Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Slide 1

Assalamualaikum wr. wb Kami dari kelompok 7:Nor HaslindaOktavia ReniRika PuspitaRismaya HafsariAkan membahas tentang.....Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)Sejarah KCKTAlat Kromatografi adalah suatu alat umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan warna atau pugmen.Penemu Alat Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1930Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom.D.T. Day juga menggukan alat kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi peroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu alat dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.Tahun 1967-1969, Kirland, Huber dan Havarth memperkenalkan prinsip serta alat kromatografi cair dengan tekanan 5000 psi (300 atm).Akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang.Akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan alat kromatografi cair Kromatografi Cair Kinerja TinggiKCKT adalah suatu metoda kromatografi yang mampu memisahkan makro molekul, senyawa-senyawa ionik, produk alam yang lebih, senyawa polimerik dan kelompok-kelompok polifungsional yang memiliki berat molekul tinggi dengan cara penyairan berfraksi, penyerapan atau penukaran ion. Menggunakan fase yang interaktif dan fase diam padat atau cair yang aktif.

Fungsi utama KCKT pada dasarnya adalah kemampuannya dalam memisahkan berbagai komponen penyusun dalam suatu sampel. Kinerja tinggi dari kromatografi awalnya ditentukan oleh ketinggian tekanannya, namun perkembangan teknologi telah menghasilkan produk kromatografi cair berkinerja tinggi dengan tekanan yang tidak terlalu tinggi.

KCKT digunakan secara luas dalam pemisahan dan pemurnian berbagai sampel dalam berbagai bidang seperti farmasi, lingkungan, industri makanan dan minuman, industri polimer dan berbagai bahan baku. KCKT lebih banyak digunakan untuk keperluan identifikasi (analisis kualitatif).KCKT digunakan untukPemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologisAnalisis ketidakmurnian (impurities)Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupunzwitter ionIsolasi dan pemurnian senyawaPemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang miripPemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

Komponen KCKT

Wadah Fase Gerak

harus terbuat dari bahan yang bersih daninert.dapat menampung sekurang-kurangnya 1-2 liter fase gerak, dan terlebih dahulu harus dibebas gas kan. Karena gas akan menimbulkan gelembung pada pompa dan detektor yang akan sangat mengacaukan hasil analisis.

Secara umum ada 2 tipe fase gerak:Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang tidak berubah selama percobaan kromatografiFase gerak/eluen gradien, yaitu fase gerak dengan komposisi pelarut yang berubah selama masa kromatografi

Berdasarkan kepolaran fase gerak dibandingkan fase diamnya, fase gerak dibedakan menjadi:Fase normal, yaitu fase diam lebih polar dari fase gerak. Kemampuan elusinya akan meningkat seiring peningkatan polaritas fase gerak.Fase terbalik, yaitu bila fase diam kurang polar dibanding fase geraknya. Kemampuan elusi akan menurun seiring peningkatan kepolaran fase geraknya.

Pompa

Pompa KCKT harus terbuat dari bahan yag inert terhadap fase gerak. Bahan pompa dapat terbuat dari: gelas, baja tahan karat, teflon maupun batu nilam.Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan hingga 5000 psi dan mamp mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 3 ml/menit. Untuk keperluan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan hingga 20 ml/menit. Ada 2 tipe pompa:Pompa dengan tekanan konstanPompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Pompa tipe ini lebih umum digunakan.

KolomAda 2 jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.

Kolom merupakan bagianHPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.Keuntungan kolom mikrobormengkonsumsi fase gerak hanya 80% dari konsumsi kolom konvensional.Aliran fase gerak pada mikrobor yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal untuk digabungkan dengan spektrometer massaSensitivitas kolom mikrobor lebih tinggi karena pelarut yang lebih pekat, sehingga cocok digunakan dalam analisis sampel berskala kecil, seperti sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.Fase Diam

Kebanyakn fase diam berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzena.

Detektor

Detektor KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu detektor yang bersifat universal, yaitu detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif.

Contoh detektor yang bersifat universal adalah detektor indeks bias dan spektrometri massa. Dan jenis detektor lainnya adalah detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, fluoresensi dan elektrokimia.Karakteristik detektor idealMempunyai respon terhadap analit yang cepat dan reproduksibleMempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar yang sangat kecilStabil dalam pengoperasiannya

Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Untuk kolom konvensional 8 ul atau lebih kecil dan 1 ul atau lebih kecil pada kolom mikrobar.Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran yang luasTidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak

Perangkat Pendukung Lainnya

Perangkat pendukung lain yang digunakan dalam KCKT dapat berupa komputer, integrator dan rekorder.

Jenis teknik pemisahan dalam KCKT a. Kromatografi adsorpsiFase diam yang biasa digunakan adalah bahan alam polar seperti partikel silika atau alumina hidrat. Fase mobil berkompetisi terhadap lokasi aktif adsorpsi pada partikel fase diam. Komponen yang terikat lebih kuat akan tertahan lebih lama di dalam kolom. Waktu retensi bergantung pada kepolaran sampel.c. Kromatografi penukar ionPrinsip kerja berdasarkan partisi ion antara fase gerak dan fase diam pada lokasi penukaran ion. Pemisahan terjadi akibat partisi ion dalam derajat yang berbeda.

b. Kromatografi partisiLinarut dibagi atas fase gerak cair dengan cairan yang tidak bercampur yang dilapiskan pada suatu patikel padat sebagai fase diam. Fase diam dapat berupa fase diam yang disalutkan pada partikel penyangga. Kolom fase terikat (bonded-fase colum) merupakan kolom yang paling umum digunakan.

Hasil sistem KCKT dan optimasinya sangat tergantung pada beberapa hal, antara lain :a. Temperaturb. Tekananc. Diameter partikel fase diamd. Viskositase. Panjang kolom

Sistem KCKT1. Sistem elusi isokratik (isocratic elution)Sampel diinjeksikan ke dalam kolom yang komposisi fasa geraknya tidak berubah selama analisis dilakukan sampai sampel terelusi dari kolom, sistem isokratik yang memiliki nilai k (rasio atau koefisien partisi yang bervariasi) akan menghasilkan resolusi yang buruk dan sukar mendeteksi pita elusinya.2. Sistem elusi gradient (gradient elution)Ada perubahan fasa gerak baik secara bertahap atau berkesinambungan selama proses berlangsung. Pada mula-mula elusi, seluruh komponen sampel ditahan di bagian atas kolom, setelah gradien mulai, kekuatan elusi fase gerak akan meningkat. 3. Sistem elusi bertahapBaik digunakan untuk sampel yang mengandung komponen-komponen yang bergerak cepat, yang diikuti senyawa-senyawa yang lambat gerakannya,

Alat Kromatografi Cair Kerja Tinggi

PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DALAM SAMPEL DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGIAlat Dan Bahan1. Alat-alat :Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)1 setLumpang dan alu1 buahSpatula1 setLabu takar 25 mL dan 10 mL7 buahNeraca analitik1 setCorong pendek1 buahPipet tetes5 buahGelas kimia 5 mL1 buahGelas ukur 10 mL1 buahUltrasonic Vibrator1 set2. Bahan:Standar parasetamol6,25 mgMetanol375 mLSampel obat6 butirAquadessecukupnyaMembran PTFE1 set Selulosa nitrat1 setKertas saringsecukupnya

Prosedur Kerja1. Pembuatan pelarut dan fasa gerakMetanol disaring denganPTFE dan air disaring dengan selulosa nitrat. Laludicampur masing-masing dengan perbandingan 75:25dengan volume total sebanyak 500 mL.2.Pembuatan larutan induk parasetamolSebanyak 6,25 mg parasetamol ditimbang dengan neraca analitik dalam botol timbang.Parasetamol tersebut dilarutkan dengan sedikit pelarut, dipindahkan ke dalam labu ukur 25 mL.Setelah itu, dihomogenkan dan ditambahkan pelarut sampai tanda batas.3.Pembuatan larutan standarparasetamolLarutan induk parasetamol masing-masing dipipet sebanyak 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL dan 5 mL yang masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL. Setelah itu ditambahkan pelarut masing-masing sebanyak 5 mL dan dihomogenkan. Kemudian ditambah lagi pelarut sampai tanda batas.Selanjutnya disaring dengan PTFE dan disimpan dalam botol vial lalu didegassing.4.Pembuatan larutan sampel parasetamolSebanyak6tablet obat sampel masing-masing ditimbang beratnya dan dihitung berat rata-ratanya. Tablet obat tersebut digerus dalam mortar hingga halus dan ditimbang serbuknyasebanyak 27mg dengan neraca analitik dalam botol timbang. Kemudiandilarutkan dengan sedikit pelarut dan dipindahkan ke dalam labu ukur 25 mL, sampel dihomogenkan dalam ultrasonicvibrator.Setelah itu ditambahkan pelarut hingga tanda batas.

Larutan sampel tersebut kemudian disaring dan ditampung dalam labuerlenmeyer. Kemudian dipipet sebanyak 1 mL dan disimpan dalam labu ukur 10 mL yang diencerkan dengan pelarut sampai tanda batas. Larutan sampel teresbut disaring kembali menggunakan membranPTFE dan filtratnya didegassing selama 5 menit. Setelah itu, sampel siap untuk diinjeksikan.

Hasil dan Analisis Data

Pada percobaan penentuan kadar parasetamol dalam sampel obat menggunakan kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) ini menggunakan fasa gerak metanol dan air dengan komposisi 75:25. Fasa gerak dalam HPLC ini selain berfungsi sebagai pelarut, juga bersifat interaktif sehingga bisa berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Fasa gerak dalam hal ini bertindak sebagai pelarut sangat mempengaruhi waktu retensi, sehingga pelarut yang digunakan harus benar-benar jernih dan murni. Oleh sebab itu, metanol dan air terlebih dahulu disaring.Dalam pembuatan larutan induk parasetamol, pembuatannya harus dilakukan dalam satu kali pengerjaan, artinya untuk membuat larutan standar parasetamol dan untuk keperluan pengenceran sampel harus menggunakan larutan induk parasetamol yang sama. Hal tersebut dilakukan untuk menjaga agar peak yang ditunjukkan kromatogram sampel memungkinkan masih berada dalam rentang konsentrasi larutan standar yang dibuat.

Selain itu, baik dalam pembuatan larutan induk parasetamol, larutan standar parasetamol maupun sampel harus dihomogenkan, supaya larutan benar-benar bercampur sempurna (merata). Larutan standar dan sampel juga harus didegassing untuk menghilangkan gas-gas yang kemungkinan ada dalam larutan tersebut. Hal itu dilakukan karena gas dapat mengganggubaselinepada kromatogram, sehingga peak yang dihasilkan tidak sesuai.Akibat perbedaan interaksi antara solut dengan fasa gerak dan fasa diam yang terjadi mulai dari kolom sampai terdeteksi oleh detektor, maka hasil yang diperoleh adalah dalam bentuk kromatogram yang diperlihatkan oleh rekorder. Deret larutan standar yang dibuat mulai dari konsentrasi 25, 50, 75, 100 dan 125 ppm

Berikut tabel data deret larutan standar yang diperoleh:

Analisis terhadap cuplikan atau sampel obat dilakukan setelah semua deret larutan standar telah dianalisis. Sampel diinjeksikan sebanyak 2 kali injeksi untuk memperoleh luas area rata-rata yang nantinya akan digunakan untuk menghitung kadar parasetamol yang terdapat dalam sampel obat tersebut.Berikut tabel data sampel yang diperoleh:

Berikut kurva kalibrasi deret larutan standar yang diperoleh:Dari kurva kalibrasi tersebut, diperoleh persamaan garis y= 84535x + 24549, sehingga setelah dilakukan perhitungan menggunakan persamaan garis, maka kadar parasetamol dalam sampel adalah 84,837% dalam 27 mg sampel obat.

Kromatogram sampel yang diperoleh dari masing-masing penginjeksian menunjukkan adanya 2 peak dan 4 peak. Hal tersebut dikarenakan kandungan dalam sampel obat tidak hanya mengandung parasetamol saja, tetapi juga mengandung bahan lain sepertipropanezon, deklorfenilamina maleatdan kafein,sehinggapeak lainnya yang ditunjukkan dalam kromatogram adalah bahan lain yang terkandung dalam sampel obat tersebut. Peak yang dianggap sebagai peakparasetamol adalah peak yang pertama (penginjeksian pertama) dan peak yang ketiga (penginjeksian kedua)karena dilihat dari waktu retensi yang sama atau hampir sama dengan waktu retensi deret larutan standar.Untuk menentukan kadar parasetamol yang terkandung dalam sampel obat tersebut, maka dibuat terlebih dahulu kurva kalibrasi dari data deret larutan standar.KesimpulanBerdasarkan percobaan, diperoleh kadar parasetamol dalam 27 mg sampel obat sebesar 84,837%.

Ada Pertanyaan?Wassalamualaikum wr. wb