Kriterien der Einteilung von RNA Viren entsprechend Ihrer Genomorganisation einzelsträngig doppelsträngig circulär (+)-Polarität (-)-Polarität ambisense Poliovirus Influenza A Virus Hepatitis δ-Virus segmentiert vesicular stomatitis virua (VSV) Reovirus nicht segmentiert Arenavirus
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Kriterien der Einteilung von RNA Viren entsprechend Ihrer ... · VPg-pUpU wirkt als Proteinprimer für die Polio RdRP. (Viele RdRPs können ähnlich den DdRP s primerunabhängig initiieren!!
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Kriterien der Einteilung von RNA Viren entsprechendIhrer Genomorganisation
einzelsträngig
doppelsträngig circulär
(+)-Polarität (-)-Polarität ambisense
Poliovirus
Influenza A Virus
Hepatitis δ-Virus
segmentiert
vesicular stomatitis virua (VSV)
Reovirus
nicht segmentiert
Arenavirus
RNA Genom(+),(-), ds Kopie des RNA Genoms
(+),(-), dsSynthese von mRNA
(+)
Translation in virale Proteine(Strukturproteine, regulatorische Proteine)
Verpackung in neue Virionen(Verpackungssequenzen, Strukturproteine)
RNA RNARNA-abhängige RNA Synthese
Virale RNA-abhängige RNA Polymerasen (RdRPs) !!
Replikation„Transkription“mRNA-Synthese
Ausnahme: Retroviren (RdDP)
Prinzipien der Replikation und mRNA-Synthesenicht-retroviraler RNA-Viren
RNA-abhängige RNA-Polymerasen
Die Aktivität konnte dem cytoplasmatischen viralen 3Dpol-Protein zugeschrieben werden
Zellextrakte Poliovirus-infizierter Zellen enthalten eine enzymatische Aktivität die die„primer“ und „template“ abhängige Inkorporation von Ribonukleotiden katalysiert (1962)
Die Aktivität ist insensitiv gegenüber Actinomycin D (im Gegensatz zu Pol II Aktivität)
Vergleichbare Aktivitäten sind später in Partikeln von (-) Strang und dsRNA Viren entdeckt worden
Die meisten RNA-abhängigen RNA Polymerasen (RdRPs) sind primerunabhängig(vergleichbar den zellulären DNA-abhängigen RNA Polymerasen) Ausnahme 3DPol
Aufgrund der präferentiellen Membranlokalisation ist die Reinigung der meisten RdRPs schwierig
Primärsequenzvergleiche verschiedener zellulärer und viraler Polymerasen weisen aufeinen gemeinsamen „Vorfahren“ hin
Initiation und Termination der RNA Synthese erfolgt an spezifischen RNA Stellen, RNA Synthese erfolgt von 5´- 3´.
Primärstrukturvergleich und Sequenzhomologie viralerund zellulärer Polymerasen
Die Beschaffenheit der RNA Matrizen von (-) und (+) Strang RNA Viren
RNA-Polymerasen kopieren die viralen (-)-Stränge nur im Proteinkomplex (nackte RNA wird nicht kopiert Bsp. VSV – N-Protein)
(-) Strang RNA Viren verpacken ihr Genom in Form von Nukleoprotein-haltigen Nukleokapsiden (diese enthalten die RdRP sowie aksessorische Proteine)
In dieser Form sind sie stabilisiert und resistent gegen RNAse
Die Genome von (+)-Strang RNA Viren sind nicht in gleicher Weise verpackt (Ausnahme: Retroviren)
Der Grund für diesen Unterschied liegt möglicherweise in der initialen Aufgabe der Matrize:Bei (+) Strang RNA Viren erfolgt zunächst TranslationBei (-) Strang RNA Viren mRNA-Synthese
Nukleoproteine sind kooperative Einzelstrang-RNA Bindeproteine die für die RNA-Synthese benötigt werden (analog den ssDNA Bindeproteinen bei der DNA-abhängigen DNA/RNA-Synthese).
Ihre Funktion besteht in der Aufrechterhaltung der Einzelsträngigkeit zum Verhindern der Basenpaarung zwischen Template und Produkt (ermöglicht mehrere Syntheserunden)
Bei vielen (+) Strang RNA Viren sind Helikasen an der Replikation beteiligt (Im Falle von Poliovirus hat 3DPol selbst (ATP-unabhängige) Helikaseaktivität).
RNA Sekundärstrukturen „stem-loops“ und „Pseudoknoten“
„stem-loop“ Strukturen Pseudoknoten
Basenpaarungen im Stamm (stem),Keine Basenpaarungen innerhalbder Schleife (loop)
Basenpaarungen im Stamm,Basenpaarungen der Schleife mitNukleotiden außerhalb der Schleife
Vorhersage von RNA-Sekundärstrukturen mit ComputerprogrammenVerifikation der Strukturen durch spezifischen RNAase Verdaus und 2D-NMRVergleichbare RNA-Sekundärstrukturen müssen nicht notwendigerweise homolog sein
Funktionen akzessorischer Proteine bei derRNA-abhängigen RNA Synthese
1. Direktion der RNA-Polymerase zum korrekten zellulären Kompartiment
Die Matrizenspezifität viraler RdRP wird durch spezifische Interaktionen derPolymerase mit akzessorischen viralen oder zellullären Proteinen, die anspezifische Stellen in der Matrize binden (RNA-Sekundärstrukturen), vermittelt.Beispiel: Poliovirus 3AB-3CD bindet an eine in Picornaviren konservierte PseudoknotenRNA Sekundärstruktur am 3´-Ende und initiiert so die Polymerase zur (-) Strangsynthese.
2. Direktion der RNA-Polymerase zur korrekten Stelle der viralen Matrize
RNA-Synthese findet typischerweise nicht frei im Cytoplasma, sondern in bzw. an definierten zellulären Strukturen statt:(-) Strang Segmente von Influenza A Virus werden vermittels eines NLS im NP Proteinsin den Kern dirigiert.(+) Strang des Poliovirusgenoms wird vermittels der Interaktion von 2C mit RNA und 3AB mit 3CD (enthält die 3DPol) an ein vesikuläres Kompartment dirigiert.
3. Stimulation der Polymeraseaktivität
4. Erleichterung der RNA-Synthese durch viruscodierte HelicasenBasengepaarte Bereiche innerhalb der RNA werden durch Helicasen aufgeschmolzen.Dies stellt einen möglichen Angriffspunkt für therapeutische Intervention dar (HCV-Helicase)
Zelluläre Orte viraler RNA Synthese
Die meisten RNA-Viren replizieren ihr Genom und synthetisieren ihre mRNAs im Cytoplasma
Cytoplasma:
Synthese erfolgt nicht frei sondern ist an zelluläre Strukturen gebunden (Vesikel, Membranen, Cytoskelett)
Die hohe lokale Konzentration der für die Replikation notwendigen Komponenten erhöhtdie Effizienz der Replikation
Membranen stellen häufig den Ort der Verpackung neuer Virionen dar.
Problem: Alle normalerweise nukleären Aktivitäten des Wirtes müssen von viralen Proteinenbereitgestellt werden (z.B. capping von mRNAs).
Nukleus:Von den RNA Viren replizieren nur Influenza und Borna Viren im Nukleus
Vorteil besteht in der Möglichkeit der Ausnutzung des zellulären „splicing“-Apparates
Es müssen Mechanismen des Kerntransportes entwickelt werden. NP-Protein enthält Kernlokalisationssequenz.
Replikation und RNA-Synthese von (+) Strang RNA Viren
RNA von (+) Strang RNA Viren ist infektiös- (+) Strang genomische RNA kann als direkte Matrize für die Synthese von RdRP dienen
(+) Strang RNA Viren bedürfen keiner aktiven RdRP im Viruspartikel
Genomreplikation erfolgt über ein komplettes (-) Strang Intermediat
Polivirus hat ein 5´VpG statt CAP
Struktur und Genomorganisation des (+) StrangPicornavirus: Poliovirus
Kovalente VPg-Bindung am 5´Ende des (+) und (-) Strangs der PV-RNA führten zur Hypothese, dass VPg als primer fungiert.Die Präsenz von VPg-pUpU in Zellextrakten infizierter Zellen bestätigte dies. VPg-pUpU wirkt als Proteinprimer für die Polio RdRP.
(Viele RdRPs können ähnlich den DdRPs primerunabhängig initiieren!!
Bei der Poliovius-RNA Synthese wird der WirtsfaktorPoly (rC) Bindeprotein 2 benötigt. Ein weiterer Faktor ist das
Poly (A) Bindprotein
Abhängigkeit der Poliovirus RNA Synthese von Wirtsfaktoren
I. Inkubation von Poliovirus (+) Strang RNA mit zytoplasmatischen Extrakten aus nichtInfizierten aber permissiven Zellen:⇒ Translation der genomische RNA (u.a. Synthese der viralen Polymerase 3DPol.⇒ Weiterhin: Synthese des (-) Stranges (in Abwesenheit von Guanidinhydrochlorid)In Anwsesenheit von letzterem findet nur assembly mit Pol statt, aber keine Initiation. Die kann erst durch erneute Zugabe von cytoplasmatischem Extrakt erreicht werden.
II. Verwendet man nicht permissive Zellen (z.B. Xenopus laevis Oocyten) und injiziertPoliovirus RNA, kann diese nicht repliziert werden. Nach zusätzlicher Injektion vonCytoplasmatischen Extrakten human Zellen erfolgt RNA Synthese.
⇒ Die Poliovirus RNA Synthese benötigt einen zellulären Faktor für die RNA Synthese
Die Spezifität der Poliovirus RNA Synthese wird durch spezifische Interaktionenviraler und zellulärer Proteine an RNA-Sekundärstrukturelemente gewährleistet
Bindung von Poly (rC) Bindeprotein 2 an stem loop B ermöglicht die Bindung von 3CD an
stem loop D.
Bindung von UTP und Anlagerung des Komplexesan Membrangebundenes 3AB Protein
(Dies ist in Wirklichkeit sehr viel komplizierter)
„Priming“ und proteolytische Abspaltung von VPg aus 3AB durch die Protease 3C;Bindung von
3Dpol/VPg-primer an 3´-Ende; Erkennung des3´“pseudoknot“ durch 3Dpol bedingt Spezifität
Um Kollisionen von Ribosomen bei der Translation mit Polymerasekomplexen bei der (-) Strang Synthese zu verhindern, müssen beide Prozesse koordiniert, d.h voneinander abhängig ablaufen.Bei Poliovirus spielt, neben anderen Prozessen, die Rekrutierung der RNA durch neu synthetisiertes 3CD zu Orten der Replikation eine Rolle. In Abwesenheit von 3CD erfolgt präferentiell die Translation durch Ribosomen.
Replikation und RNA-Synthese von (-) Strang RNA Viren
RNA von (-) Strang RNA Viren ist nicht infektiös- (-) Strang kann durch zelluläre Enzyme weder kopiert noch translatiert werden.
(-) Strang RNA Viren enthalten aktive RdRP im Viruspartikel
Genomreplikation erfolgt über ein komplettes (+) Strang Intermediat
Capping ist ein Prozess des Editings eukaryontischer mRNAs
Es involviert mehrere Transferasen-katalysierte Reaktionen
Es bildet sich u.a. ein 7N-methylguanosyl cap am 5´Ende
Cap-Struktur stabilisiert mRNA
Gecappte mRNAs sind monocistronisch und polyadenyliert
Capping ist notwendige Voraussetzung für die Initiation derTranslation. Cap bindet an den eukariontischen Initiations-Faktor eIF4F der die Bindung der RNA ans Ribosom vermittelt.
1. Bindung der konservierten (-) Strang Segmentsequenz durch PB1 induziert Bindung gecappter zellullärer mRNA an PB2
2
2. Zur mRNA Synthese aktivierter Polymerasekomplex (Komplex ist inaktiv im freien Zustand)
3
3. Bindung des 3´-Endes an PB1 (hier erfolgt Selektion) und Positionierung des hydrolysierten gecappten zellulärenmRNA-Fragmentes zum 3´Ende
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4. Templatespezifische Elongation des gecappten primers bis zu einer U7 Sequenz vor dem gebundenen 5´-Ende.Die RNA wird dabei durch den Polymerasekomplex gefädelt (Polymerase ist Fixpunkt, RNA wandert).
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5. RNA blockiert eigene Elongation und reiterativer Einbau von As (150) führt zur Polyadenylierung und Termination.
Funktionell verschieden Formen der Influenza RNA-Polymerase führen mRNA Syntese und Genomreplikation aus
mRNA-Synthese Genomereplikation
Genetische Diversität bei Viren mit RNA-Genomen
Die fehlende Akkuratesse von RNA-Polymerasen bedingt den Fehleinbau von Nukleotiden
RNA-abhängige RNA Polymerasen haben keine „proof-reading“ Aktivität (keine Exonuklease).Dies führt zu einem Fehleinbau von jedem 1.000sten bis 10.000sten Nukleotid.Für die Translation hat dies gegebenenfalls Aminosäureaustausche und Funktionsverlustdes Proteins zur Folge.Bezüglich der Replikation bedeuted dies, das typischerweise jedes neue synthetisierte Virion 1-10Mutationen in seinem Genom aufweist.Eine Population von RNA-Viren ist immer heterogen und bildet somit eine „Quasispezies“
Die Segmentierung viraler Genome (Influenza A) ermöglicht Neukombinationen
Koinfektion einer Wirtszelle mit zwei verwandten segmentierten Viren erlaubt eine Neuver-Teilung der viralen Gensegmente.Bei Influenza A Viren führt dies regelmäßig zur neuen Virussubtypen mit antigener Diversität.
RNA-Rekombination ermöglicht den Austausch von viralen und zellulären Gensegmenten
Koinfektion einer Wirtszelle mit zwei verwandten Viren erlaubt Rekombination durch SprungDer Polymerase auf den anderen Strang (Template-abhängig).Rekombination viraler und zellulärer RNAs kann zur Integration neuer gene führen(z.B. Eibau zellulärer Gene der Zellzyklusregulation).