TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KUŞ TİPİ MİKOBAKTERİYOZİSİN TAVUK VE HİNDİ SÜRÜLERİNDE KÜLTÜR VE PCR TEKNİKLERİ İLE TEŞHİSİ Khair Elsid ABDALLA MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Hakan YARDIMCI 2010- ANKARA
79
Embed
KUŞ TİPİ MİKOBAKTERİYOZİSİN TAVUK VE HİNDİacikarsiv.ankara.edu.tr/browse/28343/267112.pdfKanatlı mikobakteriyozisi etkeni, Actinomycetales takımının Mycobacteriaceae familyasına
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
KUŞ TİPİ MİKOBAKTERİYOZİSİN TAVUK VE HİNDİ
SÜRÜLERİNDE KÜLTÜR VE PCR TEKNİKLERİ İLE
TEŞHİSİ
Khair Elsid ABDALLA
MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI
DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Hakan YARDIMCI
2010- ANKARA
TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
KUŞ TİPİ MİKOBAKTERİYOZİSİN TAVUK VE HİNDİ
SÜRÜLERİNDE KÜLTÜR VE PCR TEKNİKLERİ İLE
TEŞHİSİ
Khair Elsid ABDALLA
MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI
DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Hakan YARDIMCI
2010-ANKARA
iii
İÇİNDEKİLER
Kabul ve Onay ii İçindekiler iii Önsöz v Simgeler ve Kısaltmalar vi Şekiller vii Çizelgeler viii 1. GİRİŞ 1 1.1. Genel Bilgiler 1 1.2. Etiyoloji 2 1.3. Kanatlılarda Mikobakteri İnfeksiyonları 4 1.4. Kanatlı Mikobakteriyozisinin Epizootiyolojisi 6 1.4.1. Mikobakteriyozisin İnsidensi 8 1.4.2. İnfeksiyon Kaynakları 8 1.4.3. Çevresel Koşullara Direnci 9 1.4.4. Hayvan Rezervuarı 9 1.5. Konakçı Duyarlılığı 10 1.6. Cinsiyet ve Yaş 11 1.7. Ekonomik Önem 11 1.8. Kanatlı Mikobakteriyozisinin Bulaşma ve Patogenezi 12 1.9. Klinik Belirtiler 13 1.9.1. Ante-Mortem Bulgular 13 1.9.2. Post-Mortem Bulgular 14 1.10. Hastalığın Teşhisi 15 1.10.1. Klinik Buguları 15 1.10.2. Makroskobik Bulgular 15 1.10.3. Mikroskobik Değerlendirme 16 1.10.4. Kültür 17 1.10.5. Moleküler Tanı 19 1.11. Kanatlılarda Mikobakteriyozisin Tedavisi 20 1.12. Kanatlı Mikobakteriyozisinin Kontrolü 21 1.12.1. Dezenfeksiyon 22 1.12.2. Aşılama 23 2. GEREÇ VE YÖNTEM 24 2.1. Gereç 24 2.1.1. Standart Suş 24 2.1.2. Örneklerin Toplanması 24 2.1.3. Kullanılan Besiyerleri ve Boyalar 25 2.1.4. Bakteriyolojik Muayenelerde Kullanılan Cihazlar 28 2.1.5. Primerler 29 2.1.6. PCR testinde Kullanılan Cihazlar ve Ekipmanlar 29 2.2. Yöntem 30
Kanatlı tüberkülozu olarak bilinen kanatlı mikobakteriyozisine en sık Mycobacterium avium serovar 1-3 ve son zamanlarda da M. genavense neden olmaktadır. İnfeksiyon bütün kanatlı türlerinde görülmektedir. Dünyanın çeşitli yerlerinde ve çok sayıda kanatlı türünde, diğer hayvan türlerinde, özellikle HIV infeksiyonu taşıyan immun sistemi baskılanmış ya da sağlıklı insanlarda görüldüğü bildirilmiştir. İnfeksiyon Türkiye’de ve diğer ülkelerde hayvanat bahçelerinde oldukça sık görülür. Ancak, özellikle yumurtacı tavuk ve hindi sürülerinde ise bildirimi azdır. İnfeksiyonun inkübasyon süresinin uzun olması nedeniyle yabani ve yaşlı kanatlılar etkilenir. Ticari kanatlı işletmelerinde bu infeksiyon, yeterli bakım ve idare uygulamaları, uygun biyogüvenlik şartları, ticari tavuk ve hindilerin çok genç yaşta kesime gönderilmesi nedeniyle nadir görülmektedir. Aynı zamanda, kanatlı yetiştiriciliği yapan aile işletmelerinde hijyenik olmayan çevresel koşulların olması önemli bir problemdir ve bu durum kanatlı mikobakteriyozisi yanında farklı infeksiyonların oluşmasına da zemin hazırlar. Farklı kanatlı türlerinde oluşan mikobakteriyozis ile ilgili pek çok çalışma olmasına karşın hastalığın yumurtacı tavuk ve hindilerde görülmesi ile ilgili bilgiler sınırlıdır. Ev tipi yetiştiricilikte önemsiz sayılabilecek ölümlere neden olan infeksiyon duyarlı çiftlik hayvanları ve insanlar için risk oluşturur. Buna rağmen aile işletmeleri, hindi yetiştiriciliği ve yumurtacı işletmelerde bu infeksiyonların teşhisi için PCR ve diğer moleküler tekniklerin kullanımı sık olmamaktadır. Bu çalışmada, tavuk ve hindi sürülerine ait iç organ ve dışkı örneklerinden kanatlı tipi mikobakteriyozis etkenlerinin varlığının izolasyon ve moleküler yöntemle (PCR) teşhisi amaçlanmıştır. Tez çalışmasının belirlenmesinde ve yürütülmesinde bana yol gösteren danışman hocam Sayın Prof. Dr. Hakan YARDIMCI başta olmak üzere ve tez izleme komitesi üyesi hocalarım Sayın Prof. Dr. Osman KUTSAL ve Sayın Prof. Dr. Mehmet AKAN’a, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Başkanı hocam Sayın Prof. Dr. Serdar DİKER’e ve öğretim üyeleri; Prof. Dr. Müjgan İZGÜR, Prof. Dr. Ömer M. ESENDAL, moleküler çalışmalarda yardımlarını esirgemeyen Sayın Doç. Dr. Barış SAREYYÜPOĞLU’na, istatistiksel analiz konusunda yardımcı olan Doçent Dr. Safa GÜRCAN’a, materyal toplamamda yardımcı olan Araş. Gör. Bülent BAŞ, Vet. Hekim Ramin JAHED, Mehmet CENGİZ, Mehmet NOYAN’a, çeviride yardımcı olan Dr. Sibel GÜNGÖRDÜ, Araş. Gör. Dr. Seyda CENGİZ, Vet. Hekim Orkun BABACAN ve Nihan ALTINSOY DUYGU’ya, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Araştırma Görevlilerine, doktora ve yüksek lisans yapan arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunarım.
vi
SİMGELER VE KISALTMALAR
ADC Middlebrook ADC (Albumin, Dextrose, Catalase) Enrichment ARB Asidorezistans Bakteri AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome AM Kanatlı Mikobakteriyozisi bp Baz çifti cm Santimetre dk Dakika DNA Deoksiribonükleik Asid D.S. Distile su DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay g Gram HCl Hidroklorik Asid KH2PO4 Potasyum di-hidrojen Fosfat L-J Löwenstein-Jensen besiyeri MAA Mycobacterium avium subsp. avium MAC Mycobacterium avium complex MgCl Magnezyum Klorür µl Mikrolitre µm Mikrometre mg Miligram ml Mililitre mm Milimetre NaOH Sodyum Hidroksit NTM Non-Tuberculous Mycobacteria OADC Middlebrook OADC (Oleik Asid, Albumin, Dekstroz ve
Katalaz) Enrichment 1N Bir normal PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu SDA Sabouraud dekstroz agar TBE Tris borate EDTA UV Ultra-Violet Z-N Ziehl-Neelsen boyama
Şekil 3.8. L-J Besiyerinde küçük pigmentsiz koloniler 43
Şekil 3.9. Middlebrook (7H10) agar’da farklı koloni morfolojileri 44
Şekil 3.10. Middlebrook (7H9) buyyon’da üreme 44
Şekil 3.11. İzole edilen Mycobacterium genusunun izolatlarında16S-rRNA 48
(543 bp) PCR bulguları
Şekil 3.12. İzole edilen M. avium complex izolatlarında IS1245 (427 bp) 49
PCR bulguları
Şekil 3.13. İzole edilen M. avium subsp. avium izolatlarında (509 bp ve 376 bp) 49
(IS901) nested-PCR bulguları
viii
ÇİZELGELER
Çizelge 1.1. Farklı kanatlı türlerinden izole edilen mikobakteriyel izolatlar 7 Çizelge 2.1. Materyal kaynakları ve alınan örnek sayıları 25 Çizelge 2.2. Çalışmada kullanılan primerler 29 Çizelge 3.1. İncelenen doku ve dışkı preparatlarında Z-N bulguları 41 Çizelge 3.2. MAA’ya bağlı mikobakteriyozis yönünden pozitif bulunan 45 üç ticari tavuğun makroskobik görünüm, Z-N boyama, kültür ve PCR bulgularının karşılaştırılması Çizelge 3.3. MAA’ya bağlı mikobakteriyozis yönünden pozitif bulunan 46 dört ev tavuğunun makroskobik görünüm, Z-N boyama, kültür ve PCR bulgularının karşılaştırılması Çizelge 3.4. İzole edilen suşların bazı identifikasyon testleri 47
1
1. GİRİŞ
1.1. Genel Bilgiler Kuş tipi veya kanatlı mikobakteriyozisi, tüm dünyada görülmektedir ve genellikle
Mycobacterium avium complex serotip 1-3 tarafından meydana getirilir. Kronik
olarak seyreden bulaşıcı bir hastalıktır. Bu infeksiyon, tavuklarda büyük zararlara
neden olmaktadır. Hindi, güvercin, ördek, kaz, kanarya, papağan ve sülün gibi diğer
kanatlılarda da görülmektedir. Bu hastalığa doğal koşullarda yaşıyan kuşlarda
rastlanmaz. Fakat hayvanat bahçelerinde bulundurulanlarda görülebilir (Akay, 1999;
Tell ve ark., 2001; Hoop, 2002; Yardımcı, 2006).
Mikobakterilerin identifikasyonu ve teşhisi, 1800’lü yılların sonlarına doğru
tüberküloz (Bacterium tuberculosis) ve lepra bakterisinin (Bacillus laprae) keşfi ile
başlamış ve Lehman–Neumann’nın bu türleri 1876 yılında Mycobacterium cinsi
içerisinde incelemesi ile yapılmıştır. Robert Koch, 1882 yılında tüberkülozu
laboratuarda bir hastalık etkeni olarak bulmuş ve bu yüzyıl sonunda mikobakteri
etkenleri kanatlılarda ve bazı hayvanlarda hastalığa neden olan ancak çevresel olarak
hastalığa neden olmayan organizmalar olarak tanımlanmıştır. M. tuberculosis etkeni
dışındaki mikobakteri etkenleri (nontüberküloid mikobakteriler-NTM) 1880’li
yılların sonlarında bulunmuş, Alvarez ve Tavil bu organizmayı M. smegmatis olarak
tanımlamıştır. Tavuklarda bulunan ilk tüberküloz bulgusu Mycobacterium avium
complex (MAC) olarak tanımlanmış, insanlarda infeksiyon 1868 yılında İngiltere’de
görülmüştür. 1890’lı yıllarda “avian bacteria” olarak (Mycobacterium avium)
tanımlanan etken insan infeksiyonlarına neden olan M. tuberculosis etkenlerinden
ayrılmıştır (Shinnick ve Good, 1994; Biet ve ark., 2005).
2
1.2. Etiyoloji Kanatlı mikobakteriyozisi etkeni, Actinomycetales takımının Mycobacteriaceae
familyasına bağlı tek genus olan Mycobacterium genusu içindedir. Bu genusda alt
türlerle birlikte 60’dan fazla tür vardır. Etken Mycobacterium avium olup 1.0-10 µm
uzunlukta, 0.2- 0.6 µm genişlikte, ince çomak şeklinde, bazı preparatlarda kıvrık,
asido-rezistans, sporsuz, hareketsiz, Gram pozitif boyanma özelliğinde ve aerobik
olarak pH 6.8-7.3 ve 25°-42°C arasında üreyebilen bir mikoorganizmadır (Thorel ve
ark., 1990; Levy-Frebault ve Portales, 1992; Yardımcı, 2006). Mycobacterium
avium özellikle, gliserin içeren sıvı ve katı besiyerlerinde daha iyi üreme
göstermektedir. Yumurtalı besiyerlerinde, 10-21 gün içinde küçük, yapışkan, gri-
beyaz koloniler oluşur, sıvı besiyerlerinde ise, üreme tüpün dibinde olup,
çalkalandığında tüpün hafifçe bulandığı görülür (Akay, 1980; Benson ve Ellner,
1993; Atlas, 2004).
Günümüzde, Mycobacterium genusu içindeki türlerin minimum standartları; 1)
asit-alkole dirençli, 2) 60-90 karbon atomu içeren mikolik asit varlığında pyrolisiz ile
C22 ve C26 yağ aside esterazlarına bölünmesi, 3) % 61-71 oranında G+C yüzdesi
bulunmasıdır (Levy-Frebault ve Portales, 1992). Taksonomik olarak mikobakteriler
Actinomycetales’lerden ayrılarak Mycobacteriaceae ailesi içerisinde Mycobacterium
genusu içerisinde incelenir. Actinomycetales etkenleri geniş bir mikroorganizma
grubudur ve hücre duvarlarında bulunan mikolik asit sentezi ile kolaylıkla ayırt
edilebilir. Mikobakteriler aerobik, aside dirençli, çomak şekilli, fakültatif intraselüler
etkenlerdir ve uzun süre çevrede, kurumuş dışkıda hayatta kalabilirler (Levy-Frebault
ve Portales, 1992). Mycobacterium avium, sığır ve insan tipi mikobakterilere oranla
besi yerlerinde daha kolay ve çabuk üremektedir. Etken 25-45°C’lerde
üreyebilmektedir ancak, optimum ısı 37.5-40°C’ler arasındadır. M. avium katı besi
yerinde ürediği zaman yaygın, yapışkan, gri-beyaz koloniler meydana getirir (Akay,
2002).
Mycobacterium avium gibi pek çok mikobakteri türü hem insan hem de hayvan
populasyonları için patojeniktir. M. avium ve yakın ilişkili M. intracellulare, M.
3
avium-intracellulare kompleksi olarak bir bakteri grubu şeklinde tanımlanmıştır.
Mycobacterium avium complexi, M. avium subsp. paratuberculosis etkenlerini içerir.
M. paratuberculosis etkeni ruminant ve diğer memeli hayvan türlerinde Johne
hastalığı veya paratüberküloz olarak adlandırılan hastalığa neden olur (Biet ve ark.,
2005; Tell ve ark., 2001).
Kanatlılarda yapılan deneysel infeksiyon çalışmalarında M. paratuberculosis‘in
kanatlı tüberkülozunda etiyolojik ajan olduğuna dair bir kanıt bulunamamıştır
(Sykes, 1982). Kanatlılardan izole edilen M. avium izolatlarının büyük çoğunluğu
IS901 sekansına sahiptir ve RFLP ile IS1245 yapısına karakteristik 3 bant meydana
getirdiği görülmüştür. Kanatlılarda etkenin patojenitesi IS901’in bulunması ile
kanıtlanmıştır (Dvorska ve ark., 2003). Bu sekans M. slyvaticum etkenlerinde de
bulunur ve bu mikobakteri türü de kanatlılarda infeksiyona neden olmaktadır. IS901
sadece M. avium suşlarında 1, 2 ve 3 serotiplerinde saptanmıştır ve bu serotiplerin
kanatlılarda diğer serotiplere oranla daha patojenik etkili olduğu belirlenmiştir
(Pavlik ve ark., 2000; Tell, ve ark., 2001).
Kanatlı mikobakteriyozisinin varlığı Türkiye’de de yıllar önce saptanmıştır.
Birçok araştırıcı 20. yüzyılın başlarından itibaren hastalıkla ilgili değişik çalışmalar
yapmıştır. Bu çalışmalar ile daha çok tüberkülozun epidemiyolojisi, etiyolojisi,
teşhisi (geleneksel ve moleküler) ve immunolojisi üzerinde durulmuştur. A.Ü.
Veteriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı’nda 1933 yılından günümüze kadar
kanatlı hayvan hastalıkları ve tüberküloz olgularına ait bazı yayınlar yapılmış olup
(Ertürk ve Pamukçu, 1974), 1933-1974 yılları arası incelenen kanatlıların hastalık
olguları arasında 18 olguda, tavukta ve hindiler üzerinde yapılan bir çalışmada ise 14
olguda çeşitli organlarda tüberküloz lezyonlarına rastlanılmıştır.
Tantaş ve ark. (1990) tarafından bir ticari işletmede ani ölümlerle karakterize bir
kanatlı mikobakteriyozisi olgusu tanımlanmıştır. Bu olgularda tavuklarda viseral
tüberküloz lezyonları ve bu lezyonların periorbital yerleşimi görülmüştür. Beytut ve
4
ark. (2001), aside dirençli bakterileri Ziehl-Neelsen (Z-N) boyama yöntemi ile
parafinlenmiş dokularda görüntülemişlerdir.
Akay (1980), deneysel olarak infekte edilen hindilerde, hastalığın allerjik ve
serolojik yöntemlerle teşhisini gerçekleştirmiş ve Malya Devlet Üretme Çiftliği’nden
sağlanan tüberkülozlu hindilerden izole ve identifiye edilen 16 M.avium suşunun ise
biyokimyasal, patojenite ve serotipik karakterlerini incelemiştir. Son çalışmalarda
güvercinlerde tüberküloz varlığı gösterilmiştir (Sezen ve ark., 1986; Kutsal ve
Sağlam, 1988; Gümüşsoy ve ark., 2006). Kanatlı türleri içerisinde kazların hastalığa
direnç göstermesine rağmen, infeksiyonun görüldüğüne dair bir adet olgu
raporlanmıştır (Özcan ve ark., 2001). Daha önce yapılan çalışmalarda da
Türkiye’deki hayvanat bahçelerinde uzun gagalı akbabalarda (Buteo rufinus),
1.12. Kanatlı Mikobakteriyozisinin Kontrolü Kanatlı endüstrisinde mikobakteriyozis için yönetim uygulaması çevredeki kuşların
kontrol altına alınarak hastalığı elimine etmeyi amaçlar. Bu uygulamalar başlıca iki
maddeye dayanır.
a) İdentifikasyon ve eliminasyon veya infekte kanatlıların kalıcı olarak sürüden
ayrılması
b) Katı hijyen uygulamaları ile dışkı, toprak ve diğer potansiyel kontamine
materyalin kanatlılarla temasını en aza indirmek.
Bu prensipler mikobakteriyozisin etkili kontrolü için pet kuşları, özel ve ticari
kuşhaneler ve zoolojik topluluklar için uygulanabilir (Gill ve Blandy, 1986; Thorel
ve ark., 1997).
Kanatlı tüberkülozunu kontrol altına almak için genelde kabul edilen metotlar
tuberkulin testi kullanılması, kontamine barınak ve ekipmanın değiştirilmesi ve
kontamine çevreden yeni sürünün izole edilmesi ile infekte kanatlıların
identifikasyon ve eradikasyonunu içerir. Kalabalıktan ve diğer stres faktörlerinden
kanatlıları uzak tutma ile dengeli ve yeterli beslenmelerinin sağlanması da bu
hastalığın etkisini ve insidensini en aza indirmek için önemlidir. Temas halinde olan
kuşlar en az on iki ay boyunca ayrı tutulmalı ve düzenli olarak test edilmelidirler.
Klinik veya bakteriyolojik infeksiyon belirtileri gösteren kuşlar grubun geri
22
kalanından ayrı tutulmalıdır. İyi bakım koşulları da mikobakteriyozisin kontrolünde
oldukça etkilidir (Gill ve Blandy, 1986; Mutalib ve Riddell, 1988; Hoop, 1997).
Kafesler ile tüm su ve yem kapları günlük olarak temizlenerek dezenfekte
edilmelidir. Kontamine olmuş dışkı, çöp, bitki materyalleri ve organik atıklar
kafesten hemen uzaklaştırılmalı, yakılmalı veya dezenfekte edilmelidir. İnfekte
kümeslerde toprağın üst kısmı uzaklaştırılmalı, bu toprak ve altı pH’sı M. avium’un
üremeyeceği düzeye inene kadar kireçlenmelidir. Personel infekte kanatlılar için
uygun önlemleri alabilecek ve infekte kuşlardan kontamine materyalin yayılmasını
engelleyebilecek durumda olmalıdır. Stratejik olarak yerleştirilmiş dezenfektanlı
ayak banyoları kontamine materyalin bir bölgeden diğerine yayılımını engellemeye
yardımcı olabilir. Sandıklar, tekerler, fıçılar gibi diğer potansiyel fomitler de
gözönünde bulundurulmalıdır (Gill ve Blandy, 1986; Tell ve ark., 2001).
1.12.1. Dezenfeksiyon Mikobakteriler biyositlere (dezenfektan) karşı diğer sporsuz bakterilerden çok daha
fazla dirençlidir ve hastalığın eliminasyonunda en büyük problem etkenin toprakta
yaşayabiliyor olmasıdır.
Aşağıdaki bileşenlerin antimikobakteriyel aktivitesi vardır:
- alkoller
- aldehitler (formaldehit, glutaraldehit, succinaldehit ve glyoxal)
- halojenler
- peroksijenler
- fenoller
- Kemosterilize gazlar (etilen oksit ve betapropiyolakton) (Russell, 1996;
Thorel ve ark., 1997).
Bununla birlikte yüksek konsantrasyonlarda olmasına rağmen klorheksidin ve
kuaternar amonyum bileşenleri sadece mikobakteriyostatiktir. Herhangi bir biyositle,
antimikrobiyel aktivite konsantrasyon ve sıcaklıkla birlikte arttırılır. Yine de, iyi etki
23
için uzun sure temas gerekebilir. Klorheksidin ve kuaternar amonyum bileşenleri
organik maddede en az etkili olanlardır (Russell, 1996).
1.12.2. Aşılama Deneysel çalışmalarda kullanılan aşılar BCG (M. tuberculosis için insan aşısı)
bakımından test edilen ve M. avium’un ölü veya inaktive edilmiş suşlarını içeren
aşılardır. Kuşlarda aşı etkinliğini arttırmak için yeni doz ve zamanlama denemeleri
sürmektedir. Ölü Mycobacterium vaccae Cairinini’yi (tünek ördeği) kanatlı
tüberkülozundan korumuş (p<0.02) fakat istatistik olarak diğer taksonomik gruplarda
belirgin koruma elde edilememiştir (Cromie, ve ark., 2000). Şu anda kanatlılarda
mikobakterilere karşı hiçbir ticari aşı kullanılmamaktadır.
Bu çalışmanın amacı, tavuk ve hindi sürülerine ait iç organ ve dışkı örneklerinden
kanatlı tipi tüberküloz etkenlerinin varlığının izolasyon ve moleküler yöntemle
(PCR) teşhisidir.
24
2. GEREÇ VE YÖNTEM
2.1. Gereç 2.1.1. Standart Suş Referans suş olarak Mycobacterium genusuna ait olan Mycobacterium avium subsp.
avium kullanıldı. [(DSM-No. 44156) tavuk izolatı, German Collection of
Microorganisms and Cell Cultures-DSMZ; InhoffenstraBe 7B, 38124,
Braunschweig, Almanya].
2.1.2. Örneklerin Toplanması Bu çalışmada, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim
Dalı’na rutin muayene amacıyla getirilen 53 kanatlı (45 adet 18 aylıktan büyük
yumurtacı tavuk ve 8 adet 18 aylıktan büyük hindi) ile mezbahada kesilen 50
kanatlıya (40 adet 18 aylıktan büyük yumurtacı tavuk ve 10 adet 18 aylıktan büyük
hindi) ait toplam 103 kanatlının organ (karaciğer, dalak, bağırsak, kalp, akciğer ve
gonad) ve dışkı örnekleri mikobakteriyozis varlığı yönünden incelendi. Çalışmada
toplam 385 organ ve 103 dışkı materyali kullanıldı (Çizelge 2.1.). Örnekler 50 farklı
kanatlı işletmesinden sağlandı. Mezbahalarda tavuklar ve hindiler her bir kümes için
tesadüfi örnekleme metoduyla sorumlu veteriner hekim ve sahiplerinin bilgileri
eşliğinde klinik olarak sağlıklı ve hasta kanatlılar arasından seçildi. Materyal toplama
işlemi Haziran 2008 ile Şubat 2009 tarihleri arasında yapıldı. Her bir kanatlıya ait organ örneği 20 ml’lik vida kapaklı ve polietilen kaplarda
tutuldu, laboratuvara 4°C’de muhafaza edilerek getirildi. Örnekler −18°C’de
donduruldu ve işleme aşamasına kadar bu şekilde saklandı. Aynı kanatlılardan
25
toplanan taze dışkı materyalleri 5 ml’lik tüplerde 1 ml fosfat tampon tuzu (PBS)
solüsyonu içerisinde muhafaza edildi (Tell ve ark., 2003a; Portales ve ark., 1996).
Çizelge 2.1. Materyal kaynakları ve alınan örnek sayıları
Örnekler
Materyal kaynakları
Tavuk sayısı
Organ örnekleri Dışkı örnekleri Toplam
Ticari Tavukçuluk
40 153 40 193
Köy Tavukçuluğu
45
160
45
205
Toplam
85
313
85
398
Ticari Hindiler
10
40
10
50
Köy Hindileri
8
32
8
40
Toplam
18
72
18
90
2.1.3. Kullanılan Besiyerleri ve Boyalar Löwenstein-Jensen Medium Base (Merck, KGaA 64271) Besiyeri Bileşeni (g/litre) Asparajin…..........................................................................3.6 g
Monopotasyum Fosfat …… ................................................2.5 g
Magnezyum Sülfat… ..........................................................0.24 g
Magnezyum Sitrat.. .............................................................0.6 g
Patates Unu .......................................................................30.0 g
Malaşit Yeşili.......................................................................0.4 g
Ticari olarak temin edilen besiyerinden 37.4 g alınarak, 600 ml distile su ve 12
ml gliserol ilave edildi. Sterilizasyon amacıyla 121°C’de 15 dakika otoklavda
tutuldu. Besiyeri 50°C’ye kadar soğutularak aseptik olarak yumurta katıldı. Hava
kabarcıkları oluşmasına izin vermeden yumurta karıştırıldı. Besiyeri uygun steril
26
vida kapaklı tüplere bölündü. Yatay pozisyonda 85°C’de 45 dakika bekletildi.
Koagülasyon olduktan sonra tüpleri buzdolabında saklandı.
Middlebrook 7H10 Agar (Difco) (900 ml için): Amonyum Sülfat ................................................... 0.5 g
Monopotasyum Fosfat .............................................. 1.5 g
Di-sodyum Fosfat..................................................... 1.5 g
Sodyum Sitrat............................................................ 0.4 g
Yukarıdaki besiyerlerinin ticari karışım 1000 ml distile su ile karıştırılıp
eritildikten sonra 121°C’de 15 dakika otoklavda steril edildikten sonra kullanıldı.
Ziehl-Neelsen Boyama Bileşenleri • Konsantre Karbol Fuksin Fuksin………………………………………………..1.0 g
Etanol % 95 (v/v)……………………………...........10.0 ml
Fenol ………………………………………………..5.0 g
D.S ……………………………………………….100.0 ml
• Metilen Mavisi Metilen mavisi……………………………………...…8.0 g
Etanol % 95 (v/v)……………………………………300.0 ml
Potasyum hidroksit…………………………………... 0.13 g
D.S……………………………...…………………1300.0 ml
• Asit- Alkol (Dekolarizasyon) Konsantre HCl asit...………………………………….8.0 ml
Ethanol % 95...............................................................97.0 ml
29
2.1.4. Bakteriyolojik Muayenelerde Kullanılan Cihazlar
• Etüv (EN120, Nüve, Türkiye)
• Fırın ( Fu-Berlin, Almanya)
• Mikroskop (Olympus-CX21, Japonya)
• Otoklav (Medexport-TK-100-2, Rusya)
• Santrifüj (JANETZKI-T30, Almanya)
• Vortex (FISONS, İngiltere)
2.1.5. Primerler Primerler The Midland Şirketinin (A.B.D) ürünlerini pazarlayan Bio-Kim Group
firmasının Ankara temsilciliğinden alındı. Primerlerin açık formulü aşağıda
verilmiştir (Çizelge 2.2).
Çizelge 2.2. Çalışmada kullanılan primerler
Çalışmada kullanılan primerler
Bakteri türleri Primer isimleri Primers sekansları (5´------------3´) Ürün Kaynak Boyutu(bp) Makale Mycobacterium spp. 16SrRNA F,25-mer 5´-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3´ 543 Huard
R,28-mer 5´-TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA-3´ ve ark.2003 M. avium complex IS1245 F,19-mer 5´-AGGTGGCGTCGAGGAAGAC-3´ 427 Guerrero ve
3’ünde (%23) akciğerden, 1’inde (%7.7) bağırsaktan, 1’inde (%7.7) kalpten ve
1’inde (%7.7) gonadlardan, ticari tavuklarda ise; 5 mikobakteri suşunun 3’ünde
(%60) karaciğerden, 1’inde (%20) dalaktan ve 1’inde (%20) akciğerden M. avium
subsp. avium izole edildi (Çizelge 3.2 ve Çizelge 3.3). Bir köy tavuğunun dışkısından
ARB izole edildi ancak, subkültürde üreme olmadı. Ticari ve köy tavuklarında
mikobakteri izolasyonu oranları arasında istatistiksel bir önem saptanamadı (chi
square testi, p<0.05).
Çizelge 3.2. MAA’ya bağlı mikobakteriyozis yönünden pozitif bulunan üç ticari tavuğun makroskobik görünüm, Z-N boyama, kültür ve PCR bulgularının karşılaştırılması
TL, Tüberkel lezyonu; DY, Değişiklik yok ; B, Büyüme; KB, Kalın bağırsak. Z-N boyama: -, ARB yok; + ile +++ birden çok fazla ARB. L-J besiyerinde: -, üreme yok; +≤ 10 koloni; ++, 10-20 koloni; +++ ile ++++> 30 koloni. 7H10 besiyerinde: -, üreme yok; +≤ 10 koloni; ++, 10-20 koloni; +++ ile ++++> 30 koloni. 7H9 boyununda: -, üreme yok; + üreme var. MAA genotipi: 16SrRNA (Genus spesifik) PCR (+), MAC spesifik (IS1245) PCR (+), ve MAA spesifik (IS901) nested PCR (+).
46
Çiz
elge
3.3
. M
AA
’ya
bağlı m
ikob
akte
riyoz
is y
önün
den
pozi
tif b
ulun
an d
ört k
öy ta
vuğu
nun
mak
rosk
obik
gör
ünüm
, Z-
N b
oyam
a, k
ültü
r ve
PCR
bul
gula
rının
karşı
laştırı
lması
Köy
tavuğu
1
Köy
tavuğu
2
Köy
tavuğu
3
Köy
tavuğu
4
Num
une
Kay
naği
O.E
A
RB
L-
J 7H
10
7H9
PCR
O
.E
AR
B
L-J
7H10
7H
9 PC
R
O.E
A
RB
L-J
7H10
7H
9 PC
R O
.E
AR
B
L-J
7H10
7H
9 PC
R
Kar
a ciğe
r B
&TL
++
+ ++
+ ++
+ +
IS90
1+
TL
+++
++++
++
+
IS90
1+
TL
+++
++
+++
+ IS
901+
TL
++
++
++
+++
+ IS
901+
Dal
ak
B&
TL
+++
- -
- -
TL
+++
+++
+++
+ IS
901+
TL
-
++
- +
IS90
1+
TL
+++
+++
+++
+ IS
901+
Ak
ciğe
r B
&TL
++
-
- -
- D
Y
+ ++
++
+
IS90
1+
DY
+ ++
+ +
+ IS
901+
TL
+
++
+ +
IS90
1+
Bağır
sak
KB
+
- -
- -
DY
+
- -
- -
DY
- -
- -
- K
B ++
++
++
-
IS90
1+
Kal
p TL
++
-
- -
- D
Y
+ -
- -
- D
Y
+ ++
+ -
+ 16
S-
rRN
A+
DY
-
- -
- -
Yum
urta
lık
TL
+ -
- -
- D
Y
+ ++
++
+
IS90
1+
DY
- -
- -
- B
-
- -
- -
O.E
, org
anla
rda
efek
tler
TL, t
über
kel l
ezyo
nu; D
Y, D
eğiş
iklik
yok
; B
, Büy
üme;
KB
, Kalın
bağırs
ak.
Z-N
boy
ama:
-, A
RB
yok;
+ il
e ++
+ bi
rden
fazl
a A
RB.
L-J b
esiy
erin
de: -
, üre
me
yok;
+≤
10 k
olon
i; ++
, 10-
20 k
olon
i; ++
+ ile
+++
+> 3
0 ko
loni
. 7H
10 b
esiy
erin
de: -
, üre
me
yok;
+≤
10 k
olon
i; ++
, 10-
20 k
olon
i; ++
+ ile
+++
+> 3
0 ko
loni
. 7H
9 bu
yyon
unda
: -, ü
rem
e yo
k; +
üre
me
var.
MA
A g
enot
ipi:
16Sr
RNA
(Gen
us sp
esifi
k) P
CR
(+),
MA
C sp
esifi
k (I
S124
5) P
CR (+
), ve
MA
A sp
esifi
k (I
S901
) nes
ted
PCR
(+).
46
47
Yapılan biyokimyasal testlerde, izole edilen suşların hiçbiri MacConkey
besiyerinde (Kristal viyoletsiz) üremedi, bunun yanında, % 5 NaCl’de üreme
görülmezken, suşlar 25°C’de ve 42°C’de farklı sayıda koloni oluşturdular. İzole
edilen suşların tamamı isoniazid (1µg/ml) ve thiophene-2-carboxylic acid (1µg/ml)
Bu çalışmada, toplam 103 kanatlıdan (tavuk ve hindi) 8’inde (%7.8) mikobakteri
izole edildi. Kanatlı mikobakteriyozisi boyama, kültür ve PCR yöntemiyle araştırıldı.
Çalışmada alınan sonuçlar aşağıda verilmiştir.
• Yumurtacı tavuklar ve hindilerden alınan toplam 448 örnekte, 19 mikobakteri
etkeni teşhis edildi.
• 45 köy tavuğundan 4’ünde ve 40 ticari tavuğun 3’ünde olmak üzere toplam
85 tavuğun 7’sinde Mycobacterium avium subsp. avium izole edildi. Kanatlı
mikobakteriyozisinin köy tavuklarında olduğu gibi ticari tavuklarda da
dikkate alınması gerekliliği ortaya konuldu.
• İnfeksiyon hem ticari hem de köy tavuklarında ergin hayvanlarda (18 aylıktan
büyük) belirlendi.
• Toplam 18 hindi’den 1’inde Mycobacterium avium subsp. avium izole
edilmiştir. Bu durum hindi yetiştiriciliğinde de etkenin dikkate alınması
gerekliliğini ortaya koymaktadır.
• Her iki materyal tipinde de, gliserinle zenginleştirilmiş L-J besiyerinde
middlebrook 7H10 agara göre ilk izolasyonda daha fazla pozitif kültür elde
edildi. İnkubasyon süresinin daha kısa olduğu saptandı.
• İzolatların pasajlanarak subkültürlerinin elde edilmesi sırasında L-J
besiyerine göre Middlebrook 7H10 agar ile daha az kontaminant içeren
koloniler elde edildi.
• Kanatlı izolatlarının identifikasyonunda PCR tekniğinin kullanılması suşların
Mycobacterium avium subsp. avium olduğunun doğrulanmasında son derece
hızlı (yaklaşık 4 saat) sonuç verdi.
Bu çalışma kanatlı mikobakteriyozisinin halk sağlığı da düşünülerek gerek
ticari ve gerekse köy tavuğu sürülerinde dikkate alınması gerekliliğini ortaya
koymuştur. Ayrıca, hastalık özellikle yumurtacı sürülerde ve hastalığa duyarlı
diğer tür hayvancılık işletmeleri için ciddi ekonomik kayıplara neden olacak bir
57
tehdit olmaya devam etmektedir. Ayrıca, küçük kanatlı işletmeleri için de gerekli
hijyen uygulamaları ve halk sağlığı eğitimi yaygınlaştırılmalıdır.
58
ÖZET
Kuş Tipi Mikobakteriyozisin Tavuk ve Hindi Sürülerinde Kültür ve PCR Teknikleri ile Teşhisi
Yumurtacı tavuk ve hindi sürülerinde Mycobacterium avium complex (MAC) tarafından oluşturulan kanatlı mikobakteriyozisinin tanısı zordur. Bu çalışmada kanatlılardan alınan organ ve dışkı örnekleri kültür ve Ziehl Neelsen boyama (Z-N) ile asido-rezistans organizmaların tanısı yapılarak değerlendirildi. İzole edilen etkenlerin kuş tipi Mycobacterium avium subsp. avium olduğu Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction-PCR) ile doğrulandı. Kültür için 3 farklı besiyeri (Gliserollü Lowenstein-Jensen , ADC ile zenginleştirilmiş Middlebrook 7H9 buyyon ve OADC içeren Middlebrook 7H10 agar) kullanılarak, bunların mikobakterileri izole etmekte de başarısı test edildi. Aside-dirençli boyama metodu olarak Z-N tekniği uygulandı. Mikobakteri izolatlarında M. avium subsp. avium’un moleküler identifikasyonu için IS901 genine spesifik primerler ile yapılan PCR testi kullanıldı. Bu çalışma kapsamında toplam 103 tavuk ve hindi kanatlı mikobakteriyozisi yönünden incelendi. Toplam 103 hayvanın 8’inde (%7.8) Mycobacterium avium subsp. avium izole edildi. İzolasyon yapılan toplam 8 kanatlının 7’sinde (6 tavuk ve 1 hindi) nekropside lezyon görülmesine karşın 1 tavukta lezyona rastlanmadı. İncelenen materyallerde, mikobakteri izolasyon oranları 40 ticari tavukta 3 (% 7.5), 45 köy tavuğunda 4 (%8.9) ve 18 hindide 1 (% 5.5) olarak belirlendi. Toplam 385 doku örneğinin 20’sinde (%5.19) tipik tüberküloz lezyonları görüldü. Direkt mikroskobik muayene ile 488 örneğin 45’inde (% 9.2) asido-rezistans bakteriler (ARB) görüldü. Kültür “Gold standart” test olarak kabul edildi. Diğer besiyerleriyle karşılaştırıldığında L-J besiyeri ile daha fazla sayıda pozitif kültür elde edildi. Mikobakteri izolatlarının PCR testi ile değerlendirmesi sonucunda, 18 (% 4.67) izolatın Mycobacterium avium subsp. avium, 1 izolatın ise Mycobacterium spp. olduğu saptandı. Bu çalışmada elde edilen bulgular açısından ticari ve köy kanatlı sürüleri arasında önemli farklılıklar bulunmadı (p>0.05). Sonuç olarak, kanatlı mikobakteriyozisi şüphesiyle getirilen tavuk ve hindilerden M. avium subsp. avium üredi ve izolasyon amacıyla L-J’in Middlebrook 7H10 agar’a göre daha etkin olduğu saptandı. İzole edilen suşların doğrulanmasında moleküler tekniklerin teşhiste kullanılabilirliği ortaya konuldu. M. avium subsp. avium’ un kanatlı yetiştiriciliği ve halk sağlığı yönünden dikkate alınması gerektiği sonucuna varıldı.
Diagnosis of Avian Mycobacteriosis in Layers and Turkey Flocks by Culture and PCR Techniques Diagnosis of avian mycobacteriosis in layer hens and turkeys, caused by Mycobacterium avium complex (MAC), is problematic. In this study, culture and Ziehl-Neelsen stain (Z-N) were used to detect acid-fast orgamisms in tissue and fecal samples. The isolates were confirmed using Polymerase chain reaction (PCR). Three different culture media (Lowentein-Jensen [L-J] with glycerol, Middlebrook 7H9 broth supplemented with ADC and Middlebrook 7H10 agar with OADC were tested to determine which medium had the greatest success in isolating mycobacteria. Acid-fast staining method included Ziehl-Neelsen (Z-N) technique was applied. The PCR assay was applied to identificate M. avium subsp. avium from mycobacterium isolates using specific primers to IS901 gene. Mycobacterium avium subsp. avium was cultured from 8 (7.8%) of 103 layer hens and turkeys. From a total of 8 nekropsied birds, 7 (6 layer hens and 1 turkey) birds with tuberculous lesions and 1 bird without lesions showed growth on mycobacterial medium. Considering to the origins of materials examined, mycobacteria were detected in 3 (7.5%) from 40 commercial, in 4 (8.9%) from 45 backyard hens, and in 1 (5.5 %) of 18 turkeys. Typical tuberclous lesions were observed in 20 (5.19%) samples out of 385 organs. Acid-fast bacilli (AFB) were detected in 45 (% 9.2) out of 488 samples following direct microscopic examination. Culture was considered the gold standard. Compared with other culture media, L-J yielded more positive cultures and greater numbers of colonies on positive tubes, and incubation times were shorter. From a total of 19 isolates 18 were found belonging to Mycobacterium avium subsp. avium, and only 1 was identified as Mycobacterium spp. From the results of this study, no significant differences were detected between commercial and backyard poultry flocks (p>0.05). In conclusion, M. avium subsp. avium was isolated from mycobacteriosis suspected hens and turkeys and L-J medium was determined to be more effective than Middlebrook 7H10 agar concerning bacterial isolations. The feasibility of molecular techniques for confirmation of laboratory diagnosis of isolated strains had been stated. Key words: layer hens, Mycobacterium, PCR, turkeys.
60
KAYNAKLAR
AKAY, Ö. (1980). Hindi Tüberküloz Etkenlerinin İzolasyon, İdentifikasyon, Tiplendirilmesi ile Deneysel Hindi Tüberkülozisinde Allerjik ve Serolojik Yöntemlerin Uygulanmsı Üzerinde Araştırmalar. Doçentlik Tezi. Ankara Üniv. Vet. Fak., Ankara. AKAY, Ö. (1999). Aside-Dirençli Bakteriler. In.: Özel Mikrobiyoloji. Arda, M., Minbay, A., Leloğlu, N., Aydın, N., Kahraman, M., Akay, Ö., İlgaz, A., İzgür, M., Diker, K.S. Medisan Yayınevi. 4. baskı. Ankara, s.: 180-202. AKAY, Ö. (2002). Tüberkülozis. In:Kanatlı Hayvan Hastalıkları. Ed.: M. İzgür, M. Akan. Medisan Yayınevi. 1. baskı. Ankara, s.: 101-104. ANARGYROS, P., DAVID, S.J., LIM. I.S.L. (1990). Comparison of improved BACTEC and Lowenstein-Jensen Media for Culture of Mycobacteria from Clinical Specimens. J. Clin. Microbiol. 28: 1288-1291. ARANAZ, A., LIEBANA, E., MATEOS, A., DOMINGUEZ, L. (1997). Laboratory Diagnosis of Avian Mycobacteriosis. Semin. Avian Exot. Pet Med. 6: 9-17. ATLAS, R.M. (2004). Handbook of Microbiological Media. 3rd. Ed. CRC Press, A.D.B., p.: 942-943. BASCUNANA, C.R., KATINKA, B.K. (1996). Detection and Identification of Mycobacteria in Formalin-Fixed, Paraffin-embedded Tissues by Nested-PCR and Restriction Enzyme Analysis. J. Clin. Microbiol. 34: 2351-2355. BAŞKAYA, H., AYDIN, N., AKAY, Ö. (1983). Kanatlı Tüberkulozisinin Teşhisinde Allerjik ve Serolojik Yöntemlerin Karşılaştırılması Üzerine Bir Araştırma. A. Ü.. Vet. Fak. Derg. 30: 440-448. BENNETT, R.M., CHRISTIANSEN, K., CLIFTON, R.S. (1999). Direct costs of endemic diseases of farm animals in Great Britain. Vet. Record. 145: 376- 377.
BENSON, C.A., ELLNER, J.J. (1993). Mycobacterium avium complex infection and AIDS: advances in theory and practice. Clin. Infect. Dis. 17:7-20.
BERMUDEZ, L. (1994). Immunobiology of Mycobacterium avium. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 13: 1000-1006. BEYTUT, E., ATABAY, H.İ., AKÇA, A.(2001). Tuberculosis and Sarcosporidiosis in the Periorbital location in a hen. Kafkas Üniv. Vet. Fak. Derg. 7: 213-217.
61
BIET, F., BOSCHIROLI, M.L., THOREL, M.F., GULLOTEAU, L.A. (2005). Zoonotic aspects of Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium-intracellulare complex (MAC). Vet. Res. 36: 411-136. BOTTGER, E.C., TESKE, A., KIRSCHNER, P., BOST, S., CHANG, H.R., BEER, V., HIRSCHEL,B.(1992). Disseminated Mycobacterium genavense infection in patients with AIDS. Lancet. 340: 76-80. BOWES, V. (1993). Avian tuberculosis in ostrich. Can. Vet. J. 34: 758. BRENNAN, P.J., NIKAIDO, H. (1995). The envelope of Mycobacteria. Annu. Rev. Biochem. 64: 29-63. BROWN, A. E. (2001). Acid-Fast Staining: Ziehl-Neelsen Method. In: Microbiological Applications (Laboratory Manual in General Microbiology 8th. Ed. McGrow-Hill Companies, A. B. D., p.:69. CHASKES, S. (2008). Stains for light Microscopy. In.: Practical Handbook of Microbiology. Ed.: E.GOLDMAN, L.H. GREEN. 2nd ed. CRC PRESS, A.B.D. p.: 41-42. CHEVRIER, D., OPRISAN, G., MARESCA, A., MATSIOTA-BERNARD, P., GUESDON, J. (1999). Isolation of a specific DNA fragment and development of a PCR-based method for the detection of Mycobacterium genavense. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 23: 243-252. CLARKE, K.R.; FIRLGERALD, S.D.; HATTEY, J.A.; BOLIN, C.A.; BERRY,
D.E.; CHURCH, S.V.; REED, W.M. (2006). Experimental inoculation of wild turkeys (Meleagris gallopavo) with Mycobacterium bovis. Avian Diseases. 50: 131-134.
COLES, C., CICUTA, M.E., ZUMARRAGA, M., ETCHETCHOURY, I., LERTORA, J., RAMIRAZ, G.V. (2007). Avian Mycobacteriosis in chickens from a rural area of Argentina. Rev. Vet. 18: 72-77. COLLINS, P., MATTHEWS, P., MCDIARMID, A., BROWN, A. (1983). The pathogenicity of Mycobacterium avium and related mycobacteria for experimental animals. J. Med. Microbiol. 16: 27-35. CONVILLE, P.S., WITEBSKY, F.G. (1998). Variable Affecting Results of Sodium Chloride Tolerance Test for Identification of Rapidly Growing Mycobacetria. J. Clin. Microbiol. 36: 1555-1559. CROMIE, R.L., BROWN, M.J., PRICE, D.J., STANFORD, J.L. (1991). Susceptibility of captive wildfowl to avian tuberculosis: the importance of genetic and environmental factors. Tubercle. 72: 105-109.
62
CROMIE, R.L., BROWNI, M.J., FORBES, N.A., MORGANS, J., STANFORD, J.L. (1993). A comparison and evaluation of techniques for diagnosis of avian tuberculosis in wildfowl. Avian Pathol. 22: 617-630. CROMIE, R.L., ASH, .N.J., BROWN, J.M., STANFORD, J.L. (2000). Avian immune responses to Mycobacterium avium: the wildfowl example. Develop. Comp. Immunol. 24: 169-185. DAVIS, G.B., WATSON, P.R., BILLING, A.E. (1984). Tuberculosis in a kiwi (Apteryx mantelli). N. Z. Vet. J. 32: 3-30. DONELEY, R.T.J., GIBSON, J.A., THONE, D., COUSINS, D.V. (1999). Mycobacterial infection in an ostrich. Aust. Vet. J. 77: 368-370. DVORSKA, L., BULL, T.J., BARTOS, M., MATLOVA, L., AVASTOVA, P.,
WESTON, R.T., KINTR, J., PARMOVA, I., VAN, S.D., PAVLIK, I. (2003). A standardised restriction fragment length polymerasim (RFLP) method for typing Mycobacterium avium isolates links IS901 with virulence for birds.J. Microbiol. Methods. 55: 11-27.
WESTON, R.T., ALVAREZ, J., BERAN, V., MORAVKOVA, M., PAVLIK, I. (2007). Avian tuberculosis in naturally infected captive water birds of the Ardeideae and Threskiornithidae families studied by serotyping,IS901 RFLP typing, and virulence for poultry. Vet. Mic. 119: 366-374.
ERTÜRK, E., PAMUKÇU, A.M. (1974). 1933-1975 Yılları Arasında Ankara ve
Yöresinde Kanatlı Hayvanlarda Rastlanan Hastalık ve Tümör Olayları. A. Ü. Vet. Fak. Derg. 21: 13-20.
FALKINHAM, J.O., GEORGE, K.L., PARKER, B.C., GRUFT, H. (1984). In vitro
susceptibility of human and environmental isolates of Mycobacterium avium, M. intracellulare, and M. scrofulaceum to heavy-metal salts and oxyanions. Antimicrob Agents Chemother. 25: 137–139.
FERGUSON, S.H., WALLACE, L.J., DUNBAR, F., CACCIATORE, R. (1969). Mycobacterium intracellulare (Battey bacillus) infection in a Florida wood duck (Aix sponsa). Am. Rev. Resp. Dis. 100: 876-879. FIELD, A. (2009). Discovering Statisitics Using SPSS. SAGE Publication Ltd. 3. ed. London. p.687-688. GHANI, Z.G.A. (1968). The diagnosis of Avian Tuberculosis in a turkey in Iraq. Vet. Rec. 16: 508. GILL, I.J., BLANDY, M.L. (1986). Control of avian tuberculosis in a commercial poultry flock. Aust. Vet. J. 63: 422-423.
63
GOLDMAN, E., GREEN. L.H. (2009). Practical Handbook of Microbiology. CRC Press. 2. ed. FL, ABD. pp. 41. GONZALEZ, M., BERTOS, A.R., GIMENO, I., FLORES, J.M., PZARRO, M. (2002). Outbreak of avian tuberculosis in 48-week old commercial layerhen flock. Avian Dis. 46: 1055-1061. GRANGE, J.M., YATES, D.M., BROUGHTON, E. (1990). A review: the tubercle bacillus and it’s relative. J. Appl. Bacteriol. 68: 411-431. GRANGE, J. M., YATES, M. Y., KANTOR, H, N. (1996). Emerging and other
GROSS, W.B., FALKINHAM, J.D., PAYEUR, J.B. (1989). Effect of environmental-genetic interactions on Mycobacterium avium challenge infection. Avian Dis. 33: 411-415. GUERRERO, C.C., BERNASCONI, D., BURKI, T., BODMER, T., TELENTI, A.
(1995). A novel insertion element from Mycobacterium avium, IS1245, is a specific target for analysis of strain relatedness. J.Clin. Microbiol. 33: 304-307.
GÜMÜŞSOY, K.S., BEYAZ, L., AYDIN, F., ÖZCAN, M., ATASEVER, A. (2006). Avian tuberculosis in Kayseri zoo. Erciyes Üniv. Vet. Fak. Derg. 3: 25-28. HAWKEY, C., KOCK, R.A., HENDERSON, G.M., CINDERY, R.N. (1990). Haematological Changes in Domestic fowl (Gallus gallus) and Cranes (Gruiformes) with Mycobacterium avium infection. Avian Pathol. 19: 223- 234. HEJLICEK, K., TREMEL, F. (1995). Comparison of pathogenesis and epizootology signification of avian mycobacteriosis in different sorts of domestic and free living synanthropic fowl . Vet. Med-Czech. 40: 187-194. HOOP, R.K. (1997). Public health implications of exotic pet mycobacteriosis. Semin. Avian exot. Pet Med. 6: 3-8. HOOP, R.K. (2002). Mycobacterium tuberculosis Infection in a Canary (Serinus canaria L.) and a Blue-Fronted Amazon Parrot (Amazona amazona aestiva). Avian Dis. 46: 502-504. HOOP, R.K., BOTTGER, E.C., OSSENTS, P., SALFINGER, M. (1993). Mycobacteriosis due to Mycobacterium genavense in six pet birds. J. Clin. Microbiol. 31: 990-993.
64
HOOP, R.K., BOTTGER, E.C., PFYFFER, G.E. (1996). Etiological agents of Mycobacteriosis in pet birds between 1986 and 1995. J. Clin. Micrbiol. 34: 991-992. HUARD, R.C., LAZZARINI, C.O., BUTLER, W.R., VANSOOLINGEN, D., HO, J.L. (2003). PCR-based method to differentiate the subspecies of MTB on the basis of genomic deletions. J. Clin. Microbiol. 41: 1637-1650. HUEBNER, R.E., GOOD, R.C., TOKARS, J.I. (1993). Current Practices in Mycobacteriology: Results of a Survey of State Public Health Laboratories. J. Clin. Microbiol. 31: 771-775. IKONOMOPOULOS, J., FRAGKIADAKI, E., LIANDRIS, E., SOTIRAKOGLOU, K., XYLOOURI, E., GAZOULI, M. (2009). Estimation of the spread of pathogenic mycobacteria in organic broiler farms by the polymerase chain reaction. Veterinay Microbiology. 133: 278-282. KEYMER, I.F., JONES, D.M., PUGSLEY, S.L., WAFSWORTH, P.E. (1982). Asurvey of tuberculosis in birds in the Reagent’s Park Gardens of the Zoological Society of London. Avian Pathol. 11: 563-568. KOCK, N.D., KOCK, R.A., WAMBU, J., KAMAU, G.J., MOHAN, K. (1999). Mycobacterium avium-related epizootic in free-ranging lesser flamingos in Kenya. J. Wildl. Dis. 35: 297-300. KUL, O., TUNCA, R., HAZIROĞLU, R., DİKER, K.S., KAHRAMAN, S. (2005).
An out break of avian tuberculosis in peafowl (Pavo cristatus) and pheasants (Phasianus colchicus) in a zoological aviary in Turkey. Vet. Med.-Czech. 50: 446-450.
KUNZE, Z., PORTALES, M.F., MCFADDEN, J.J. (1992). Biologically distinct subtypes of Mycobacterium avium differ in possession of insertion sequence IS901. J. Clin. Microbiol. 30: 2366-2372. KUTSAL, O., SAĞLAM, M. (1988). Güvercinlerde Tüberküloz olgularının değerlendirilmesi. A. Ü. Vet. Fak. Derg. 35: 545-552. LEVY-FREBAULT, V.V., PORTALES, F. (1992). Proposed minimal standards for the genus Mycobacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 42: 315-323. MANAROLLA, G., LIANDRIS, E., PISONI, G., MORONI, P., PICCININI, R., RAMPIN, T. (2007). Mycobacterium genavense and avian polymavirus co- infection in a European Goldfinch (Carduelis carduelis). Avian Path. 36: 423- 426. MORITA, Y., ARIA, M., NOMURA, S., KATSUBE, Y. (1994b). Avian
tuberculosis which occurred in an imported pigeon and the pathogenicity of the isolates. J. Vet. Med. Sci. 56: 585-587.
65
MORITA, Y., MARUYAMA, S., KATSUBE, Y. (1994a). Pathogenicity of Mycobacterim avium serovar 1 isolated from swine in Japan for the first time. J.Vet. Med. Sci. 56: 77-81.
MORITA, Y., MARUYAMA, S., KATSUBE, Y. (1999). Pathogenicity of Mycobacterium avium complex serovar 9 isolated from painted quail (Excalfactoria chinensis). J. Vet. Med. Sci. 61: 1309-1312. MUTALIB, A.A., RIDDELL, C. (1988). Epizootiology and pathology of avian tuberculosis in chickens in Saskatchewan. Can. Vet. J. 29: 840-842. ODIAWO, G.O., MUKURIRA, J.M. (1988). Avian cerebral tuberculosis. Vet. Rec. 122: 279-280. ÖZCAN, K., BEYTUT, E., AYDIN, F., TUZCU, M. (2001). Tuberculosis in geese (Anser anser). Avian Dis. 45: 755-759. PAINTER, K.S. (1997). Avian tuberculosis caused by Mycobacterium avium serotype-3 in captive wildlife. Vet. Rec. 140: 457-458. PANIGRAPHY, B., CLATRK, E.D., HALL, C.F. (1983). Mycobacteriosis in psittacine birds. Avian Dis. 27: 1166-1168. PAVLIK, I., SVASTOVA, P., BARTL, J., DVORSKA, L., RYCHLIK, I. (2000). Relationship between IS901 in the Mycobacterium avium complex strains isolated from birds, animals, humans, and the environment and virulence for poultry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7: 212-217. POCKNEL, A.M., MILLER, B.J., NEUTFELD, J.L., GRAHN, B.H. (1996). Conjunctival mycobacteriosis in two emus (Dromaius novaehollandiae). Vet. Pathol. 33: 346-348. PORTALES, F.L., REALINI, L., BAUWENS, B., HIRSCHELS, W.M., MEYERS,
M., MEURICHY, W.M. (1996). Mycobacteriosis caused by Mycobacterium genavense in birds kept in a zoo: 11-year survey. J. Clin. Microbiol. 34: 319-323.
1165. PRIMM, T., LUCERO, P. CHRISTEI, A., FALKINHAM, J.O. (2004). Health impacts of environmental mycobacteria. Clin. Microbiol. Rev. 17: 98-106. QUINN, P.J., CARTER, M.E., MARKEY, M.E., CARTER, G.R. (1999). Clinical Veterinary Microbiology. MOSBY, London, U.K. p.: 161.
66
RASTOGI, N., BARROW, W.W. (1994). Cell envelope constituents and the multifaceted nature of Mycobacterium avium pathogenicity and drug resistance. Res. Microbiol. 145: 243-252. REALINI, L., RIDDER, K., PALMINO, J., HIRSCHEL, B., PORTALES, F. (1998). Microaeriphilic conditions promote growth of Mycobacterium genavense. J. Clin. Microbiol. 36: 2565-2570. REALINI, L., STUYTP, V., RIDDER, K., HIRSCHEL, B., PORTALES, F. (1997). Inhibitory effects of Polyoxyethylene staerate, PANTA, and neutral Phon growth of Mycobacterium genavense in BACTEC primary cultures. J. Clin. Microbiol. 35: 2791-1794. ROBERT, E., PORTER, J.R. (1998). Bacterial Enteritides of Poultry. Poultry Science. 77: 1159-1165. RUSSELL, A.D. (1996). Activity of biocides against mycobacteria. J. Appl. Bacteriol. 81: 87-101. SALFINGER, M., KAFADER, F.M. (1987). Comparisn of two pretreatment
methods for the detection of mycobacteria of BACTEC and Lowenstein-Jensen slants. J. Micrbiol. Mehtods. 6: 315-321.
SCHAEFER, W.B., BEER, J.V., WOOD, N.A., BOUGHTON, E., JENKINS, P.A., MARKS, J. (1973). A bacteriological study of endemic tuberculosis in birds. J. Hyg., Camb. 71: 549-557. SEZEN, İ.Y., ERER, H., ERGANİŞ, O. (1986). Bir güvercinde tüberküloz olgusu. Selçuk Üniv. Vet. Fak. Derg. 2: 163-166. SHINNICK, T.M., GOOD, R.C. (1994). Mycobacterial Taxonomy. Eur. J. Clin. Micribiol. Infect. Dis. 13: 884-901. SHITAYE, J.E., MALTOVA, L., HORVATHOVA, A., MORAVKOVA, M., BARTOSOVA, L., TREML, F., LAMKA, J., PAVLIK, I. (2008). Mycobacterium avium subsp. avium distribution studied in a naturally infected hen flock and in the environment by culture, serotyping and IS901 RFLP methods. Veterinary Microbiol. 127: 155-164. SINGBEIL, B.A., BICKFORD, A.A., STOLTZ, J.H. (1993). Isolation of Mycobacterium avium ringneck pheasants (Phasianus colchicus). Avian Dis. 37: 612-615. SMIT, T., EGER, A., HAAGSMA, J., BAKHUIZEN, T. (1987). Avian tuberculosis in Wild Birds in the Netherlands. J. Wildl. Dis. 23: 485-487. STAGER, C.E, LIBONATI, J.P., SIDDIQI, S.H., DAVIS, J.R., HOOPER, N.M., BAKER, J.F., CARTER, M.E. (1991). Role of Solid Media When Used in
67
Conjunction with the BACTEC System for Mycobacterial Isolation and Identification. J. Clin.Microbiol. 29: 154-157. SYKES, G.P. (1982). Tuberculosis in a red-tailed hawk (Buteo jamaicensis). J.
Wildl. Dis. 18: 495-499. TADESSE, S., WOLDEMESKEL, M., MOLLA, B., TIBBOS,M., KIDANE, D., MEDHIN, G., BRITTON, S. (2004). Avian Mycobacteriosis in Domestic Chickens from Selected Agro-climatic Regions in Ethiopia. J. Appl. Res. Vet. Med. 2: 17-25. TANAKA, C., MIYAZAWA, T., WARATAI, M., ISHIGURO, N. (2005).
Bacteriological Survey of Feces from Feral Pigeons in Japan. J. Vet. Med. Sci.67: 951-953.
TANTAŞ, A., AK, S., YILMAZ, H. (1990). A case of fowl tuberculosis in which are taken from a poultry farm. İstanbul Üniv. Vet. Fak. Derg. 16: 61-66. TELENTI, A., MARCHES, F., BALZ, M., BALLY, F., BOTTGER, E., BODMER, T. (1993). Rapid Identification of Mycobacteria to the Species Level by Polymerase Chain Reaction and Restriction Enzyme Analysis. J. Clin. Microbiol. 31: 175-178. TELL, L.A., FOLEY, J.M., NEEDHAM, L., WALKER, R.L. (2003a). Diagnosis of Avian Mycobacteriosis: Comparison of Culture, Acid-Fast Stains, and Polymerse Chain Reaction for the Identification of Mycobacterium avium in Experimentally Inoculated Japanese Quail (Cturnix coturnix japonica). Avian Dis. 47: 444-452. TELL, L.A., LEUTENEGGER, C.M., LARSEN,R.S., AGNEW, D.W., KEENER,
L., NEEDHAM, M.L., RIDEOUT, B. (2003b). Real-Time Polymerase Chain Reaction Testing for the Detection of Mycobacterium genavense and Mycobacterium avium complex species in Avian samples. Avian Dis. 47: 1406- 1415.
THOREL, M.F., HUCHZERMEYER, H., WEISS, R., FONTAINE, J.J. (1997). Mycobacterium avium infections in animals. Literature review. Vet. Res. 28: 439-447. THOREL, M.F., KRICHESKY, M., LEVY, F.V.V. (1990). Numerical taxonomy of
Mycobactin-dependent Mycobacteria, emended description of Mycobacterium avium, and description of Mycobacterium avium subsp. avium nov., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis nov., and Mycobacterium avium subsp. silvaticum. Int. J. Syst. Bacteriol. 40: 254-260.
TORTOLI, E., NANETTI, A., PIERSIMONI, C., CICHERO, P., FARINA, C., MUCIGNAT, G., SCARPARO, C., BARTOLINI, L., VALENTINI, R., NISTA, D., GESU, G., TOSI, C.P., CROVATTO, M., BRUSARROOCO, G. (2001). Performance Assessment of New Multiplex Probe Assay for Identification of Mycobacteria. J. Clin.Microbiol. 39: 1079-1084. VAN der HEYDEN, N. (1997a). Clinical Manifestations of Mycobacteriosis in pet birds. Semin. Avian Exot. Pet Med. 6: 18-24. VAN der HEYDEN, N. (1997b). New Strategies in the Treatment of Avian Mycobacteriosis. Semin. Avian Exot. Pet Med. 6: 25-33. WASHKO, R.M., HOEFER, H., KIEHN, T.E., ARMTRONG, D., DORSINVILLE, G., FRIDEN, T.R. (1998). Mycobacterium tuberculosis infection in a green- winged macaw (Ara chloroptera): report with public health implications. J. Clin. Microbiol. 36: 1101-1102. WAYNE, L.G., ENGBAEKH, H.C., NGELH, H.W.B., FROMANS, S., GROSS, W.,
HAWKINS, J,. KAPPLER,W., KARLSSON, A.G., KLEEBERG, H. H., KRASNOW, I., KUBICA,G. P., MCDURMONCT, C., NEEL, E.E., PA-ITYNS, S.R., SCHRODER, K.H., SHOWALTER, S., TARNOK, I., TSUKAMURMA, M., VERGMANN, B., WOLINSKY, E. (1974). Highly reproducible techniques for use in systematic bacteriology in the genus Mycobacterium: tests for pigment, urea, resistance to sodium chloride, hydrolysis of Tween 80 and P-galactosidase. Int. J. Syst. Bacteriol. 24: 41 2-4 19
WILSON, M.L., STONE, B.L., HILDRED, M.V., REVES, R.R. (1995). Comparison of Recovery Rates for Mycobacteria from BACTEC 12B Vials, Middlebrook 7H11- Selective 7H Biplates, and Lowentein-Jnensen Slants in a Public Health Mycobacteriology Laboratory. J. Clin. Microbiol. 33: 2416-2518. YARDIMCI, H. (2006). Mycobacterium İnfeksiyonları. In: Veteriner Mikrobiyoloji: Bakteriyel Hastalıklar. Ed.: N. Aydın, J. Paracıkoğlu. Medisan Yayınevi, Ankara, s.: 87-107.
69
YODER, S., ARGUETA, C., HOLTZMAN, A., AROSON, T., BERLIN, O.G. TOMASEK, P., GLOVER, N., FROMAN, S., STELMA, G (1999). PCR comparison of Mycobacterium avium isolates obtained from patients and foods. Appl. Environ. Microbiol. 65: 2650-2653.