu bahan atau alat dikatakan
steril bila alat atau
bahan tersebut bebas dari mikroba baik dalam bentuk sel
vegetative ataupun
spora. Sterilisasi dilakukan terhadap bahan dan alat sehingga
terbebbas dari
kontaminasi mikroorganisme lain (dwidjoseputro, 2005).
Alat dan bahan disiapkan, aquadest sebanyak 9 ml di pipet lalu
di
masukan ke masing-masing tabung reaksi. Pada ujung pipet volume
di
masukan kapas bebas lemak dengan tujuan agar bakteri yang
terdapat dalam
sampel tidak terhirup oleh mulut serta bakteri dari mulut juga
dapat disaring
oleh kapas.. Apabila ada mikroorganisme yang masuk maka akan
terjerap
lebih dulu dengan sumbat kapas.
Setelah ketiga tabung terisi dengan aquades selanjutnya sampel
yang
berupa air minum dipipet sebanyak 1 ml dan di masukan ke tabung
reaksi
pertama dan akan dilakukan pengenceran bertingkat. Pengenceran
digunakan
karena untuk menumbuhkan bakteri pada media yang terbatas tidak
mungkin
dilakukan perhitungan bakteri yang berjumlah puluhan ribu.
Pengenceran ini
di maksudkan untuk mengurangi kepadatan bakteri pada sampel
(pelchzar,
2006)
-
Metode untuk perhitungan ini menggunakan pengenceran berseri
atau
pengenceran serial dari sample yang mengandung mikroorganisme.
Koloni
bakteri yang muncul akibat pertumbuhan mikroorganisme,
diasumsikan
berasal dari satu sel bakteri. oleh karena itu jumlah bakteri
pada sampel asal
dapat ditentukan dengan menghitung jumlah kolonidan
memperhitungkan
factor pengenceran. (Hadioetomo,1993)
Setelah sampel dimasukan ke tabung reaksi pertama. Di kocok
terlebih dahulu agar sampel yang mengandung bakteri bercampur
dengan
aquadest dan homogen. kemudian diambil dari tabung reaksi
tersebut
sebanyak 1 ml dan di masukan ke dalam tabung reaksi kedua.
Homogenkan
kembali kemudian dipipet lagi 1 ml dan di masukan kedalam tabung
reaksi
ketiga lalu homogenkan. Sama halnya seperti perlakuan yang
pertama
perlakuan ini dilakukan dekat dengan nyala api agar terhindar
dari
kontaminan.
Langkah selanjutnya yaitu mengambil 1 ml dari tabung reaksi
tersebut
untuk di masukan ke dalam cawan petri yang sudah di sterilisasi.
Sampel pada
tabung reaksi 1 di masukan ke dalam cawan petri 1 begitu pula
selannjutnya
sampai tabung reaksi ketiga. Setelah itu masukan media agar
kedalam 3
cawan petri tersebut. Pada saat perlakuan tersebut untuk membuka
cawan
petri harus hati hati, tidak boleh terlalu lebar dan harus dekat
dengan nyala
api agar terhindar dari kontaminasi mikroorganisme lain.
Pada praktikum ini, media yang di gunakan adalah media padat.
Untuk
membuat biakan padat, larutan biakan cair ditambahkan bahan
pemadat.
Bahan pemadat yang biasa digunakan dan ideal adalah agar. Agar
adalah
polisakarida yang disusun kompleks dan teratur yang berasal dari
ganggang
laur. Bila di perlukan media biakan padat tanpa komponen
organic, maka di
pakai silikogel sebagai bahan pemadatnya. Cawan yang dipilih
untuk
perhitungan koloni adalah rentang 30-300 koloni. Untuk
memperoleh rentang
tersebut pada satu cawan yang mengandung koloni, maka harus
dilakukan
pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat
dalam
-
sampel ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk
dengan
factor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Dwidjoseputro,
2003).
Setelah media agar dituangkan kemudian di homogenkan.
Tujuannya
untuk mempermudah dalam penghitungan koloni. Setelah padat cawan
petri
dibalikan agar pada saat inkubasi uap yang dihasilkan tidak
jatuh ke media
agar yang dapat menyebabkan media mencair sehingga
pengamatan
pertumbuhan koloni akan terganggu. Kemudian biakan di inkubasi
selama
18-24 jam yang tujuannya untuk melihat pertumbuhan bakteri
tersebut.
Setelah 18-24 jam, sampel diambil dari inkubator dan dihitung
jumlah
koloni bakteri di dalam masing-masing cawan. Saat akan
dilakukan
perhitungan terlihat bahwa bakteri pada cawan 10-1 jauh lebih
banyak
daripada bakteri pada kedua cawan lainnya. Untuk memudahkan
perhitungan,
apabila penyebaran bakteri merata cawan petri bisa dilukis
menjadi empat
kuadran. Jumlah koloni pada cawan 1 sebanyak 780 koloni, cawan
2
sebanyak 576 koloni dan cawan 3 sebanyak 318 koloni.
Faktor yang mempengaruhi hasil penghitungan koloni pada
metode
ini adalah tingkat pengenceran yang tinggi sehingga menyebabkan
koloni
tidak muncul pada media, tingkat pengenceran terlalu rendah
sehingga koloni
yang muncul lebih dari 300 koloni, adanya kontaminasi yang bisa
saja
dikarenakan alat yang digunakan; lingkungan dan diri kita,
kondisi pH dan
suhu yang tidak sesuai (Fardiaz, 2005).
Pada analisis ini digunakan satuan CFU/ml karena pada percobaan
ini
yang dihitung adalah koloni bukan sel. Pada metode ini tidak
mungkin
dilakukan untuk menghitung sel karena pada metode ini
pengamatan
dilakukan dengan mata telanjang (tanpa bantuan mikroskop)
sehingga yang
tampak adalah berupa koloni (Fardiaz, 2005).
Kelemahan metode pengenceran adalah keselektifan hasil
perhitungan yang kadang menjadi bias. Kondisi pertumbuhan
kontaminan,
termasuk komposisi media yang digunakan, waktu inkubasi, suhu
dan pH
sangat menentukan bakteri yang dapat tumbuh dari seluruh
populasi yang ada
(Harmita dan Maksum Radji 2008).
-
IX. Kesimpulan
1. Praktikan dapat melakukan pengenceran bertingkat atau
pengenceran
serial pada sampel bakteri serta mengetahui konsentrasi dari
sampel
bakteri yang telah diencerkan, yaitu 1 x 10-1, 1 x 10-2, 1 x
10-3.
2. Praktikan dapat melakukan perhitungan koloni bakteri yang
telah
diinkubasi selama 18-24 jam, yaitu koloni yang tumbuh
sebanyak
127800 CFU.
-
DAFTAR PUSTAKA
Ashad, dkk. 2006. Degradasi Kekuatan Beton Akibat Intrusi
Miktoorganisme.
Tersedia online di: http://www.ftsl.itb.ac.id/wp-
content/uploads/2007/12/Hanafi%20(JTS%20Vol.13%20No.3).pdf
(diakses 4 April 2015)
Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang :
Djambatan.
Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta: PT.
Raja
Grafindo Persada
Pastra, dkk. 2012. Penapisan Bakteri yang Bersimbiosis dengan
Spons Jenis
Aplysina sp sebagai Penghasil Antibakteri dari Perairan Pulau
Tegal
Lampung . Tersedia online di :
http://eprints.unsri.ac.id/1256/1/9.Defin_ari_pastra_77-82.pdf
(diakses 4
April 2015)
Hadioetomo RS, 1993. Mikrobiologi dasar dalam Praktek Teknik dan
Prosedur
Praktikum. Jakarta : Gramedia Pusaka Utama.
Harmita dan Maksum Radji. 2008. Analisis Hayati. Jakarta :
Penerbit Buku
Kedokteran EGC.
Pelczar, M.J. & E.C.S. Chan, 1986, Penterjemah , Ratna Siri
Hadioetomo. Dasar-
Dasar Mikrobiologi 1. Jakarta : Universitas Indonesia Press.
Plechzar, M.J. 2006. Dasar dasar Mikrobiologi . Jakarta:UI
Pres
Sitorus, 2013. Jurnal Ilmiah Fakultas Teknik Limits. Tersedia
online:
http://portal.kopertis3.or.id/bitstream/123456789/1630/1/Microsoft%20W
ord%20-Jurnal%20%20Limit%20volume%209%20no.1.pdf (diakses 4
April 2015)